TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA HPV E ITS EN ADOLESCENTES

Programa de Microbiología- ICBM

Facultad de Medicina-Universidad de

Chile

María A. Martínez Tagle MSc, Ph.D

Declaración de Conflictos de Interés

Declaro no tener conflicto de

interés.

Mayor sensibilidad

No requieren viabilidad de los microorganismos

Eficientes con muestras No invasivas

Requieren menos tiempo para entrega de resultados

De elección en el diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis de muestras urogenitales y No genitales en adolescentes y adultos

Mayor eficiencia que las técnicas convencionales para el diagnóstico de T. vaginalis, Virus Herpes simplex y HPV

Ventajas de las técnicas de Biología molecular

en la detección y diagnóstico de ITS

Pruebas que han superado las TAAN comerciales en su desarrollo

Ausencia de reacciones falsas negativas, por mutaciones en los blancos de amplificación

Ausencia de reactividad cruzada Estándar de referencia de validación Sensible y

Específico Elevado VPP Elevado VPN No existen TAAN perfectas No todos las TAAN son iguales

Distintas plataformas, blancos de amplificación, partidores distintos flujogramas y poblaciones empleadas en la validación

Limitaciones de las TAAN

Mayor costo que es difícil de asumir por los países en desarrollo

Buen “costo-beneficio” si pensamos en complicaciones y secuelas que se evitan

Exigencias para la acreditación

Diseño de laboratorios

Personal competente

Organismo acreditador

Acceso expedito de los Laboratorios a:

Insumos

Mantención de equipos

Recomendaciones de “Screening” de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en EUA

MMWR 2014; 63:2

# US Preventive Services Task Force, 2013

ITS USPSTF # CDC AAFP ACOG

C. trachomatis < 25 años Con riesgo

< 25 años Con riesgo

< 25 años Con riesgo

< 25 años Con riesgo

N.gonorrhoeae < 25 años Con riesgo

No Con riesgo

< 25 años Con riesgo

Adolescentes Con riesgo

Diagnóstico de laboratorio de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. CDC-Abril 2014

Las TAAN son las técnicas recomendadas para “screening” ó diagnóstico de C. trachomatis y N gonorrhoeae en muestras urogenitales

Indicaciones sobre las muestras urogenitales: Obtenidas por el paciente (Screening) ó por el personal médico si se requiere examen clínico Hombres: Orina de 1er chorro ó secreción uretral son equivalentes Mujeres: Muestras vaginales ó endocervicales ú orina de 1er chorro. La orina es 10% menos sensible que las muestras vaginales ó cervicales Indicaciones sobre las técnicas No se requiere confirmar los resultados positivos, porque tienen: Especificidades >99% y VPP>90%

MMWR 2014; 63:2

Comparación muestras clínicas para el diagnóstico de C. trachomatis

Muestras clínicas : -vaginales tomadas por la paciente - endocervicales tomadas posteriormente por el médico durante el examen clínico Población: 3.793 mujeres ≥16 años (Centro de Salud Sexual, UK) Laboratorio: TAAN Aptima AC2, confirmado

Prevalencia de infección 10,3%

BMJ 2012; 345:e8013

Las TAAN son las técnicas de elección para “screening” ó diagnóstico de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en muestras rectales y orofaríngeas

La sensibilidad de las técnicas clásicas es muy baja en muestras extragenitales

Los TAAN comerciales aún no han sido aprobados para el estudio de muestras No urogenitales

En EUA los laboratorios deben seguir las indicaciones de “Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA)” (Este Instituto es de la FDA y otorga certificación)

MMWR 2014; 63:2

Qué se recomienda para el análisis de muestras rectales y orofaríngeas?

TAANs comerciales aprobadas por FDA para diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis

Varias plataformas de TAAN aprobadas por la FDA

Desarrolladas por 5 firmas comerciales

La mayoría corresponden a técnicas de 2ª generación

Algunas son útiles para laboratorios pequeños y otras son plataformas robotizadas para uso en laboratorios de gran complejidad

Abbott RealTime m 2000 Reacción en cadena de la

polimerasa Roche , Amplicor y COBAS Reacción en cadena de la

polimerasa Hologic/ Gen-Probe , Aptima (Amplificación mediada por

transcripción (TMA) BD ProbeTec Amplificación por

desplazamiento de hebra (SDA) Cepheid, Xpert assay Amplificación isotérmica

BD Viper™ System

Totalmente automatizado

Incluye sistema de extracción de ADN

Eficiencia

Hasta 736 resultados por 8,5 h

Demora 20 min por corrida

Flexibilidad

Puede analizar hasta 5 ITS simultáneamente

Tecnología “Point of care”(POC)

Ventajas particulares

Para laboratorios de baja ó mediana complejidad

Equipamiento mínimo

Resultados en 60-90 min

Xpert® CT/NG, Cepheid 90 minute detection and

differentiation of Chlamydia trachomatis and Neisseria

gonorrhoeae

Sensibilidad analítica 10 genomas

Muy flexible

J Clin Microbiol 2013; 51: 1666-72

Estándar de comparación: APTIMA Combo 2 (AC2) y

ProbeTec ET

Eficiencia de Xpert para la detección de C. trachomatis

y N. gonorrhoeae en distintas muestras clínicas

Técnica Sens (%) P

Cultivo 81 <0.001

Vaginal 99

Endocervical 96

Sintomáticas

Cultivo 84 0.004

Vaginal 100

Endocervical 100

Asintomáticas

Cultivo 78 0.008

Vaginal 98

Endocervical 90

Diagnóstico de N. gonorrhoeae:

Comparación de técnicas y muestras clínicas

BMJ 2012; 345:e 8107

Cultivo: Médico: Muestra

uretral y endocervical

TAAN (Aptima AC2):

Paciente: vaginal Médico:

Endocervical

Población: 3859 mujeres ≥16

años (Clínica GU de UK)

Prevalencia gonorrea: 2.5%

Consideraciones adicionales para el diagnóstico de N. gonorrhoeae

Mantener el uso del cultivo para vigilancia epidemiológica y susceptibilidad antimicrobiana

Frente a sospecha de falla terapéutica debe efectuarse diagnóstico por cultivo y efectuar estudio de susceptibilidad

Los resultados positivos de las muestras faríngeas deben confirmarse con otro DNA blanco, por la posibilidad de reacción cruzada con Neisseria spp.

Las técnicas comerciales actuales suelen traer 2-3 blancos de amplificación distintos

Trichomonas vaginalis

Agente de transmisión sexual no viral de mayor prevalencia mundial (180 millones casos nuevos/ año) Diferencias por acceso a salud, raza, nivel socioeconómico

En Chile la literatura informa prevalencias en adolescentes sexualmente activas entre 2,2 y 5,7%

No es una ITS reportable en la mayoría de los países

Factor reconocido de riesgo de:

Transmisión de VIH y otras ITS

Parto prematuro

EIP

Parasitol.dia 1999; 23: 9-14

Rev Chil Obstet Ginecol 2003; 68:499-502

Comparación de técnicas para el diagnóstico de T. vaginalis

Clin Infect Dis 2002;35:576-80.

N=337 mujeres

Las TAAN de 1ª generación no lograban superar esta sensibilidad

Diagnóstico molecular de T. vaginalis

Protocolo: Aptima T. vaginalis (TMA). SR: Ex al fresco y cultivo. Discordancias: Alt TMA

Diseño: Estudio prospectivo multicéntrico USA

Población: 933 mujeres ≥14 años con y sin síntomas urogenitales

Prevalencia de infección: 7%

Muestras clínicas Sens.(%) Esp.(%)

Vaginal 100 99

Endocervical 100 99,4

Thin Prep (PAP) 100 99,6

Orina 95,2 98,9 J Clin Microbiol; 2011; 49: 4106-11

Virus Herpes simplex

Técnicas de diagnóstico

Cultivo (Shell vial/tubo)

Técnica de referencia Tinción con AcMo tipo específicos 70-99% sensibilidad, 99% especificidad

Examen citológico Sensibilidad y especificidad <60%

PCR Distingue ambos tipos de virus Mayor sensibilidad

POC para diagnóstico de VHS IsoAmp® HSV assay

Aprobado por la FDA en 2011

Amplificación isotérmica

Sensibilidad analítica:

VHS-1: 5,5 genomas

VHS-2: 34,1 genomas

Tiempo: 60 min

Expert Rev Mol Diagn. 2012;12(5):437-443

Técnicas de diagnóstico de la infección por VPH

Citología (PAP)

Colposcopía

Moleculares

TAAN Hibridación

Técnicas moleculares para VPH aprobadas por FDA

Detección Genotipificación

• En base a PCR

• Son más sensibles y específicas

• Permiten la detección de infecciones latentes subclínicas y

activas

• Determinar los genotipos virales

AMPLICOR® HPV Test (ROCHE)

Aprobado para:

Screening primario de cáncer cervical

Resultados indeterminados del PAP (ASCUS)

Amplificación del DNA mediante PCR Desnaturalización

Hibridación de ácidos nucleicos para detectar: 13 hrVPH

Sensibilidad: 96,1%

Especificidad: 95,6%

VPN: 99,8%-100%

Ausencia de reactividad cruzada

Buena reproducibilidad

Genotipificación de VPH Linear Array VPH Genotyping Test

Etapas procedimiento

Amplificación del ADN

Hibridación de los amplicones con sondas biotiniladas

Detección mediante ELISA

Tipos de Virus que Detecta

• Sensibilidad: 96% •Especificidad: 99% •Sin reactividad cruzada

• Buena reproducibilidad

• Precisión: 95-100%

Detección de ARNm de E6/E7 de VPH

• La expresión de mARN de los oncogenes E6 y E7 de VPH indica actividad viral

• Se observa que le progresión de las lesiones aumentan en relación directa con los niveles de mRNA de E6 y E7

Importancia de una prueba

mRNA E6/E7 de HPV

Prueba negativa

No hay actividad oncogénica

Alto VPN

Prueba positiva

Hay multiplicación viral

El monitoreo de los niveles de mRNA permite seguir la progresión de la enfermedad con alto VPP

Alto nivel de expresión de E6/E7

Existe actividad celular anormal

Integración viral

Utilidad de las técnicas moleculares para la detección del VPH

La principal utilidad es la detección temprana de lesiones de alto riesgo NIC II/III y recurrencia post-tratamiento no identificadas por citología

Screening de cáncer cervical primario

Screening de cáncer cervical primario simultáneo con PAP

Especiar los intervalos del “screening” para las mujeres que no presenten infección por hrVPH

Seguimiento de mujeres con citologías ASCUS

Seguimiento post tratamiento de NIC II/III

Adolescentes con LSIL (lesión intraepitelial escamosa de bajo grado)

Las adolescentes presentan alta frecuencia de anormalidades citológicas de bajo grado (ASC-US/LSIL)

La prevalencia de VPH en <21 años con citología ASC-US varía entre el 70 -77%

Hay regresión espontánea en 91% de los casos a los 36 meses

Muy pocas desarrollan cáncer cervical

No está indicada la detección de VPH en adolescentes con ASC-US/LSIL para evitar colposcopias ó tratamientos innecesarios

http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/screening/cervical/HealthProfessional

Am J Obstet Gynecol 2007; 197: 346-55

J Natl Cancer Inst 2002; 94: 102-7

¡Gracias¡