Colorantes-HEMATOLOGICOS

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

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1. El color y los colorantes HEMATOLOGICOS

2. El color y las estructuras celulares

3. Problemas TECNICOS en las tinciones

4.

Casos de morfología

2

3


¿Qué es un COLOR?

Es la longitud de onda del espectro de LUZ VISIBLE que absorbe y refleja un

cuerpo

Espectro de la luz visible:

380 nm........Violeta

780 nm..........Rojo


Un cuerpo es BLANCO cuando “refleja” todas las longitudes de onda

Un cuerpo NEGRO “absorbe” todas las longitudes de onda

Un cuerpo ROJO “absorbe” todas las longitudes de onda menos las rojas

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BASOFILO NEUTROFILO

¿Qué es un COLORANTE?

Un colorante es una sustancia con capacidad de transmitir

un color a un sustrato

Debe penetrar e interactuar con las estructuras

moleculares de las células

HEMATIES PLAQUETAS 5


Las estructuras celulares que vamos a teñir deben ser tratadas previamente, mediante la FIJACION

La FIJACION es un proceso físico- químico que inmoviliza determinadas estructuras celulares, y que permite que puedan ser posteriormente coloreadas sin ser arrastradas en el proceso

EOSINOFILOS 6


Durante la FIJACION se producen varios fenómenos:

Se “coagulan” las proteínas celulares conservando su arquitectura

Pueden perderse algunas sustancias no esenciales para la interpretación citomorfológica; los alcoholes disuelven las grasas

Las extensiones sanguíneas se pueden fijar con calor seco, alcoholes, formaldehído, acetona, etc. El mejor fijador para morfología es el metanol (alcohol metílico)

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS ¿QUE PRETENDEMOS CON LAS TINCIONES?

1. Identificar las células

2. Identificar sus estructuras internas

Densidad de la cromatina

Presencia de nucléolos

Citoplasma: Características

Granulación

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CELULA PLASMATICA (LINFOCITO B): A LA IZQUIERDA IMAGEN AL MICROSCOPIO ELECTRONICO Y A LA DERECHA UN ESQUEMA DE LA MISMA

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MITOCONDRIAS

NUCLEO

APARATO DE GOLGI

RETICULO ENDOPLASMICO CON RIBOSOMAS

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NUCLEO

CONTIENE ADN Y PROTEINAS ESPECIFICAS

SU MAYOR O MENOR DENSIDAD, EQUIVALENTE A MAS O MENOS MADUREZ, SE TRADUCE POR UNA COLORACIÓN +/– INTENSA

LA PRESENCIA DE NUCLEOLOS (ACUMULACION DE ARN PROPIA DE CELULAS INMADURAS) SE VE COMO UNA ZONA CLARA RODEADA DE UN HALO MAS INTENSO

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RETICULO ENDOPLASMICO RUGOSO

ES EL LUGAR DONDE SE SINTETIZAN LAS PROTEINAS DE LAS CELULAS

ES MUY RICO EN ARN (RIBOSOMAS) CUYO CARACTER ACIDO ATRAE A LOS COLORANTES BASICOS

A VECES MUESTRA DILATACIONES QUE AL MICROSCOPIO PARECEN PEQUEÑAS VACUOLAS

SU PRODUCCION SE ENVIA AL APARATO DE GOLGI, Y DE ESTE AL EXTERIOR

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ESTRUCTURAS GRANULARES

MITOCONDRIAS

LISOSOMAS

CENTRIOLOS

GRANULOS DE GLUCOGENO

VACUOLAS

OTRAS

SE OBSERVAN CON EL MICROSCOPIO OPTICO COMO GRANULOS, MAS O MENOS GRANDES, QUE ADQUIEREN DISTINTA COLORACION SEGUN SU CONTENIDO

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¿QUÉ “COLOR” TRANSMITE UN COLORANTE?

NEUTROFILO

1. El suyo propio

2. Un color distinto: metacromasia

BASOFILO

3. Más de un color: alocromasia

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¿COMO “TRANSMITE” EL COLOR?

Coloración = impregnación del sustrato

Reacción química = citoquímica

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MECANISMO USUAL DE COLORACION

ATRACCION ELECTROSTATICA

+ -

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Coloración: Afinidad de carga eléctrica del colorante por el sustrato celular

Directa: Se produce una unión electro polar entre colorante y sustrato

Indirecta: El colorante necesita una “pieza de unión” intermedia, a la que se

denomina “mordiente”

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Los “mordientes” suelen ser metales: aluminio, molibdeno, cromo, vanadio, etc

Colorante Mordiente Sustrato

El conjunto colorante + mordiente se denomina “laca”

Ejemplo: Tanto la Hematoxilina como el Rojo Nuclear emplean el Aluminio como mordiente

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Coloración “progresiva”

Se añade al sustrato celular el colorante muy diluido (por ej. al 1%), y se deja durante tiempos diferentes en distintas muestras. Se observa la tinción de distintas estructuras de manera progresiva

Coloración “regresiva”

Partiendo del colorante muy concentrado, se enjuagan gradualmente las muestras (“diferenciación”) hasta lograr la mejor visualización de determinadas estructuras celulares

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METACROMASIA

Fenómeno tintorial en el que un colorante determinado tiñe a un sustrato celular en un color diferente al propio

AZUL DE TOLUIDINA

Tiñe de color ROSA los gránulos de los basófilos

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METACROMASIA

Los gránulos de los BASOFILOS contienen mucopolisacáridos ácidos con grupos sulfatos [-] a menos de 5 Å unos de otros

Las moléculas de Azul de Toluidina (intensamente básicas +) se unen apretadamente configurando una tonalidad final rosada (fenómeno de basofilia)

BASOFILO

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PARTES DE UN COLORANTE

GRUPO CROMOFORO: son grupos de átomos en resonancia (e- en vibración) que predisponen a la molécula a ser colorante

FRACCION CROMOGENA: constituyen la mayor parte de la molécula, a la que da color (“peso y densidad”)

GRUPO AUXOCROMO: portador de la carga eléctrica, positiva o negativa, que se une al sustrato

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ANILINA

O2N - - NH2+ / Cl-

cromóforo cromógeno auxócromo

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Grupos cromóforos: -NO (nitroso)

-NO2 (nitro)

-N=N- (azo)

-C=S (tio)

Son grupos atómicos en resonancia (nubes de electrones en vibración), que confieren una “aptitud” colorante a la molécula. Aportan el color de base: morado en el caso de la anilina

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Fracción cromógena

Anillo bencénico

Cuanto mayor sea el peso de esta fracción mas intensa será la acción colorante

Pueden ser cíclicos (derivados de Benceno, Antraceno o Naftaleno) o Acíclicos (Etil, Metil,...)

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Grupos auxócromos

Catiónicos (+): Amina primaria –NH2 Amina secundaria -NH- Derivados arílicos y alquílicos

Aniónicos (-): Carboxilo –COOH Sulfónico –SO3H

Oxidrilo –OH Fosfórico PO4H3

Nota: Actúan como lugar de “enganche” al sustrato celular. Para ser “activos” deben hallarse como sales solubles (sódicas, potásicas, cloruros, sulfatos, etc)

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COLORANTES BASICOS

Los AUXOCROMOS CATIONICOS o básicos (+) se salifican con los ácidos (-) del sustrato:

BASOFILO

BASOFILIA

afinidad del sustrato celular [-] por colorantes básicos [+]

BASOFILIA INTENSA MA DE EN EL CITOPLAS 27

UN PLASMOCITO


COLORANTES ACIDOS

Los AUXOCROMOS ANIONICOS o ácidos (-) se salifican con las sustancias básicas (+) contenidas en las estructuras celulares:

ACIDOFILIA

afinidad del sustrato celular [+] por colorantes ácidos [-]

EOSINOFILO

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COLORANTES NEUTROS

Sus moléculas contienen AUXOCROMOS CATIONICOS Y ANIONICOS, que les permite presentar acidofilia y basofilia según los sustratos celulares sobre los que se fija. Ejemplo:

Eosinato de azul de metileno

[+]/Cl- [-]/Na+

BASOFILIA - +

CELULA

ACIDOFILIA

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COLORANTES NEUTROS

Suelen emplearse diluidos en soluciones alcohólicas (metanol con frecuencia), en las que existe un equilibrio entre los iones [+] y [-]

NEUTROFILO

Ejemplo: El eosinato de azul de metileno tiñe los núcleos de las células reaccionando con los ácidos nucleicos (azul de metileno[+]) y con las nucleoproteínas (eosinato[-])

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COLORANTES NEUTROS

Variando el pH del medio en el que interaccionan el colorante y los sustratos celulares, se puede modificar la afinidad y por tanto la coloración final

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COLORANTES NEUTROS

Las proteínas celulares contiene grupos aminos y grupos ácidos:

Cualquier proteína a un pH inferior a su punto isoeléctrico (PI) se carga [+], con lo que tendrá mayor afinidad por los colorantes ácidos [aniónicos -].

Por el contrario, si elevamos el pH por encima de su PI se pondrán de manifiesto sus cargas [-], aumentando su avidez por los colorantes básicos [catiónicos +].

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COLORANTES NEUTROS

HEMOGLOBINA: proteína eritrocitaria rica en grupos ácidos (-COO-) y amino (-NH2). La tinción de MGG proporciones varias coloraciones:

= Sepia (beige claro), a pH 7 - 7.2

= Rosa a rojo, a pH 6.4 – 6.8 (útil si policromasia)

= Gris-azulada, a pH 7.2 – 7.6

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pH 6.8

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COLORANTES NEUTROS

NEUTROFILO

Normalmente para teñir extensiones de

citologías sanguíneas se emplean colorantes “químicamente neutros”, con los que se obtiene una:

TINCION PANCROMATICA,

ó una TINCION PANOPTICA

LINFOCITO

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En 1.891, ROMANOVSKI empleó una solución acuosa de Azul de Metileno para teñir una muestra de sangre con Plasmodios, en la que habían aparecido colonias de hongos después de 3-4 meses.

Sorprendido, observó que los núcleos de los polimorfo nucleares adquirían un tono rojo púrpura, mientras el citoplasma permanecía más o menos azulado.

TINCION NORMAL CON AZUL DE

METILENO

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AZUL DE METILENO CH3

N+ auxócromo CH3

cromógeno S N cromóforo

CH3

N+

CH3

auxócromo

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AZUL

AZUL DE METILENO

-CH3

AZUR B

AZUL-VIOLETA

-CH3

AZUR A

VIOLETA-ROJO

-CH3

ROJO OSCURO

VIOLETA DE METILENO

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El azul de metileno y sus derivados aportan 3 colores principales:

Rojo

Azul

Violeta

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TINCION PANCROMATICA

Una SOLUCION UNICA, compuesta por varios colorantes y sus derivados químicos en solución aportan toda una gama de colores

NEUTROFILIA

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TINCIONES PANCROMATICAS

De los trabajos de ROMANOVSKI, y de otros autores como LEISHMAN, WRIGTH, GIEMSA, TRIBONDEAU, etc, derivan las actuales tinciones pancromáticas, basadas en diversas combinaciones de:

Azul de metileno y sus derivados (azures)

Eosina

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TINCIONES PANCROMATICAS

COLORANTE DE WRIGHT: Resulta de la demetilación del Azul de Metileno (AM) en un medio muy alcalino (CO3HNa) y a 1 atmósfera de presión, obteniéndose sucesivamente una mezcla de:

Azul de Metileno

+ Azur B (I)

+ Azur A (II)

+ Violeta de Metileno 42


TINCIONES PANOPTICAS Empleo sucesivo de 2 o más soluciones colorantes.

En general son de mayor calidad cromática que las tinciones pancromáticas

Ejemplo: La Tinción de May-Grünwald-Giemsa

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TINCIONES PANOPTICAS

COLORACION DE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA

(o panóptica de Pappenheim)

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GIEMSA: - Eosinato de Azur II (azur A)

- Azur II al 0.76% en glicerina y metanol

MAY-GRÜNWALD (*): Eosinato de AM al 0.2% en metanol

(*): Eosinato de Azul de Metileno (una molécula de Eosina unida a dos de Azul de Metileno) al 0.2-0.25% en metanol

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MAY-GRÜNWALD

FIJACION: metanol

PRECOLORACION: AM + eosina

GIEMSA COLORACION FINAL NOTAS: La adición de pequeñas cantidades de GLICERINA a la solución de Giemsa aumenta la ionización del colorante y su disponibilidad, y por otra parte disminuye la formación de precipitados cuando la tinción es prolongada.

Si además se añade una gota de ACETONA (x 20 cc de sol. de Giemsa) se mejora la penetrabilidad del colorante, hecho muy útil cuando existe una gran densidad celular 46


EL COLOR DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES

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Para COMUNICAR lo que vemos al microscopio debemos reconocer determinadas CARACTERISITCAS de las células teñidas, e informar en términos concretos que definan situaciones de normalidad o de anormalidad.

Vamos a tratar a continuación sobre la TERMINOLOGIA que debemos usar para expresar nuestros resultados

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Componentes moleculares implicados en la química de las coloraciones

Acidos Nucleicos Ac. Fosfórico: anión principal

Nucleoproteínas Alcalinidad de HIS, ARG y LIS

Lípidos (fosfo-) Ácidos, básicos o neutros

Carbohidratos En su mayoría acídicos (+): alcalino, carácter básico, pH elevado (>7), catión

(-): carácter ácido, pH bajo (<7), anión 49


COLORACION CELULAR

Fijando con metanol y coloreando con AM/derivados y Eosina, se tiñen:

CROMATINA NUCLEAR

el ADN tiene avidez por el azul de metileno y sus derivados, adquiriendo una tonalidad violeta oscura-negruzca, más intensa cuanto más maduro es el núcleo y más compacto.

Las nucleoproteínas son ricas en histonas y protamina (+), por lo que tienen afinidad por la eosina, que aporta una tonalidad roja.

ERITROBLASTO

MADURO

ERITROBLASTO INMADURO

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51


COLORACION CELULAR

= HEMOGLOBINA de los hematíes: ya hemos visto que esta proteína tiene numerosas cargas eléctricas (+) y también (-). Esto da lugar a que pequeñas variaciones en el pH de la tinción modifica su basofilia/acidofilia

= GRANULOS NEUTROFILOS: toman las moléculas de eosinato de AM sin disociar, completas

= GRANULOS BASOFILOS: debido a su contenido ácido (heparina) poseen alta afinidad por el AM.


COLORACION CELULAR

POLIMORFONUCLEAR

= GRANULOS EOSINOFILOS: su contenido fuertemente básico atrae únicamente a colorantes ácidos, como la eosina

= VACUOLAS: cuando su contenido es graso puede ser disuelto por el alcohol usado como fijador, y aparecen como estructuras vacías

MONOCITO

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TERMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

BASOFILIA

BASOFILIA GRANULAR

BASOFILIA DIFUSA

La GRANULACION del basófilo (-COO-) tiene afinidad por los colorantes alcalinos (+). Igual ocurre en la basofilia difusa de las células plasmática, ricas en ARN (-COO-)

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BASOFILIA

ANILINA

O2N - - NH2+ / Cl-

cromóforo cromógeno auxócromo

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BASOFILIA

AZUL DE METILENO CH3

N+ auxócromo CH3

cromógeno S N cromóforo

CH3

N

CH3

auxócromo

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AZUROFILIA

A veces se comenta erróneamente que el Azul de Metileno produce metacromasia, y no es cierto.

Se trata en realidad del fenómeno de AZUROFILIA, coloración violeta-rojiza y no azul como sería de esperar, debida a la presencia de pequeñas cantidades de derivados trimetilados del A.M., denominados Azur I (o Azur B).

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AZUROFILIA

La GRANULACION del mielocito neutrófilo es típicamente azurófila, igual que la de algunos linfocitos

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ACIDOFILIA

EOSINA

cromógeno COO-/Na+

auxócromo

Br ACIDOFILIA

Na+/O-

auxócromo

O

Br Br cromóforo 58



ACIDOFILIA

La GRANULACION del eosinófilo (proteínas catiónicas [+]) tiene avidez por los colorantes ácidos [-](como la eosina)

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HIPOCROMIA

FALTA DE INTENSIDAD en la coloración: en la imagen la “hipocromia” típica de la falta de

Hb en la anemia ferropénica

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HIPERCROMIA

REFUERZO DE LA TINCION: en la imagen el núcleo del eritroblasto es hipercromático

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ANISOCROMIA

Distinta “intensidad” de la coloración en el mismo tipo de células

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TORMINOS DE USO HABITUAL SOBRE COLORACION

POLICROMASIA

Distinto color en el mismo tipo celular

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CARACTERISTICAS DEL NUCLEO

Redondeado Hendido Lobulado

Linfocito Linfocito hendido

Polimorfonuclear Neutrófilo

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Arriñonado Irregular Bilobulado

Monocito Monocito Eosinófilo

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Centrado Excéntrico

Eritroblasto Cél. Plasmática

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Cromatina laxa Cromatina de

densidad media

Cromatina densa

Blasto indiferenciado

Monocito (cromatina “peinada”)

Eritroblasto

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Un nucléolo Dos nucléolos

>2 nucléolos

Mononucleosis Infecciosa

Blasto maligno Blasto maligno

68

O”


CARACTERISTICAS DEL CITOPLASMA

INTENSAMENTE BASOFILO

Es decir contiene sustancias con gran avidez por los colorantes básicos. Y concretamente las células con gran actividad de síntesis poseen una gran basofilia debido a la presencia en el citoplasma de ARN, que contiene abundantes grupos fosfóricos (PO3

-).

PLASMOCITO

LINFOCITO “ACTIVAD 69



DE BASOFILIA MEDIA

Como ocurre en los linfocitos ligeramente activados o en los promielocitos

LINFOCITO T ACTIVADO (MONONUCLEOSIS I.)

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Bordes netos Bordes irregulares

Linfocito activado (mononucleosis inf.)

Linfocito

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CARACTERISTICAS DE LA GRANULACION

Eosinófila (ó acidófila)

Basófila Neutrófila (mixta)

Granulocito Eosinófilo

Granulocito Basófilo

Granulocito Neutrófilo

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PROBLEMAS TECNICOS

Vamos a revisar brevemente algunos defectos comunes en las tinciones de rutina que se realizan en los

laboratorios de Hematología

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PROBLEMAS TECNICOS

Las extensiones de sangre para examen morfológico se deben de realizar inmediatamente después de la extracción de la muestra en EDTA.

Cuando pasan más de 2 o 3 horas, comienzan a aparecer fenómenos degenerativos en las células.

CELULA NO IDENTIFICABLE, CON EL NUCLEO EN DEGENERACION

(CARIOLISIS) 74


PROBLEMAS TECNICOS

La solución de fijación precoloración se ha derramado, secándose en la zona dejada al descubierto

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PROBLEMAS TECNICOS

Fijación defectuosa y depósitos de colorantes en torno a los hematíes

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PROBLEMAS TECNICOS

Precipitados de colorante en “halo” entre las células

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PROBLEMAS TECNICOS

Defecto en la fijación: es imposible distinguir la morfología de los eritrocitos

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PROBLEMAS TECNICOS

Extensión insuficientemente seca, y mal fijada por el alcohol

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PROBLEMAS TECNICOS

Entre otros excesos se observa una sobre-tinción que impide reconocer las características de la cromatina de los núcleos

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PROBLEMAS TECNICOS

La cantidad de solución fijadora- colorante es deficiente

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PROBLEMAS TECNICOS

Solución de lavado con suciedad que dificulta la visión

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T. PANCROMATICA DEFICIENTE: EXCESO DE COLORANTE QUE IMPIDE VER LA CROMATINA NUCLEAR Y SUCIEDAD

T. PANCROMATICA

CORRECTA

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PROBLEMAS TECNICOS

LA GRANULACION ESPECIFICA DEL BASOFILO SE HA PERDIDO PARCIALMENTE. AL SER SU CONTENIDO SOLUBLE EN AGUA, UN EXCESO DE LAVADO LA HA ELIMINADO

LA GRANULACION SECUNDARIA DEL BASOFILO MUESTRA SU TIPICA COLORACION NEGRUZCA DEBIDO A LA AVIDEZ DE LA HEPARINA (ACIDO) POR EL AZUL DE METILENO (BASE)

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PROBLEMAS TECNICOS

En las tinciones que usamos, ya hemos comentado que el color se logra por una atracción electrostática, estableciéndose enlaces químicos estables aunque no muy fuertes.

Por ello un lavado excesivo, combinado o no con una cantidad insuficiente de solución colorante, puede conducir a una decoloración más o menos intensa

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SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Limpieza de los portaobjetos

Eter / Alcohol [1:1]

pH del agua destilada: 7-7.2

Hervir o tamponar

Secado de las extensiones

Mínimo 2 horas; óptimo 24 h

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SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Sobrecarga de color: precipitados

Glicerina

Suciedad de fondo

Lavar con A.D.

Conservación

Cubrir con DPX

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CASOS DE MORFOLOGIA

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Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Fig. 1: Linfocito

Coloración

Bordes

Gránulos

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Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 2: Eosinófilo

Bordes

Gránulos

90


Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Fig. 3: Mielocito

Coloración

Bordes

Gránulos

91


Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 4: Neutr. Banda

Bordes

Gránulos

92


Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Fig. 5: Linfocito

Coloración

Bordes

Gránulos

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Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 6: Basófilo Bordes

Gránulos

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Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 7: Neutr. Segmentado

Bordes

Gránulos

95


Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 8: Monocito Bordes

Gránulos

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Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Fig. 9: Blasto

Coloración

Bordes

Gránulos

97


Núcleo

Forma

Cromatina

Nucléolos

Citoplasma

Coloración

Fig. 10: Linfocito

Bordes

Gránulos

98

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