Marcadores celulares: radioisótopos, cromóforos, fluoróforos y otros

Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

Radioisótopos: principios generales

•Radioisótopos empleados en biomedicina: 3H, 14C, 13C, 32P, 33P, 35S , 125I, 131I, 24Na

•1 dps = 1 Bq; 60 dpm = 1 Bq; 1 Ci = 37 kBq

•Eficiencia, E = cpm/dpm

Técnicas: autoradiografía (histoquímica, electroforesis), centelleo líquido, contaje gamma, trazadores orgánicos (distribución y metabolización).

Propiedades de los radioisótopos

3H 14C 35S 32P 125I

T1/2 12.3a* 5730a*87.4d* 14.3d* 60d*Radiación Penetración (aire) 6 mm 24 cm 30 cm 7,2 m > 10 mEscudo No 1 cm 1 cm 1 cm plomo 0.25 mm

(13 mm para 131I)Actividad (Bq) 3·1010 9·108 4·109 1·108 1·107

Limite anual (MBq) 3000 90 80 10 1

*a=años, d=días

Cromóforos: la absorción

Ley de Beer-Lambert

I = I0 · 10-c l

Log I0

/I = A = · c · l

T = 100 · (I/I0

)

La densidad óptica (D.O.) es la absorción en us sistema en el que l = 1

Cromóforos

Cromóforos: el espectrofotómetro

Cromóforos intrínsecos

Determinados gruposprostéticos de proteínasactúan como cromóforosintrínsecos. Su espectro característico sirve paraidentificar proteínas.

Cromóforos intrínsecos

Fluoróforos: excitación y emisión

La molécula A es fluorescente, mientras B carece de fluorescencia. G denota el estado basal; S el primer estado excitado.

Esquema del fluorímetro(Formato en L)

Prisma o filtro

Fluoróforos: ejemplos

Fluoróforos: Ejemplos

Medición con Fura-2 de la concentración de Ca2+ en célula de Purkinje.

Ejemplo en microscopia de fluorescencia

Marcaje de proteínas con anticuerpos fluorescentes. Ejemplo de marcaje con anticuerpos primarios y secundarios

Fluoróforos: Marcaje

La citometría de flujo es una técnica ampliamente utilizada para separar, clasificar, analizar e investigar las células

Citometría de flujo

Fluorescencia en la fluidez de membrana

Fluidez y difusión mediante FRAP (Fluorescence Recovery After Fotobleaching)

Fluorescencia e Interacción entre moléculas (FRET)

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Fluorescencia en la fluidez de membrana

Estudio de la fluidez en híbridos ratón-humano

Patching y capping en membranas de leucocitos

Otros métodos de marcaje

•Oro coloidal•Biotina-Avidina•Marcaje enzimático•Esferas magnéticas•Marcaje de Spin

Fluorescencia en la fluidez de membrana

EJERCICIO: Describe un experimento en el que uno de los siguientes marcajes sea una buena elección:

1. Marcaje de una proteína con 125I.2. Marcaje de una hormona con 3H.