Clase Fluorescencia 2
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1
1
Introducción a las técnicas de fluorescencia (2)
2
1. Un poco de historia..los inicios de la fluorescencia en biología2. Ensayos de fluorescencia en cubeta (con ejemplos):
a. Características de los espectros de fluorescencia:Regla de la imagen especular, corrimiento de stokesb. Instrumentaciónc. Tiempo de vida.
Bibliografía general1. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Bernard Valeur,
Wiley-VCH
2. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Joseph Lakowicz. Plenum Press, New York
Temas de la clase pasada:
2
3
Temas de la clase de hoy:
a. anisotropía de fluorescencia
b. Quenching (desactivación) de fluorescencia
c. FRET (Transferencia de energía por el mecanismo de Förster)
4
Anisotropía: Momento de una transición electrónica
fluoróforos
Luz polarizada linealmente: el vector E oscila en un plano determinado
Momento de la transición: durante una transición electrónica los e- se "desplazan": el momento dipolar del estado fundamental y el excitado puede ser distinto, generando un momento dipolar transitorio, asociado a la transición.
Para que se produzca la transición el momento de la transición debe tener un componente paralelo al plano de la luz polarizada
Fotoselección
excitación
3
5Bagatolli y col. Biophys J 1999
Para pensar: porqué la intensidad de fluorescenciano es homogénea?
Giant unilamellar vesicles (GUVs) marcadas con una sonda fluorescente lipídica que se intercala en la bicapa.Se observan por microscopía de fluorescencia con excitación por 2 fotones (por ahora no nos importa). Se utiliza un láser (polarizado) y sólo se detecta fluorescencia de el anillo central de la vesícula
6
Anisotropía de fluorescencia: Principios
Polarizadorde excitación
Polarizadorde emisión
Moléculafluorescente
Detector
4
7
Definición de anisotropía de fluorescencia (r)
IIIIr
llll
2
muestra
Polarizador de excitación
Polarizador de emisión
-0.2 < r < 0.4 (para moléculas random)
III lltotal 2
A veces se usa también el parámetro polarización (P)
IIIIP
llll
1
3
11
3
2
P
r
8
ro/
rr
1
Ecuación de Perrin
ro= anisotropía intrínsecar= tiempo de correlación rotacional = tiempo de vida de la sonda= viscosidad V= volumen de la partícula (esférica)k= constante de BoltzmannT= temperatura v1 = volumen específico del H20 (1.0018 cm3/g)v2 = volumen específico de la proteína (0.73 ml/g) = grado de hidratación
proteínas esféricas
)(kTMr
kTVr 12
5
9
Aplicaciones: Determinación del volumen molecular
VkT
rrr oro1
11
11
r-1
T/
ro-1
k/V
10
La anisotropía puede sensar la dinámica local y/oglobal de la molécula
Rotational Modalities(a) overall dimer rotation(b) movement of one C-domain relative to other domains(c) movement of dye molecule around its point of attachment
6
11
Otras aplicaciones de anisotropía de fluorescencia:
Determinación del binding de calmodulina del péptido RS20(la secuencia del péptido correspondiente a la región de unión a calmodulina de la myosin kight-chain kinasa)
* El péptido tiene un residuo Trp (Cam tiene sólo 1 Tyr)
13
Determinación de anisotropía de fluorescencia (formato L)
Monocromador de excitación
muestra
Monocromador de emisión
detector
Fuente de excitación
Polarizadorde excitación
Polarizadorde emisión
Esquema de espectrofluorímetro
7
14
hhhv
vhvvvhvv
IIG,
GIIGIIr
2
IIIIr
llll
2
Los monocromadores transmiten con distintaeficiencia luz polarizada vertical u horizontal.
Para el formato L:
Determinación de anisotropía de fluorescencia
15
Procesos intermoleculares que afectan a la fluorescencia
F* + Qk
products
8
16
Quencher (Q): molecule that provides a non-radiative path for deactivation of the fluorophore
Quenching: 2 posibles (pero no únicos) mecanismos
F* + Qkq
F + Q + heat collisional
F + QKs
F-Q static
no fluorescent
Como cambia la intensidad de fluorescencia en estos dos procesos?
17
Se puede explotar estos fenómenos para estudiar biomoléculas
Ejemplos:
9
18
Quenching dinámico
]Q[kIIo
oq 1 Stern-Volmer equation
Kd
F* + Qkq
F + Q + heat
F* kr
F + photon
F*knr
F
Io, in the absence of quencher
19
Quenching dinámico
La constante de quenching va a depender de la frecuencia y efectividad de los choques entre Q y F
kofk qq
eficiencia del choque
R=radio de choque (Rf+Rq) [cm]Di= coeficiente de difusion de i [cm2/s]N = nro de Avogadroko = [M-1s-1]
10
20
Collisional Quenching: Applications
lipid vesicle
lisozyme
4PC vesicle7.8buffer
Kd (M-1)condition
Gorbenko et al, Biophysical Journal 93:140-153 (2007)
acrylamide
21
Io, in the absence of quencher
Quenching estático
]Q[KIIo
s 1Stern-Volmer equation
F* kr
F + photon
F + QKs
F-Q
no fluorescente
F*knr
F
11
22
Diferencias entre quenching estático y dinámico
1) Tiempo de vida 2) temperatura3) alguna otra forma?
La forma de la curva es igual para dinámico y estático..como se pueden diferenciar?
23
Métodos radiométricos: determinación de [Cl-] por quenching2 sondas en 1 molécula
aceptor de e-(quenchea por Cl-)
dador de e- (no se quenchea)
Jayaraman y col. Am J Physiol (1999)
12
25
Qué está pasando?
27
FRET (Förster resonance energy transfer)A todos nos encanta FRET...por qué?
•Sirve para ver asociaciones•Medir distancias en el rango de los Å•Determinar cambios conformacionales•y muchas cosas mas
En qué consiste FRET?
D*-Akt D-A*
Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes
Ojo! no hay emisión y reabsorción de fotones! Es una interacción dipolar
13
28
Porqué es tan lindo FRET?
61
rRkt o
oD
D* -Akt D-A*
Agregamos esta reacción a las anteriores y calculamos t:
D* kr
D + photon
D*knr
D
Considerando una única distancia fija r entre D y A
66
6
rR
R
o
oT
29
Resonance energy transfer
61
rRkt o
oD
66
6
rRR
kr)(knrkk
oo
tt
T
1/oD
D* + Akt
D +A*D* D + photon
kr
D* Dknr
oD = donor lifetime, no acceptor
14
30
0 20 40 600.0
0.5
1.0
Tr (Å)
Ro
66
6
rR
R
o
oT
Resonance energy transfer
Ro = Förster distance
range of FRET: 10-100 Å
El fenómeno de FRET ocurre a distancias moleculares
31
Orientationfactor
Overlap integral
04
44
26
128
109000d)()(I
nN
)(lnR AD
A
oD
o
La distancia de Forster
15
32
0
4d)()(I AD
Integral de solapamiento
Fluo
resc
ence
Absorbance
Para calcularla, normalizar el espectro de fluorescencia:
0
1d)(ID
33
Factor de orientación
K2 = factor de orientación
K2 = 4 (colineales)K2 = 2/3 (random)K2 = 0 (perpendicular)K2 = 1 (paralelos)
DA=ángulo entre los dipolos de emisión de D y de absorción de A (T)A(D)= ángulo entre el dipolo del A(D) de la transición y el vector de separación
Pregunta: cómo verificarían experimentalmente que K2=2/3?
16
34
0 20 40 600.0
0.5
1.0
Tr (Å)
Ro
66
6
rR
R
o
oT
Resonance energy transfer
Ro = Förster distance
range of FRET: 10-100 Å
35
Consecuencias de FRET: estado estacionario
Donor
excitation
Acceptor
I
Fluorescence of the donor Fluorescence of the acceptor (at ex, donor)Qué pasa con el del donor?
17
36
1. Fluorescencia del donor (evaluada a D)
2. Fluorescencia del aceptor (evaluada a em)
Estado estacionario
DoD
D
)A(D
)D(FLUO
)A,D(FLUOT I
IA
A
11
en general AD(A) = AD
1)em,(I)em,(I
)(A)(A
AoA
DA
T
demostrar esa ecuaciónPista:
)em,(A)em,(AC)em,(I DTAAA
Pregunta: cual es el problema del método 2?
absorciónfluorescencia
D A
emD
37
Tiempo de vida del donor
0 10 20 300.0
0.5
1.0
Rela
tive
inte
nsity
time (ns)
D
A,Dtnrr
tT kkk
k
1
with FRETD*+ A
ktD + A*
D* D + photonkr
D* Dknr
Preguntas:1. Cambia el tiempo de vida del aceptor?2. Cómo varía IA vs t?
18
38
Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos
Kraynov y col, Science 2000
39
Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos
células que se mueven
célula quieta
alto FRET o I
bajo FRET o I
Kraynov y col, Science 2000
19
40
Aplicaciones 2: mecanismo de ATP sintasa
donoracceptor
ATP synthase
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
ADP + Pi
ATP
H+
H+
donor (TMR)aceptor (Cy5 bis)
41
Aplicaciones 3: mecanismo de ATP sintasa
ATP sATP sííntesisntesisATP hidrólisis
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
20
42
Homo-FRET
fluoresceína
Hay solapamiento entre los espectros de absorción y emisiónde la misma sonda, si el valor de k2 y r son los adecuados:
D + D* → D* + D
43
Homo-FRET
Cómo se detecta homo-FRET?
Intensidad?Tiempo de vida?Anisotropía?