Diagnóstico genético burgos

PCR

Blotting por vacío

Hibridación con sonda marcadaVisualización

Análisis de mutaciones por DGGE

Exón 10

Exón 19

Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC

Análisis por DGGE de mutaciones en el exón 11 del gen CFTR

© MJ Alonso

G542X

G551D S549X 1717-

1G→A


SSCP (polimorfismos conformacionales de cadena única)

ASP (allele specific PCR)

ACTGA

Bases 575859606162

R

Laboratorio Pediatría IBGM

Secuenciación

Inestabilidad somática

Anticipación

Diagnóstico


Laboratorio Pediatría IBGMLaboratorio Pediatría IBGM/CSIC


D d

mM

M

D

25%

m

D

25%

M

d

25%

m

d

25%


d

m

D

M

RecombinantesNo recombinantes

DM

50%

D

M

d

m

d

m

D

M

D dM m

dm

50%


GENGCACTGAATTCCCTGA

CGTGACTTAAGGGACT

EcoRI

GEN

GCACTGCATTCCCTGA

CGTGACGTAAGGGACT

1,2Kb

0,4Kb 0,8Kb

1/11/22/2

DNADNA DigestiónDigestión

ElectroforesisElectroforesis

BlotBlot

ReveladoRevelado


GEN

GEN


POLIMORFISMOS DE RESTRICCIÓN (RFLP)

Laboratorio Pediatría IBGM/ CSIC

PCR

2/2 1/1 1/2

Visualización

Electroforesis

Digestión

CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA


MICROSATÉLITES (VNTR)

CA CA CA CA CA CA CA CACA CA CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CACA CA CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CACA CA CA CA CA

CA CA CA CA CACA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA

11122

3 3

4 44



RFLP NcoI (intrón 1) TNF-β

Composición de los cromosomas en metafase

• Patrón de bandas• Bandas G/Q

• Bandas R

• Características• ADN rico en AT (55-60%)• Replicación tardía en fase S• Contiene pocos genes (la mayor

parte específicos de tejido)• Abundantes miembros L1

• ADN rico en GC (50-60%)• Replicación precoz en fase S• Contiene la mayoría de los

genes• Rico en secuencias Alu• Abundantes islas CpG

BANDAS C

Cuantificación de cromosomas mediante FISH rápido prenatal en interfase

•Las trisomías del 13, 18, 21 y la monosomía del X son las

aneuploidías más frecuentes relacionadas con la edad materna

y las anomalías fetales

•El cariotipado prenatal precisa de 8 a 14 días para llevarse a

cabo

•El FISH prenatal un screening rápido de aneuploidías en

células de líquido amniótico no cultivadas en 2-3 días

Indicaciones clínicas diagnóstico rápido prenatal mediante FISH

•Sospecha de anomalía cromosómica y/o embarazo avanzado

(20 semanas)

•Estudio ecográfico sugerente de aneuploidía

•Edad materna avanzada

•Indicación bioquímica de aneuploidía fetal

50kb

Sd. Williams-Beuren (Cr 7)

Transtornos monogénicos para los que existe detección selectiva

familiar y diagnóstico prenatal mediante estudio del ADN

•Neurofibromatosis Ligamto./mutación directa

•Distrofia miotónica Mutación directa

•A. Falciforme Mutación directa

•X frágil Mutación directa

•Hemofilia A Ligamto./mutación directa

•E. De Huntington Mutación directa

•D. M. Duchenne Ligamto./mutación directa

•Cáncer de mama familiar Rastreo/ ligamiento

•Hemocromatosis Mutación directa

•Fibrosis quística Ligamto./mutación directa

INDICACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO PRENATAL MEDIANTE

AMNIOCENTESIS

•EDAD MATERNA>35 AÑOS

•UN HIJO ANTERIOR CON ANOMALÍA CROMOSÓMICA

•Hª DE ANOMALÍA CROMOSÓMICA EN UNO DE LOS PADRES

•Hª FAMILIAR DE DEFECTO GENÉTICO DIAGNOSTICABLE MEDIANTE

ANÁLISIS BIOQUÍMICO O DEL DNA

•RIESGO DE D.T.N.

ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO DIAGNOSTICABLES

MEDIANTE AMNIOCENTESIS Y/O C.V.S

Aminoácidos•Orina de jarabe de arce•Acidemia metilmalónica

Hidratos de Carbono•Glucogenosis tipo 2•Galactosemia

Ezs. lisosómicas•Gangliosidosis•Mucopolisacaridosis•Enf. de Tay-Sachs

Met. De las purinas•Lesh Nyham

Met. Peroxisómico•Enf. de Zellweger

• Uso de técnicas moleculares o citogenéticas durante la Uso de técnicas moleculares o citogenéticas durante la fertilización in vitro (FIV) con el fin de seleccionar fertilización in vitro (FIV) con el fin de seleccionar embriones libres de una determinada característica embriones libres de una determinada característica genética antes de ser transferidos al útero. genética antes de ser transferidos al útero.

• Esta tecnología se desarrolló con el objeto de ofrecer Esta tecnología se desarrolló con el objeto de ofrecer una opción a las parejas con un riesgo significativo de una opción a las parejas con un riesgo significativo de una enfermedad genética severa, pero que se oponen al una enfermedad genética severa, pero que se oponen al aborto. aborto.

• El diagnóstico genético preimplantacioal se realiza a El diagnóstico genético preimplantacioal se realiza a partir de una sola célula de una blastómera de 6-10 partir de una sola célula de una blastómera de 6-10 células tras la FIV.células tras la FIV.

Diagnóstico genético preimplantacional

Reproducción asistidaFecundación in vitro

Cultivo embrionario in vitro


Día +1 Día +2 Día +3

Biopsias embrionariasMicromanipulación


Biopsias embrionariasAbertura parcial de la zona pelúcida


Disolución química/mecánica Láser

Biopsias embrionariasExtracción de blastómeros


•Células íntegras

•Células con núcleo

•Una/dos células

Margen de tiempo: 3 días post-inseminaciónMargen de tiempo: 3 días post-inseminación

Las células se analizan por FISH para las anomalías Las células se analizan por FISH para las anomalías cromosómicas o PCR para análisis mutacional. cromosómicas o PCR para análisis mutacional.

Los embriones seleccionados pueden implantarse al final Los embriones seleccionados pueden implantarse al final del día.del día.


• Ventajas:Ventajas:– Diagnóstico muy precozDiagnóstico muy precoz– Sólo se transfieren embriones no afectos (o Sólo se transfieren embriones no afectos (o

portadores)portadores)

• Desventajas:Desventajas:– El coste es muy elevado. El coste es muy elevado. – Baja tasa de éxito en la implantaciónBaja tasa de éxito en la implantación– Se descartan embriones afectados o no Se descartan embriones afectados o no

utilizados. Lo que puede plantear dilemas éticos.utilizados. Lo que puede plantear dilemas éticos.


aa Aa AA

Bajo Alto

Bajo Alto

aaBbAabb

AABBAaBBAABb

aaBBAaBbAAbb

aabb

Bajo Alto

Bajo Alto

♀

♂

Bajo Alto

Riesgo de recurrencia (%) en la estenosis pilórica

Familiares Probandos masculinos Probandos femeninos Londres Belfast Londres Belfast

Hermanos 3,8 5,6 9,2 12,5

Hermanas 2,7 3,0 3,8 3,8

Riesgo de recurrencia en las enfermedades poligénicas

1. Mayor si hay más de 1 afecto en la familia.

2. Mayor si el probando presenta una forma severa.

3. Mayor si el probando es del sexo menos frecuentemente afectado.

4. Disminución rápida del riesgo en familiares más lejanos.

5. El riesgo está relacionado con la prevalencia en la población

aa

Aa

AA

Algunas enfermedades se comportancomo monogénicas y multifactorialesal mismo tiempo

Causas genéticas y causas medioambientales en la enfermedad

1. Estudios en gemelos:gemelos MZ vs. DZ ----- concordancia vs. discordancia

Del mismo sexo

Para rasgos cuantitativos -------> coeficiente de correlación interclases

para un rasgo totalmente determinado por los genesgenes:CCI MZ=1,0CCI DZ=0,5

para un rasgo totalmente determinado por el ambienteambiente:CCI MZ=CCI DZ

Heredabilidad h=2(CMZ-CDZ)

h≈1,0 cuando CMZ ≈ 1,0 y CDZ ≈0,5

Algunas tasas de concordancia en gemelos MZ y DZ

Rasgo o enf. Concordancia HeredabilidadMZ DZ

Transtorno bipolar 0,79 0,24 1,0Alcoholismo >0,60 <0,30 0,60Autismo 0,92 0,0 >1,0Presión arterial (diast) 0,58 0,27 0,62Presión arterial (sist.) 0,55 0,25 0,60Labio leporino/P.H. 0,38 0,08 0,60Dermatoglifos 0,95 0,49 0,92Diabetes Mellitus (TI) 0,35-0,5 0,05-0,1 0,6-0,8Diabetes Mellitus (TII) 0,7-0,9 0,25-0,4 0,9-1,0Epilepsia (idiopática) 0,69 0,14 >1,0Estatura 0,94 0,44 1,0Sarampión 0,95 0,87 0,16Esclerosis múltiple 0,28 0,03 0,50Infarto (hombres) 0,39 0,26 0,26Infarto (mujeres) 0,44 0,14 0,60Esquizofrenia 0,47 0,12 0,70Espina bífida 0,72 0,33 0,78

Causas genéticas y causas medioambientales en la enfermedad

2. Estudios de adopción:

tasas de enfermedad en hijos de afectados vs. hijos de no afectados

Posibles sesgos:

- Factores ambientales prenatales

- Factores ambientales previos a la adopción

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