Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch...
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Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia
Pedro Bosch Mendoza13 Feb. 2014
Introducción
Quimioteca de compuestos catiónicos
Ensayos de intercalación
Intercalantes deADN
Ensayos de selectividad de secuencia
Ensayos de fluorescencia
Compuestos fluorescentes
Bases estructurales
de selectividad
Sondas de ADN
RT-PCR
Tinción celular
Ensayos de actividad
antiproliferativa
Potencial antitumoral
Introducción
N+
X-N+
X-
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
Quinolizinio
Sistemas tri , tetra y pentacíclicos
Variación de forma y tamaño N
N+N
MSTS-
Síntesis
• Condensación de Westphal
NX
R
R1
R1
CH2R
NXH
O
O
R1
R1
CH2R
NAr
++
R =H, EWG
N-Alkylation or
N-Amination Base
X=NH, CHCO2Et
Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, 37-45.J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, 159-245
N
Me
OH
N
Me
OO
N
Me
CO2H
RR
O
O
OO
N
R
R
O OH
N
R
RN
R
R
OH
Br_
Br_
Br_
Br_
Br_
2. HBr, 100 oC, 1 h
1.Ethyl bromoacetatenBu4NI, Toluene, reflux
HOBt, DIC
Wang resin
DCM/DMF
++Het Het Het
Base, Solvent, rt
+
-CO2
+
Het
+
Het
+
Het
F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006, 4057-4060
Síntesis
• Metátesis de cierre de anillo
N N
RuCl
Cl
PhPCY3
N N
RuCl
ClO
Grubbs 2º generaciónHoveyda-Grubbs
Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, 2977-2980 A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006
N+
X-
N+
X- N+
X-
1. GII ó HG2. Oxidación HG
N+
1. GII ó HG2. Oxidación
Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión
Intercalantesde ADN
Ensayo de selectividadde secuencia ADN
(preferencia AT vs GC)
Ensayo deIntercalacióncon el ADN
Selectividadvs estructura
V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010
Quimioteca de compuestos catiónicos
Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión
V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010
Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
Unión ADN
Selectividad GC ó AT
1 No ---
2 Sí AT
3 Muy débil No existe
4 No ---
5 No ---
6 Sí AT
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N
MSTS-
Unión ADN
Selectividad GC ó AT
7 No ---
8 No ---
9 Débil AT
10 Débil AT
11 Muy débil AT
12 Sí AT
Máx. emisión
Eficiencia cuántica
1 442 0,33
2 544 < 0,05
3 464 < 0,05
4 461 0,14
5 361 0,23
6 467 0,15
Ensayos
• Fluorescencia:
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
Máx. emisión
Eficiencia cuántica
7 353 0,18
8 437 < 0,05
9 419 0,15
10 400 0,35
11 398 0,31
12 450 0,25
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N
MSTS-
Ensayos
NH
N+Br-
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-12
1
6
Valoración Fluorescencia
• Materiales– Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) – DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M)
• Procedimiento– Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo– Tiempo de intercalación: 10 min– Error correspondiente a dilución menor del 5%– Ratio 1:12 cromóforo/DNA
Valoración Fluorescencia
• Gráficas
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-
1
12
Valoración Fluorescencia
• Gráficas– Área bajo la curva– Anisotropía de fluorescencia– Constante de unión al DNA
Kb= (6.92.6) 104 M-1
– Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-
12
1
2 2
0 0 0 0 0 0
0
0
0 0
1+ n K[L] K[M] 1+ nK[L] + K [M] 4 nK [L] [M]=
2K n [L]
+I II
I I
Dicroísmo circular inducido
• Luz polarizada en un plano• Plano formado por 2 componentes en fase• Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría
– Cercanía en el espacio– Molécula capaz absorber
Dicroísmo circular inducido
• Gráficas– Señal correspondiente al
apilamiento de bases y a helicidad.– CD aumenta en presencia de
cromóforo– Este cambio sugiere intercalación
Dicroísmo circular inducido
• Gráficas
Nuevos cromóforos
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998Dyes and pigments 96 (2013) 554-562
N
NH2
N
NAc. p-toluensulfónico
Anh Acético, 3h,RT
1 2
68%
S OOO
NH2
CH2Cl2, 1hRT
N
N+
N
N+
NH2
MSTS-
O OEt
Br-
3
4
65%
59%
O
O
O
O
AcONa
EtOH, 24h, Reflujo
Et3N
EtOH,5h,Reflujo
N
N+N
MSTS-
N
N+
Br-
5
6 22%
BrO
OAcetona (anh)4h, Reflujo
50%
Nuevos cromóforos
N
NH2
N
NAc. p-toluensulfónico
Anh Acético, 3h,RT.
1 2
68%
Dyes and pigments 96 (2013) 554-562
Nuevos cromóforos
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
N
N
2
S OOO
NH2
CH2Cl2, 1hRT
N
N+NH2
MSTS-
3 65%
O
O
AcONa
EtOH, 5h,Reflujo
N
N+N
MSTS-
5 50%
Nuevos cromóforos
N
N+
O OEt
Br-
459%
O
O
EtOH, 24h, Reflujo
Et3NN
N+
Br-
6 22%
BrO
O
Acetona (anh)4h, Reflujo
N
N
2
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
Nuevos cromóforos
• Perspectivas– Cromóforos funcionalizados– Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA
Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS
Híbrido de Losartán
• Introducción– Losartán
• Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona• ARAII
– Inhibidor de RAS• Proteína reguladora• Proteína G monomérica• Activación y proliferación
• Objetivo– Estrategia
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
4
Híbrido de Losartán
• Síntesis del inhibidor de RAS
NH
Br
OH
N
Br
OH
C8H17
NaH 60%1-bromooctano
DMF, 4h, RT
1 297%
N
OH
C8H17
Ac. m-tolilborónicoPd(PPh3)4
Na2CO3 (2M)
DMF, EtOH,5h, reflujo
385%
NC8H17
NOH
H2N-OH.HClpyr
EtOH,2,5h, reflujo
488%
NiCl2.H2ONaBH4
MeOH, 5min,RT
NC8H17
NH2
547%
J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850
Híbrido de Losartán
• Oxidación de Losartán
A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 949-957
N
N
OH
Cl
NN
NN
N
N
O
Cl
NN
NN
HCloruro deoxaliloDMSOEt3N
CH2Cl2 (anh)17h, -78ºC
1 2 57%
Híbrido de Losartán
• Síntesis del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
N
O
Cl
NN
NN
H
N
NH2
C8H17
CH2Cl2 (anh),24h, RT
N
NHN
Cl
NN
N N
NC8H17NaBH4
(2eq.)
CH2Cl2/MeOH 1:2(anh), 4h, RT
23
25%
Híbrido de Losartán
• Desprotección del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
NHN
Cl
NN
N N
NC8H17
TFA
CH2Cl2, RT
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
34
Híbrido de Losartán
• Perspectivas– Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% – Se evita la deshalogenación.
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
4