Captulo 25CROMATOGRAFALQUIDOSDE ALTA EFICACIALa cromatografa de lquidos es importante porque la mayora de los compuestos no son suficientemente voltiles para que se les pueda aplicar la cromatografa de gases. La cromatografa moderna se desarroll a partir del experimento que se representa en la figura 23.5, consistente en aplicar un analito y un eluyente por el extremo de una columna abierta, alimentada por gravedad y que contiene una fase estacionaria. Esta tcnica se usa ampliamente en qumica preparativa y en bioqumica, para aislar cantidades del orden de miligramos a gramos de una sustancia. Las columnas abiertas se usan en qumica analtica para purificar y concentrar muestras, por extraccin en fase slida (apartado 28.3).

La cromatografa de capa fina es una

forma de cromatografa de lquidos

que se usa sobre todo en anlisis

cualitativo. Se muestra en la lmina

en color 22.

La cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presin elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene partculas muy finas, consiguiendo as separaciones de gran resolucin. El sistema HPLC que se muestra en la figura 25.1 consta de un sistema de suministro de disolvente, una vlvula de inyeccin de muestra, una columna de alta presin, un detector y un ordenador para controlar el sistema y visualizar los resultados. Actualmente muchos sistemas incluyen adems un horno para controlar la temperatura de la columna. En este captulo se describen estos componentes, y los factores que rigen la calidad de las separaciones cromatogrficas. De momento, nos limitamos a la cromatografa de reparto lquidolquido y de adsorcin lquidoslido.25.1 EL PROCESO CROMATOGRFICOEn el captulo anterior vimos que para aumentar la eficacia en cromatografa de gases debemos aumentar la velocidad de transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase mvil. En columnas tubulares abiertas, esto se consigue disminuyendo el espesor de la fase estacionaria y reduciendo el dimetro de la columna, de modo que las molculas se puedan difundir rpidamente de la fase lquida a la fase estacionaria que recubre la pared. La difusin en lquidos es 100 veces ms lenta que en gases. Por tanto, en cromatografa de lquidos, por lo general, no es factible usar columnas tubulares abiertas, porque el dimetro de la vena lquida del disolvente es demasiado grande para que lo atraviese una molcula de soluto en poco tiempo. La cromatografa de lquidos se hace con columnas empaquetadas.

Las partculas pequeas aseguran mayor eficacia pero requieren mayor presinLa eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en HPLC es de 310 , m. La figura 25.2 ilustra el aumento de resolucin que se consigue al disminuir el tamao de

Figura 25.2 Cromatogramas de una misma muestra obtenidos con una columna empaquetada de particulas de scile,

partcula al pasar de 10 a 5 , m. Se puede ver cmo se hacen ms estrechos los picos, y cmo se resuelve un pico nuevo de los componentes que se eluyen ms lentamente. La figura 25.2 muestra que al disminuir el tamao de las partculas se reduce la altura de plato, incluso a caudales altos.1 En condiciones ptimas (cerca del mnimo en la figura 25.3), el nmero de platos tericos de una columna de longitud L (cm) es2

donde dp es el dimetro de las partculas en micrmetros. Una columna de 15 cm de longitud y partculas de 5 m de dimetro pueden tener 104 platos, aproximadamente. Cuanto ms pequeas son las partculas, mayor es el nmero de platos.Una razn de por qu las partculas pequeas originan mejor resolucin es que permiten un flujo ms uniforme a travs de la columna, reduciendo as el trmino de camino mltiple (A) de la ecuacin de van Deemter (23.33). Otra razn es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusin en la fase mvil que hay entre las partculas es del orden del tamao de las partculas. Cuanto ms pequeas son las partculas, menor es la distancia en la que debe difundirse el soluto en la fase mvil. Este efecto disminuye el trmino C de la ecuacinde van Deemter, correspondiente al tiempo finito de difusin.La desventaja que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen al flujo del disolvente. La cromatografa analtica de alta eficacia precisa presiones de ~ 740 MPa (70400 atm) para alcanzar caudales de ~0,55 m1/min.

La columnaEl equipo HPLC de la figura 25.1 utiliza columnas de acero o de plstico de una longitud de 530 cm y un dimetro interior de 15 mm (figura 25.4). Las columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo o las partculas de las muestras o del disolvente. Por eso, se protege la entrada de la columna con una columna corta, la precolumna, que contiene la misma fase estacionaria que la columna analtica. Las partculas finas y solutos que se adsorben con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que reemplazar peridicamente.La ecuacin 25.1 se aplica a una

columna que opera en el mnimo de

la curva de van Deemter (como la de

la figura 25.3). Cuanto menor es el

tamao de partcula, ms eficaz es la

columna. Con partculas pequeas

hay que usar altas presiones para

obtener un caudal razonable.

Calentando una columna cromatogrfica, de ordinario, disminuye la viscosidad del disolvente, reducindose as la presin requerida o permitiendo un mayor caudal. Al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retencin (figura 23.17) y mejora la resolucin, porque aumenta la velocidad de difusin de los solutos. Sin embargo, aumentando la temperatura se puede degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna. Si no se controla, la temperatura de la columna flucta con la temperatura ambiente. Usando un horno a un temperatura a unos pocos grados por encima de la temperatura ambiente se mejora la reproducibilidad de los tiempos de retencin y la precisin del anlisis cuantitativo.

La fase estacionariaEl soporte ms comn en HPLC son partculas microporosas esfricas de slice muy pura, que son permeables al disolvente, y que tienen un rea superficial de varios centenares de metros cuadrados por gramo (figura 255). La slice se disuelve en agua a pH superior a 8, por lo que no puede utilizarse por encima de ese pH. Algunas calidades de slice son estables hasta pH 9 10. Para cromatografiar compuestos bsicos a pH entre 8 y 12, se pueden usar soportes polimricos, como el poliestireno (figura 261).3La superficie de la slice (figura 25.6) tiene hasta 8 , ** figura **moles de grupos silanol (SiOH) por metro cuadrado. Todos los grupos silanol estn prcticamente protonados si el pH es ~23. Se disocian formando SiO en un amplio intervalo de pH por encima de 3. Los grupos SiO superficiales retienen con fuerza las bases protonadas ** figura ** y originan colas (figura 25.7).

La slice pura se puede utilizar como fase estacionaria en cromatografa de adsorcin. Ms frecuente es la cromatografa de reparto lquidolquido, que se lleva a cabo con fase estacionaria enlazada covalentemente a la slice, mediante reacciones semejantes a sta

Fases polares comunes Fases no polares comunes

R = (CH2)3NH3AminoR = (CH2) 17CH3Octadecilo

R = (CH2)3C = NCianoR = (CH2)7CH3Octilo

R = (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OHDiolR = (CH2)3C6H5Fenilo

La fase estacionaria de octadecilo

(C18) es con mucho la ms usada en

HPLC. Se la designa frecuentemente

como ODS, abreviatura de octade-

cilsilano. El recuadro 25.1 describe

algunas fases enlazadas con funcio-

nes especiales.

Aproximadamente, hay ~4 , moles de grupos R por metro cuadrado de soporte, perdindose muy poca fase estacionaria de la columna durante una cromatografa.El enlace siloxano (SiOSiR) se hidroliza por debajo de pH 2, de modo que la HPLC con una fase enlazada en soporte de slice est limitada al intervalo de pH 28. Si los tomos de silicio se enlazan con grupos voluminosos isobutilo (figura 25.8), el enlace SiO- Si se hace menos accesible al ataque de H30+ y la fase estacionaria es estable a pH bajos durante largos periodos, incluso a temperaturas elevadas (p. ej. a pH 0,9 a 90 C).

Fase estacionaria diseada para separar fullerenos: (a) estructura molecular, (b) dibujo en el espacio. [Tomado de J. Xiao, M. R. Savina, G. B. Martn, A. H. Francis y M. E. Meyerhoff, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 9341.]Se pueden emplear fases estacionarias especiales para cromatografa cuando las fases ordinarias no pueden separar los componentes de una mezcla. Por ejemplo, la separacin de ismeros pticos es importante en la industria farmacutica, cuando los dos enantimeros de un medicamento tienen una actividad biolgica o una toxicidad distinta. Para separar ismeros pticos, existen en el mercado numerosas fases estacionarias enlazadas de quiral (pticamente activas) .4 El recuadro 24.1 trata de las ciclodextrinas, usadas como fase estacionaria en cromatografa de gases y de lquidos.Las mezclas de fullerenos (compuestos completamente cerrados de carbono, como el C60 que representa en la figura 18.21) son difciles de separar, porque las molculas son muy semejantes. Una fase estacionaria con grupos de tetraporfirina presenta concavidades de tipo aromtico, poco profundas, en el que se acoplan los fullerenos, por interaccin entre los electrones pi de la porfirina y los electrones pi del fullereno.El cromatograma muestra la separacin preparativa de fullerenos por HPLC. Los picos son anchos porque se inyect un muestra grande, para aislar la mayor cantidad posible. Esta columna podra separar C82 de La @ C82. La molecula La@C82 contiene La3+ en el interior de una jaula .

Cromatograma de una mezcla de fullerenos obtenido en una columna de 4,6 mm x 25 cm, eluyendo con una mezcla de un 25 % v de CS2 y 75 % v de tolueno a un caudal de 1 ml/min. El volumen inyectado fue 150 l. [Tomado de J. Xiao, M. R. Savina, G. B. Martn, A. H. Francis y M. E. Meyerhoff, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 9341.]El proceso de elucinEn cromatografa de adsorcin el disolvente compite con las molculas del soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria (figura 25.9). La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto del adsorbente es prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.La serie eluotrpica es la ordenacin de los disolventes de acuerdo con su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente. La fuerza eluyente es una medida de la energa de adsorcin del disolvente, supuesto el valor cero para el sistema pentano/slice pura. La tabla 25.1 ordena una serie de disolventes de acuerdo con su fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna.Cromatografa de fase normal:

fase estacionaria polar

cuanto ms polar es el disolvente,

ms fuerza eluyente tiene.

Cromatografa de fase inversa:

fase estacionaria no polar

cuanto menos polar es el disol-

vente, ms fuerza eluyente tiene.

Elucin isocrtica : un disolvente

Elucin gradiente: cambio continuo

de la composicin del eluyente en

sentido de aumento de fuerza elu-

yente. La elucin gradiente en HPI_C

es semejante a la programacin de

temperatura en cromatografa de

gases. Para eluir solutos fuertemente

retenidos hay que aumentar la fuerza

eluyente del disolvente.

La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionara polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colas de los picos, porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto originando colas (figura 23.19). La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (como el agua) que pueda haber en el eluyente.

Elucin isocrtica y gradienteLa elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo as un gradiente continuo.

Tabla 25.1 Serie eluotrpica y longitudes de onda de corte en el ultravioleta de los disolventes, en cromatografa de adsorcin sobre sliceDisolventeFuerza eluyente Corte en el ultravioleta (nm)

Pentano0,00190

Hexano0,01195

Heptano0,01200

Triclorotrifluoroetano0,02231

Tolueno0,22284

Cloroformo0,26245

Diclorometano0,3233

ter dietico0,43215

Acetato de etilo0,48256

ter metil t-butlico0,48210

Dioxano0,51215

Acetonitrilo0,52190

Acetona0,53330

Tetrahidrofurano0,53212

2-Propanol0,60205

Metanol0,70205

El corte en el ultravioleta del agua es 190 nm.FUENTES: L. R. Snyder en HighPerformance Liquid Chromatography (C. Horvth, ed.), Vol. 3 (New York: Academic Press, 1983); Burdick & Jackson Solvent Guide, 3a ed. (Muskegon, MI: Burdick & Jackson Laboratories, 1990.)La figura 25.10 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente en la elucin isocrtica de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separacin con fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace ms polar. El primer cromatograma (superior izquierda) se obtuvo con disolvente que tena un 90% de acetonitrilo y un 10% de tampn acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rpidamente. De hecho, slo se observan cuatro picos, porque los restantes estn solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgnico. El primer cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con 80% de B, se consigue una separacin algo mejor, observndose cinco picos. Con un 60% de B, se empiezan a ver seis picos. Con un 40% de B, se ven claramente ocho picos, pero los picos 2 y 3 no estn completamente resueltos. Con un 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separacin deja que desear porque tarda demasiado. Ajustando a 35% el contenido de B (el grfico de abajo), se separan todos los picos en poco ms de 2 horas (que todava es demasiado tiempo para muchos fines).El recuadro 25.2 describe la elucin

gradiente en cromatografa de flui-

dos supercrticos.

A partir de los datos obtenidos con las eluciones isocrticas en la figura 25.10, se eligi el gradiente que se representa en la figura 25.11, con el que se consigui resolver todos los picos en 38 min. Primero, se trabaj con un 30% de B (B = acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1, 2 y 3. A continuacin se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente, se modific el disolvente hasta alcanzar un 80% de B en 2 minutos, mantenindose esa composicin para eluir los ltimos picos.

Notas sobre disolventesEn HPLC se necesitan disolventes muy puros y caros, de calidad HPLC, para evitar que se degraden por impurezas las columnas, que son caras, y para minimizar el fondo de las seales del detector debido a los contaminantes. Se toma el disolvente del depsito a travs de un filtro para impedir el paso de partculas micromtricas. La muestra y el disolvente se pasan a travs de una precolumna corta y desechable (figura 25.4), que contiene la misma fase estacionaria que la columna analtica, y que fija las especies que se adsorberan fuertemente en la columna. Aun cuando se use una precolumna, se recomienda lavar la columna analtica peridicamente, para prolongar su vida. 6 Los disolventes se deben purgar previamente, burburjeando He a travs de ellos o aplicando vaco, para eliminar el aire disuelto. Las burbujas de aire crean dificultades en las bombas, en las columnas y en los detectores.

Una recomendacin "verde": es posible reducir residuosLa cromatografa HPLC usa grandes volmenes de disolvente. Se pueden reducir los residuos usando: columnas ms cortas y partculas de menor tamao columnas ms estrechas: pasar de dimetro de 4,6 mm a 3,0 mm 2,0 mm en separaciones isocrticas, usar un recuperador electrnico, que dirija el eluato a un depsito de reciclado cuando no sale un pico. Las separaciones de fase normal son muy sensibles a la presencia de agua en el disolvente. Para acelerar el equilibrio de la fase estacionaria con el cambio de eluyente, los disolventes orgnicos usados en cromatografa de fase normal tienen que estar saturados con agua en un 50%. Esto se puede conseguir agitando el disolvente con unos pocos mililitros de agua separando luego el disolvente saturado con agua, y aadindole despus una cantidad igual de disolvente anhidro.Cuando se trabaja con elucin gradiente en separaciones de fase inversa, despus de cada anlisis se debe pasar por la columna un volumen de disolvente igual a 1020 volmenes de columna vaca, para acondicionar la fase estacionaria con el disolvente antes del siguiente anlisis. El reequilibrado puede durar tanto como una separacin. Aadiendo un 3% en volumen de 1propanol al disolvente (de forma que haya siempre un 3% de 1propanol en cualquier punto del gradiente) se puede rebajar el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio a 1,5 veces el volumen de la columna vaca.? Se cree que el propanol cubre la fase estacionaria con una monocapa de alcohol, que no vara mucho durante toda una separacin.Cuestin Por qu el agua tiene

fuerza eluyente baja en las separa-

ciones de fase inversa, y alta en las

separaciones de fase normal?

25.2 INYECCIN Y DETECCIN EN HPLCConsideremos el instrumental necesario para inyectar la muestra y el disolvente dentro de la columna, y para detectar los compuestos a medida que salen de ella. Todo este instrumental constituye la mayor parte del sistema que se muestra en la figura 25.1.Bombas y vlvulas de inyeccinLa calidad de una bomba en HPLC se mide atendiendo a si produce un flujo constante y reproducible. Un caudal fluctuante da origen a ruido en el detector, que no deja ver bien las seales dbiles. La figura 25.14 muestra una bomba con dos pistones de zafiro, que producen un caudal programable constante, de 10 ml/min, a presiones hasta de 400 Mpa (400 atm). Se forman gradientes hasta con cuatro disolventes, ajustando los volmenes de los lquidos a travs de una vlvula de baja presin, e impulsando la mezcla con la bomba a alta presin. El proceso de formacin de gradiente se controla electrnicamente y se puede programar con una precisin del 0,1 % en volumen.

Se deben filtrar las muestras a travs

de un filtro de 0,5 m antes de inyec-

tarlas, a fin de que no se contamine la

columna con partculas, no se obstru-

yan los conductos y no se dae la

bomba. La aguja de la jeringa usada

en HPLC debe tener el extremo romo,

no acabado en punta. Asegurarse,

pues, de que se utiliza una aguja de

HPLC, para evitar que se estropee la

entrada de la vlvula.

Intervalo lineal: intervalo de concen-

tracin del analito, dentro del cual la

respuesta del detector es proporcio-

nal a la concentracin.

Intervalo dinmico: intervalo dentro

del cual el detector responde de la

manera que sea (no necesariamente

lineal) a la concentracin del analito.

Lmite de deteccin: concentracin

del analito que da una relacin

seal-ruido definida (suele tornarse

3, como se define en la figura 22.22).

El problema 4-20 da una mejor defi-

nicin de lmite de deteccin.

La vlvula de inyeccin, que se ve en la figura 25.15, permite lazos intercambiables de carga de muestra, cada uno de un volumen fijo, que van desde 2 a 1000, l. Se utiliza una jeringa, en la posicin de "carga", para lavar y llenar el lazo con nueva muestra a la presin atmosfrica. El lquido que procede de la bomba a alta presin pasa por la vlvula por el segmento situado en la parte inferior izquierda; y cuando la vlvula gira 60 en sentido contrario a las agujas del reloj, arrastra la muestra a alta presin, introducindola en la columna.Detectores espectrofotomtricosUn detector ideal, de cualquier tipo que sea, debe se sensible a pequeas concentraciones de analito, dar una respuesta lineal y no ensanchar los picos del cromatograma. No debe ser sensible a variaciones de temperatura y de la composicin de disolvente. Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector deber ser menor que el 20% del volumen de la banda cromatogrfica. Las burbujas que puedan existir en el detector producen ruido, y por eso se debe aplicar al detector una contrapresin, para impedir que se formen durante la despresurizacin del eluyente. La tabla 25.2 compara algunas caractersticas de los distintos detectores usados en cromatografa de lquidos. Reservamos el comentario sobre detectores de espectrometra de masas para el final del captulo.El detector ms comn en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la que se muestra en la figura 25.16, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas ms simples utilizan la intensa raya de emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio. Los instrumentos ms verstiles tienen lmparas de deuterio, xenn o volframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda ptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados. El sistema de la figura 25.17 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala ms sensible, una absorbancia de 0,0005, dara una seal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre ms de cinco rdenes de magnitud de concentracin de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta estn indicados para elucin gradiente, y para disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo. La tabla 25.1 muestra la longitud de onda de corte aproximada, por debajo de la cual el disolvente absorbe ya tanto que deja de ser til.

Para registrar el espectro completo

de ultravioleta de todos los picos que

aparecen en la figura 25.10 se utiliz

un detector de fila de fotodiodo. De

esta manera se pudo identificar el

compuesto que corresponda a cada

pico.

Tabla 25.2 Comparacin de detectores comerciales usados en HPLCDetectorlmite de deteccintil en elucin

aproximadoa(ng) gradiente?

De ultravioleta0,1-1S

De ndice de refraccin100-1000No

De dispersin de luz0,1-1S

Electroqumico0,01-1No

De fluorescencia0,001-0,01S

De conductividad0,5-1No

De espectrometra de masas0,1-IS

De infrarrojos con transformada de Fourier1000S

Los detectores de fluorescencia excitan el eluato con un lser, y miden la fluorescencia que se origina (apartado 19.5). Estos detectores son muy sensibles, pero responden slo a los analitos que presentan fluorescencia. Para aumentar la utilidad de los detectores de fluorescencia y los electroqumicos (que se describen luego), se puede enlazar covalentemente al analito grupos fluorescentes o electroactivos.8 Este proceso de derivatizacin se puede llevar a cabo en la muestra antes de hacer la cromatografa, o aadiendo los reactivos al eluato entre la columna y el detector (llamada derivatizacin postcolumna).

Detector de ndice de refraccinUn detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de deflexin, que se muestra en la figura 25.18, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 , l: a travs de uno pasa disolvente puro, y a travs del otro eluato. Para eliminar la radiacin infrarroja (que calentara la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a travs de la celda, con disolvente puro en los dos compartimientos, y se dirige a la fotoclula mediante la placa de deflexin. Cuando entra en la celda soluto de diferente ndice de refraccin, el haz se desva, y vara la seal dada por la fotoclula.La razn de que la deteccin por

fluorescencia es por lo general ms

sensible que por absorcin en el

ultravioleta se explica al principio

del apartado 19.6.

La relacin entre el ngulo de refrac-

cin y el ndice de refraccin se

explica en el apartado 21.1

Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y la referencia mientras vara la composicin del disolvente. Los detectores de ndice de refraccin son sensibles a las variaciones de presin y temperatura (~0,01 C). Debido a su baja sensibilidad, los detectores de ndice de refraccin no sirven en anlisis de trazas. Tienen intervalos pequeos de linealidad, que se extiende slo en un factor de 500 de concentracin de soluto. La principal ventaja de este detector es que es casi universal, respondiendo a todos los solutos, incluso a aquellos que no absorben en el ultravioleta.

Detector de dispersin de luzUn detector de dispersin de luz responde a todos los solutos que son claramente menos voltiles que la fase mvil. Como se ve en la figura 25.19, el eluato entra en este detector por la parte superior. En el nebulizador, el eluato se mezcla con nitrgeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma una fina dispersin de gotitas. El disolvente se evapora en un tubo caliente que se le hace recorrer, dejando una nube de finas partculas slidas, que entran en la zona de deteccin por la parte inferior. Las partculas se detectan por la luz que procede de un diodo lser y llega al fotodiodo por dispersin.El detector de dispersin de luz responde a la masa del analito, no a su estructura o peso molecular. Si se observa un pico grande y uno pequeo, se puede estar seguro de que el pico pequeo corresponde a menos cantidad que el pico grande. Con un detector de ultravioleta, una pequea cantidad de un analito que absorbe mucho da una seal ms intensa que una cantidad grande de un analito que absorbe poco. La respuesta de un detector de dispersin de luz no es lineal, de modo que frecuentemente se recurre a polinomios para construir la curva de calibrado.El detector de dispersin de luz es compatible con una elucin gradiente. Adems, no hay picos asociados con el frente del disolvente, y as no se dan interferencias con los picos que se eluyen al principio. Qu es el frente del disolvente? En la figura 25.11 se pueden ver pequeas seales positivas y negativas entre 3 y 4 minutos. Estas seales se deben a cambios de ndice de refraccin de la fase mvil, causados por el disolvente en que se disolvi la muestra. Este cambio modifica la seal dada por el detector de ultravioleta a un tiempo tm, que es el tiempo que tarda la fase mvil en atravesar la columna. Si un pico sale a un tiempo prximo a tm, queda distorsionado por los picos del frente. Un detector de dispersin de luz no tiene picos de frente de disolvente.Si se usa un tampn en el eluyente, debe ser voltil, o de lo contrario se evaporara formando partculas slidas, que dispersaran la luz y no dejaran discernir la seal del analito. Se pueden usar tampones de baja concentracin a partir de cido actico, frmico o trifluoactico, acetato de amonio, fosfato de diamonio, amonaco o trietilamina.

Detector electroqumicoUn detector electroqumico responde a analitos que pueden oxidarse o reducirse, como fenoles, aminas aromticas, perxidos, mercaptanos, cetonas, aldehdos, nitrilos conjugados, compuestos halogenados o nitroaromticos. En la introduccin al captulo 17 se mostr un detector basado en la oxidacin o reduccin del eluato en un electrodo de trabajo. Se mantena el potencial a un valor seleccionado, respecto al potencial de un electrodo de referencia de platacloruro de plata, y se meda la corriente que pasaba entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, de acero inoxidable. Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbn vitrificado. Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo puede ser el de gotas de mercurio. La corriente es proporcional a la concentracin del soluto en un intervalo de seis rdenes de magnitud. Se tiene que trabajar con disoluciones acuosas o de disolventes polares que contengan electrolitos, y deben estar rigurosamente exentas de oxgeno. Los iones metlicos que puedan proceder de los tubos se deben enmascarar aadiendo EDTA al disolvente. El detector es muy sensible a las variaciones de caudal y de temperatura.Haciendo medidas electroqumicas mediante impulsos, con electrodos de trabajo de Au o Pt, se pueden detectar tambin alcoholes, hidratos de carbono y compuestos de azufre. El electrodo se mantiene a +0,8 V (respecto a un electrodo de calomelanos) durante 120 s, a fin de desorber, mediante un proceso de oxidacin, los posibles compuestos orgnicos adsorbidos, y para oxidar la superficie metlica. A continuacin se lleva el electrodo a 0,6 V durante 200 ms para reducir de nuevo el xido al metal original. Se lleva entonces el electrodo al potencial constante de trabajo (el intervalo habitual es entre +0,4 y 0,4 V), al cual se oxida o se reduce el analito. Despus de esperar 400 ms, para que se anule la corriente de carga (figura 18.5), se integra la corriente durante los siguientes 200 ms, para medir el analito. La secuencia de impulsos que acabamos de describir se repite para obtener nuevos datos a medida que el eluato sale de la columna. Mediante este procedimiento, el etilenglicol (OHCH2CH20H), da una relacin sealruido de 3, a una concentracin de 10 ppb, tal como se muestra en la figura 25.20.

Atributos deseables de un nuevo

mtodo cromatogrfico

adecuada resolucin de los anali-

tos que interesan

rapidez

robustez (no estar afectado mucho

por pequeas variaciones de con-

diciones)

25.3 DESARROLLO DE UN MTODO DE SEPARACIN DE FASE INVERSA 2Muchas separaciones que se presentan en los laboratorios industriales y de investigacin se pueden realizar por cromatografa de fase inversa. A continuacin se describe un procedimiento general para desarrollar un mtodo de separacin isocrtica de una mezcla desconocida con una columna de fase inversa. El apartado siguiente trata de las separaciones con elucin gradiente. Al desarrollar un mtodo, lo que se pretende es conseguir una separacin adecuada en un tiempo razonable. Idealmente, el procedimiento debe ser robusto, lo que significa que la separacin no debe empeorar mucho por deterioro gradual de la columna, por pequeas variaciones de la composicin del eluyente, del pH o de la temperatura, o por usar diferentes lotes de fase estacionaria, o quizs de diferentes fabricantes. Si la columna no dispone de un control de temperatura, se la puede al menos aislar para evitar las fluctuaciones de temperatura.La cromatografa de fase inversa, normalmente, es adecuada para separar mezclas de compuestos orgnicos neutros o cargados de bajo peso molecular. Si no se separan bien los ismeros, se recomienda la cromatografa de fase normal, porque los solutos tienen interacciones ms fuertes y especficas con la fase estacionaria. En el caso de enantimeros, se necesitan fases estacionarias quirales (recuadro 24.1). En el siguiente captulo se describen tcnicas para separar iones inorgnicos, polmeros y macromolculas biolgicas.A1 igual que en cromatografa de gases (apartado 24.5), los primeros pasos para desarrollar un mtodo son (1) determinar la finalidad del anlisis, (2) seleccionar un mtodo de preparacin de muestra, que asegure una muestra "limpia", y (3) escoger un detector que permita observar los analitos de la mezcla. El resto del desarrollo de un mtodo que se describe en los siguientes apartados presupone que se han hecho los pasos 13.Criterios de una separacin adecuadaEl factor de capacidad (ecuacin 23.16) es una medida del tiempo de retencin, tr, en unidades del tiempo; tm, el tiempo que precisa la fase mvil o un soluto no retenido para atravesar la columna. Una separacin razonable exige que los factores de capacidad de todos los picos valgan entre 0,5 y 20. Si los factores de capacidad son demasiado pequeos, el primer pico se distorsiona por el frente del disolvente. Y si son muy grandes, el anlisis dura mucho. En el ltimo cromatograma de la figura 25.10, tm es el tiempo al que se observa la primera perturbacin cerca de 3 min. Si no se observa perturbacin alguna de la lnea base, se puede estimar que t,m ~ , donde L es la longitud de la columna (cm), dc es el dimetro de la columna (cm), y F es el caudal (ml/min) (ver figura 25.21). En cromatografa de fase inversa, tn, se podra medir pasando por la columna solutos no retenidos, como uracilo (que se detecta a 260 nm) o NaN03 (que se detecta a 210 nm).En anlisis cuantitativo es conveniente un mnimo de resolucin de 1,5 entre dos picos contiguos (figura 23.10), a fin de que puedan separarse. Para conseguir robustez, es an mejor una resolucin de 2. De este modo, la resolucin es todava adecuada, aunque empeore algo por pequeos cambios de condiciones o lento deterioro de la columna.Otro criterio de un buen mtodo cromatogrfico es que no exceda el lmite superior de presin del equipo. Si se mantiene la presin por debajo de ~ 15 MPa (150 atm) se prologa la vida de la bomba, de las vlvulas, de las juntas, y del automuestreador. La presin puede aumentar en un factor de 2 durante la vida de la columna a causa de un progresivo taponamiento. Fijar la presin de trabajo en 15 MPa durante el desarrollo de un mtodo permite un margen a la degradacin de la columna.Todos los picos (desde luego todos los picos que se tienen que medir) deben ser simtricos, con un factor de asimetra A/B dentro del intervalo de 0,9 a 1,5, como se ilustra en la figura 23.13. Antes de optimizar una separacin, se debe corregir la forma de los picos asimtricos, tal como se explica al final del apartado 25.1.

Optimizacin con un disolvente orgnicoCombinando adecuadamente acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano con agua (o un tampn acuoso), se dispone de una gama suficiente de interacciones dipolares, por puentes de hidrgeno, para separar un gran nmero de compuestos, por cromatografa de fase inversa. La primera mezcla de disolventes que se puede ensayar es acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una viscosidad baja, permitiendo una presin de trabajo relativamente baja, y, adems, la deteccin en el ultravioleta hasta 190 nm (tabla 25.1). A esta longitud de onda, muchos analitos potenciales presentan absorbancia. El metanol es el segundo disolvente orgnico a elegir, porque tiene mayor viscosidad, y una longitud de onda de corte mayor. El tetrahidrofurano es el tercer disolvente que se elegira, porque es menos til en el ultravioleta, se degrada lentamente por oxidacin, y se equilibra ms lentamente con la fase estacionaria. Las condiciones generales iniciales en cromatografa HPLC de fase inversa aprecen en la tabla 25.3.Atributos de una buena separacin

0,5 k' 20

resolucin 2

presin de trabajo 15 MPa

0,9 factor de asimetra 1,5

Seleccin del disolvente orgnico

1. acetonitrilo

2. metano

3. tetrahidrofurano

Para no tirar desechos txicos de

tetrahidrofurano, se puede hidroli-

zar con acetato sdico, antes de ver-

terlo ala pila.9

La figura 25.10 ilustra una sucesin de experiencias hasta establecer la composicin de 35%v de CH3CN (designado como B) y 65%v de tampn como buen disolvente para separar esa mezcla particular de analitos. La primera experiencia se hizo con una alta proporcin de CH3CN (90% de B), para asegurar la elucin de todos los componentes de la muestra desconocida. A continuacin se va disminuyendo el % de B, con objeto de separar todos los componentes. El eluyente con un 40% de B no separ adecuadamente los picos 2 y 3, y con un 30% de B el pico 8 tard mucho tiempo en eluir. Por consiguiente se eligi un 35% de B.

Con un 35% de B, el pico 1 se eluye a 4,9 min, y el pico 8 a 125,2 min. El frente del disolvente aparece a un tm = 2,7 min. Por tanto k' del pico 1 es (4,9 2,7)/2,7 = 0,8, y k' del pico 8 es (125,2 2,7)/2,7 = 45. Para k' > 20, est indicada una elucin gradiente (que se explica en el apartado 25.4). Si se pudieran resolver todos los picos de la figura 25.10 manteniendo 0,5 k' 20, se podra hacer bien una separacin isocrtica. Si no interesase medir los picos 2 y 3, probablemente una buena eleccin sera un 45% de B. Se puede imaginar qu resultado se obtendra con un 45% de B a partir de los resultados con 50% y 40% de B, que aparecen en la figura 25.10.Tabla 25.3 Condiciones de :partida en cromatografa de fase inversa2

Optimizacin con dos o tres disolventes orgnicosLas figuras 25.22 y 25.23 ilustran un proceso sistemtico de cmo desarrollar una separacin con una combinacin de disolventes. El desarrollo del mtodo se termina cuando la separacin cumple los criterios de seleccin. Es posible conseguir una separacin adecuada sin necesidad de seguir todos los pasos.Paso 1 Optimizar la separacin con acetonitrilo/tampn, con el resultado del cromatograma A de la figura 25.23.Paso 2 Optimizar la separacin con metanol/tampn, con el resultado del cromatograma B.Paso 3 Optimizar la separacin con tetrahidrofurano/tampn, con el resultado del cromatograma C.Paso 4 Mezclar los disolventes usados en A, B y C, de dos en dos cada vez, en proporcin 1:1, con el resultado de los cromatogramas D, E y F.Paso 5 Construir una mezcla 1:1:1 con los disolventes con los que se obtuvieron A, B y C, con el resultado del cromatograma G.Paso 6 Si alguno de los resultados de A a G son casi bastante buenos, seleccionar los dos mejores, y mezclar los disolventes para obtener combinaciones intermedias entre las de esos dos.Si no se preve una buena separacin

despus del paso G, se tendra que

recurrir a otra clase de columna o a

otra forma de cromatografa.

Examinemos la figura 25.23, para ver cmo se aplica el procedimiento sistemtico. El paso 1 genera el cromato- grama A, variando las proporciones de acetonitrilo y tampn acuoso (como en la figura 25.10), para obtener la mejor separacin con la restriccin que 0,5 k' 20. Con la composicin ptima de 30% v de acetonitrilo/70% v de tampn, no se resuelven adecuadamente los picos 4 y 5, en vistas a un anlisis cuantitativo.En HPLC al disminuir el caudal, de ordinario, mejora la resolucin. Para la figura 25.23 se eligi un caudal de 1,0 ml/min, que es mejor que el de 2,0 ml/min recomendado en la tabla 25.3. Con un caudal menor, se decidi mantener k'< 10 (en lugar de 0,25 Usar elucin isocrtica si tItG < 0,25Si todos los picos se eluyen en un intervalo pequeo de disolvente, es factible una elucin isocrtica. Si se necesita un intervalo amplio de disolvente, la elucin en gradiente es ms prctica. En la figura 25.27a, tItG = 21,5/40 = 0,50 > 0,25. Por consiguiente, est recomendada la elucin en gradiente. La elucin isocrtica es posible, pero el tiempo que se necesita en la figura 25.10 es demasiado grande.Si estuviera indicada una elucin isocrtica porque tItG < 0,25, un buen disolvente de partida tendra la composicin requerida para el punto medio del intervalo t. Es decir, si el primer pico se eluye a los 10 min y el ltimo pico a los 20 min, un disolvente socrtico razonable tendra la composicin del gradiente a los 15 min. El primer ensayo que se debe hacer

ante una mezcla nueva es un gra-

diente.

Si t/tG > 0,25 usar elucin en gra-

diente.

Si t/G < 0,25 usar elucin socr-

tica.

El disolvente isocrtico debe tener

la misma composicin aplicada a la

columna aplicada en el punto

medio del intervalo t.

Pasos en el desarrollo de un mtodo

en gradiente

1. Realizar un ensayo con un gra-

diente amplio (p. ej. 5 a 100% de

B) durante 40-60 min. A partir de

este ensayo, decidir qu es mejor,

si una elucin en gradiente o una

isocrtica.

2.Si se ha elegido una elucin en

gradiente, eliminar las porciones

del gradiente previas al primer

pico y las posteriores al ltimo

pico. Utilizar el mismo tiempo de

gradiente que en el paso 1.

3. Si la separacin en el paso 2 es

aceptable, intentar reducir el

tiempo de gradiente para reducir

la duracin del cromatograma.

Desarrollo de una separacin en gradienteEl primer ensayo debe examinar un amplio margen de fuerza eluyente. La figura 25.27a us un gradiente de acetonitrilo desde 10 a 90% de B, en 40 minutos. Como el tiempo de demora era de 5 minutos y el gradiente empez a t = 0, el gradiente empez a llegar a la columna a t = 5 min. (Hubiera sido mejor inyectar la muestra a t = 5 min, pero no se hizo.) Curiosamente, el primer ensayo de la figura 25.27 dio una separacin satisfactoria de los 8 picos. Podramos haber parado en este punto, si estuvisemos dispuestos a una duracin del cromatograma de 36 min.Cuando se desarrolla un mtodo en gradiente, el siguiente paso es separar los picos escogiendo un gradiente ms suave. Para un tiempo de demora de cinco minutos, el perfil del gradiente para la figura 25.27a es como el de la figura 25.28. El pico 1 se eluy a los 14 minutos con un 28% de B. El pico 8 se eluy hacia los 35,5 min, cuando el disolvente tena un 71% de B. Es decir, las porciones del gradiente entre un 10 y un 28% de B, y entre un 71 y un 90%, no son realmente necesarias. Por consiguiente, se podra hacer un gradiente desde un 28 a un 71 % de B en el mismo tiempo tG (40 min). Las condiciones elegidas para el cromatograma de la figura 25.27b fueron algo diferentes: de 30 a 82% de B, en 40 min. Este gradiente separ los picos y redujo algo el tiempo a 32 minutos.

En la figura 25.27c, se quiso ver si un gradiente ms brusco podra reducir el tiempo del cromatograma. Los lmites del gradiente fueron los mismos que en el cromatograma B, pero tG se redujo a 20 minutos. Los picos 6 y 7 no se resuelven por completo con un tiempo ms corto de gradiente. El cromatograma B representa las condiciones razonables de una separacin en gradiente.Si la separacin obtenida en la figura 25.27b no fuera aceptable, se podra intentar mejorarla, reduciendo el caudal, o pasando a un gradiente segmentado, como el de la figura 25.11. La justificacin de un gradiente segmentado es usar una buena composicin de disolvente para cada regin dada del cromatograma, y despus aumentar el % de B para la regin siguiente. Es fcil jugar con el caudal y los perfiles de gradiente. Procedimientos ms difciles para mejorar la separacin consisten en cambiar el disolvente, usar una columna ms larga, un tamao de partcula ms pequeo, o cambiar la fase estacionaria.Con todas estas herramientas, de ordinario, se puede encontrar una manera de separar los componentes de una mezcla, si no contiene demasiados compuestos. Si falla la cromatografa de fase inversa, se puede usar la cromatografa de fase normal, o alguno de los mtodos que se explican en el captulo siguiente. El desarrollo de un mtodo es en parte ciencia, en parte arte y, en parte, suerte.

25.5 CROMATOGRAFA DE LQUIDOS / ESPECTROMETRA DE MASASLa espectrometra de masas es una tcnica de deteccin muy utilizada en cromatografa de gases y de lquidos, que da informacin cualitativa y cuantitativa de los componentes de una mezcla. El espectrmetro puede ser muy selectivo de los analitos que interesan. Esta selectividad facilita las exigencias de la preparacin de muestra, o la separacin cromatogrfica completa de los componentes de una mezcla. Cuando se trabaja en un modo que es muy selectivo de una analito determinado, el espectrmetro de masas aumenta la relacin sealruido en anlisis cuantitativo, y disminuye el lmite de deteccin del analito.Un obstculo para acoplar la cromatografa de lquidos y la espectrometra de masas es la enorme cantidad de disolvente que acompaa al analito. Los espectrmetros de masas son aparatos de alto vaco que no pueden recibir fcilmente 1 ml de disolvente por minuto. Por esta razn, una buena eleccin para usar un espectrmetro de masas es la de una columna cromatogrfica de 2,1 mm de dimetro y un caudal de ~ 0,2 ml / min. Si se reduce el dimetro de la columna de 4,6 mm a 2,1 mm, es importante usar tubos de conexin muy estrechos (de dimetro interior 0,1 mm), para minimizar el ensanchamiento de la banda fuera de la columna. Adems, cuando se usa espectrometra de masas, se deben evitar los aditivos no voltiles en la fase mvil (como el tampn fosfato).

Formacin de iones gaseosos a partir de analitos de la disolucinDe los muchos mtodos que se han usado para introducir el eluato de una columna cromatogrfica dentro del entorno de alto vaco de un espectrmetro de masas, los ms frecuentes son ionizacin qumica a presin atmosfrica y electronebulizacin asistida con un gas. La ionizacin qumica produce iones gaseosos a partir de molculas neutras de analito que hay en la disolucin. La electronebulizacin pasa los iones preexistentes en la disolucin a fase gaseosa, pero no crea nuevos iones.

La ionizacin qumica a presin atmosfrica utiliza calefaccin y un flujo coaxial de N2 convirtiendo el eluato en una nube fina de aerosol, de la que se evapora el disolvente (figura 25.29). Esta tcnica es probablemente el acoplamiento (interface) ms verstil entre la cromatografa de lquidos y la espectrometra de masas, porque es aplicable a muchos tipos de analito, y puede aceptar caudales convencionales en cromatografa, hasta 2 ml/min. Por lo general, para que el analito, M, pueda ser observado, debe ser capaz de formar el ion protonado, MH+. Normalmente, existe poca fragmentacin de iones en un espectro de masas obtenido mediante ionizacin qumica a presin atmosfrica. Los espectros son fciles de interpretar, pero dan poca informacin estructural, fuera del peso molecular. Los analitos inestables se podran descomponer a una temperatura de 125 C del aerosol.

En la ionizacin qumica a presin atmosfrica, una descarga corona de alto voltaje, aplicada a una aguja, inyecta electrones en el aerosol donde puede desecadenar una serie de reacciones qumicas, en las que se forman cationes y aniones.10 El analito protonado, MH+, se puede formar de la siguiente manera:

El analito M podra formar un anin por captura electrnica:

Una molcula, XY, en el eluato podra dar origen a aniones mediante reacciones como

La especie Y podra sustraer un protn de un analito dbilmente cido, AH:

El espectrmetro de masas puede funcionar detectando cationes y aniones.La ionizacin por electronebulizacin (electrospray), tambin llamada nebulizacin inica, viene ilustrada en la figura 25.30a. Aplicando a la salida del capilar del cromatgrafo un fuerte campo elctrico a la vez que una corriente coaxial de N2, se crea un fino aerosol de partculas cargadas. El aerosol est cargado positivamente, si el potencial del capilar es positivo respecto a la entrada del espectrmetro de masas. Y es negativo, si el voltaje del capilar es negativo. Los iones que eventualmente se vaporizan a partir de las gotitas de aerosol ya estaban presentes en la disolucin, que pasa por la columna cromatogrfica. Por ejemplo, se pueden observar bases protonadas (BH+) y cidos ionizados

(A). (Se puede ajustar el pH del eluyente para favorecer BH+ o A segn se desee.) Se forman otros iones en fase gaseosa por reaccin entre el analito, M ( que podra ser neutro o cargado), e iones estables que ya hubiera en la disolucin. Se pueden citar como ejemplos MH+ (masa = M + 1) M(HC0 (masa = M + 45) M(NH) (masa = M + 18) M(CH3C0 (masa = M + 59) M(Na)+ (masa = M + 23)Como ocurre en la ionizacin qumica a presin atmosfrica, se produce poca fragmentacin de analito, y los espectros de masas son muy simples.La figura 25.30b da con mayor detalle el proceso de ionizacin, que no est aclarado por completo.12 El voltaje impuesto al eluato a la salida del capilar metlico crea exceso de carga en el lquido por reacciones redox. Si el capilar est polarizado positivamente (como en la figura 25.30b), la oxidacin que tiene lugar en la salida enriquece el lquido en cationes. Por ejemplo, se puede oxidar el capilar de acero o el agua del disolvente:

Los electrones procedentes de la oxidacin circulan a travs del circuito externo y, eventualmente, neutralizan cationes gaseosos a la entrada del espectrmetro de masas.El lquido cargado que sale del capilar forma un cono, y luego un hilo fino que finalmente se rompe en una nube de gotitas muy finas. La gotitas se reducen a un dimetro de ~ 1 mm, por evaporacin del disolvente, hasta que la fuerza repulsiva de las cargas en exceso igualan a la fuerza de cohesin debida a la tensin superficial. En este punto, las gotitas empieza romperse en diminutas partculas, de dimetros del orden de 10 nm. Los iones gaseosos se forman eventualmente a partir de esas minsculas partculas.

Deteccin selectiva con un espectrmetro de masasEl modo ms simple de usar un espectrmetro de masas como detector cromatogrfico es midiendo la corriente inica total de todos los iones que llegan al detector, como se ve en la figura 24.21a. De esta manera un espectrmetro de masas, simplemente, detecta todo lo que puede ser ionizado procedente de la columna. O bien, el espectrmetro puede ser selectivo midiendo la corriente inica de una masa determinada. La figura 25.31a es un cromatograma convencional que usa la absorbancia en el ultravioleta para detectar una mezcla de herbicidas (designados como 16), que se aadieron a agua de ro a un nivel de 1 ppb. La figura 25.31 b muestra el correspondiente cromatograma de masas de corriente inica total. La figura 25.31 c muestra la deteccin de un ion seleccionado, de m/z = 312, correspondiente a MH+ formado a partir del herbicida 6, que es imazaquina. La relacin sealruido cuando se registra un ion seleccionado es mejor que la sealruido en un cromatograma a o b porque apenas hay nada fuera del analito buscado que d una seal a m/z = 312.La selectividad y la relacin sealruido se puede aumentar an ms mediante espectometra de masas tndem, tambin llamada : espectometra de masas/espectometra de masas, o bien MS/MS. Este proceso se ilustra en la figura 25.32 con un espectrmetro cuadrupolo triple de masas. La mezcla de iones entra en el cuadrupolo Q1, que deja pasar iones de una masa dada a una segunda fase, Q2. La segunda fase deja pasar todos los iones de cualquier masa a la tercera fase Q3. Est constituida por una celda de colisin, que est llena de N2 o Ar, a una presin de 0,1 Pa. El ion precursor seleccionado por Q 1 choca con N2 0 Ar con suficiente energa para romperse en fragmentos llamados iones producto. El cuadrupolo Q3 selecciona slo una clase de iones producto, que son los que llegan al detector.

La espectrometra de masas tndem es extraordinariamente selectiva respecto al analito de inters. Un ejemplo es la medida de clorato (Cl0 ), clorito (Cl0), bromato (Br0 ) y yodato (I0) en agua potable a niveles de partes por billn. El clorato y el clorito se forman a partir del C102 usado como desinfectante. El bromato y el yodato se pueden formar a partir de Br-o1, cuando se desinfecta el agua con ozono (03). Los mtodos analticos existentes para estas especies o no son suficientemente sensibles o no son bastante especficos.

La figura 25.33 muestra la intensa seal especfica debida al clorato cuando se observa por espectrometra de masas tndem el eluato de una columna de cromatografa inica (apartado 26.2). En el agua existe una multitud de iones a muy diferentes niveles de concentracin, y el tiempo de retencin del clorato vara de muestra a muestra, dependiendo de la composicin del agua. Si embargo, un espectro de masas tndem da suficiente garanta de que slo se mide (CIO) en la figura 25.33. En este anlisis, el primer separador cuadrupolo de masas, Q1 en la figura 25.32, selecciona el ion de m/z = 83, que es CIO . En la clula de colisin (Q2), el clorato puede perder uno, dos o tres tomos de oxgeno:

El tercer cuadrupolo (Q3) selecciona slo el ion de m/z = 67. Si existen otras especies en la mezcla distintas del clorato con mlz = 83, es muy improbable que estas especies produzcan el ion de m/z = 67. El espectrmetro de masas tndem es sumamente especfico para clorato, aun cuando se separe mal de otros componentes de la mezcla. La sensibilidad y selectividad de la espectrometra de masas tndem hacen de ella una herramienta de gran valor como detector cromatogrfico.