Cultivos Microbianos

Dr. Claudio Voget

Curso CABBIO, Noviembre 2005

Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento

Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos, la asimilación del C deriva de 8 intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato.

hhhhhhhhhhhh

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hhhhh

Conceptos básicos de cinética microbiana

estado fisiológico de la célula (flujos metabólicos)

qi velocidad específica

de consumo de sustrato o formación de producto

(qi mmol/ g biomasa x h )

ri velocidad volumétrica

de consumo de sustrato o formación de producto

ri ( mmol/ litro x h )

V

rO2 = qO2 * X

ri = qi * X

X concentración de biomasa

Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades !

qO2

qS

qp

qCO2

µO2

S

CO2

P

Rendimientos verdaderos y mantenimiento

d1 CH2O + α1 NH3 + β1 O2 g1 biomasa + δ1CO2 + w1H2O + Δh1

d2 CH2O + α2 NH3 + β2 O2 s2 producto + δ2 CO2 + w2H2O + Δh2

d3 CH2O + β3 O2 mantenimiento + δ3 CO2 + w3 H2O + Δh3

Rendimientos verdaderos

(d1+d2+d3) = d , (α1+ α2) =α , (β1+ β2+ β3) = β , (δ1+ δ2+ δ3) = δ, Si d=1 α=a, β=b, δ= yco2/s

CH2O + a NH3 + b O2 yx/s biomasa + yp/s producto + yco2/s CO2 + w H20 + Δh

Rendimientos experimentales

rx

rsx

rp

rsp

rsm

sx

sx

r

r

d

gy

x

1

1

/'psr

r

d

sy

p

sp 2

2

/'

s

x

sx

r

r

d

gy

1

/

rs ,rO2

rx , rp

rsS

NH3

O2

rN

rO2

sxyy sx /'/ spp yy s /'/ s

p

sp

r

r

d

sy

2

/

Ecuación lineal de consumo de sustrato (ELCS)

xmy

rr s

sx

x

s /'

s

sx

s my

q /'

ms = 0.05 g glucosa / g biomasa x h

µ (h-1) yx/s / y´x/s

0.05 0,645

0.1 0,78

0.3 0,92

rp = 0

s

sxsx

m

yy

// '

11

xmy

r

y

rr s

spsx

x

s

p

// ''smspsxs rrrr

Factores que afectan la velocidad de crecimiento (µ)

Ecuación de Monod µ = f(S)

me

s

KS

Sevv

max

se

ss

KS

Seqq

max≡

membrana celular

SextE Sint

µqs qi

Temperatura

pH

øH2O

Composición del medio

cultivo restricto

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

cultivo irrestricto µ ≠ f(S)

maxu

u

5.0max

u

u

S (g/l)

sxs yq /*

se KS

Se

maxsKS

Ks = ug a mg/l

Crecimiento de Saccharomyces cereviseae

Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana

El metabolismo de S cereviseae es

netamente oxidativo hasta una µ de

0.2-0.25 h-1. Por encima de este valor

se induce la fermentación alcohólica

dando lugar a un metabolismo mixto

oxidativo-fermentativo. El rendimiento

celular disminuye. La producción

aeróbica de etanol en S. cereviseae se

denomina Efecto Crabtree

µ < µcrit

µ > µcrit EtOHyCOyXyNHaObOCH spscosx //2/322 2

2/2/322 COyXyNHaObOCH SCOsx

Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana

Parámetros de crecimiento y actividad β-galactosidasa

Cultivo Continuo (µ = 0.1 h-1)

Nutriente limitante

Yx/sg/g

ActividadLAU/mg

Carbohidratos totales %

Proteína%

Glucosa 0.44 0.19 30 42.5

Lactosa 0.47 18 30 43.5

Amonio 0.38 3.2 52 29

Batch (fase estacionaria)

Lactosa 0.40 4.3 - -

Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 ºC, pH 4.7, Medio definido

Sistemas de cultivo

Los procesos fermentativos pueden dividirse básicamente en 2 grandes grupos

Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS)

Contenido de agua del medio 90-95 %

Fermentaciones en sustrato sólido (FSS)

El medio son partículas húmedas con ausencia o

casi ausencia de agua libre

Reactores empleados en fermentaciones líquidas sumergidas

Fermentación en sustrato sólido

Hay dos formas básicas de cultivos sólidos

Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos

agroindustriales)

Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo

(inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano)

Comparación a nivel de

microescala entre FLS y FSS

Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido

Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida

FSS Fermentación sumergida

Medios simples. Requieren adición de agua o una solución mineral. Sustratos variables

Medios con mayor cantidad de ingredientes, mayor costo. Buena reproducibilidad en

medios definidos

Bajo øH20 reduce riesgos de contaminación Mayores riesgos de contaminación

Medios concentrados. Elevada concentración de producto Menor volumen de reactor

Medios diluídos, Volúmenes de fermentación grandes. Altas concentraciones de medio

puede afectar crecimiento. Alimentación de sustrato es común

Menor consumo de energia para aerear Transferencia G-L es generalmente limitante

Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusión puede limitar el proceso

Mezclado intenso.

La difusión de nutrientes es generalmente no limitante

Remoción de calor es crítica. Transferencia de calor por evaporación puede ser

importante Alto contenido de agua facilita control de Tra

Control del proceso dificultosa.

Estimación de biomasa no es directaAmplio desarrollo en sistemas de medición y

control

Downstream processing simple. Contaminación de producto con componentes

del medio es alta

Bajos volúmenes de efluentes líquidos

La remoción de grandes volúmenes de agua aumenta costos en los procesos de

separación y purificación

Cinética y fenómenos de transporte poco conocidos

Modelos cinéticos y difusionales

Operación de reactores

Ecuaciones de

balanceinterfase G-L

Co, Fo,

C, FS

VL

C

Yo, Fgo

Y, Fgs

VG

Y

transfiereYFYFdt

dYVgsogo

G

Fase líquida

Fase gaseosa

transfiereLdiLisooL

VrVrCFCFdt

CVd

Cultivo BatchEs el cultivo mas simpleVolumen constanteCerrado para fase líquida Fo = Fs = 0Composición inicial del medio determina el curso del cultivo

Fase exponencial

0/

SS

XXY

f

ofsx

t dtrXX

Yo

ofox

02

/

inóculo

Cultivo Batch0 so FF cteVL

transfiereiir

dt

Cd i

ir

dt

Cdó

tiempo (h)

0 2 4 6 8 10 12

ln X

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5Balance para biomasa

Lag

exponencial

desaceleración

estacionaria

m (pendiente) = µmax Xdt

dXmax

Xrdt

dXx )(tf

teXX omax

tXX it maxlnln

Velocidades de crecimiento de microorganismos y células

Cultivo µ (h-1)tiempo de

duplicación (h)

bacterias 0,6-1,4 0,5-1,15

levaduras y hongos

filamentosos0,2-0,6 1,15-3,0

células animales 0,01-0,04 17-70

células vegetales

0,007-0,03 23-100

Fase de desaceleración y estacionaria

Puede deberse a inhibición por producto, agotamiento de

nutrientes, limitación por oxígeno

En medios complejos la fase de desaceleración es mas

extendida en comparación con medios definidos.

La característica de la biomasa al final del batch puede ser

controlada con la composición inicial del medio (el cultivo

puede limitarse en C, N, P, etc)

En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a

la falta de nutrientes (condición de starvation): supervivencia

prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de

stress (salino, térmico, oxidativo, osmótico), etc. Hay expresión

diferencial de genes al entrar al estado estacionario

Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se

mantienen viables (viables no cultivables)

Desventajas del cultivo batch

Dificultad de controlar el µ, excepto variando la

composición del medio o las condiciones de proceso

Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el

crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del

medio o toxicidad de nutrientes

Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación

debido a una insuficiente capacidad del reactor para

transferir O2 al medio

Inconvenientes para remover calor

Tiempos muertos entre procesos disminuye la

productividad. Pie de cuba

Cultivo continuo

El tipo básico es el quimiostato, que consiste en una

suspensión celular perfectamente mezclada a la cual se

adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira

cultivo a igual velocidad, de este modo el VL es cte. La

composición del medio que se alimenta se diseña según que

sustrato es el limitante

Fo, Ci

reservorio bomba

Fo

BIOREACTOR

rebalse

medio fresco

Cio

Ci

Cultivo continuo

inicio alimentación

transitorio estacionario

X

s

Cultivo continuo

cteVLFFF so

en e.e 0dt

Cd i

LV

FD )(

1hdilucióndevelocidadD

transfiereLiiioL VrCCFdt

CdV

i

)(

0)( transfiereiiio rCCD

Balance de biomasa

Cultivo continuo

XDxr entoncesXxrcomo D

Balance de sustrato

Balance de producto

PDpr

)( 0/

SSD

X

s

xsxrr

y

X

PDpq

X

SSD osq

)(

)( SSD osr

Cultivo continuo

SKs

SD

SKs

S

maxmax

D

KsDS

max

sxs

osx

YmD

SSDYX

/

/

'

)('

Balance de sustrato con mantenimiento (rp = 0)

0)'

()(/

Xmy

rSSoD s

sx

x

Cultivo continuo

µmax = 1.0 h-1

Y´x/s = 0,5 gX /gS

ms = 0,05 gS/gX h

Ks = 5 mg/l

S0 = 2,0 g/l

D

KsDS

maxsxs

osx

YmD

SSDYX

/

/

'

)('

Aplicaciones del cultivo continuo

Estudios fisiológicos. Se puede discriminar el efecto de la velocidad de crecimiento y de las condiciones de cultivo en la fisiología celular.

Varío la composición del medio y parámetros del cultivo a µ =cte

Varío µ manteniendo cte el resto de los parámetros

Muestreo estadístico en el estado estacionario

Inconvenientes del sistema continuo

Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de plásmidos

Contaminación

Imposibilidad de establecer estado estacionario

Cultivo batch alimentado (B.A)

reservorio bomba

F(t)

BIOREACTOR

C(t) V(t)

Vo

Vf

Vr = Vf - Vo

C(t)

Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen varía

con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A

Controlado por alimentación: el cultivo sigue el curso que le

dicta la alimentación

Con alimentación controlada: el estado del cultivo ( captado

por sensores ) controla la alimentación

Cultivo B. A

VrtCtFdtCVd

i )()()(

Vrdt

PVdp

)(

Balance de biomasa

Balance de sustrato

Balance de producto

Vrdt

XVdx

)(

VrtSrtFdt

SVds )()(

)(

Cultivo B. A cteScteF r

0)(

dt

SVdsxYSrF

dt

XVd/

)(

tsxoo YSrFVXXV /

sxY

XVSrF

dt

SVd

/

)()(

VSrFdt

SVdsr

)()(

)(XVV

dt

XVdxr

0smSi

Cultivo B. A cteScteF r

0smSi )()()(

/'XV

XVSrF

dt

SVds

sxm

Y

sxsxs YSrFYXVdt

XVd m // '')()(

tYeSrF

XoVoSrF

XV sxs

ss

mmm

/')( )(

s

r

m

SFXVXVt max)(

Cultivo B. A

El objetivo del BA es básicamente controlar el µ

XY

Xooox

qr/

22

Limitar la demanda de O2 del cultivo

Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto osmótico y tóxico de nutrientes

Incrementar el qp (metabolitos secundarios, proteínas

recombinantes) para maximizar el Yp/s.

Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en levaduras)