Control microbiológico en cervecería

UNIVERSIDAD DE LASFUERZAS ARMADAS ESPE

PERFIL DE PROYECTO INTEGRADOR

Estandarizacion del AnalisisMicrobiologico para el proceso de

fabricacion de Cerveza Artesanal para lamicrocervecerıa QUINDE BREWERY.

Autor:

Carlos Caiza

Tutores:

Msc. Alma Koch

Ing. Marco Taipe

Proyecto Integrador IIB

Departamento de Ciencias de la Vida

Carrera de Ingenierıa en Biotecnologıa

Sangolquı-Ecuador

Diciembre, 2013.

Contenido

1 Resumen 1

2 Introduccion 2

3 Justificacion 3

4 Objetivos e Hipotesis del Proyecto 4

4.1 Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

4.2 Objetivos especıficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

4.3 Hipotesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

5 Marco Teorico 5

5.1 Levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

5.1.1 Levadura cervecera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

5.1.1.1 Morfologıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

5.1.1.2 Composicion celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.2 Reproduccion de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.2.1 Reproduccion sexual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.2.2 Reproduccion asexual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.2.1 Division celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.2.2 Esporas vegetativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.2.3 Gemacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.3 Factores que intervienen en la reproduccion de la levadura . . . . . 7

5.2.3.1 Oxıgeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.3.2 Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.2.3.3 Composicion del mosto (sustrato nutritivo) . . . . . . . . 8

5.3 Floculacion de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

5.3.1 Hidrofobosidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

5.3.2 Potencial Zeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

5.3.3 Interaccion proteınas – azucares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

5.4 Factores que influyen en la floculacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

5.5 Mutacion de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

5.6 Deterioro de la cerveza por microorganismos contaminantes . . . . . . . . 9

5.6.1 Levaduras salvajes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

5.6.2 Bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

5.6.3 Bacterias lacticas como contaminantes . . . . . . . . . . . . . . . . 11

5.6.3.1 Lactobacillus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

5.6.3.2 Pediococcus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

i

Contenidos ii

5.6.4 Bacterias del acido acetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

5.6.5 Zymomonas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

5.6.6 Enterobacteriaceae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

5.6.7 Subproductos que pueden afectar la calidad del producto . . . . . 12

5.7 Proceso de elaboracion de cerveza artesanal . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

5.7.1 Molienda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

5.7.2 Proceso en Pailas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

5.7.3 Filtracion del Mosto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

5.7.4 Ebullicion del Mosto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

5.7.5 Enfriamiento del Mosto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

5.7.6 Fermentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

5.7.7 Maduracion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5.7.8 Filtracion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5.7.9 Envasado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

5.7.10 Diagrama del Proceso de Elaboracion . . . . . . . . . . . . . . . . 18

6 Materiales y Metodos 19

6.1 Tipo de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

6.2 Evaluacion de los puntos claves en el proceso de elaboracion . . . . . . . . 19

6.3 Toma de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

6.4 Tincion Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

6.5 Medios de Cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

6.5.1 Medio TSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

6.5.2 Medio SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

6.5.3 Medio MRS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

6.5.4 Solucion salina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

6.5.5 Inoculacion e incubacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

6.6 Pruebas Bioquımicas de identificacion bacteriana . . . . . . . . . . . . . . 21

6.6.1 Pruebas API R© . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

6.7 Recuento celular para Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 22

7 Resultados 23

7.1 Medio TSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

7.2 Medio SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

7.3 Medio MRS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

7.4 Pruebas API (Identificacion Bioquımica) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

7.4.1 Interpretacion de Pruebas API . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

7.5 Recuento en Placa Petrifilm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

8 Discusion 29

9 Conclusiones y recomendaciones 31

Capıtulo 1

Resumen

Este trabajo se realizo con el objetivo de analizar los microorganismos presentes en el

proceso de fabricacion de cerveza artesanal y evaluar la calidad microbiologica del pro-

ducto ya terminado en una microcervecerıa local.

La parte inicial del trabajo se centro en la descripcion del microorganismo responsable

de la fermentacion alcoholica para el proceso de fabricacion de cerveza artesanal, tal

organismo conocido normalmente como levadura es Saccharomyces cerevisiae. Aquı se

detallaron los aspectos relacionados de este orgsnismo durante la fermentacion y los

posibles problemas que pueden surgir como un mal manejo de estos microorganismos.

Mas adelante hizo una revision del proceso tıpico cervecero llevado a cabo en la micro-

cervecerıa con el fin de identificar los puntos claves durante la produccion para ası llevar

a cabo el cumplimiento de los objetivos que se han planteado, se tomaron muestras en

cada una de las etapas identificadas. El manejo de las muestras se lo realizo utilizando

material esteril y su almacenamiento previo a la siembra se llevo a cabo bajo condiciones

de refrigeracion para evitar la multiplicacion de microorganismos presentes en estas o la

proliferacion de contaminantes por mal manejo de las mismas.

Como parte complementaria se realizaron los procesos concernientes al analisis micro-

biologico de los organismos que se puedan encontrar en las muestras.

Los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigacion fueron organizados en

tablas para su respectivo analisis. Para el aislamiento e identificacion de los diferentes

microorganismos se realizaron las tecnicas de siembra mas conocidas utilizando medios

altamente selectivos que garantizo el exito de la siembra.

1

Capıtulo 2

Introduccion

El objetivo clave de una microcervecerıa es que la calidad de las cervezas que ofrece

surge como consecuencia de hacer las cosas bien desde el comienzo, en forma ordenada

y metodica, es ası como en el proceso de elaboracion se ha observado que uno de los

aspectos mas importantes para este tipo de empresa consiste en garantizar una excelente

calidad de su producto, por medio de un riguroso control, la utilizacion de una buena y

adecuada materia prima y la realizacion de un optimo proceso de fabricacion, logrando

ası satisfacer las expectativas de sus clientes.

En la medida que se avanza en el proceso de elaboracion de la cerveza, se evidencia

que dentro de cada una de las etapas de elaboracion existen muchos riesgos que pueden

afectar el producto; estos aspectos pueden ser: organolepticos, fısico- quımicos y mi-

crobiologicos, y de esta manera influir en la calidad del producto terminado. En el

control de la calidad se encuentran involucrados no solo el control proceso, las especifi-

caciones y el muestreo, sino tambien los procedimientos de organizacion, documentacion

y autorizacion que aseguran se lleven a cabo las pruebas pertinentes para verificar el

cumplimiento de los estandares nacionale, y porque no tambien internacionales y de

esta manera asegurar que la calidad es alta.

Es ası como en este trabajo de investigacion se planteo analizar los microorganismos

presentes en el proceso de fabricacion de cerveza artesanal y evaluar la calidad micro-

biologica del producto ya terminado, con el fin de identificar los microorganismos tıpicos

o posibles contaminantes, que puedan afectar la calidad del proceso de elaboracion y de

esta manera establecer por medio de los resultados obtenidos, si estos afectan la calidad

del producto terminado.

2

Capıtulo 3

Justificacion

La calidad de la cerveza en el sentido mas amplio, es la suma de todas aquellas car-

acterısticas que le permiten a un producto llenar los requisitos del mercado y atraer a

los consumidores para quienes esta dirigido; la calidad tambien es usada para denotar

la ausencia de defectos y, mientras que el termino se aplica tanto al empaque como

al proceso de elaboracion del producto, solo este ultimo aspecto sera evaluado en este

proyecto.

Las cervecerıas generan y recolectan grandes cantidades de informacion con respecto a

caracterısticas especıficas de la produccion de la cerveza tanto en producto en proceso

como en el producto terminado, la cual requiere ser analizada de una manera confiable

para que se constituya en una herramienta basica para el control de su proceso.

Considerando esto, se hace importante la necesidad de conocer el comportamiento mi-

crobiologico de la cerveza, en cada una de sus etapas de produccion, para que al obtener

los datos, dicha informacion contribuya a mejorar la calidad, consistencia del producto y

confiabilidad del proceso que se lleva a cabo, para establecer finalmente que los analisis

realizados son precisos y repetibles, que estan utilizando los controles de proceso adecua-

dos, para que los cerveceros puedan centrar su atencion en la administracion y mejora

continua del proceso.

3

Capıtulo 4

Objetivos e Hipotesis del

Proyecto

4.1 Objetivo general

Estandarizar el analisis microbiologico para el proceso de elaboracion de cerveza arte-

sanal para la microcervecerıa QUINDE BREWERY.

4.2 Objetivos especıficos

• Identificar levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces en las muestras recolec-

tadas.

• Identificar los posibles microorganismos contaminantes.

• Deternimar el numero de levaduras por recuento en placas de Petrifilm.

4.3 Hipotesis

Para el proceso de fabricacion de cerveza artesanal se puede plantear un protocolo de

analisis microbiologico, el cual permita mantener un control periodico en el lugar de

produccion.

4

Capıtulo 5

Marco Teorico

5.1 Levadura

Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen principalmente por gemacion,

son organismos eucarioticos, es decir que tienen una membrana nuclear bien definida

que envuelve el nucleo [Adams et al, 1998].

Las levaduras son las causantes principales de la fermentacion de los alimentos, lo cual

puede ser perjudicial (deterioro) o favorable (produccion de cervezas, vinos, pan, quesos,

enzimas, etc) [Adams et al, 1998].

5.1.1 Levadura cervecera

Saccharomyces cerevisiae tiene como caracterıstica que al final de la fermentacion se

va al fondo del tanque, se la conoce como levadura de profundidad y su temperatura

optima de fermentacion es de 10–14C [Aguilar, 2003].

5.1.1.1 Morfologıa

S. cerevisiae tiene forma esferica, elipsoide u ovoide. Su tamano varıa con la edad de

la celula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras. Puede vivir aislada o formando

colonias [Aguilar, 2003].

5

Marco Teorico 6

Fig. 5.1: Morfologıa de Saccharomyces cerevisiae[Caiza, 2013].

5.1.1.2 Composicion celular

Con el objeto de producir una nueva celula, todos los compuestos presentes en la celula se

deben incrementar. La celula de levadura tiene alrededor del 75 – 80% de agua [Adams

et al, 1998].

El contenido de otros materiales es usualmente expresado como % de la materia seca

remanente.

La celula esta constituida aproximadamente por:

P-glucanos (polisacarido) 40%

Mananos (polisacarido) 40%

Proteınas 8%

Lıpidos (grasas) 7%

Sustancias inorganicas 3%

Hexosamina y quitina 2%

5.2 Reproduccion de la levadura

La levadura se puede reproducir de dos formas diferentes: sexual y asexual.

5.2.1 Reproduccion sexual

En este proceso se realiza la fecundacion uniendose dos celulas sexuales. Los dos

nucleos de las celulas se unen formando uno, mezclandose el material genetico de los

dos “padres”.De este tipo de reproduccion resultan cuatro celulas hijas, cada una con la

mitad de los cromosomas iniciales [Klimovitz, 2002].

Marco Teorico 7

5.2.2 Reproduccion asexual

Se caracteriza porque se genera sin fecundacion, un solo individuo puede producir una

celula completamente nueva [Klimovitz, 2002]. Este tipo de reproduccion puede ocurrir

de tres maneras:

5.2.2.1 Division celular

Es una simple division de la celula formando un nuevo individuo a partir del que se esta

dividiendo (bacterias y algunos tipos de levaduras) [Klimovitz, 2002].

5.2.2.2 Esporas vegetativas

La celula forma un cuerpo reproductor, que una vez afuera y en condiciones del medio

adecuadas produce un nuevo organismo (bacterias y hongos)[Klimovitz, 2002].

5.2.2.3 Gemacion

Es la mas importante en este caso porque es la principal forma en que se reproduce la

levadura cervecera[Klimovitz, 2002].

La celula madre produce un pequeno “brote” en la pared celular, que aumenta gradual-

mente y se estructura poco a poco como una nueva celula de levadura [Klimovitz, 2002].

Cuando la celula “hija” ha alcanzado el desarrollo adecuado, se separa de la celula

“madre” por estrangulacion dejando una cicatriz en la pared celular [Klimovitz, 2002].

Es posible llegar a tener “cadenas celulares” cuando una “madre” tiene varias forma-

ciones de nuevas celulas al mismo tiempo y a su vez las celulas en crecimiento empiezan

a ser “madres” de otras nuevas, sin haber terminado de separarse [Klimovitz, 2002].

5.2.3 Factores que intervienen en la reproduccion de la levadura

5.2.3.1 Oxıgeno

A mayor oxigeno, entonces mayor es la velocidad de reproduccion.

5.2.3.2 Temperatura

A mayor temperatura, mayor velocidad, teniendo en cuenta que la temperatura optima

de desarrollo se encuentra entre 25oC y 30oC.

Marco Teorico 8

5.2.3.3 Composicion del mosto (sustrato nutritivo)

Debe contener los nutrientes requeridos para la formacion de la nueva celula.

5.3 Floculacion de la levadura

La floculacion es una propiedad fısica, donde las celulas de la levadura se adhieren unas

con otras, formando grupos que rapidamente sedimentan (levaduras de fondo) o alcan-

zan la superficie del liquido (levaduras de superficie) [Klimovitz, 2002].

Una levadura que flocule bien facilita la separacion y recoleccion de la levadura, dismin-

uye tiempos de proceso y evita que pase excesiva cantidad de levadura a maduracion

(riesgos de autolisis) [Klimovitz, 2002].

Los mecanismos fısicos por medio de los cuales la levadura flocula son:

5.3.1 Hidrofobosidad

La pared celular presenta caracterısticas hidrofobas (repele el agua) lo que hace que se

aglomeren. Esta propiedad esta asociada a la edad de la celula [Klimovitz, 2002].

5.3.2 Potencial Zeta

Es una medida de la carga electrica de la superficie celular. La reduccion en esta carga

favorece el acercamiento celular (y por ende la floculacion). La carga superficial se afecta

por el pH del medio y la presencia de sustancias “buffer” como los fosfatos [Klimovitz,

2002].

5.3.3 Interaccion proteınas – azucares

Existe una proteına llamada lectina que tiene la propiedad de “reconocer” (atraer)

sacaridos como la manosa. Como la pared celular de la levadura es rica tanto en lectina

como en manosa se considera factible que estos compuestos se atraigan entre si uniendo

las celulas[Klimovitz, 2002].

5.4 Factores que influyen en la floculacion

Una levadura que carezca de los factores geneticos de la floculacion no podra flocular.

A menor temperatura la levadura entra en un estado de “latencia” que activa el sistema

Marco Teorico 9

de floculacion.

A menor pH se activa la floculacion por la neutralizacion de cargas en la pared celular.

Durante la fermentacion hay una caıda de pH por lo que la levadura tiende a flocular al

final.

El calcio favorece la formacion de lectina en la pared celular y facilita la union lectina-

manosa entre las celulas de la levadura.

La presencia de azucares (como la manosa) o de proteınas tipo lectina en el mosto puede

bloquear los sitios de atraccion de la pared de la celula e interrumpir la floculacion

[Klimovitz, 2002].

5.5 Mutacion de la levadura

Se conoce como mutacion los cambios que ocurren en la informacion genetica de la

celula (DNA) inducido por factores externos y que pueden generar variaciones en el

metabolismo o comportamiento celular, asociados a la fraccion de DNA alterado [Heg-

gart, 1999]..

En el proceso cervecero se pueden favorecer las mutaciones por malas practicas de manejo

almacenamiento, de tratamiento la levadura acido, (condiciones contaminacion externas

con de levaduras diferentes, etc). Sin embargo nos es muy comun que se presenten mu-

taciones a gran escala en el proceso tıpico cervecero [Heggart, 1999].

5.6 Deterioro de la cerveza por microorganismos contam-

inantes

Los microorganismos causantes de deterioro durante la preparacion y el procesamiento

de la cerveza se limitan a algunos generos de bacterias , levaduras salvajes, y los hongos.

Esto es porque la cerveza es un medio de crecimiento desfavorable para la mayorıa de

microorganismos. El alcohol contenido, bajo pH y la presencia de componentes de lupulo

son agentes que inhiben el crecimiento de organismo extranos, mientras que la falta de

nutrientes restringe el crecimiento de estas celulas. Sin embargo , estas pueden interferir

con la fermentacion o tener efectos negativos sobre sabor de la cerveza y la vida util

[Hornsey, 2003].

Marco Teorico 10

5.6.1 Levaduras salvajes

Se considera como “levadura salvaje” o “silvestre” cualquier especimen que no corre-

sponda al utilizado en el proceso y que aparece como contaminante del medio o equipos

de trabajo [Heggart, 1999].

No todas las levaduras salvajes originan defectos en el producto, pero son indeseables

ya que pueden llegar a competir con la levadura del proceso. Algunos tipos de levadura

salvaje, pueden producir velos (turbidez), malos olores, sabores anormales, floculacion

deficiente y fermentacion diferente. Las levaduras salvajes se pueden identificar por

diferentes formas:

• Forma de las celulas (redondas, ovales, alargadas, etc).

• Tamano de la celula.

• Forma de agrupamiento de las celulas (aisladas, cadenas, etc).

• Forma de reproduccion.

• Metabolismo fermentativo.

Algunas de las levaduras salvajes mas comunes en cervecerıa son: Saccharomyces elip-

soideus, S. turbidans, S. pastorianus, S. chevaliere. Candida utilis, C. tropicales y C.

mycodema [Heggart, 1999].

5.6.2 Bacterias

Para todos los efectos practicos solo hay siete generos comunes de contaminantes bac-

terianos en la fabrica de cerveza . Estos se dividen en dos categorıas en funcion de su

reaccion a una procedimiento de tincion diferencial , la tincion de Gram . La tincion de

Gram divide bacterias cerveceras en dos grupos [Heggart, 1999].

• Bacterias Gram Positivas.

• Bacterias Gram Negativas

Dentro del primer grupo encontramos a las bacterias acido lacticas

Marco Teorico 11

5.6.3 Bacterias lacticas como contaminantes

El grupo de bacterias lacticas esta constituido por cocos y bacilos que comparten propiedades

fisiologicas y bioquımicas y cuyo metabolismo generador de energıa es fermentativo, los

sustratos fermentables son azucares que incluyen variedad de monosacaridos, disacaridos

y polialcoholes y cuyo producto final principal es el acido lactico y en algunos casos el

unico dependiendo de la ruta metabolica que utilicen para convertir los carbohidratos,

de ahı que las bacterias lacticas pueden dividirse en dos grupos segun los productos

resultantes de la fermentacion de glucosa [Jacques et al, 1999].

Bacterias del acido lactico son capaces de crecimiento a lo largo de fermentacion, ya que

son resistentes a etanol, no requieren oxıgeno y pueden sobrevivir en niveles bajos de

pH. El nivel optimo para el crecimiento es de aproximadamente 5,5 , pero algunas cepas

puede sobrevivir a niveles de pH tan bajos como 3,5 [Hornsey, 2003].

Las bacterias lacticas a menudo son contaminantes presentes el los granos secos (ce-

bada, trigo, avena, etc.) y pueden actuar al momento de activar la levadura para la

fermentacion. Ellos pueden ser los organismos infecciosos mas significativos durante fer-

mentacion y maduracion, ademas causan turbidez , acidez y sabores desagradablesdebido

a la presencia de diacetilo [Hornsey, 2003].

5.6.3.1 Lactobacillus spp.

En terminos generales , las bacterias del acido lactico son las mas problematicas de las

bacterias de la putrefaccion de cerveza, se cree que Lactobacillus spp. son mas peligrosos

durante la maduracion y despues del envasado [Hornsey, 2003].

5.6.3.2 Pediococcus spp.

Pediococcus es un contaminante mas comun que el Lactobacillus y es prevalente al final

de la fermentacion y durante la maduracion. Es particularmente frecuente como un

organismo que deteriora la cerveza fermentada a bajas temperaturas [Hornsey, 2003].

Este organismo es uno de los mas temidos debido a la dificultad de sacarlo de la fabrica

de cerveza. La contaminacion es mas a menudo de los depositos calcificados turbios

[Klimovitz, 2002].

5.6.4 Bacterias del acido acetico

Son bacterias Gram Negativas. Estas son particularmente conocidas en fabricas de

cerveza por su capacidad para producir acido acetico y, por lo tanto, sabores a vinagre

Marco Teorico 12

y turbidez. La superficie de contaminacion que causan a menudo es evidente como una

pelıcula aceitosa o con moho [Klimovitz, 2002].

Las bacterias del acido acetico pueden desarrollarse en ambientes aerobicos o microaerofılicos.

Se desarrollan mejor en el mosto y la cerveza cuando se expone a aire durante la fer-

mentacion inicial [Klimovitz, 2002].

Estas bacterias son por lo tanto incapaces de crecer despues de que el cultivo de levadura

ha utilizado el oxıgeno disuelto en el mosto [Hornsey, 2003].

No hay ninguna restriccion del crecimiento de bacterias de acido acetico por un pH bajo,

o por resinas de lupulo o sus isomeros [Klimovitz, 2002].

Bacterias del acido acetico se subdividen en los generos Acetobacter y Acetomonas.

5.6.5 Zymomonas

Es la principal bacteria anaerobia que puede deteriorar la cerveza. Las Zymomonas

en cervezas son capaces decrecer rapidamente; solo unas pocas celulas por litro puede

producir el deterioro en cuestion de dıas [Hornsey, 2003].

Es particularmente un problema en la industria cervecera del Reino Unido debido a las

practicas continuas de maduracion barril, y quizas tambien debido a las temperaturas

mas altas en la fermentacion [Klimovitz, 2002].

La contaminacion por Zymomonas en una fabrica de cerveza se da a menudo ren la fase

de envasado, aunque en algunos casos se remonta a la etapa de fermentacion [Hornsey,

2003].

5.6.6 Enterobacteriaceae

Especies de esta familia incluyen Klebsiella, Citrobacte y Enterobacter, que son bacte-

rias moviles y anaerobicas. Estas especies se denominan ”coliformes” , ya que estan

estrechamente relacionadas con Escherichia coli, un ejemplo bien conocido de la familia.

Normalmente atacan durante el enfriamiento y el periodo de retraso de la fermentacion.

El mosto enfriado es un medio ideal para su crecimiento [Hornsey, 2003].

5.6.7 Subproductos que pueden afectar la calidad del producto

La produccion de algunos compuestos por bacterias contaminantes contribuye a la dis-

minucion de la calidad del producto final de la fermentacion ası como el desarrollo mismo

del proceso pues el microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiologıa por la

presencia de sustancias extranas y/o en altas cantidades [Jacques et al, 1999].

Los acidos lactico y acetico son productos que afectan notablemente las caracterısticas

Marco Teorico 13

organolepticas del producto (etanol), pues se producen a partir de el, ası como la ac-

roleına y el diacetil, una cetona que puede producirse durante la fermentacion cuando el

piruvato es convertido a acido lactico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus

son los responsables de dicha produccion, no obstante, las levaduras producen diacetil

durante los primeros estados de la fermentacion pero este es removido por la accion de

varias enzimas y por la presencia de algunos aminoacidos en el medio [Jacques et al,

1999].

5.7 Proceso de elaboracion de cerveza artesanal

La cerveza, al igual que otras bebidas similares producidas con cereales, es sometida a

fermentacion pero no a destilacion. Las materias primas que intervienen en el proceso

son agua, lupulo y cebada, suplida a veces por el maız, el arroz o el azucar [Hough, 1990].

5.7.1 Molienda

Tanto la malta como los cereales sin maltear (trigo, avena, centeno, maız, arroz), tienen

que pasar por el molino que rompe el grano, dando lugar a la harina y otras partes fijas

[Hornsey, 2003].

La molienda consiste en destruir el grano, respetando la cascara o envoltura y provo-

cando la pulverizacion de la harina. La malta es comprimida entre dos cilindros pero

evitando destruir la cascara lo menos posible, pues esta servira de lecho filtrante en la

operacion de filtracion del mosto; a su vez el interior del grano en una harina lo mas fina

posible. Estas dos condiciones, cascara entera y harina fina no podran respetarse si el

grano no esta seco (excepcion molienda humeda) y muy bien desagregado, una tercera

exigencia es un buen calibrado de la malta. La molienda debe ser tambien regulada

segun el cocimiento posterior [Hornsey, 2003].

5.7.2 Proceso en Pailas

En esta parte del proceso se extraen de la malta y eventualmente de los granos crudos la

mayor cantidad de extracto y de la mejor calidad posible en funcion al tipo de cerveza

que se busca fabricar. La extraccion se logra principalmente por hidrolisis enzimatica,

solamente un 10% de la extraccion es debida a una simple disolucion quımica. Las

Marco Teorico 14

amilasas desdoblan el almidon en dextrinas y maltosa, principalmente las enzimas pro-

teolıticas desdoblan las proteınas complejas en materias nitrogenadas solubles, la fitasa

desdobla la fitina en inositol y fosfato, etc. Estas transformaciones enzimaticas han sido

ya empezadas durante el malteado a un ritmo menos intenso del que sucedera en el

cocimiento; donde debido a la accion de las diferentes temperaturas y la gran cantidad

de agua las reacciones suceden muchas veces en forma explosiva [Hough, 1990].

Cuantitativamente el desdoblamiento del almidon en azucares y dextrinas es el mas im-

portante. Las principales reacciones que ocurren durante el cocimiento por accion de

las amilasas son formacion de dextrinas, formacion de maltosa y en menor proporcion

formacion de glucosa [Hough, 1990].

5.7.3 Filtracion del Mosto

Una vez disueltas las materias solubles por el cocimiento es necesario separar el mosto de

la parte insoluble llamada orujo o afrecho. La operacion se realiza en dos fases: primero

el flujo del mosto y luego la operacion de lavado del extracto que contiene el afrecho

[Verstrepen, 2003].

El mosto y el agua de lavado deben ser claros pues si se aporta durante la operacion

demasiadas sustancias mal disueltas, la clarificacion de la cerveza sera demasiado difıcil.

La calidad de la cerveza puede ser tambien alterada por un lavado de afrecho con agua

alcalina pues los polifenoles y sustancias amargas de la cascara de la malta se disuelven

muy facilmente en agua alcalina aun mas si se tiene en cuenta que el lavado se hace en

agua a una temperatura maxima de 75 C; esta no puede exceder ese lımite, pues se corre

el riesgo de disolver almidon presente aun en el afrecho, lo que conllevarıa a problemas

de turbiedad y fermentacion posteriores [Verstrepen, 2003].

5.7.4 Ebullicion del Mosto

La finalidad de la ebullicion es estabilizar enzimatica y microbiologicamente el mosto,

buscar la coagulacion de las proteınas. La destruccion de las enzimas es realizada para

evitar que sigan desdoblando a lo largo de la fermentacion, las amilasas podrıan seguir

desdoblando las dextrinas y estas se transformarıan enteramente en alcohol [Hornsey,

2003].

La esterilizacion del mosto es obtenida por simple ebullicion, pues su reaccion es ligera-

mente acida. La coagulacion de las materias proteınicas debe hacerse lo mejor posible,

pues si subsisten en el mosto ocasionarıan problemas en la fermentacion, provocando

facilmente turbiedad en la cerveza embotellada. La esterilizacion y la destruccion de las

enzimas es facil de realizar, un cuarto de hora de ebullicion es generalmente suficiente

Marco Teorico 15

[Hornsey, 2003].

La coagulacion de proteınas es mucho mas difıcil, se realiza por etapas, la primera es la

desnaturalizacion que consiste en la ruptura de puentes de hidrogeno en la molecula de

proteına, pasando del estado hidratado al deshidratado, manteniendose en suspension

unicamente por su carga electrica; luego de la desnaturalizacion se produce la coagu-

lacion propiamente dicha por agrupacion de micelios deshidratados; es aquı donde el

pH juega un papel muy importante, pues la coagulacion sera eficiente si se realiza en el

punto isoelectrico; como existen muchas proteınas en el mosto se ha optado por el pH

5.3 como el mas conveniente [Hornsey, 2003].

Durante la ebullicion, la coloracion tambien aumenta sobre todo por la formacion de

melanoidinas, tambien por oxidacion de taninos, estas dos reacciones son favorecidas

por el pH elevado. Por ultimo a lo largo de la ebullicion se forman productos reductores

que contribuyen a la calidad y estabilidad de cerveza [Hornsey, 2003].

El lupulado del mosto se realiza tradicionalmente durante esta operacion, es decir, en la

paila de ebullicion. El amargor es obtenido por isomerizacion de los acidos y del lupulo;

esta isomerizacion es incompleta debido principalmente al pH del mosto, el pH optimo

de isomerizacion es de 9. Existen muchas lupulonas y humulonas en el lupulo; cada

uno de estos compuestos donara su isomero respectivo; el conjunto es conocido como

isohumulonas pues son esencialmente quienes donan el amargor deseado [Verstrepen,

2003].

5.7.5 Enfriamiento del Mosto

El mosto obtenido por sacarificacion de la malta o de los adjuntos y por proteolisis de

las proteınas de la malta, es llevado a ebullicion durante hora y media con el lupulo para

otorgarle el amargo, a lo largo de esta ebullicion la esterilizacion completa es obtenida

gracias al pH que oscila alrededor de 5.3 [Hough, 1990].

Los precipitados proteicos son eliminados por sedimentacion, filtracion o centrifugacion;

el mosto es enseguida enfriado a la temperatura de inoculacion de la levadura, esta tem-

peratura depende del tipo de levadura empleada y del tipo de cerveza a fabricar entre 6

a 20 C [Hough, 1990].

Durante el enfriamiento un nuevo precipitado de polifenoles-proteınas se forma, por un

lado por enlaces de hidrogeno y tambien por la falta de solubilidad de las prolaminas.

La presencia de este nuevo precipitado juega un rol esencial sobre la formacion de H2S

por la levadura [Verstrepen, 2003].

El mosto enfriado, en principio esteril, debe ser aireado antes del inicio de la fer-

mentacion, de no ser aireado la tasa de mortalidad de la levadura aumentarıa a tal punto

Marco Teorico 16

que esta no podrıa ser reutilizada; la oxigenacion del mosto antes del inicio de la fer-

mentacion permite a la levadura sintetizar acidos grasos insaturados (oleıcos, linoleıcos, y

linolenicos), en ausencia de estos acidos grasos la pared celular esta sujeta a alteraciones

lo cual lo hace mas permeable a los esteres correspondientes a los alcoholes superiores

que ella misma forma [Klimovitz, 2002].

La composicion del mosto es muy variable en funcion al tipo de cerveza fabricada, su

densidad puede variar entre 2 a 20 grados Plato, es decir que puede contener de 2 a 20g

de soluto por 100g de lıquido; a su vez puede ser rico o no en aminoacidos y peptidos

en funcion de la importancia de la proteolisis y de la proporcion de adjuntos utilizados

[Klimovitz, 2002].

La relacion maltosa/dextrinas es igualmente variable de acuerdo al metodo de cocimiento

escogido. De manera general se puede decir que el mosto es un medio incompleto, nor-

malmente carente de aminoacidos y acidos grasos insaturados pues es imposible obtener

un crecimiento rapido y completo de levadura; cosa que no sucede si se tratara de un

medio sintetico a base de extractos de levadura [Klimovitz, 2002].

5.7.6 Fermentacion

Hasta esta etapa se ha preparado un lıquido complejo y se ha purificado cuidadosa-

mente hasta el momento de agregar la levadura cervecera para producir su fermentacion

[Hornsey, 2003].

Inicialmente, se agrega al mosto frıo, levadura en una cantidad calculada, para que quede

en el mosto de 8 a 10 millones de celulas por cc. Para la fermentacion de mosto con-

centrado, se usa un millon de celulas por cc por cada grado plato del mosto [Hornsey,

2003].

La cantidad de levadura previamente determinada se diluye en el mosto y luego se in-

yecta a la lınea de mosto frıo durante el enfriamiento. La cantidad total de levadura que

se inyecta se calcula teniendo el cuenta el volumen de mosto que va contener la tina de

fermentacion [Hornsey, 2003].

La temperatura inicial de fermentacion puede variar entre 6 a 10 C. Una vez que se

inicia la fermentacion se aprecian como cambios notorios, el descenso del extracto, la

produccion de gas carbonico y el desprendimiento de calor; durante la fermentacion se

controla el descenso de la densidad regulando la temperatura con atemperadores (ser-

pentines o chaquetas), por los cuales circula agua frıa o salmuera o agua glicolada a

temperaturas que oscilan entre 1 a 2 C para el caso del agua y de -5 a -10 C para el caso

de la salmuera o el agua glicolada [Xiao, 2004].

Para recolectar el gas carbonico que se desprende de la fermentacion, comunmente el

Marco Teorico 17

tanque esta conectado por la parte superior con dos tuberıas; una que va a la intem-

perie y la otra que va a la planta de purificacion de gas carbonico. En la planta de

gas carbonico, este es purificado y licuado con el fin de inyectarlo posteriormente a la

cerveza [Hornsey, 2003].

Cuando se alcanza el extracto lımite o sea hasta donde se le va a dejar fermentar se abre

el frıo para conseguir enfriar la cerveza y para que la levadura se alimente [Xiao, 2004].

Se consigue enfriar la cerveza hasta 5 C y se suspende el envio de gas carbonico a la

planta, luego se bombea la cerveza a los tanques de maduracion y se recupera la levadura

[Hornsey, 2003].

A la cantidad de levadura obtenida en cada fermentacion se le denomina cosecha de

levadura, lo normal es obtener 4 veces la cantidad de levadura agregada [Hornsey, 2003].

Al final de esta cuando los azucares han sido transformados hasta alcohol y gas carbonico

se tendra la cerveza. Despues de la fermentacion la cerveza es separada de la levadura,

la cual puede ser utilizada para fermentar mas mosto, posteriormente. La fermentacion

juega un rol esencial en la calidad de la cerveza, en particular gracias a los productos

secundarios como los alcoholes superiores y esteres; es tambien la etapa de la fabricacion

mas difıcil de controlar [Xiao, 2004].

La levadura que es reutilizada de una fermentacion a otra no tiene un metabolismo

estable; esta se va degenerando.

5.7.7 Maduracion

Es la etapa siguiente a la fermentacion y comprende todo el tiempo que dure la cerveza

en los tanques a baja temperatura antes de ser filtrada. Comunmente se divide en dos

etapas que son reposo y acabado, entre el reposo y el acabado puede haber una pre-

filtracion, pre-enfriamiento y pre-carbonatacion [Klimovitz, 2002].

5.7.8 Filtracion

Despues de la maduracion y antes del embotellamiento, la cerveza pasa de nuevo por

una filtracion con tierra diatomacea que elimina los ultimos restos que puedan quedar

de la fermentacion y tambien los restos de nitrogeno que durante la maduracion han

formado una especie de mucosa, lo que podrıa provocar mas adelante que la cerveza

saliera turbia [Hornsey, 2003].

Marco Teorico 18

5.7.9 Envasado

Antes de llevar la cerveza a la maquina de llenado se inyecta CO2 en los tanques hasta

conseguir la saturacion deseada, para que la cerveza salga de su recipiente con una buena

capa de espuma [Hornsey, 2003].

Para alargar el tiempo de conservacion de una cerveza, sin que cambie de aspecto, se

esteriliza por medio de la pasteurizacion despues del envasado (las botellas pasan por un

tunel con agua a 70 oC), o con una pasteurizacion rapida antes de envasar (durante el

recorrido del tanque a la cadena de envasado la cerveza se calienta hasta 65 oC) [Hornsey,

2003].

5.7.10 Diagrama del Proceso de Elaboracion

El porceso descrito anteriormente se puede representar por el siguiente diagrama:

Fig. 5.2: Esquema de elaboracion de cerveza. (www.cerveceriaaustralis.com.ar).

Capıtulo 6

Materiales y Metodos

6.1 Tipo de estudio

Este trabajo se realizo de manera experimental, se analizaron los microorganismos pre-

sentes durante la elaboracion de cerveza artesanal. Para esto se tomo muestras en cada

una de las etapas de produccion de la cerveza.

6.2 Evaluacion de los puntos claves en el proceso de elab-

oracion

Mediante el desarrollo de este trabajo se pretende mejorar los porcesos de elaboracion

de cerveza artesanal en una microcervecerıa local. Una microcervecerıa libre de agentes

contaminantes tendra mayor posibilidad de ampliar su mercado y ofrecer un mejor pro-

ducto, por ello, se debe detectar los puntos de contaminacion en el proceso y eliminarlos

de una manera practica e inmediata.

Para eliminar las bacterias que contaminan la cerveza, lo que se necesita saber es en que

etapa del proceso de elaboracion de la cerveza son introducidas estas bacterias. Tambien

sera util saber que tipo de bacteria es, para tener una mejor idea de como tratar con

esta. Ciertos tipos de bacterias son mas susceptibles a tipos especıficos de saneamiento.

Incluso la fabrica de cerveza mas limpia alberga ciertos tipos de bacterias, y la cerveza,

en algun momento, puede entrar en contacto con algunas de ellas. Esto puede suceder

en cualquier etapa del proceso de elaboracion de la cerveza.

Parte del trabajo en las fabricas de cerveza es reducir al mınimo el numero de bacterias

que pueden ponerse en contacto con la cerveza. Pruebas y analisis periodicos de diversas

areas de la fabrica de cerveza daran una idea del trabajo que se esta haciendo respecto

19

Materiales y Metodos 20

a la proliferacion o no de las bacterias contaminantes.

Debido a que las bacterias se pueden introducir en cualquier etapa de la produccion, es

importante poner a prueba la cerveza en cada etapa de su elaboracion; por motivos de

tiempo, se ha decidio tomar las muestras en tres etapas de todo el proceso, estas son

en la activacion de la levadura, una vez terminada la fermentacion y en el producto ya

almacenado.

6.3 Toma de muestras

Se tomo tres muestras en cada etapa senalada, las muestras fueron manejadas utilizando

material esteril y su almacenamiento previo a la siembra se llevo a cabo bajo condiciones

de refrigeracion para evitar cualquier foco de contaminacion.

6.4 Tincion Gram

Para la identificacion de microorganismos presentes en alimentos y, en el caso particular

en muestras de cerveza artesanal, primero se debe identificar la morfologıa general de los

microorganismos de interes y clasificarlos segun su respuesta a la tincion Gram[Hornsey,

2003].

Esta tecnica es la tincion diferencial mas utilizada en Bacteriologıa pues permite separar

las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas[Jacques,

1999].

Una vez que se tuvo las muestras refrigeradas se realizo, como primer paso de iden-

tificacion, una tincion Gram y de esta manera se tuvo idea con que microorganismos

posiblemente se estuvo trabajando.

6.5 Medios de Cultivo

Una vez diferenciados por tincion Gram, que organismos estan presentes en las muestras

se preparo tres medios de cultivo en funcion de lo observado en la tincion.

6.5.1 Medio TSA

El primer medio, un medio estandar llamado TSA (por sus siglas Trypticasa Soya Agar).

Es un medio idoneo para el desarrollo de muchos microorganismos, entre ellos levaduras

y los posibles agentes contaminantes de cerveza. Para cada ensayo se preparo 400 mL


de agar, el cual se distribuyo en 20 cajas de Petri ( 20 mL en cada una) previamente

lavadas y esterilizadas en el auto clave.

6.5.2 Medio SDA

Es un medio exclusivo para levaduras. Conocido como Sabouraud Dextrosa Agar, per-

mite el crecimiento selectivo de levaduras y hongos. Para cada ensayo se preparo 100

mL de este medio selectivo y se lo distribuyo en 5 cajas de Petri (20 mL en cada una)

tambien lavadas y esterilizadas.

6.5.3 Medio MRS

Tambien un medio selectivo para varios microorganismos del genero Bacillus. Se preparo

400 mL para cada ensayo. Se distrbuyo el medio en 20 cajas esterilizadas.

6.5.4 Solucion salina

Precio a la inoculacion de las muestras en los medios de cultivo se realizo una serie de

diluciones de cada una de las muestras con el propısito de evitar una sobrepoblacion

de microorganismos. Estas diluciones se las hizo con una solucion salina. Para cada

muestra se preparo 8 tubos de ensayo de 25 mL en los cuales se hicieron las diluciones

correspondientes.

6.5.5 Inoculacion e incubacion

Una vez que se tuvo las diluciones de cada muestra se inoculo los medio de cultivo

con 1 mL de muestra por siembra en superficie y estriado simple y luego las cajas de

Petri fueron selladas con parafilm y almacenadas en la incubadora por 48 horas a una

temperatura de 32 oC.

6.6 Pruebas Bioquımicas de identificacion bacteriana

Luego de aislar las colonias bacterianas presentes en cada medio de cultivo se re-

alizo la identificacion de las bacterias. Para ello se preparon pruebas de identificacion

bioquımicas. Para este proyecto se utilizo las pruebas conocidas como API.


6.6.1 Pruebas API R©

Las pruebas de identificacion API R© son metodos simplificados que permiten identi-

ficar los microorganismos presentes en muestras a traves de un conjunto de pruebas

bioquımicas.

Existen varias pruebas API R© que sirven para la identificacion de una serie microorgan-

ismos, en este trabajo, en particular se utilizo las pruebas API R©: api 20E y api 50CH.

Estas son especıficas para Bacilos Gram negativos y Gram positivos respectivamente.

6.7 Recuento celular para Saccharomyces cerevisiae

El recuento de microorganismo es indispensable cuando se trabajo com productos de

consumo humano. En especial para la cerveza artesanal, la cual no es pasteurizada, se

dedbe controlar bien el numero de celulas de levadura que estuvieran presentes en el

producto que se dispensa al publico[Klimovitz, 2002].

En base a las normas INEN para bebidas alcoholicas una cerveza artesanal debe con-

tener un numero maximo de levaduras. De esta manera se asegura que el producto es

apto para el consumo humano.

En el desarrolo de esta proyecto se utilizo, para el recuento de levaduras, las placas

de cultivo selectivo para recuento denominadas Petrifilms, en funcion de la casa com-

ercial 3MTM PetrifilmTM . Estas placas contienen medios selectivos dependiendo del

microorganismo que se predende analizar, para el proyecto se utilizo las placas 3MTM

PetrifilmTM especıficas para Mohos y Levaduras.

En funcion del manual de la casa comercial, primero de deben realizar una serie de

dilusiones de la muestra e inocular 1 mL de cada dilusion en una placa de Petrifilm y

luego incubar por un perıodo de tiempo de 5 dıas. Finalmente observas las placas y con-

tar el numero de colonias de color azul-verdoso. En total se preparo 30 diferentes placas.

Capıtulo 7

Resultados

Luego del proceso de incubacion se observo todas las cajas macroscopicamente y se noto

que existıan varios tipos de colonias en cada medio. Los primeros resultados se muestran

en las siguientes figuras:

Fig. 7.1: Medio MRS (Caiza, 2013).

Fig. 7.2: Medio SDA (Caiza, 2013).

Ya identificadas las colonias se realizo una tincion Gram de cada una de ellas y se ob-

servaron los siguientes resultados bajo el microscopio optico:

23

Resultados obtenidos 24

Fig. 7.3: Medio TSA (Caiza, 2013).

Fig. 7.4: Medio MRS (Caiza, 2013).

Fig. 7.5: Saccharomyces cerevisiae. 100x. (Caiza, 2013).

Como se muestra en las figuras 7.1, 7.2, 7.3 y 7.4 existen varias colonias en los medios

de cultivo. Pero luego de realizar la tincion se obtuvo los microorganismos mostrados

en las figuras 7.5, 7.6 y 7.7.

Todas las imagenes anteriores muestran a los organismos que se encontraron en las

muestras tomadas en los tres puntos de control.

Para cada medio preparado se inoculo un total de 36 cajas de Petri, para los tres ensayos

en los que tomo las muestras en la microcervecerıa. Se inoculo estas con las dilusiones

10−4 y 10−5.


Fig. 7.6: Posible organismo contaminante. 100x.(Caiza, 2013).

Fig. 7.7: Posible organismo contaminante. 100x.(Caiza, 2013).

7.1 Medio TSA

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.1 a continuacion.

Muestra Dilucion No Cajas Inoc. Tiempo de Inc. (h) Crecimiento Observaciones

Activacion 10−4 6 72 Crecimiento Moderado Una sola colonia

Fermentacion 10−4 6 72 Poco Crecimiento Se observo diferentes colonias

Maduracion 10−4 6 72 Poco Crecimiento Se observo diferentes colonias

Activacion 10−5 6 72 Poco Crecimiento Una sola colonia

Fermentacion 10−5 6 72 Poco Crecimiento Se observo diferentes colonias

Maduracion 10−5 6 72 Ninguno No hubo colonias

Tabla 7.1: Resultados para la inoculacion de medio TSA.

7.2 Medio SDA

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.2 a continuacion.

7.3 Medio MRS

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.3.



Activacion 10−4 6 72 Crecimiento Moderado Se observo una sola colonia

Fermentacion 10−4 6 72 Crecimiento Moderado Se observo una sola colonia

Maduracion 10−4 6 72 Crecimiento Moderadoo Se observo una sola colonia

Activacion 10−5 6 72 Poco Crecimiento Se observo una sola colonia

Fermentacion 10−5 6 72 Poco Crecimiento Se observo una sola colonia

Maduracion 10−5 6 72 Poco Crecimiento Se observo una sola colonia

Tabla 7.2: Resultados para la inoculacion de medio SDA.


Activacion 10−4 6 72 Poco Crecimiento Se observo una sola colonia



Activacion 10−5 6 72 Ninguno No hubo presencia de colonias



Tabla 7.3: Resultados para la inoculacion de medio MRS.

7.4 Pruebas API (Identificacion Bioquımica)

Luego que se aislo los microrganismos presentes en las cajas de Petri se realizo pruebas

de identificacion bioquımicas conocidas como Pruebas API.

Para los resultados de este trabajo utilizo dos tipos de API: API 20E para bacterias

Gram Negativas (especialmente Bacilos) y API 50CH para bacilos Gram Positivos. Los

resultados se indican en las figuras 7.8 y 7.9.

Se realizo cuatro pruebas API en total: dos API 20E y dos API50CH.

Fig. 7.8: API 20E para bacterias Gram Negativas. (Caiza, 2013).


Fig. 7.9: API 50CH para bacterias Gram Positivas. (Caiza, 2013).

7.4.1 Interpretacion de Pruebas API

Los resultados de las pruebas API fueron ingresados en el programa en lınea de la casa

comercial que provee las pruebas. La direccion es:

http : //www.mediclim.ro : 81/jsp/ident/index.jsp

7.5 Recuento en Placa Petrifilm

Para concluir el proceso de estandarizacion del analisis microbiologico, se realizo un

recuento del numero de levaduras presentes en la cerveza ya envasada. Para esto se

utilizo las placas de Petrifilm que se inocularon e incubaron de acuerdo con el protocolo

de la casa comercial. Los resultados que se observaron en este ensayo se muestran en la

figura 7.10. Los resultados que se obtuvo para todas las muestras analizadas se resumen

en la tabla 7.4. Donde se indican los tres ensayos elaborados y de cada uno de ellos se

replico la prueba tres veces con tres dilusiones distintas, tambien se preparo un blanco

para cada dilusion.


Fig. 7.10: Placas Petrifilm para Mohos y Levaduras. (Caiza, 2013).

Muestra Dilucion No Placas No Colonias

Ensayo 1 10−3 3 0

Ensayo 2 10−4 3 0

Ensayo 3 10−5 3 0

Ensayo 1 10−3 3 0

Ensayo 2 10−4 3 0

Ensayo 3 10−5 3 0

Ensayo 1 10−3 3 0

Ensayo 2 10−4 3 0

Ensayo 3 10−5 3 0

Blanco 0 3 0

Tabla 7.4: Resultados para el recuento de levaduras en placas Petrifilm.

Capıtulo 8

Discusion

Para disenar un protocolo de control se requiere la toma de muestras periodicamente a

lo largo de todo el proceso para su analisis directo al microscopio y a traves de medios de

cultivo adecuados para obtener crecimiento de colonias y realizar una verificacion mas

especializada de las mismas [Hornsey, 2003].

Un adecuado control microbiolico en distinto puentos del proceso de fabricacion permite

corregir los errores de manipulacion y/o manejo de la materia prima involucrada y ası

obtener en producto de buena calidad [Hornsey, 2003].

Al concluir con las pruebas para los tres ensayos planteados y en base a los resulta-

dos obtenidos se puede afirmar que existen contaminacion en algunas de las muestras

analizadas. Para la muestra que se tomo al momento de la activacion de la Levadura

no se observo en las cajas de Petri algun tipo de contaminacion; pero respecto a las

muestras en las etapas de fermentacion y maduracion, los resultados indicados en las

tablas muestran que ya existe agentes contaminantes.

Al aislar estas colonias son los posibles organismos contaminantes se encontro que hay

dos tipos de bacterias claramnete diferenciables bajo la Tincion Gram: el primero es un

basilo Gram negativo no esporulado mientras que el segundo es un basilo Gram positivo

tambien sin esporas. En base a los resultados arrojados por las pruebas bioquımicas

API los posibles agentes contaminantes serıan Citrobacter en el caso Gram Negativo y

un tipo de Lactobacillus Gram Positivo.

Segun [Hough, 1990; Klimovitz, 2002; Hornsey, 2003] los posibles contaminates de una

cervecerıa pueden ser los generos Citrobacter y Lactobacillus spp. ya que estos generos

estan presentes en el ambiente y en los granos secos utilizados en la elaboracion.

Ademas se sabe que ambos generos son resistentes a pH bajos y tambien a cierttas con-

centraciones de etanol [Klimovitz, 2002].

29

Discusion 30

Pediococcos y Lactobacillus, pueden proliferar en la etapa de fermentacion, ya que al

ser los Lactobacillus generalmente insensibles a los amargos del lupulo, sobreviven en

un 5% de etanol, y son capaces de crecer en un rango de temperatura de 5 - 50 oC

[Hornsey, 2003]. Los Lactobacillus son heterofermentativos, y producen acido lactico,

acido acetico, dioxido de carbono, etanol y glicerol como productos finales [Hornsey,

2003].

El otro contanimante es Citrobacter, estos organismos no son muy tolerantes al etanol.

Soportan alrededor del 2% de etanol por lo que no representarıan una ameza muy directa

al producto finalpero sin duda en las etapas tempranas pueden ocasionar inconvenientes

[Klimovitz, 2002]. Todos los analisis y muestreos se llevaron a cabo bajo normas de

seguridad adecuadas pese a esto siempre existe riesgo de contaminacion externa; mi-

crorganismos presentes en el ambiente del laboratorio pudieron contaminar las mues-

tras. Esto hace que cualquier control de calidad para un analisis serio se haga bajo

circunstancias de extremo cuidado.

Respecto al recuento en placas de Petrifilm, en todos los casos analizados se obtuvo un

conteo nulo de colonias. Estos resultados pueden explicarse segun [Hornsey, 2003] por

una mala preparacion de las dilusiones inoculadas en cada placa, tambien podrıa ser el

caso que las placas ya estuvieran deterioradas. Por estas razones es necesario realizar

otras pruebas en las placas de Petrifilm cambiando los factores que estan involucrados.

Finalmente es importante recordar que un control de calidad microbiologico rutinario

no resolvera necesariamente los problemas de contaminacion. Sin embargo, ayudara a

identificar el problema, cuando este aparezca, para que puedan tomarse las medidas

apropiadas para eliminar tal problema [Klimovitz, 2002]. Un control de calidad mi-

crobiologico tambien revelara los problemas que ocasionalmente surgen en un producto

terminado que no sea resultado de una contaminacion microbiana, permitiendo ası im-

plementar correcciones y mejoras al proceso de elaboracion.

Capıtulo 9

Conclusiones y recomendaciones

• Al conocer detalladamente el proceso de elaboracion de cerveza artesanal se logro

establecer punto definidos de control de dicho proceso. Estos puntos son: acti-

vacion de levadura, fermentacion y proceso de maduracion.

• Con la inoculacion en los medios preparados se observo que en la etapa de acti-

vacion no existe contaminacion, salvo por dos cajas que presentaron un tipo de

contaminacion que luego de realizar las repeticiones se evidencio que no existıa.

• Para los procesos de fermentacion y maduracion se encontro dos agentes contami-

nantes: una bacteria Gram Negativa y otra Gram Positiva, ambos con estructura

de bacilos y sin la presencia de esporas.

• Las pruebas API revelaron que estos contaminantes son de los generos Citrobacter

y Lactobacillus. Ambos son los contaminantes mas comunes en la cervecerıas segun

lo reportado por la bibliografıa consultada.

• El recuento en Petrifilm tuvo resultados ilogicos, en todos los caos el conteo de

colonias fue nulo.

• Para un control microbiologico de un producto para el consumo humano se debe

tener un cuidado muy minucioso y seguir el protocolo establecidos de la mejor

manera para evitar errores de interpreatcion.

• Estandarizar un metodo de control microbiologico para un producto de consumo

humano resulta ser un proceso laborioso y en cierto grado complicado por todos los

facores que se deben tener presentes al momento de montar las pruebas a aplicarse.

En nuestro trabajo se cumplieron los objetivos planteados pero, sin embargo, no

se logro establecer el protocolo de control microbiologico.

31

Discusion 32

• Por esta razon se recomienda que el trabajo de continuar en funcion de las pruebas

que presentaron resultados dudosos o fuera de contexto.

• Para ello se recomienda tambien que en futuros trabajos se debe tener mas preacucion

al aplicar los protocolos, mejor manejo de materiales y adecuar un espacio es-

pecıfico para realizar todos los ensayos.

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Control microbiológico en cervecería

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