Tema: Control de Calidad Biológico y Microbiológico

Tema: Control de Calidad

Biológico

y Microbiológico

Preparado por el Dr. Dario A. Bianchi

~ ~ Año 2021 ~ ~

Área Análisis de Medicamentos

FCByF-UNR

<90> - CONTROL HIGIÉNICO DE PRODUCTOS NO

OBLIGATORIAMENTE ESTÉRILES

La calidad microbiológica de los productos farmacéuticos está

enormemente influenciada por el entorno, materiales y personas

involucradas durante su proceso de elaboración.

Potenciales Fuentes de Contaminación Biológica:

-MATERIA PRIMA

-MATERIAL DE ENVASE Y ACONDICIONAMIENTO

-EQUIPOS Y MAQUINARIAS

- PERSONAL

-MEDIO AMBIENTE Y CONDICIONES EDILICIAS

Control de Calidad Biológico

y Microbiológico



- Los productos no estériles son susceptibles de contaminarse con

microorganismos tales como bacterias, mohos y levaduras durante: -

proceso de elaboración (pesada, fabricación, llenado,

almacenamiento).

- Durante su uso. Productos multidosis.

- La contaminación de los productos farmacéuticos, puede reducir o

inactivar la actividad terapéutica del principio activo y por lo tanto

representa un riesgo para la salud del paciente.


y Microbiológico



- La presencia de estos microorganismos dependiendo de su

patogenicidad puede ocasionar infecciones o enfermedades que

afecten al paciente o consumidor.

- Materias primas y productos farmacéuticos terminados, deben ser

sometidos a un análisis microbiológico que demuestre que cumplen

con las especificaciones establecidas para garantizar que los

productos son adecuados para el uso al que están destinados.


y Microbiológico

<90> - Control higiénico de productos no

obligatoriamente estériles

Contempla los ensayos necesarios para estimar el

número de microorganismos aerobios viables

presentes y para determinar la ausencia de ciertas

especies microbianas en cualquier tipo de materia prima

o producto farmacéutico

Sanidad e Higiene en el Control de

Calidad de Medicamentos

Se establecen límites microbiológicos y se dividen en tres categorías según la

vía de administración:

-CATEGORIA 1

Categoría 1.1.

Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras

graves.

Categoría 1.2.

Productos para ser administrados por vía inhalatoria.

-CATEGORIA 2

Productos para ser administrados por vía nasal, ótica, rectal, tópica y vaginal.

-CATEGORIA 3

Productos para ser administrados por vía oral.





Límites de aceptabilidad microbiológicos:

Categoría 1.1.

Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras

graves.

• Ausencia de gérmenes revivificables.

Categoría 1.2.

Productos para ser administrados por vía inhalatoria.

• Recuento de aerobios viables totales: no más de 10 por gramo o mililitro.

• Ausencia de Enterobacteriaceae en un gramo o mililitro.

• Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gramo o mililitro.

• Ausencia de Staphylococcus aureus en un gramo o mililitro.





Límites de aceptabilidad microbiológicos:

CATEGORIA 2

Productos para ser administrados por vía nasal, ótica, rectal,

tópica y vaginal.

• Recuento de aerobios viables totales: no más de 102 por gramo

o mililitro.

• Ausencia de Enterobacteriaceae en un gramo o mililitro.

• Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gramo o mililitro.






Límites de aceptabilidad microbiológicos :

CATEGORIA 3

Productos para ser administrados por vía oral.

• Recuento de bacterias aerobios viables: no más de 103 por gramo o mililitro.

• Recuento de hongos y levaduras: no más de 102 por gramo o mililitro.

• Recuento de Enterobacteriaceae: no más de 102 en un gramo o mililitro.

• Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (solamente en forma farmacéutica

oral líquida) en un mililitro.


• Ausencia de Escherichia coli en un gramo o mililitro.

• Ausencia de Salmonella en un gramo o mililitro.







Este análisis o control microbiológico de las materias primas y de los

productos o medicamentos no estériles, involucra principalmente de

la realización de dos tipos de ensayos:

1) Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total

de microorganismos aerobios y el recuento total de mohos y

levaduras.

2) Investigación de microorganismos específicos: bacterias Gram

negativas tolerantes a bilis, Escherichia coli, Salmonella,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium, y

Candida albicans.


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FUNDAMENTO DEL ENSAYO

Estas pruebas se basan principalmente en la capacidad de

determinar la presencia de microorganismos a través del uso de

medios de cultivo: nutritivos, de enriquecimiento, selectivos y/o

diferenciales, capaces de permitir su recuperación a partir de

materias primas o productos no estériles y/o de evidenciar ciertas

características bioquímicas, producto del metabolismo de los

diferentes microorganismos a investigar.


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Condiciones para el ensayo:

-Los ensayos para detectar contaminación microbiológica se llevan

acabo en condiciones tales que previenen la contaminación

accidental de la muestra durante el ensayo.

-Las precauciones antes mencionadas no deben afectar a los

microorganismos que se desea detectar en el ensayo.




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Ejemplo:

MANITOL

Cuando en el rótulo se indica que Manitol esté destinado a la

preparación de formas farmacéuticas parenterales, el recuento de

microorganismos aerobios viables no debe ser mayor que 102

bacteria ni que 102 hongos por gramo, determinado por recuento

en placa. La sustancia en ensayo debe cumplir con el Ensayo para

Salmonella spp y Escherichia coli.




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<330> - ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Las endotoxinas son un componente de la membrana exterior de las

bacterias Gram negativas y son altamente tóxicas.

Provocan fiebre (pueden considerarse sustancias pirógenas),

malestar, afecciones respiratorias y estado de shock, llegando en

algunos casos a producir la muerte.

Las bacterias Gram negativas se encuentran en el medio ambiente,

principalmente contaminando los vegetales y estas bacterias se

multiplican rápidamente en el agua estancada ya que requieren muy

pocos nutrientes.


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<330> - ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS -El ensayo de endotoxinas bacterianas se aplica a la determinación o

cuantificación de endotoxinas provenientes de las bacterias Gram

Negativas, empleando como reactivo, lisados de amebocitos

circulantes de cangrejos. Lisados de amebocitos circulantes del

cangrejo herradura de Limulus Polyphemus (ensayo LAL).

-Cuando el lisado entra en contacto con soluciones que contienen

endotoxinas produce gelificación. La reacción requiere de ciertas

condiciones pH, temperatura y la presencia de cationes bivalentes.

- El lisado contiene un sistema enzimático que actúa en cascada y que

se activa progresivamente en presencia de endotoxinas. Como

resultado final, la proteína coagulable (coagulógeno) se transforma

en un gel (coagulina), siendo la base del método de gel en tubo.


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Los métodos descriptos son:

-métodos turbidimétricos: basados en los cambios de turbidez que ocurren

durante la formación de geles.

-métodos cromogénicos: basados en el desarrollo de color luego del clivaje de

un péptido sintético que contiene un cromóforo. Se libera p-nitroanilina

proporcionalmente a la presencia de endotoxina

Antes de llevarlo a cabo es necesario verificar:

1) que todos los materiales y reactivos a usar no contengan endotoxinas

bacterianas.

2) la sensibilidad del lisado, l, de acuerdo a los requisitos posteriormente

descriptos en cada método

3) la ausencia de factores interferentes en las muestras a analizar. Los

resultados son válidos siempre que se haya demostrado previamente que las

muestras a analizar no inhiban ni intensifiquen la reacción.


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Límite de Endotoxinas

Es necesario demostrar que los productos (materia prima y producto

terminado) a contienen una concentración de endotoxinas bacterianas

menor al límite especificado. La misma se expresa en unidades

endotóxicas por peso (UE/mg), por droga activa (UE/UI) o por volumen

(UE/ml).

Cuando no se cuenta con especificación de límite de endotoxina en las

monografías, se puede calcular tomando en cuenta la dosis y vía de

administración, empleando la fórmula siguiente:

K/M

en la cual K es la dosis máxima de endotoxinas admitida (UE) por Kg de

peso corporal en humanos y M es la dosis máxima (en mg o UI)

recomendada para ser administrada por Kg de peso corporal en humanos.


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MÉTODO DE GEL EN TUBO

- El método de gel en tubo permite establecer la presencia de

endotoxinas bacterianas empleándose como ensayo límite o como

determinación semicuantitativa el punto final es la constitución de

un gel firme. La determinación del punto final de la reacción se hace

mediante comparación directa con una Endotoxina control o de

referencia.

- Antes de llevar a cabo la determinación, se deben realizar los

ensayos de confirmación de sensibilidad del lisado y de inhibición o

intensificación.


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Ensayo para la confirmación de la sensibilidad del lisado La sensibilidad del lisado se define como la menor concentración de

endotoxinas que puede formar un gel firme en las condiciones del ensayo.

Se debe confirmar la sensibilidad indicada en el rótulo del Reactivo LAL

(Lisado de Amebocitos) de cada lote.

Máxima dilución válida (MDV) Es la dilución máxima de la muestra que corresponde a la máxima dilución

en la cual el límite de endotoxina puede ser determinado en las condiciones

del ensayo.

Ensayo límite

El objetivo del ensayo es comprobar que el producto a ensayar presenta un

contenido de endotoxinas menor al especificado en la monografía

correspondiente. Se prepara la muestra o la dilución de la misma que no

exceda la MDV (Máxima dilución válida) .


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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS:

turbidimétrico y cromogénico

Método turbidimétrico

Mide el cambio de turbidez (por absorbancia o transmitancia) durante la

transformación final de la proteína coagulante en coagulina. El valor de

velocidad del cambio de turbidez es función de la concentración de

endotoxina.

Método cromogénico cromogénico

Mide la concentración de un cromóforo liberado a partir de un péptido

cromogénico contenido en una solución de endotoxina incubada con un

lisado y un sustrato peptídico p-nitroanilina), empleando un onda apropiada

para la reacción.


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MÉTODOS CINÉTICOS:

-Método turbidimétrico - Mide el tiempo de reacción necesario para

el desarrollo de un grado predeterminado de turbidez de una solución

sobre la cual se agrega lisado, empleando un aparato apropiado.

-Método cromogénico – Mide el tiempo de reacción necesario para

el desarrollo de una intensidad predeterminada de color después de

la liberación de un péptido cromogénico, empleando un

spectofotómetro a la longitud de onda apropiada.

-En ambos métodos cinéticos, el logaritmo del tiempo de reacción

guarda una relación lineal con el logaritmo de la concentración de

endotoxina.


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AGUA POTABLE

Para ser denominada como tal debe cumplir con las normas de

calidad según la legislación divulgada por las autoridades locales

e internacionales.

El Agua Potable no está descripta por una monografía de la

Farmacopea Argentina pero debe cumplir con los requisitos

especificados para Agua Potable en Código Alimentario Argentino.

Ley Nacional 18.284/69, Capítulo XII: Bebidas Hídricas, Agua y

Agua Gasificada. Sin embargo, debe analizarse la calidad del

Agua Potable en el lugar de manufactura para corroborar su

adecuación a los parámetros de calidad establecidos.


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AGUA POTABLE -El agua potable puede ser empleada en la síntesis química y en las

primeras etapas de limpieza de los equipos empleados en los procesos

farmacéuticos de manufactura a menos que existan requerimientos técnicos

específicos o requerimientos de mayor calidad de agua.

-Características microbiológicas que debe cumplir el agua potable: -Bacterias coliformes: NMP (nº de gérmenes de máxima probabilidad) a 37ºC

– 48h, menor o igual a 3 en 100 mL.

-Escherichia coli: ausencia en 100 mL

-Pseudomonas aeruginosa: ausencia en 100 mL

-Mesófilos: 500 UFC/mL En el caso de que el recuento supere las 500

UFC/ml, y se cumplan con el resto de los parámetros indicados, solo se

deberá exigir la higienización de la planta y realizar un nuevo recuento.


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AGUA PURIFICADA

-El Agua Purificada es el agua empleada como un excipiente para

la preparación de todos los medicamentos que no requieran el uso

de Agua para Inyectables, a menos que la monografía del producto

especifique otra calidad de agua.

- Se prepara a partir de agua potable. Obtenida por medio de

destilación, intercambio iónico, ósmosis reversa o cualquier otro

proceso validado.

-Ensayo de endotoxinas bacterianas:

Cuando el Agua Purificada esté destinada a soluciones

concentradas para hemodiálisis, no debe contener más de 0.25

unidades de endotoxinas por mL.


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AGUA PARA INYECTABLES

-El Agua para Inyectables es el agua utilizada para la preparación

de formas farmacéuticas de administración parenteral y cualquier

otro uso indicado en esta Farmacopea, obtenida por medio de

destilación u ósmosis reversa de doble paso.

-Se prepara a partir de agua potable o purificada. Obtenida por

medio de destilación u ósmosis reversa de doble paso.

-Ensayo de endotoxinas bacterianas:

No debe contener más de 0.25 unidades de endotoxinas por mL.


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<370> - ENSAYOS DE ESTERILIDAD

-El siguiente ensayo se emplea para verificar la ausencia de

contaminación por microorganismos en productos esterilizados o

preparados asépticamente.

-Algunas consideraciones del ensayo:

- Evitar la exposición del área de trabajo a la luz ultravioleta directa

u otros agentes esterilizantes.

- Deben realizarse monitoreos microbiológicos del área durante los

ensayos.

-La ausencia de contaminación microbiana se realiza sobre un

número de muestras del lote y se hace una estimación de la

esterilidad probable de todo el lote. No se sabe con certeza si la

muestra analizada fue representativa.


Medio de Cultivo

Tienen como fin ofrecer las condiciones necesarias para que se

puedan desarrollar determinados microorganismos. Se lo puede

emplear con diferentes propósitos como ser: aislamiento e

identificación de microorganismos, pruebas de esterilidad, análisis

de agua y productos farmacéuticos, pruebas industriales, etc.

Componentes de los medios de cultivo:

-Peptonas: Materiales hidrosolubles derivados de las proteínas,

obtenidas por hidrólisis de fuentes protéicas como ser carne,

caseína, gelatina, leche, sangre, etc.

Se emplea principalmente como fuente de carbono y nitrógeno.


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Medio de Cultivo

-Indicadores colorimétricos: Algunos de los mas usados son:

Rojo fenol, azul de bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo

neutro.

-Indicadores de oxido-reducción: Azul de metileno y resazurina

son los más utilizados.

-Agentes selectivos: Permiten el crecimiento de algunos

microorganismos e inhiben la de otros. Son muy usados en los

ensayos de identificación de gérmenes en una flora mixta.

Algunos de ellos son:

Cristal violeta y verde brillante: inhiben microorganismos gram

negativos


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Medio de Cultivo

-Cloruro de sodio concentrado: inhibe casi todas las bacterias pero es

tolerado muy bien por los estafilococos.

-Agentes antimicrobianos: deben ser termoestable para que puedan

agregarse al medio y luego sea esterilizado en el autoclave (Cloramfenicol,

Cicloheximida, Sulfonamidas, Vancomicina, Trimetroprima, Neomicina). Para el

aislamiento e identificación de organismos anaerobios se usa la Kanamicina.

-Agentes reductores: son agentes que se agregaran para promover la

anaerobiosis y promover el crecimiento de algunos microorganismos

(tioglicolato de sodio, formaldehído, ácido tiomálico, hidrosulfito de sodio,

sulfoxilato de sodio, ácido ascórbico, cisteína).

-Agar: es un derivado de algas marinas y para el uso microbiológico debe

estar limpio y fundir a 80ºC y formar el gel a no más de 30ºC.


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<340> - ENSAYO DE PIRETÓGENOS El ensayo de piretógenos consiste en medir el aumento de la

temperatura corporal en el conejo, provocado por la inyección

intravenosa de una solución estéril del producto a ensayar.

Materiales y diluyentes

Emplear materiales y diluyentes estériles y libres de piretógenos

Registro de la temperatura -

Emplear un termómetro capaz de medir la temperatura con una

exactitud de ± 0,1 °C y que la lectura máxima se alcance en menos

de 5 minutos. Introducir el dispositivo elegido en el recto del conejo

a una profundidad no menor de 7,5 cm.

Animales para el ensayo

Emplear conejos adultos, sanos, machos o hembras, cuyo peso no

sea menor a 1,5 kg.


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<340> - ENSAYO DE PIRETÓGENOS

Alojamiento

Alojar los animales en un ambiente apropiado, a una temperatura

uniforme entre 20 y 23 °C.

Procedimiento

Realizar el ensayo sobre un grupo de tres conejos del mismo sexo,

en un área con condiciones ambientales similares al espacio donde

están alojados habitualmente y que ésta no presente una

variación de temperatura mayor a ± 2 °C. Los animales serán

privados de alimento desde la noche anterior hasta el final del

ensayo.


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Interpretación de los resultados

-El producto cumple con los requisitos del ensayo si ningún conejo

presenta una respuesta con una variación mayor o igual a 0,5 °C.

Si uno o más de los tres conejos presenta un aumento de

temperatura mayor a 0,5 °C se debe repetir el ensayo empleando

cinco conejos adicionales.

-El producto cumple con los requisitos del ensayo si no más de tres

de los ocho conejos presentan un aumento de temperatura mayor

o igual a 0,5 °C y si la suma de los aumentos de temperatura de

los ocho conejos no es mayor de 3,3 °C.


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Ejemplos:

Envases plásticos estériles para sangre humana o

hemoderivados

Los envases plásticos para la recolección, almacenamiento,

procesamiento y administración de sangre humana y hemoderivados

se fabrican de uno o más polímeros y estos materiales no deben

liberar monómeros u otras sustancias, en cantidades que puedan

ser nocivas o causen modificaciones anormales a la sangre.

Los materiales de los envases deben cumplir con los requisitos para

envases destinados a soluciones acuosas para perfusión

intravenosa.


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Envases plásticos estériles para sangre humana o

hemoderivados

ENSAYOS

Solución S1 - Llenar el envase con 100 ml de Solución fisiológica

libre de piretógenos (SR) estéril. Cerrar el envase y calentarlo en

autoclave, manteniendo la temperatura a 110 °C durante 30

minutos.

Piretógenos <340> - Inyectar 10 ml de la Solución S1 por cada kg

de peso del conejo. La Solución S1 debe cumplir con los requisitos

establecidos.


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SUCCINATO SÓDICO CLORANFENICOL

Cuando Succinato Sódico de Cloranfenicol esté destinado a la

preparación de formas farmacéuticas parenterales, debe cumplir con los

requisitos del ensayo. Inyectar a cada conejo 2,5 ml de una solución de

aproximadamente 2 mg de Succinato Sódico de Cloranfenicol por ml en

Agua para Inyectables, por kilogramo de peso corporal.

DICLOXACILINA SÓDICA

Cuando Dicloxacilina Sódica esté destinada a la preparación de formas

farmacéuticas inyectables, debe cumplir con los requisitos del ensayo.

Inyectar a cada conejo 1 ml de una solución de aproximadamente 20 mg

de Dicloxacilina Sódica por ml en Agua para inyectables, por kilogramo

de peso corporal.


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LACTOBIONATO DE ERITROMICINA

Cuando el Lactobionato de Eritromicina esté destinado a la preparación de

formas farmacéuticas parenterales, debe cumplir con los requisitos.

Inyectar a cada conejo 1,0l de una solución de aproximadamente 7,4 mg

de Lactobionato de Eitromicina por ml de Agua para Inyectables

(equivalente a 5 mg de Eritromicina), por kilogramo de peso corporal.

SULFATO DE POLIMIXINA B

Cuando el Sulfato de Polimixina B esté destinado a la preparación de

formas farmacéuticas de administración parenteral, debe cumplir con los

requisitos cuando se inyecta 1 ml de una solución de Sulfato de Polimixina

B de aproximadamente 1,5 mg por ml en Agua para inyectables por kg del

peso corporal del conejo.


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<80> - CONSERVANTES

-Los conservantes son sustancias auxiliares que se agregan a las

preparaciones oficiales para protegerlas de la contaminación microbiana.

-Cualquier agente antimicrobiano puede exhibir propiedades conservantes,

sin embargo, se debe tener en cuenta que todos los agentes

antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para evitar efectos adversos,

la concentración de los conservantes en el producto terminado debe ser la

concentración mínima que presenta el efecto antimicrobiano buscado y

considerablemente más baja que la concentración tóxica en seres

humanos.

-En ningún caso se debe emplear un conservante para prevenir

contaminaciones debidas a malas prácticas de elaboración.


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<80> - CONSERVANTES

Ensayo de eficacia Se emplean para demostrar su eficacia como tal en los productos

farmacéuticos que sean estériles o no y envasados en envases

multidosis.

- En el caso de productos no estériles, se han agregado para inhibir

el crecimiento de microorganismos que hubieran sido introducidos

accidentalmente durante o después del proceso de elaboración,

- En productos estériles (parentales, óticos, nasales u oftálmicos),

deben también inhibir el crecimiento de microorganismos que

pudieran introducirse por las extracciones repetidas de las dosis

individuales.


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<80> - CONSERVANTES

Ensayo de contenido Los métodos proporcionados aquí se emplean para demostrar que el

conservante está presente y su concentración no excede en más de ± 20

% la cantidad declarada.

-La concentración de un conservante agregado a una preparación

parenteral, ótica, nasal u oftálmica, monodosis o multidosis puede disminuir

durante la vida útil del producto.

-El fabricante determinará la menor concentración a la cual el conservante

es eficaz. En el momento de su elaboración, el producto debe contener la

cantidad declarada de conservante (dentro de ± 20 %, admitiendo las

variaciones debidas al proceso de elaboración)


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<80> - CONSERVANTES

Algunos ejemplos:

-Esteres del ácido p-hidroxibenzoico (metílico, etílico, propílico y butílico)

-Fenol

-Elcohol bencílico

-Clorobutanol

-Derivados mercuriales:

-nitrato fenilmercúrico

-tiomersal

Para la determinación de los derivados mercuriales se emplean métodos

Polarográficos y la cromatografía de gases se emplea en la determinación

del resto los otros conservantes.

Tema: Control de Calidad Biológico y Microbiológico

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