INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“JOSE MARÍA MORELOS Y PAVON”

ANALISIS INSTRUMENTAL

INGENIERIA BIOQUIMICA IV SEMESTRE

PRACTICA

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

ANALISIS CROMATOGRAFICOS DE AMINOACIDOS

PROFESORA: ELIA PEREZ HERNANDEZ

NOMBRE DE LOS ALUMNOS:

Juan francisco bocanegra López

Fedra Navarrete Irra

FECHA:

26 DE NOVIEMBRE DEL 2013

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

“ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO DE AMINOÁCIDOS”

A. Introducción

En el análisis instrumental químico es necesario previamente separar los componentes de la mezcla de sustancias presentes en nuestra muestra para así obtener un analito libre de interferencias, por lo que es necesaria la aplicación de una serie de métodos y técnicas eficientes que nos permitan obtener nuestros analitos de interés en el mayor grado de pureza e integridad. Una técnica ya clásica es la Cromatografía que se define como un método de separación basado en la distribución selectiva de los diferentes componentes entre dos fases inmiscibles. La separación ocurre según el tipo de interacción entre los componentes de la muestra con respecto a las fases, una estacionaria y otra móvil. Esta interacción puede ser de diversos tipos y esto da a lugar a las diferentes categorías de cromatografías: de absorción, reparto, intercambio iónico, afinidad, etc.

En la presente práctica se aplica la técnica más sencilla, la cromatografía de partición ascendente, donde una hoja de papel de celulosa funciona como soporte de la fase estacionaria, las fases móvil y estacionaria son una mezcla de solventes y agua.

En todas las separaciones cromatografías, las moléculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una móvil. Dependiendo del tipo de fase estacionaria podemos distinguir: cromatografía en papel, cromatografía en capa fina, o cromatografía en columna. La separación depende de la tendencia relativa de las moléculas en la mezcla de asociarse con más fuerza a una o a otra fase.

B. Competencias específicas

Conoce un método de separación cromatografía útil para la separar e identificar pequeñas moléculas orgánicas como los aminoácidos.

C. Objetivos

Describir y aplicar un protocolo de cromatografía en papel para separar e identificar una mezcla de aminoácidos.

D. Material y Reactivos

Papel Whatman No. 1 Aminoácidos a 3mg/mL

1 Pipeta Pasteur Ninhidrina 0.1% con piridina 0.2% en etanol

Tijeras Butanol ác. Acético: agua 3:1:1

Soporte universal

Vaso de pp. de 600 mL

Pipeta de 10 mL

Lápiz

Regla de 30 cm

Atomizador

Vidrio de reloj

Plástico autoadherible

Horno

Pinzas de madera

Guantes de látex

E. Desarrollo experimental.

1. Corte una hoja de papel filtro con el alto de la base interna del vaso de precipitados de 600 mL a 0.5 cm de la boca del vaso. El ancho se debe considerar el perímetro interno del vaso ya que se realizará un cilindro con el papel como se muestra en la figura 3.

2. Encienda el horno y ajuste a 80±5°C la temperatura de revelado.

3. Trace con lápiz una fina línea de inicio a 1 a 2 cm del volumen de solvente en el extremo inferior de la hoja de papel (ver fig. 3A).

4. Divida a equidistancias y con marcas muy finas la posición para la aplicación de cada muestra a lo largo de la línea con el lápiz.

5. Con el apoyo de pipetas Pasteur vierta una alícuota de 3 mm de diámetro de cada uno de los aminoácidos, deje secar por aeración.

6. Una los extremos verticales del papel con las manchas ya secas y engrápelos para formar un cilindro con las muestras hacia el exterior y quedando en la parte inferior (ver fig. 3B).

7. Vierta una alícuota de 25 mL de la mezcla eluyente en el vaso de precipitados de 600 mL, y en seguida tape el vaso con el plástico autoadherible y el vidrio de reloj.

8. Coloque el cilindro con las muestras aplicadas en un solo movimiento y sin que entren en contacto el papel y las muestras con la pared del vaso o la tapa. Enseguida se tapa la cámara y se deja estar hasta que el solvente haya migrado hasta el extremo superior.

9. Una vez terminada la corrida, se remueve el cilindro y se transfiere al horno por 5 min para su secado con el apoyo de las pinzas de madera.

10. Se retira y se transfiere el cilindro con el apoyo de las pinzas de madera a una campana de extracción donde por medio del atomizador se aplica la solución reveladora de ninhidrina, cubriendo la cara externa y sin exceso.

11. Transfiera al horno por 5 min para su secado con el apoyo de las pinzas de madera.

12. Una vez reveladas las manchas se miden las distancias de migración respecto a la distancia de aplicación y el centro de la mancha, así como la distancia de la marca de lápiz y la migración del solvente (en mm).

13.Anote sus resultados y observaciones.

F. CUESTIONARIO

1. Usando la cromatografía terminada introduzca la información requerida en la siguiente tabla, considerando el cálculo de los valores de Rf (frente de referencia) para cada uno de los aminoácidos componentes.

(mm) solvente por el migrada Distancia

(mm) aminoácido por el migrada Distancia

AMINOACIDOS DISTANCIA MIGRADA (mm)

DISTANCIA MIGRADA POR EL SOLVENTE (mm)

Rf

Fenilalanina 17 100 6.32Alanina 45 100 2.073Glicina 36 100 2.453Lisina 52 100 2

2. ¿Cuál es la relación entre la solubilidad de los aminoácidos y la distancia que viajan en la cromatografía en papel?

La relación entre la distancia recorrida por una aminoácido con la distancia que viaja el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicación de la mezcla de aminoácidos, se designa como valor Rf (movilidad relativa con el solvente) de ese aminoácido.

Rf = Distancia corrida por la muestra

3. El fundamento y generalidades de la reacción de revelado de la ninhidrina con los aminoácidos.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido). El derivado coloreado presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R CH2-NH) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera

Rf=

CO2. La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras técnicas de separación. La presencia de aldehídos resultantes de la degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.

4. Técnicas instrumentales para la separación de aminoácidos.

Técnicas para aislar aminoácidos

Los a.a. son liberados de las proteínas mediante una hidrólisis. Un hidrolizado proteico, obtenido por cocción con HCl 6N, presenta una mezcla de a.a. Para el conocimiento proteico es muy importante identificar y cuantificar los a.a., lo que es hoy en día logrado por métodos cromatográficos.

Cromatografía:

En todas las separaciones cromatografías, las moléculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una móvil. Dependiendo del tipo de fase estacionaria podemos distinguir: cromatografía en papel, cromatografía en capa fina, o cromatografía en columna. La separación depende de la tendencia relativa de las moléculas en la mezcla de asociarse con más fuerza a una o a otra fase.

Cromatografía en papel

Aunque es sustituída en gran parte por técnicas más sofisticadas, esta técnica todavía encuentra aplicación en la separación de a.a. Las muestras se aplican en un punto marcado aprox. A 5 cm del extremo de una tira de papel filtro, y ésta se suspende en un recipiente sellado que contiene el solvente cromatográfico (para a.a. son mezclas de agua, alcoholes y ácidos o bases, constituyendo la fase móvil). La fase movil asciende por capilaridad. Cuando ha avanzado hasta el otro extremo, la tira se seca y se trata para permitir la visualización de las moléculas de interés (ej.: para a.a. se trata con ninhidrina al 0.5% en acetona, seguida de calentamiento de 90-100° C durante unos minutos). Los a.a. con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ileu, Fen, Trip, Val, Met, Tir) migran más que que aquellos con cadenas laterales más cortas no polares (Pro, Ala, Gli) o con cadenas laterales polares (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis). Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en la fase estacionaria hidrofílica, y de las moléculas no polares en solventes orgánicos. La relación entre la distancia recorrida por un a.a. con la distancia que viaja el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicación de la mezcla de a.a., se asigna como valor Rf (movilidad relativa con el sustrato) de ese a.a. La movilidad puede expresarse en relación a la de un estándar.

Cromatografía en capa fina

Es muy similar a la cromatografía en papel, pero se utiliza como fase estacionaria unos soportes adsorbentes como celulosa pulverizada o gel de sílica, incorporados en capa fina sobre una placa de vidrio. La cromatografía en capa fina de adsorción se aplica a sustancias apolares, como lípidos, no así a a.a. ni la mayoría de los peptidos.

Cromatografía de intercambio iónico

En el análisis de los residuos de a.a. después de la hidrólisis de un polipéptido, se utiliza generalmente la cromatografía de intercambio iónico. Esta técnica explota principalmente las diferencias en el signo y en las magnitudes de las cargas eléctricas netas de los a.a. a un determinado valor de pH, las cuales son predecibles a partir de los valores de pK a o de sus curvas de titulación. La columna cromatográfica consiste en un tubo largo relleno de partículas de una resina sintética, que contiene grupos cargados fijos; las que contienen grupos aniónicos se denominan resinas de intercambio catiónico (ej.: resina con grupos –SO3

-) y las que contienen grupos catiónicos, resinas de intercambio aniónico. La afinidad

de cada a.a. por la resina está afectada por el pH (que determinará el estado de ionización de la molécula) y la concentración de iones salinos, que pueda competir con la resina por asociación con el a.a. Se puede, por lo tanto, conseguir la separación óptima de los a.a. mediante un cambio gradual del pH o de la concentración salina de la solución que se pase a través de la columna, de manera que se cree un gradiente de pH o de sal. Una mejora moderna de ésta y otras técnicas cromatográficas se denomina cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica aprovecha una resina más fuerte y un aparato mejorado diseñado de forma tal, que permite la cromatografía a alta presión, lo que conduce a mejores separaciones en un tiempo mucho más corto. En el caso de los a.a. todo el procedimiento está automatizado, de modo que la elución, colección de fracciones, análisis de cada fracción y registro de los datos se lleva a cabo de manera automática en un analizador de a.a.

5. Casos de sustancias separadas e identificadas por cromatografía de papel y de capa fina (Investigue artículos científicos).

Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.

A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.

En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, de forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.

Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.

1. Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico.

2. Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico.3. Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se puede

hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o en forma de spray.

Cromatografía en columna

Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla.

Procedimiento

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

BIBLIOGRAFIA:

http://acemucsc.galeon.com/articulos/Bioquimica/aminoacidos.htm

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf http://www.buenastareas.com/ensayos/ Cromatografias/2877389.html