ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 01

Control de Calidad y Análisis Microbiológico de pescado

ASIGNATURA : Microbiología de los Alimentos II

DOCENTE : Blgo. Díaz Zapata Alberto

INTEGRANTES :

Arias Matos Lisbeth

Aycachi Inga Rómulo

Chafloque Millones Alex M.

Culqui Lozada Liliana

CICLO : 2008 - I

Lambayeque, 13 de junio de 2008.

INTRODUCCION:

El consumo de especies marinas está muy difundido en el Perú, siendo la mayor proporción de este consumo a lo largo de la costa peruana. Los pescados y mariscos son, por lo tanto, una fuente importante de alimento para la población y de ahí la importancia de su control, reglamentación y legislación.

Las caracteristicas particulares de los productos marinos lo hacen sumamente vulnerable a factores ambientales como temperatura y humedad, motivo por el cual, si no se lo conserva de manera idónea sufre una rápida degradación (putrefacción). Su alto contenido de proteinas y grasas también lo hace sensible a la rápida degradacion.

La legislación peruana marca determinados parámetros para el buen expendio, comercialización e industrial ización de los productos alimenticios en general y de los productos marinos en particular. Entre los parámetros establecidos se tiene lo referente a la calidad de la carne (que esté en buen estado: color, olor, consistencia, elasticidad), la cantidad mínima que debe contener la carne en lo referente a proteinas, carbohidratos, grasas, vitaminas y minerales, se toma también parámetros en lo referente a humedad, cenizas y la presencia de minerales pesados. En lo referente a la presencia de estos elementos, la legislación nacional e internacional actual es muy estricta en lo referente a metales pesados, estos elementos, que se encuentran, en la mayor parte de los casos, como contaminates en las aguas marinas y f luviales, son por hoy una gran amenaza para la salud de la comunidad. Metales como el plomo, cadmio, cobalto, mercurio, arsénico y muchos otros son responsables, además de la contaminación de mares y ríos (y de las comunidades biológicas que albergan las mismas) de causar una diversidad de enfermedades en los consumidores finales (humanos). Se asocian a la contaminación de mercurio problemas tales como cáncer de medula, l infomas, problemas neuromusculares. El plomo y el arsénico actuan como agentes de daño hepático y de riñón, efectos que pueden l levar a la muerte.

OBJETIVOS:

- Determinar la calidad bromatológica y microbiológica de una muestra de Jurel.

- Determinar los valores contenidos de nitrógeno, proteína, grasas, humedad y ceniza de la muestra tratada.

- Relacionar los valores obtenidos con parámetros de calidad en la muestra uti l izada (Jurel).

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CONTROL DE CALIDAD DE PESCADOS (Jurel)

DETERMINACION DE CENIZAS

FUNDAMENTO

La muestra se incinera a 600ºC para quemar todo el material orgánico. El material inorgánico, que no se destruye a esta temperatura se llama ceniza. A todos los componentes inorgánicos de los alimentos se les llama colectivamente ceniza, aunque algunos de ellos se volatilizan al quemar los alimentos. Esta ceniza contiene los minerales esenciales para el mantenimiento de la vida, siendo los más importantes: calcio, cloro, yodo, hierro, fósforo, potasio, sodio y azufre.

MATERIALES

Muestra: Pescado (Jurel). Horno de incineración (mufla). Crisoles de porcelana. Desecador, con desecante de depelorato de magnesio o silicagel. Balanza de precisión. Papel manteca. Espátula y escobilla. Pinza.

PROCEDIMIENTO

Colocar los crisoles limpios en una estufa a 105ºC durante una hora. Luego traslade los crisoles de la estufa al desecador y enfríelos a la temperatura del laboratorio.

Pesar 1 gramo de muestra y agregar al crisol de porcelana, luego colocar a la mufla y manténgalo a temperatura de 600ºC durante toda la noche.

A la mañana siguiente traslade el crisol al desecador y enfríelo a temperatura de ambiente. Cuando este frio, pese el crisol tan pronto como sea posible para prevenir la absorción de la humedad ambiental y se registre como peso.

Calculo:

% de ceniza =peso de ceniza x 100

Peso de la muestra

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DETERMINACION DE EXTRACTO ETEREO O GRASA

FUNDAMENTO

El solvente (éter dietílico) extrae la grasa de la muestra y la deposita en el beakers previamente tratado (pesado) y la diferencia de peso se obtiene la cantidad de grasa en la muestra.

MATERIALES

Éter dietílico, anhidro (C2H5)2.

Extractor de grasa GOLFISCH. Papel filtro. Beakers. Dedales huecos y con base. Balanza de precisión. Espátula y pinzas.

PROCEDIMIENTO

Se pesa la muestra 1gr. en el papel filtro, luego se coloca en los dedales huecos y se lleva al equipo con los vasos previamente pesados e identificados y además se les agrega 4 ml de (C2H5)2.

Seguidamente conectar la fuente de calor eléctrica. El solvente (éter) al calentarse (35ºC) se evapora y asciende a la parte superior del cuerpo. Allí se condensa por refrigeración con agua que cae sobre la muestra, regresando al beakers arrastrando consigo grasa. El ciclo es cerrado y la velocidad del goteo debe ser de 35 – 40 gotas por minuto; este proceso dura de 3 – 4 horas para que haya una buena extracción de grasa, luego se baja y se hace la recuperación de éter reemplazando los dedales huecos por los con base.

Después de bajar el vaso se coloca en la estufa a 105ºC y se dejan hasta el día siguiente, luego traslade el vaso de la estufa al desecador y enfríelos a la temperatura del laboratorio, péselos tan pronto como sea posible para prevenir la absorción de humedad ambiental, obteniendo el peso del vaso más la grasa, luego por diferencia de pesos se encuentra la grasa.

Cálculo:

% Grasa =Peso del vaso con grasa – Peso del vaso solo x 100

Peso de la muestra

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DETERMINACION DE NITROGENO Y PROTEÍNA TOTAL

(METODO DE MICRO KJELDAHL)

FUNDAMENTO

Se obtiene por la destrucción de materia orgánica, ya sea de un concentrado, forraje o cualquier compuesto nitrogenado, por acción del acido sulfúrico concentrado o en caliente obteniéndose como resultado sulfato de amonio, el cual después es destilado a amoniaco.

El procedimiento comprende de 3 fases: digestión, destilación y titulación.

Digestión : de la muestra por ebullición con H2SO4 concentrado y en presencia de catalizadores, la materia orgánica se oxida a CO2 y H2O mientras que una parte del acido se reduce a SO2.

Muestra + H2SO4 CO2 + 2 SO2 + 2 H2O + NH3

El nitrógeno transformado en NH3 se combina con la parte restante del acido sulfúrico para formar sulfato de amonio.

2NH3 + H2SO4 SO4 (NH4)2

Destilación : mediante esta operación el nitrógeno que está en forma de sulfato de amonio, se ataca con un álcali fuerte que es la soda caústica (NaOH) para liberar el amoníaco. El vapor de agua arrastra el amoníaco y después de la condensación lograda con la ayuda del refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en el Erlenmeyer.

SO4 (NH4)2 + 2NaOH SO4 Na2 + 2 NH3 + 2 H2O

El Erlenmeyer contiene ácido bórico, con los siguientes indicadores de pH, rojo de metilo y verde de bromo cresol, formándose borato de amonio.

Titulación : se hace con ácido clorhídrico de normalidad conocida. El HCl reacciona con el borato de amonio. En el punto final ya no hay borato de amonio y un pequeño exceso de HCl provocara un cambio del pH y el consiguiente viraje de la mezcla.

MATERIALES

H2SO4 concentrado. NaOH Acido Bórico (H3BO3) indicador de pH Sulfato de Cobre (CuSO4. 5H2O) Sulfato de Potasio (K2SO4) HCL al 0.02N.

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Solución indicadora (rojo de metilo + ácido bórico) Equipo de digestión y destilación micro Kjeldahl. Balones de digestión. Erlenmeyer. Buretas. Papel cebolla (libre de nitrógeno).

PROCEDIMIENTO

Pesar 0.3gr de muestra, luego agregar 0.5gr de catalizador de oxidación, para acelerar la reacción, agregar 2.5 mL de H2SO4 concentrado y colocar el balón en la cocina de digestión, este termina cuando el contenido del balón es completamente cristalino o verde clarito.

Colocar la muestra digerida en el aparato de destilación, agregar de 7 a 10mL de NaOH e inmediatamente conectar el vapor para que produzca la destilación. Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un Erlenmeyer conteniendo 15mL de solución de indicadora; la destilación termina cuando ya no pasa más amoniaco y hay viraje del indicador, luego se procede a la titulación con HCl 0.02N , anotar gasto.

Cálculos:

% Nitrógeno =Gasto de HCl x N(ácido) x miliequivalente del Nitrógeno x 100

Peso de la muestra

% Proteínas = % Nitrógeno x 6.25

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DETERMINACION DE MATERIA SECA

FUNDAMENTO

El método más generalizado para esta determinación, se basa en la pérdida de peso que sufre una muestra, por calentamiento hasta obtener peso constante.

MATERIALES

Estufa Termómetros. Balanza de precisión. Crisoles de porcelana. Espátula y escobilla. Bandeja, tijeras y pinzas.

PROCEDIMIENTO

Colocar los crisoles limpios en una estufa a 105ºC durante 1hora, luego traslade los crisoles de la estufa al desecador y enfríelos a la temperatura del laboratorio.

Péselos tan pronto como sea posible para prevenir la absorción de la humedad ambiental.

Pesar 1 gramo de muestra y agregar al crisol de porcelana, una vez hecho esto se lleva a la estufa a 105ºC dejar por espacio de 12 horas o sino es preferible que a la mañana siguiente trasladar el crisol al desecador dejar enfriar a temperatura de ambiente. Cuando este frio pese el crisol tan pronto como sea posible para prevenir la humedad y registre el peso.

Cálculos:

100 - % de Materia Seca = % de Humedad

100 - % de Humedad = % de Materia Seca

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DETERMINACION CUALITATIVA DE PLOMO

FUNDAMENTO:

Esta determinación está basada en la demostración cualitativa de la presencia de restos de Plomo en la muestra al ser acidificada con HCl al 10% y calentada, el desprendimiento de vapores cargados de restos de Pb reaccionará con un papel filtro impregnado con acetato de Pb. Su positividad se demostrará por el oscurecimiento del papel, por la acumulación y oxidación del Pb presente.

MATERIALES:

Tubo de ensayo Mechero de alcohol Pinzas para tubos Acetato de Plomo Papel filtro Ácido clorhídrico al 10%

PROCEDIMIENTO:

Pesamos exactamente 2.5 g de muestra, en este caso músculo del pescado.

Luego, en un tubo de ensayo agregamos la muestra y la impregnamos con 10 mL de HCl al 10% (tiene que tapar la muestra).

Luego la tomamos con la pinza para tubos y la ponemos a calentar en un mechero hasta que empiece el desprendimiento de gases (vapor).

Inmediatamente cuando esto suceda, tapar la boca del tubo de ensayo con un papel filtro humedecido con acetato de plomo.

Observar el viraje (oscurecimiento) del papel filtro en caso de positividad, de no ser así, el papel seguirá del mismo color.

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ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ESPECIES MARINAS (Jurel)

DETERMINACION DE PSEUDOMONADACEAS EN PESCADO

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10-1 10-2 10-3

Diluciones

3 g de muestra

+

27 mL caldo pept.

9 mL CP 9 mL CP

Caldo GSP Glutamato

1 mL 1 mL 1 mL

Doble Concentrado Concentración Simple

Incubar a 37º C x 24 h

SEMBRAR (Escoger de tubos positivos)

Agar GSPAgar Cetrimide

AISLAMIENTO

IDENTIFICACION

RESULTADOS:

Determinación de cenizas:

% de ceniza =peso de ceniza x 100

Peso de la muestra

% de ceniza =0.1039 x 100

1

% de ceniza = 10.39 %

Determinación de extracto etéreo o grasa:

% Grasa =Peso del vaso con grasa – Peso del vaso solo x 100

Peso de la muestra

% Grasa =61.545 – 61.335 x 100

1

% Grasa =0.21 x 100

1

% de Grasa = 21 %

Determinación de Nitrógeno y Proteínas totales:

Determinación de Nitrógeno total:

% Nitrógeno =Gasto de HCl x N(ácido) x miliequivalente del Nitrógeno x 100

Peso de la muestra

10

% Nitrógeno =112.3 x 0.02 x 0.014 x 100

0.3

% Nitrógeno =0.0314 x 100

0.3

% Nitrógeno =3.14

0.3

% de Nitrógeno = 10.46 %

Determinación de Proteína total:

% Proteínas = % Nitrógeno x 6.25

% Proteínas = 10.46 x 6.25

% de Proteínas = 65. 375 %

Determinación de Materia Seca Total:

- Para hallar la materia seca total se realizan los sgtes. cálculos:

% Materia seca

=(Peso de crisol + muestra) – Peso de crisol vacío x 100

Peso de la muestra

% Materia seca

=26.0641 – 25.1200 x 100

1

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% Materia seca

=0.9441 x 100

1

% Materia seca = 94. 41 %

- Con este dato, podemos hallar el valor, en porcentaje, de la humedad:

% de Humedad = 100 - % de Materia Seca

% de Humedad = 100 - 94.41

% de Humedad = 5.59 %

Determinación cualitativa del Plomo:

- Realizado el procedimiento de determinación cualitativa del plomo, no se llegó a determinar la presencia de este metal (no hubo coloramiento del papel filtro).

Determinación de Pseudomonadaceas en pescado:

- Realizadas las pruebas bacteriológicas a las muestras traidas de puestos de venta de pescado del Mercado Modelo, se llegó a aislar Pseudomonas sp.

- Este microorganismo tuvo las sgtes. características:

o Bacilos Gram negativos, rectos, aislados.

o Movilidad positiva.

o Oxidasa positiva.

o Fermentación de carbohidratos: glucosa (+), maltosa (+), lactosa

(+), manitol (+), arginina (-), arabinosa (+).

o Crecimiento en medio líquido: película y turbidez.

o Pigmentación amarillo verdoso.

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Determinación cuantitativa de Pseudomonadaceas (NMP)

- Para la determinación cuantitativa de Pseudomonadaceas presente en las muestras de pescado (Jurel) se utilizó como medio al Caldo GSP con Glutamato.

- La positividad de la prueba se determinó por el viraje en el medio del rojo de fenol, el cual, por la acidez producida por el consumo de almidon del medio, cambia a amarillo.

- Se incubó a 37 ºC por 24, pasado el tiempo se obtuvo positividad en todos los tubos, dando como resultado los sgte. Números: 3 - 3 - 3.

- Entonces, cotejando con la tabla del NMP, se obtuvo el sgte. Resultado:

NMP

MUESTRA Código NMPNMP de

microorg./g

Pescado (Jurel) 3 – 3 – 3 > 1100

CONCLUSIONES:

- Se determinó la calidad Bromatológica a una muestra (Pescado: Jurel), estando esta, de acuerdo a los datos obtenidos, dentro de los parámetros permitidos para su consumo.

- Se concluye que de acuerdo a los análisis Microbiológicos, la muestra analizada no es apta para el consumo (de acuerdo a los valores obtenido en la tabla para NMP de tres tubos), estando por encima de 1100 microorg./g

- Se obtuvo los sgtes. resultados de las pruebas bromatológicas realizadas en la muestra de Pescado (Jurel): % de Ceniza = 10.39%, % de Grasa = 21%, % de Nitrógeno = 10.46%, % de Proteína = 65. 375 %, % Materia Seca Total = 94. 41 %, % de Humedad = 5.59 %.

- De acuerdo a la información dada por el Jefe del Laboratorio de Bromatología (Prof. Reupo Periche) los valores obtenidos son similares a los análisis realizadas a una muestra de anchoveta, estando por tanto dentro de los valores normales. En el laboratorio de Nutricion de la Facultad de Zootecnia, el Tecnico Collantes Díaz (que nos ayudó en la

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realización de las pruebas bromatológicas), los resultados obtenidos estuvieron dentro de los límites permisibles para el consumo, siendo, por tanto de mediana calidad y apto para el consumo humano.

- Los valores elevados obtenidos en la técnica del NMP para tres tubos pueden explicarse por la mala manipulación del producto y también al lugar de almacenamiento, al ambiente y a que la muestra no estuvo refrigerada el momento de su expendio y transporte, apresurando así los procesos de degradación de la muestra.

REFERENCIAS:

- ALGORTA, G. (2005). Bacilos Gram Negativos No Exigentes: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonas. Obtenido el 15 de febrero de 2008 en http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf

- Vibrio (2005) Obtenido el 7 de marzo de 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/vibrio.pdf

- FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Investigación y recuento de B. cereus. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- FUENTES, A. F. y otros (2005). Calidad Sanitaria de Alimentos Disponibles al Público de la Ciudad de Sonora, México. Revista Salud Pública y Nutrición. Vol. 6 Nº 3. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.respyn.uanl.mx/index.html

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ANEXOS:

DIAGRAMA DE COMPOSICIÓN QUIMICA DE LOS ALIMENTOS

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ALIMENTO

MATERIA ORGANICA MATERIA INORGANICA

COMPUESTOS NITROGENADOS

CARBOHIDRATOS GRASAS CENIZAS AGUA

AMINOACIDOS

PROTEINAS

COMPUESTOS NTROGENADOS

COMPLEJOS

MINERALES

DIAGRAMA DE ANÁLISIS QUIMICO DE LOS ALIMENTOS

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% HUMEDAD

(Agua)

% CENIZAS

(Minerales)

% DE EXTRACTO ETEREO (Grasas, Pigmentos, Ceras)

% NITROGENO

(x 6.25 = Proteínas)

% FIBRA CRUDA

(Celulosa, Lignina)

ALIMENTO

% DE EXTRACTO NO NITROGENADO (Azucares, Polisacáridos)

100 - TOTAL

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IMÁGENES DE LOS PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRACTICA

Procesamiento de la Muestra:

Determinación cualitativa de Plomo:

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Equipo de molienda de la muestra

Determinación de grasas y proteínas:

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Determinación microbiológica:

Crecimiento en placa:

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Obtención de cepa y pruebas de identificación (pruebas bioquímicas)

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