Dr. Oscar Alonso Luna 1. Temas Genes, Genómica y Cáncer – Introducción Tecnologías que están...
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Dr. Oscar Alonso Luna1
Biologia Molecular en OncologiaParte 1
Temas
• Genes, Genómica y Cáncer – Introducción
• Tecnologías que están revolucionado la genómica en el tratamiento del cáncer
¿Cual es la diferencia entre estas dos frutas?
Descubrimiento del ADN
Células y DNA• El cuerpo humano contiene
~100 trillones de células
• Cada célula contiene 23 pares de cromosomas ( = genoma)
• Los cromosomas contienen DNA
• Cada célula (excepto algunas cuantas) en un individuo contiene exactamente el mismo genomaEd Radclyffe, CSIRO
Estructura del ADN
DNA a Proteína
• El DNA en el genoma se interpreta para producir proteínas
• Los segmentos del DNA en el genoma llamados “GENES” codifican para proteínas
• Las proteínas son los productos funcionales finales en la célula.
DNA RNA Funciónproteína
Código Producto decodificado
insulin
Embrión de Erizo de mar
Embrión de ratón
Embrión de alga Fucus
Alga FucusRatónErizo de mar
Embrión humano
Genomas a Organismos
Humano (conectado)
Modificado del MCB 4a edición
Proyecto del genoma humano• 23 pares de cromosomas
• 3 x 109 pares de bases (o nucleotidos)– A, G, C & T
• Proyecto del Genoma Humano - 10 años y costó $2700 millones de dolares• ACGTGCATCTGACATTTACTG …..
Variaciones del genoma humano – Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
• ~ 97 % del genoma entre dos individuos es idéntico.• ~ 1% de las diferencias son
variaciones de un solo nucleótido (SNPs)
• ~2% debido a otros cambios – variaciones en el número de copias, deleciones
• Entre 11-12 millones de SNPs se han identificado
DefinicionesGenética: estudio de la herencia y de alteraciones en genes; también, el estudio de un solo gene
Genómica: estudio de genes múltiples, sus funciones, evoluación y sus interacciones, actuando en conjunto
Pruebas pronósticas de los genes: refleje la probabilidad de un cáncer para repetirse o la extensión fuera del sitio primario estas pruebas determina la probabilidad que un cáncer recurrirá o se detendrá.
Pruebas Predictivas: indican la sensibilidad o la resistencia relativa a los tratamientos específicos, tales como quimioterapia o tratamiento hormonal
Estas pruebas determinan la probabilidad que un cáncer responderá a un tipo de tratamiento en particular.
Que es el Cáncer?
13
Mutaciones
Modified from: M. Meyerson, S.Gabriel, G.Getz, Nature Reviews Genetics 11, 685-696
Tipo de cambio Cuenta Porcentaje
Mutaciones somáticas identificadas en COLO-829
SustitucionesCodificantes
SilenciosaMissenseTruncante
No codificantesUTRncRNAmiRNA
IntrónicasSplicingOtras
IntergénicasInserciones y deleciones pequeñas
CodificantesUTRIntrónicasIntergénicas
RearreglosPuntos de rupturaCodificantesUTRIntrónicosIntergénicos
ClasesIntracromosomales
DelecionesInversiones
DuplicacionesOtras
IntercromosomalesmiRNA, microRNA; ncRNA, RNA no codificante; UTR, región no traducida
Genética ayuda a identificar pacientes de “High Risk” para desarrollar Cáncer
– Genética es el estudio de la herencia
– Genetica se enfoca primariamente en el como se desarrolla el cáncer… BRCA1 o BRCA2
– Genética evalúa demostrar mutaciones, no enfermedades
Source: Understanding Cancer Series: Gene Testing,
National Cancer Institute
Genómica ayuda a buscar Pacientes de una Biología Tumoral Individual
Genómica Genómica es el estudio de como interactuan los genes
genes y son expresados como un todo• Genómica y los perfiles de expresión de genes son
herramientas enfocadas en el cáncer mismo y pueden ayudar a determinarCuanto agresivo es el cáncer (pronóstico)y/oCuanto es beneficioso un particular tipo de
tratamiento (predicción)
1818
La Promesa de la Genómica• Diagnóstico temprano y efectivo
– Anticipatorio, no reactive
– Predictivo y preventive
• Mayor individualización de las decisiones de tratamiento • Terapia Dirigida basada en una enfermedad individual• Mayor posibilidad de éxito en los estudios clínicos• Más “drug discovery” racional• Desarrollo de drogas más rápido
– Selección de pacientes– Respuesta de los pacientes
• Más rápido de comercializar
Entonces, Porqué es esto tan importante en el Cáncer?
Expresión Génica en el Cáncer
• Sobre-expresión génica
• Mitógenos, Factores de crecimiento.
Oncogenes
• Silencio génico durante la diferenciación, Reparación del DNA, control mitótico y apoptosis
Genes supresores de tumor o anti-oncogenes
Como se activan los oncogenes?
Secuencia codificante
Deleción o MutaciónPuntual en la secuencia
codificante
Amplificación Génica Re-arreglo Cromosómico
DNA
RNA
Proteína hiperactiva encantidades normales
Proteína normalampliamente sobre-expresada
Amplificación cercana ófusión a un gen activo
Combinaciones de oncogenes frecuentemente asociados con algunos cánceres humanos
Loci Afectado Tumor
APC, MCC, DCC, KRAS2, P53 Cáncer Colorrectal
HRAS, MYC Carcinoma cervical
MYB, MYC, EGFR, HER2, HRAS, P53, RB1, BRCA1, BCL1, HSTF1, INT2
Carcinoma mamario
JUN, MYC, MYCN, MYCL, HRAS, RB1, P53, RAF1 Carcinoma pulmonar
HRAS, P53, RAF1, INT2 Carcinoma de células escamosas
MYC, BLYM Linfoma de Burkitt
P53 (EGFR, MYC, MYCN, GLI, HER2, PDGFB, ROS, TGF alfa
Astrocitoma
ABL Leucemia mieloide crónica
Que vías metabólicas están relacionadas con el cáncer?
WNT
Cell
ECM
Growth factors (e.g. EGF, amphiregulin TGFa)
Nuclear receptors(e.g. oestrogen)
Survival factors(e.g. IGF1)
Cytokines(e.g. ILs, IFNs)
Deathfactors
(e.g. FasL)
Anti-growth factors(e.g. TGFb)
GPCR ligands
Frizzled Dishevelled
GSK-3b
APC
Tubulin
TCF
Integrins
b-Cutenin b-Cutenin:TCFE-Cadherin
CdC42 PI3K Rac
FakCas Crk
Src
Fyn
ShcNF1
RasRTK Grb2SOS
Ral MEK MAPK MAPK
MEKK
PLC
PKC Mos MKKs JNKs
ELK
Myc:Max
Max:MaxFos
JUN
Abl
7-TMR
CdC42 Rac Rho
G-Prol Ad Cycl PKA CREB
PKC NF-kB
NHR (e.g. ER)
NF-kB
P13K Akt Akka IKB
PTEN?
Stat 3.5
Stat 3.5
Stat 3.5
Bcl XL
Caspase 9
Cytochrome C
Jaks
Bad BidMitochondria
Bim, etc.Abnormalitysensor
Bcl-2
Cell Death(Apoptosis) Caspase 8
Fap
FADD
Bcl-2
Bax
ARF
p53
Mitochondria
MDM2
DNA damagesensorCell
Proliferation(cell cycle)
Changesin Gene
Expression
Cycl E:CDK2 p21
p27
E2Fs
Rb
p16
Cycl D:CDK+ p15 Smads
RTK
Cytokine R
Decoy R
Fas
SurfaceAg
TGFbR
HPVE7
Hanahan D, Weinberg RA. Cell 2000;100:57–70
Moléculas Candidatas para mutaciones causantes de cáncer (“oncogenes”=rojo)
Efectores candidatos = verde
Candidatos para blanco= amarillo
Fallas Moleculares del Tumor Primario
Genómica FuncionalLos ensayos funcionales: Permiten perturbar los diferentes elementos del sistema y ver las consecuencias funcionales.
Integración de Datos por Pruebas Moleculares
Una lista ordenada y registro de genes controladores.
…
• Haciendo uso de la gran escala de las pantallas funcionales que se están acumulando rápidamente.
• Lo mejor de ambos mundos: Integración de datos de los tumores primarios con pantallas funcionales en los datos genómicos.
Tumor Primario Análisis Genómico
Alteraciones Moleculares en la progresión del Cáncer
Normal Hi perplasia Displasia
In Situ Carcinoma
InvasorCarcinoma
- p53 - p53 - BRCA 1, 2 - BRCA 1, 2 +HER-2 +HER-2 +Cyclin-D +Cyclin-D +myc +myc
p53 BRCA1 BRCA2
Growth factor, hormone, ER deregulation?
Temas
• Genes, Genómica y Cáncer – Introducción
• Tecnologías que están revolucionado la Genómica en el tratamiento del Cáncer
Tecnologías de Biología Molecular• PCR en tiempo real
– Alta sensibilidad– Alta precision
• DxS kit (CE)• TIB MOLBIOL (CE)• COBAS (CE)
MELTING CURVESResults show GAT (G12D), GTT (G12V), AGT (G12S), and TGT (G12C) mutations at codon 12 of the K- ras
Curves represent GAT (G12D) and GTT (G12V) mutations at codon 12 of the K-ras gene.
Test usando sondas hidrolizables
Tecnologías de Secuenciación• Tecnología de secuenciación de Primera generación
• Secuenciación Sanger• Tecnología de secuenciación de Segunda generación
• Roche - 454• Illumina – GA II• SOLiD
• Tecnología de secuenciación de Tercera generación• Helicose• PacBio• Illumina = HiSeQ, MiSeq• Ion Torrent• Oxford Nanopore
Comparación de métodos
Sequencing TIB MOLBIOL
Taqman COBAS
Probe preparation identical identical identical identical
Tissue material requirement
low low medium low
Detection sensitivity(low level mutations
< 5-10%)+/- +++ +++ +++
Work flow complexity complex simple simple simple
Cost high low low high
Advantages of TIB MOLBIOL assay will allow future diagnostic application in tumor diseases with limited tumor tissue availability (e.g. lung tumors). Additionally, simple workflow requires less personnel, which will increase acceptance of diagnostic kit utilization.
Estrategias de la “Next Generation Sequencing” (NGS)
• Secuenciación de Genomas completos (WGS)– Mutaciones somaticas en tumores– Mutaciones de línea germinal y
polimorfismos• Secuenciación de exomas completos (WXS)• Secuenciación de blancos de alteraciones
accionables (ACGS)• Soporte Informático
El aparato personal genómico ha sido diseñado con propósitos de investigación, ofreciendo cargar un iPod mientras que analiza DNA. Tiene un puerto iPod en la parte superior…
La plataforma usa sensores semiconductores en paralelo para medir los iones hidrógeno producidos durante la replicación del DNA en tiempo real (pH…).
Es el primer aparato en usar este tipo de tecnología superconductora, mientras que continua el uso de fluidos integrados y micromaquinaria para traducir la información en nuestro DNA a información digital fácilmente medible.
Ion Torrent (LifeTechnologies) – lecturas de 100bp reads, barato, fácil
http://www.iontorrent.com/?s_kwcid=TC-12648-4977112303-p-652132722
Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing
First Generation Sequencing
Clinical therapeutics consultation
“Drugs for a patient, or patients for drugs.”
Manuel Hidalgo, MD
Clinical care or clinical trial
Investigación tradicional vs aplicaciones “High-throughput”
Royal Mail Stamp Issue 25 February 2003
The doctor’s perspective
"Here's my
sequence..."
The patient’s perspective
www.nanopharmacia.com