Composición en ácidos grasos (método de cromatografía gas-liquido) Aplicación: El método es aplicable a todos los tipos de lípidos que contenga

ácidos grasos dentro del rango C10:0 a C 22:6

Principio: La muestra de grasa es transmetilida y los esteres metílicos , una vez purificados, se separan por cromatografía gas-liquido.

Reactivos: Mezcla de transmetilación . Mezclar 150 ml de metanol y 70 ml de tolueno.

Enfriar bajo chorro de agua corriente y añadir cuidadosamente, bajo agitación , 7.5 ml de ácido sulfúrico concentrado (peso especifico 1,84).

Éter de petróleo con punto de ebullición dentro del rango 40-60C.Sulfato sódico anhidro en gránulos.Columna rellena de adipato de polietilénglicol al 15% sobre A.W. celita de 100-

200 mesh.

AparatosCromatógrafo gas-líquido columna única detector de ionización de llama, 60 mL

Ar por minuto como gas portador, 50 mL H por minuto, 400 mL de aire por minuto, temperatura del horno 200°C, velocidad de la carta de registro 120 mm por hora. Columna de vidrio 215 cm de longitud y 3 mm de diámetro interno.

Procedimiento1.- Pesar 10-20mg de grasa en un matraz de 50ml de fondo redondo (Nota1)2.- Añadir 10 ml de mezcla de transmetilación.3.- Calentar sobre baño de vapor durante 1 ½ horas bajo flujo.4.- Enfriar, añadir 10ml de éter de petróleo y 10ml de agua.5.- Tapar el matraz y agitar bien.6.- Dejar separar las capas y eliminar la capa acuosa inferior con una pipeta

Pasteur.7.- Repetir el procedimiento de lavado con otros 10ml de agua.8.- Añadir suficiente sulfato sódico (2-3g) para calificar la solución del éter.9.- Decantar la capa de éter de petróleo clara hacia un tubo y evaporar a

sequedad bajo nitrógeno.10.- Disolver el residuo en un pequeño volumen de éter de petróleo (0.3ml).11.- Inyectar en la columna una alícuota de 5 ul de la solución de esteres

metílicos de los ácidos grasos.12.- Aumentar la sensibilidad del amplificador tras la evolución del acido

linoléico (C18:2) si se encuentran presentes ácidos grasos de cadena larga superior a C20:0

13. Identificar los esteres metílicos eluidos por referencia a esteres conocidos determinado sus volúmenes de retención.

CálculoLos cromatogramas de los éteres metílicos de los ácidos grasos separados se

obtienen con el registrador pontenciométrico. Las aéreas de los picos pueden

medirse manualmente o utilizando un dispositivo integrador electrónico conectado a la salida del detector. La medida manual del área de los picos se puede hacer convenientemente a partir de la altura del pico y su anchura 0.607 de la altura del pico (sin el atenuador se ha cambiado durante el análisis hay que hacer las correcciones oportunas.)

Suponer que la respuesta del detector de ionización de llama a los esteres metílicos de los ácidos grasos sea constante; en tal caso del área del pico es proporcional al peso del ácido graso.

Si: Área del pico de los ácidos grasos individuales (A, B, C, etc.) = a, b, c…Entonces: Contenido del ácido A (%)= ( a/ (a+b+c) x100Similarmente por los ácidos B,C, etc.La identificación de los ácidos grasos C10:0 a C18:2 no suelen representar

problemas. Sin embargo, el número de isómeros posibles de los ácidos grasos C20 hace la identificación más difícil. Existen tres métodos de identificar los éteres metílicos de los ácidos grasos.

(a) Representación grafica de log10 del tiempo de retención frente a la longitud de la cadena carbonada. Utilizando está técnica los ácidos grasos saturados dan el número entero de átomos de carbono ( por ejemplo, el ácido palmílitico C16:0 tiene un número de 16 C).

Por lo tanto, a partir de una mezcla de esteres metílicos de ácidos grasos conocidos puede determinarse el número de átomos d carbono por una serie de patrones y relacionados con los picos desconocidos de una mezcla.

(b) Análisis utilizando una fase estacionaria no polar. Los esteres metílicos de los ácidos grasos son eluidos por una columna polar, como el adipato de polietlénglicol, en una orden de polaridad creciente en toda la serie que pósese el mismo número de átomos de carbono ( es decir, el volumen de retención varia en el orden C18:2 > C18:1 > C18:0). Este orden de evolución se invierte cuando se utiliza una columna no polar (por ejemplo, Apiezon L al 10% sobre A.W. celita de 100/120 mesh). De esta forma los volúmenes de retención de los ácidos grasos insaturados pueden reducirse apreciablemente. En consecuencia, el análisis separado usando los sistemas polar y no polar originan dos series de números de átomos de carbono que pueden utilizarse con fines de identificación. La identificación de los esteres metílicos de los ácidos grasos a partir de los datos de retención como se ha descrito en más segura cuando se utilizan tanto en la fase polar como no la polar.

(c) Cromatografía de gases/espectrometría de masas. Cuando se precisa la confirmación adicional se combinan ambas técnicas.

ReferenciasOsborne, D.R. y Voogt P.(1986). Análisis de los nutrientes de los alimentos.

Zaragoza , España: Acribia.