DiagnóStico Molecular De La InfeccióN Por Hpv

DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR HPVNUEVAS TECNOLOGIAS DETECCIÓN HPV

Juan José Terrádez RaroAnatomía PatológicaH. Arnau de Vilanova

BASES MOLECULARES DEL CANCERAPLICACIÓN A LA PATOLOGIA TUMORALHospital Luis AlcanyísXATIVA. Valencia

Situación de la detección precoz en EUROPASituación de la detección precoz en EUROPA1959 ( Ostfold County,Norway )1960 ( Región de Grampian. Scotland)1963 Programas de cribado organizado en países nórdicos: Finlandia, Islandia y Suecia No se introduce en Noruega Éxito del Programa Finlandés: Cribado a mujeres de 30-60 años Pauta: Cada 5 años. Suecia: Valoración de la eficacia del cribado basado en el análisis de lesiones preinvasivas.1965: Programa de cribado organizado en Paises Bajos (BENELUX) 1980: Programa de cribado organizado en una provincia de Dinamarca1980/ 1989: Programa de cribado organizado en InglaterraAustria, Alemania y Luxemburgo en año 2000. Tendencia ineficaz de sus cribados1990: “ European commission, “ Europe Aganist cancer”. Red Europea de cribado Grupo de Epidemiología de la Red E. de cribado CC. VARIABILIDAD entre los Pr. De Cribado: Organización/Aplicación Metodología de Cribado2008 España: Cribado oportunista Evaluación / Manejo clínico1993: European Commision´s Quality Assurance Guidelines for CC screening 1995-2005 Numerosos Estudios multicéntricos y Planes Pilotos con N.Tecnologías

Miller AB. The inefficiency of cervical screening in Europe. European J Cancer 2002;38:321-326A.Linos, E.Ariza. Introduction Cervical Cancer Screening. European J of Cancer 36 (2000) 2175-2176

Recomendación

Límites de edad(años)

Intervalo

(años)

% con detección selectiva regular

Mortalidad del cáncer de cuello

uterino/100.0004

Incidencia de cáncer de cuello

uterino/ 100.0004

Bélgica1 25-64 3 58 3,4 9,3

Dinamarca2 23-59 3 75 5,0 12,6

Inglaterra2 20-64 3 a 5 83 3,1 8,3

Finlandia2 30-60 5 93 1,8 4,3

Francia2 25-65 3 69 3,1 9,8

Alemania2 20-85 1 50 3,8 10,8

Italia2 25-64 3 53-74 2,2 8,1

Países Bajos2 30-60 5 77 2,3 7,3

España2, 3 20-64 3 a 5 49,6 2,2 7,6

Suecia2 23-60 3 83 3,1 8,2

*Grupo de edad 0->651- Van Ballegooijen y cols. Eur J. Cancer. 2000; 36: 2177-2188. 2- Anttila y cols. Brit. J. Cancer. 2004; 91: 935-941. 3- Luengo Matos y cols. Aten Primaria. 2004; 33(5):229-36. 4- Ferlay J y cols. GLOBOCAN 20023- Quinn et al. BMJ 1999; 318: 904-908

A pesar del cribado, el cáncer de cuello A pesar del cribado, el cáncer de cuello uterino sigue siendo demasiado frecuenteuterino sigue siendo demasiado frecuente

Segundo cáncer en frecuencia Segundo cáncer en frecuencia en mujeres jóvenes europeasen mujeres jóvenes europeas

UE, mujeres (edad 15–49)

Casos nuevos de cáncer cada año: 106,906Cuello uterino

Mama

Melanoma cutáneo

Ovario

Colon/Recto

Enfermedad de Hodgkin

Tiroides

SNC cerebro

Linfoma no hodgkiniano

Estómgao

Leucemia

Cuerpo uterino

Pulmón

Otros cánceres

1. Ferlay y cols., editores. Globocan 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, version 1.0 IARC Cancer-Base No.5. Lyon. IARC Press, 2001

Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000)Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000)

MUJERES (1)

(15 - 74 años) 15.640.00015.640.000

VPH + (2) 655.000655.000

ASCUS/LSIL (2) 497.000497.000

HSIL (3)

16.00016.000

Cáncerinvasor (1)

2.0002.000

(1) Estimación basada en Globocan 2000.(2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2-7%).(3) Estimación de un 0.1% de prevalencia de HSIL basado en (2)

Cerca de 1000 muertes/ año 2008

ESTUDIO AFRODITA 2007ESTUDIO AFRODITA 2007Informe sobre la situación de la Patología Cervical en España Informe sobre la situación de la Patología Cervical en España

Encuesta poblacional6852 mujeres (18-65)19 C. Autónomas

XVII Reunión AEPCDr. J. CastellseguéServ. EpidemiologiaI.C.O. 2006.

Análisis de cobertura en dif. Comunidades Autónomas (58%-85%)

51% no saben ¿HPV?38% conocen su existencia

25% no PAP en su vida

• Cribado oportunista poco eficiente / NO equitativo Ausencia de un cribado poblacional organizado

• Diferencias respecto de la frecuencia de realización de la toma

Sanjose S et al. Eur J Obstet Gynecol and Reprod Biol 2008, May 20Puig Tintoré LM; J Low Genit Tract Dis 2008; 12:82-9

Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España (1975-2004) (1975-2004) Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)

Hitos en el Screening del Cáncer Hitos en el Screening del Cáncer de Cérvixde Cérvix

ThinPrep® SurePath®

1996 19991949

LBC: Citología líquida

2003

Revisión de las pautas de screening

1990s LBC 2000sTest de Papanicolau

VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix1

1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )

PCR

1980

P16 CINTecCervatec p16 ELISA

L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1º basado en

DNA HPV

HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD

2008PREVENCION PRIMARIA

ESCENARIO POSTVACUNAL

Prevención SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008

Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV

Dürst et al. 1983

Filogenia

Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995)

31

1635

4518

39

116

33VP Humanos (mucosa genital)

Beta HPV

VP Animales

VP Humanos (cutaneos)

Alfa HPV

HPV Prevalence and Cervical Cancer HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by AgeIncidence by Age

15-19

20-24

25-29

30-34

35-39

40-44

45-49

50-54

55-59

60-65

Age (Years)

HP

V P

reva

len

ce (

%)

HPV (HC2)HPV (HC2)

CancerCancer

1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30

Can

cer

inci

den

ce p

er 1

00,0

00

Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV

• La infección por HPV-HR produce una lesión morfológíca con fuerte tendencia a la regresión y muy baja a la progresión ( Moscicki 2004; Castle 2005)

• La resolución de la infección confiere inmunidad.

• Una inf. posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación de una infección latente lo que podría explicar el aumento de prevalencia observado en mujeres mayores de 60 años ( Silvia de Sanjosé 2006)

• En el proceso de carcinogénesis los eventos moleculares no se correlacionan con las categorias morfológicas. ( Gran variabilidad interobservador del CIN II)

• La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo• contrario. (Cantor et al 2005)

• Pueden aparecer lesiones de alto grado en ausencia de LSIL. (Schiffman et al 2005)

• La carcinogenesis precisa de una infección persistente Inf. 7-15 a. CIN III 10 a. C. E. I. ( Bosch y Sanjose , 2003)

Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV

Sylvia MichelinaFernandes Brenna; Kari Juhani SyrjänenSao Paulo Med. J. vol.121 no.3 Sao Paulo 2003• Sobreexpresión de E5,E6 y E7

• Alteración en los oncogenes y genes supresores de la célula infectada: Alt. Genéticas: Pérdidas en 3p,6q,10p,11p,13q y 18q Ganancias en 3q,7q,8q,9q y 20q Alteraciones estructurales en 10,18 y 20. (Cottage et al 2001)

Oncogenes: Gen del EGFR, c-myc, neu/c-erB2, MDM2 y Ras Genes supresores: CDH1, DAPK,FHIT,HIC-1,p16,RAR-beta,RASSFIA,TIMP-2 TSLC1. Hipermetilación de genes supresores entre el 20-40% de CEI (Steeenbergen et al 2005)

• Activación de la telomerasa: subunidad catalítica hTERT. (Snijders et al 1998)

World Health Organization Classification World Health Organization Classification

http://screening.iarc.fr/atlashisto_detail.php?flag=1&lang=1&Id=hexocole&cat=B2

Nuestro problema: Lesión escamosa atípicaNuestro problema: Lesión escamosa atípica

Metaplasia transicionalMetaplasia transicional

METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico

no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV

Metaplasia papilar inmaduraMetaplasia papilar inmadura

ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos

Diagnóstico diferencial con SILDiagnóstico diferencial con SIL

EL PAPILOMAVIRUS

EL VIRUS: ORGANIZACIÓN GENÓMICA

• Consta de varios genes u “Open Reading Frames” (ORF) de dos tipos diferentes:

• Hasta 8 genes de expresión temprana o “early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en proteínas para la regulación y replicación viral

• 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2) que generan las proteínas para la unión de la cápside

• Una región URR ó LCR que controla la expresión de los genes tempranos E6 y E7

REGION EARLY: Funciones proteínas

E1 (Factor Replicación ADN

viral)

E2 (Regulador de la replicación ADN y

transcripción ARN)

Target: CRA-UBF (Upstream Binding Factor)

Domínio: 5H 216-255C

E7 (Ruptura ciclo celular). Rb / P16

E6 (Degradación p53)

Antiapoptotic / BAK

Activ. TELOMERASA

Mecanismos reguladores crecimiento

Membrane associated epitelial hiperplasia

Activation EGFR / Inhibition Vascular ATPase

Inhibition MHC-I and MHC-II

E5B

Patogenia del cáncer de Cérvix

1. Bosch FX, et al. Journal of Clinical Pathology, 2002,55: 244-265.

HPV infection

HPV infection

Persistent HPV infection

Persistent HPV infection

Cellular dysregulation

Cellular dysregulation

High-grade CIN

High-grade CIN

Invasive cancer

Invasive cancer

Immunologic factors

Immunologic factors Co-carcinogensCo-carcinogens

RESPUESTA INMUNE:

• Enmascaramiento antigénico

• MHC-II En células dendríticas POLIMORFISMOS VARIANTES APLOTÍPICAS

• TOll like Receptors

REGION LATE: Funciones proteínas

L1 Proteina mayor cápside 57 KDa

Virion formation

Interactua con L2

Interactua con receptores de la célula

L2 Proteina menor cápside de 43-53 KDa

Genome encapsidation / Membrana penetration / Entry / Traficking

72 capsómeros

Capsómero de L1

5 x L1

Partícula viral

Virus HPV

Proteina L1

VARIABILIDAD GENÉTICAY DETECCIÓN

• Los genes de expresión tardía “Late” presentan secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos de VPH.

gen L1 principal diana “consenso” de detección.• Los genes de expresión temprana “Early”

presentan secuencias muy variables por lo que se han utilizado para la detección específica del tipo. – genes E6 y E7.

Changes in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTIONChanges in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTION

Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )

Infección productiva HPVInfección productiva HPV

Changes in expression patterns that Changes in expression patterns that accompany progression to cervical cancer accompany progression to cervical cancer

Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez )Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez )

Decresing epitelial diferentationVirus producing Non productive

¿Cómo se transforma una ¿Cómo se transforma una infección HPVinfección HPV en en un carcinoma? Integración del ADN viral en un carcinoma? Integración del ADN viral en

el ADN huéspedel ADN huésped

Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

LCRE7

E6

E1L1

L2

E2

E4E5

Punto de rotura e integración

+

–

LCR E7E6 E1L1L2E2 E4 E5

ADN del VPH integradoAND huéspedADN huésped

E2

ADN episomal del VPH

La integración aumenta el riesgo de La integración aumenta el riesgo de cáncer - Icáncer - I

PA

p53E6

Después de laintegración

Episoma

Asociación de E6 con p53 y PA

Efecto

• Expresión del gen E6 controlada por E2

• La expresión de E6 deja de estar controlada

• Bloqueo de la actividad de p53

• Resistencia a la apoptosis

• Aumento de la inestabilidad cromosómica

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

Forma del VPH en la célula

E2F

pRBE7

Después de laintegración

Episoma

Libre

Forma del VPH en la célula Efecto

• Expresión del gen E7 controlada por E2

• La expresión de E7 deja de estar controlada

• Generación de múltiples cromosomas

• Inmortalización celular

• Oncogénesis

+

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

La integración aumenta el riesgo de cáncer - IILa integración aumenta el riesgo de cáncer - II

DETECCIÓN DEL HPVDETECCIÓN DEL HPV

1.El HPV no puede cultivarse in vitro.

2.No hay tests serológicos lo suficientemente sensibles y seguros para la detección de la presencia del HPV.

3.Los tests utilizados en la actualidad se basan en la detección de ácidos nucleicos del virus ( DNA, RNA).

Proposed new screening algorithmProposed new screening algorithmWomen aged 25-64 y

HPV Test

Normal 5 year recall

CYTOLOGY

HPV test and Cytology at 6-12 months

Colposcopy

Normal 5 Year Recall

Cyto NegHPV Neg

Colposcopy

NegativePositive

=/> Mild

Normal or Borderline

Cyto=/> Mild

HPV and Cytology at 6-12 months

HPV+ and Cyto >mildHPV – and Cyto

Borderline

EUROGIN November 2008

Métodos de detección del HPVMétodos de detección del HPV y uso clínicoy uso clínico

1. Citología Papanicolau / citología líquida Automatización de la lectura.

2. Colposcopia / Microcolposcopia Colposcopia computarizada

3. Métodos moleculares basados en la detección de ADN / RNA viral

4. Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA / Cit/ Tej.

5. Métodos SEROLOGICOS de detección de Ac. contra HPV

Pendiente de estandarizar.

Tecnologías patentadas.

Requieren experienciay dotación costosadel laboratorio.

Tecnología flexible (carga viral y genotipo).

Sensibilidad muy alta.

Análisis múltiple.

Amplificación de la diana

Tecnologías patentadas y costes elevados.

Genotipado en grupos.

Comercializaday estandarizada.

Semicuantitativa.

Señal amplificada

Baja sensibilidad, laborioso, y el SB no puede utilizar tejido con ADN degradado.

SB es el estándar y el FISH permite ver el VPH asociado con la lesión histológica.

Sonda directa

InconvenientesVentajasMétodo

Carácterísticas de las técnicas de Carácterísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicosdetección de ácidos nucleicos

Carácterísticas de las técnicas de Carácterísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicosdetección de ácidos nucleicos

Principios usados en las técnicas mas Principios usados en las técnicas mas comunes de detección del HPVcomunes de detección del HPV

1- Hibridación in situ (ISH): (Sonda directa) Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. ( Comercial)

2- Hibridación seguida de “amplificación de la señal”

Hybrid Capture 2 (HC2 R ,Qiagen): RNA probe Coktail. (Comercial).

Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test. ( Comercial).

3- PCR de amplio espectro: “Amplificación de DNA con primers

consenso” o formato múltiplex ( Disponibles comercialmente)

Real time HR-HPV ( Aboot)

AMPLICOR R ( Roche)

4- PCR tipo específicas: Linear Array / Secuenciación

1- Hibridación in situ sobre tejido: 1- Hibridación in situ sobre tejido: sondas HPV HR Poca sensibilidad sondas HPV HR Poca sensibilidad

• Hibridación ADN/ARN.

• Cóctel de sondas:

- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.

• Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/mL).

• Aprobado por la FDA.

• Posibilidad de semicuantificar.

• Estandarizada y automatizable.

• Detecta de forma cruzada otros genotipos.

(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

2- Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)


• LIMITACIONES:• Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral• La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias• No distingue los diferentes tipos virales• No detecta infecciones múltiples• Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y

ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo



Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)

• DESNATURALIZACIÓN

• HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE

ALTO Y BAJO RIESGO

• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE

ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN

• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-

ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA

ALCALINA

• DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE

• Es la técnica molecular más sensible y flexible.

• Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional.

• La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos).

• Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales.

E6E7 E1

E2 E5

E4L2

L1

1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb

CGTCCMARRGGAWACTGATC

GCMCAGGGWCATAAYAATGG

primers 450 bpMY09/11 PGMY

GP5+/6+ 150 bp

65 bpSPF10165 bpAMPLICOR ROCHE ®

3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR

GPMY09/11

Description of main primer sets Description of main primer sets used in PCR amplification 1used in PCR amplification 1

Description of main primer sets Description of main primer sets used in PCR amplification 2used in PCR amplification 2

• El genotipado es importante en tres situaciones:- El potencial oncogénico y el riesgo de progresión a CIN III difieren de forma importante según el genotipo.

- Es necesario monitorizar la eficacia de las vacunas multivalentes.

- Estudios epidemiológicos.

• La incidencia acumulativa de CIN III en pacientes seguidas durante diez años e infectadas con VPH-16 y 18 es muy superior (17,2/13,6) a la de las infectadas por otros tipos oncogénicos (3%) o sin detección de VPH (0,8%). Estos datos se refuerzan en mujeres con más de 30 años.

VPH-16VPH-18

(Schiffman et al. Virology 2005; 337: 76-84. Khan et al. JNCI 2005; 97: 1072-9.

Castle et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3915-7)

Genotipado del VPH ¿aporta información útil?Genotipado del VPH ¿aporta información útil?

Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray

PCR en tiempo real

Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH

PCR

Primersde consenso

GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11

primers específicos

LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL)

• Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1 (primers SPF).

• Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples.

LINE-BLOTTING (PGMY-LB)

• Amplifica la región L1 con mezclas de primers (PGMY09/PGMY11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados.

• El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa.

(Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17.Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7.

Kornegay et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6.Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.)0,79Valor kappa

8,2Discordancia

11,2Compatibilidad

80,6Concordancia

LIPA Vs. LINE-BLOTTING

Hibridación reversaHibridación reversaHibridación reversaHibridación reversa


PCR en tiempo real


PCR

Primersde consenso



• Método que permite combinar la

sensibilidad de la PCR con el

poder discriminatorio de las

endonucleasas de restricción.

• Es un sistema poco laborioso

y menos costoso que LIPA

y secuenciación.

• Resulta difícil detectar

infecciones mixtas.Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85.

Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70.

RFLP (patrón de restricción con RFLP (patrón de restricción con endonucleasas)endonucleasas)

RFLP (patrón de restricción con RFLP (patrón de restricción con endonucleasas)endonucleasas)


PCR en tiempo real


PCR

Primersde consenso



• Tras una PCR de la región L1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray.

• Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción.

• Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado.

• Hibridación y lectura.

(An et al. Cancer 2003; 97: 1672-80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272-80.

Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025-31.)

Hibridación con microarraysHibridación con microarraysHibridación con microarraysHibridación con microarrays


PCR en tiempo real


PCR

Primersde consenso



1980 1990 2000

TESTS PARALA DETECCIÓNDE ADN-VPH

SOUTHERN

FISH

HC I HC II HC IIITS.PCR; L1.PCR GP.PCR

realtime-PCR

SENSIBILIDAD- +

ADN-VPH EN CÁNCER

CERVICAL30%-60% 75% 95% 99%

Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix

Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix

(Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.)

- +

SENSIBILIDAD

Hibridación in situ

Southern blot

HC II PCRreal time

PCR

Sonda directa

Señal amplificada

Amplificación de la diana

Hibridación Hibridación In situIn situ (ISH) (ISH)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)

Tests VPH hoy… VPH-ADNTests VPH hoy… VPH-ADN

• Valor predictivo negativo– Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría

de mujeres que están infectadas no lo desarrollan– Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer

• El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5 años) • Sólo detectan infecciones muy prevalentes, de las cuales 70% de las

infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin ningún tipo de tratamiento)

• Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de mujeres con el virus.)

Por tanto, estos tests presentan limitaciones que las tecnología basada en la determinación de proteínas virales pretende resolver

• No se correlaciona bien con el nivel

de lesión histológica.

• Hay que distinguir la alta carga

vírica previa al aclaramiento del

virus y la que es consecuencia de

la persistencia del virus.

• Únicamente se ha demostrado que

tiene valor en las infecciones

simples por HPV 16.

Gravitt et al., Int J Cancer, 2007,121,2787.Briolat et al., Int J Cancer, 2007,121,2198.

Determinación de la carga víricaDeterminación de la carga víricaDeterminación de la carga víricaDeterminación de la carga vírica

Carga viral total / Carga viral relativaCarga viral total / Carga viral relativa1- Celularidad de la toma 2- Distribución superficial de la lesión3- Tasa de infección por célula 4- Conservación de la muestra ( DNA, Inhibidores)

CVR= CVT : nº cel.


PCR en tiempo real


PCR

Primersde consenso



La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION valor en la predicción de Progresiónvalor en la predicción de Progresión

PCR a tiempo real: • Asigna valores cuantitativos reales a los amplificados• Usa sondas específicas marcadas con fluorocromos (Taqman, Scorpions)• Se mide la excitación lumínica ciclo a ciclo ( Laser + Cámara CCD)• Análisis de regresión de las variaciones de niveles lumínicos con elaboración de línea gráfica donde extrapolar los valores iniciales cuantitativos para cada gen estudiado.Carga viral:• Permite la comparación de las cantidades de un determinado gen viral con un gen celular constitutivo.• Permite determinación de CV Total• Determinación de CV Relativa: CVR = CVT : nº de cel. ( Gen Constitutivo)Estado de integración: Análisis de la proporción de E6-7 con el gen susceptiblede pérdida de E2•,Episomal: E6-7 = E2• Integración total: E2 = 0• Formas episomales e integradas: E6-7> E2

• La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E6 y E7

• Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad

incrementada (HPV-CARD)

• El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de

visualización

chimnich et al., Cancer Cytopath,2007,111,330.

Integración del ADN vírico en el Integración del ADN vírico en el cromosoma celularcromosoma celular

Integración del ADN vírico en el Integración del ADN vírico en el cromosoma celularcromosoma celular

Tests de detección de RNATests de detección de RNA

Métodos de amplificación de RNA isotérmicosMétodos de amplificación de RNA isotérmicos

PreTec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA GenProbe: 13 Genotipos HR-HPV.

Detección mRNA sin destrucción celular:Detección mRNA sin destrucción celular:ONCOTECONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo

• La expresión de E6 y E7 puede medirse por sus niveles de ARNm.

• Es un marcador indirecto de integración vírica.

(Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.)

• Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado.

• Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH.

Detección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPH

• Amplificación de diana ARN (NASBA)

• Utiliza sondas específicas (molecular beacons)

• Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45

• Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p16INK) pero no con la carga vírica.

Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204.

Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705

Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- ProoferPreTect HPV- ProoferDetección de ARNm de E6/E7 del VPH: Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- ProoferPreTect HPV- Proofer

• Técnica de FISH

• Directamente de citología

líquida.

• Se realiza en menos de 3 horas

• Lectura en citómetro de flujo

• En muestras de LSIL:

- Sensibilidad 83.3%

- Especificidad 91.3%Narimatsu y Patterson, Am J Clin Pathol,2005,123,716.

101 102 103 104

Probe 1- FITC -->10

20

30

40

50

60

Nu

mb

er

101 102 103 104

Probe 1- FITC -->10

20

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50

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Nu

mb

er

Detección de ARNm de E6/E7 del Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV OncotectVPH: HPV Oncotect

Detección de ARNm de E6/E7 del Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV OncotectVPH: HPV Oncotect

XVIII Congreso Nacional de la SEC. XVI Reunión de la SPC. XIII Reunión Iberoamericana de citología. Mayo del 2008.

CÉLULAS exocervicales con secuencia diana

Etiqueta anticuerpos

CITÓMETRO DE FLUJO

101 102 103 104

Probe 1- FITC -->

10

20

30

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50

60

Nu

mb

er

HPV E6, E7 ARNm+ Cels (%)

HPV E6, E7 ARNm - Cels

FIJAR/PERMEABILIZAR(R1, R2, R3)

+ CALOR/LAVADO (R6/R7)

OLIGONUCLEÓTIDOSmarcados con fluorocromo (R5)

ARNm E6/E7

Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm

ATTAGAAT

Método HPV OncoTectMétodo HPV OncoTect

R1

R2

R8R11

PMNsCélulas

endocervicalesCélulas

exocervicales

Debris

Distribución de poblaciones celularesDistribución de poblaciones celulares

según expresión de E6/E7según expresión de E6/E7

Narimatsu R, Patterson BK. High-throughput cervical cancer screening using intracellular human papillomavirus E6 and E7 mRNA quantification by flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2005 May;123(5):716-23.

Sobrexpresión E6/E7 presente

(doble pico)

No expresión E6/E7detectada

Hibridación In situ (ISH)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Quiagen)

VPH negativoLa mujer no se

encuentra infectada por VPH.

Es muy difícil que se desarrollen lesiones

severas o cáncer

Alto Valor predictivo negativo (VPN)(cribado 3 a 5 años)

VPH positivo

La mujer esta infectada por VPH

NO significa que desarrollará cáncer, la

mayoría de mujeres que están infectadas no lo

desarrollan

Bajo Valor predictivo positivo (VPP)

Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años

Test VPH - ADN significación diagnósticaTest VPH - ADN significación diagnóstica

Test VPH -ARNm significación Test VPH -ARNm significación diagnósticadiagnóstica

HPV OncoTect

HPV OncoTect negativo

No hay expresión de oncoproteínas

Aunque el virus este presente no hay actividad

oncogénica

Alto Valor predictivo negativo (VPN)

HPV OncoTect positivo

Presencia de oncoproteínas en el

exocervix.

Existe actividad celular anormal, integración viral

y alta probabilidad de progresión.

Alto Valor predictivo positivo (VPP)

Alta correlación con progresión

Utilidad clínica mRNA HPV-HRUtilidad clínica mRNA HPV-HR • VPH ARNm E6/E7 como marcador clínico para la detección precoz del cáncer

de cérvix1:detección de VPH mRNA E6/E7 indica la actividad oncogénica del VPH y no sólo la

presencia de una infección frecuente (tests de VPH ADN)

Es el indicador clínico más relevante para el desarrollo del cáncer de cérvix, y puede ser usado como un marcador clínico predictivo para identificar aquellas mujeres con riesgo alto de desarrollar lesiones displásicas de alto grado y cáncer

Debido a la integración del VPH y la fragmentación del ADN, en muchos casos los tests basados en detección de ADN darán resultado negativo 2: 4-25% casos

• Sería un método de cribado ideal³ aquel que incidiera en la detección de la transcripción activa de oncogenes VPH-AR o de las proteínas resultantes de su expresión

(1) HPV HandBook: "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", edited by Professor Walter Prendiville and Dr Philip Davies, supports detection of oncogenic activity (page 75 and 76):(2) Sankaranaryanan et al., Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India. International Journal of Cancer 112: 341-347, 2004(3) Documento de consenso SEGO: “La infección por papilomavirus”.

Métodos basados en la detección de Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido vaginal vaginal P16 en citología / Tejido parafinadoP16 en citología / Tejido parafinado

Diseño general del Estudio CERVATEC:

• Estudio prospectivo, comparativo multicéntrico y multinacional Se inicia como proyecto piloto en 2007

• Duración de la participación: Alta de la primera paciente: Enero 2007 Baja de la última paciente: Mayo de 2007 Cierre de la Base de Datos: Junio 2007• Numero de pacientes: 12000 pacientes en España, Italia y Francia• Se realiza paralelamente un estudio en Alemania ( 12000 )

• Población a Estudio: Criterios de inclusión y de exclusión• Condiciones del muestreo y seguimiento de la paciente• Se establecen medidas de control de calidad• Se documentan y definen las bases científicas del estudio• Con los resultados se realizará análisis estadístico

Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002

Cervatec TM p16INK4a ELISA

• Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente.

• El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas).• Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p16.

• El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.

Tecnología aplicada en el Estudio CERVATECTecnología aplicada en el Estudio CERVATEC

Objetivo principalObjetivo principal

• Identificación de mujeres que sufren HSIL en Cuello Uterino

• Demostrar que CERVATEC p16 junto con el test de Pap mejora la sensibilidad para identificar mujeres con HSIL ( CINII-CIN III )

Objetivos secundarios:

• Comprobar el valor límite predefinido ( Punto de cohorte a partir del cual la prueba se considera positiva.

• Comparar la sensibilidad de la detección de lesiones CIN II y CIN III con CERVATEC versus citología convencional.

• Comparar la idoneidad del test para identificar de forma correcta a las mujeres sin HSIL frente a la citología convencional

Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002

Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:

• Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 años

• Especificidad del (92%)

• La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV

Satellite Symposium. EUROGIN 2007

Determinación de p16:Determinación de p16:

Citologías y Biopsias:• Aumenta la concordancia inter-observador• Aumenta la sensibilidad y especificidad de los resultadosrespecto de HC-II para detectar lesiones de alto grado (HSIL).

Fluido vaginal: Cervatec p16 ELISA Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 añosEspecificidad del (92%)La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV

Expresión de P16Expresión de P16Expresión de P16Expresión de P16

Infección HPV

Infección HPV

Infección HPV

Persistente

Infección HPV

Persistente

DesregulaciónCelular

DesregulaciónCelular

CINAlto

grado

CINAlto

grado

Cancer InvasivoCancer

Invasivo

HPV test (HC2 o PCR)

Nuevo biomarcador (p16INK4a )

Pap test

Individuos en riesgo Pacientes con Enfermedad

Utilidad del estudio Utilidad del estudio de patrones de expresión de p16de patrones de expresión de p16

Criteria for assessment of p16 INK4 aCriteria for assessment of p16 INK4 a POSITIVE CELLSPOSITIVE CELLS• Nuclear size and nuclear-cytoplasmic ratio: nucleus significantly enlarged >50%• Hipercromasia and nuclear texture: coarse and inhomogeneous cromatin• Nuclear shape and membrana structure: Irreg. of the nuclear shape/or border.

• Anisonucleosis

Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

SCORE 1

SCORE 2

p16 INK4 Inmunocytochemistryp16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytologyon liquid-based cytology


SCORE 3

SCORE 4

p16 INK4 Inmunocytochemistry p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytologyon liquid-based cytology


Muchas Gracias

DiagnóStico Molecular De La InfeccióN Por Hpv

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