CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, …

Profesor Patrocinante Dr. Jaime Figueroa Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias

CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, TLR5 DE MEMBRANA Y TLR5 SOLUBLE EN Salmo salar.

ANÁLISIS DE SU EXPRESIÓN EN CÉLULAS SHK-1 INFECTADAS CON P. salmonis

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

CAROLINA CONSTANZA SALAZAR RIVERA

VALDIVIA – CHILE 2011

“La ciencia de vivir

es el arte de amar”

Para mis padres, Ximena y Hector.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Jaime Figueroa por su ayuda, guía, apoyo y comprensión en todo momento y también creo

poder decir por su amistad. A los chicos del Laboratorio BMP: Tamy, Clara, Adolfo por estar

siempre que necesitaba alguna ayuda o apoyo. A Lorenza, Mary, Barbara, Andres, Alexei,

Guillermo, Matias, Profe. Gudy por la buena onda y amenas conversaciones que hacían que los

días fueran más que sólo rutina. A Denise por ser mi mentora en el laboratorio, por tu buena

onda, amistad, paciencia y disposición desde mis inicios en el laboratorio y por estar siempre

presente, ayudándome y apoyándome.

A los chicos del PPT, Karlita, Negro, Victor, Claudio, todos en general y al Dr. Yáñez, por

prestarme su ayuda y conocimiento cada vez que lo necesité. Muchas Gracias por todos los

consejos y ayuda.

A la Esme, por ser como eres, una gran amiga. Gracias por todos los buenos momentos y

desahogos. A Pachi, Noe, Cristian, Pablo, Juan Pablo, Dany por su compañía y amistad durante

toda esta travesía, les deseo todo el éxito del mundo.

A mis padres por estar a mi lado apoyándome y alentándome siempre. A mi hermana por

ayudarme, apoyarme y comprenderme. A Nico por estar presente en todo momento, por las miles

de veces que me ayudaste a comprender y entender las cosas y por el apoyo constante. A la Tía

July por la constante preocupación y apoyo durante toda mi vida. A mis amigas y amigos por

estar conmigo siempre.

Al proyecto INNOVA IBM-259 por el apoyo financiero para la realización de esta tesis.

i

INDICE GENERAL

Página

1.- Resumen 1

1.1. Summary 2

2. Introducción 3

2.1. Sistema inmune de peces 3

2.2. Sistema inmune innato y sus Receptores de Reconocimiento de patógenos, 5

RRPs

2.3. Receptores tipo Toll, TLR 7

2.3.1. Activación de los TLR al reconocer su ligando 12

2.3.2. Activación de la respuesta inmune adaptativa por TLR 16

2.3.3. TLR en peces teleósteos 17

2.4. Relación TLR con Piscirickettsia salmonis 22

3. Material y Método 25

3.1. Materiales 25

3.1.1. Reactivos 25

3.1.2. Soluciones 26

3.1.3. Kits 28

3.1.4. Equipos 28

3.1.5. Software 29

3.2. Métodos 29

3.2.1. Extracción de RNA total desde tejidos de Salmo salar 29

3.2.2. Síntesis de cDNA a partir de RNA total 30

3.2.3. Clonamiento del cDNA de los receptores tipo toll TLR1, TLR22, TLR5S 30

y TLR5M de Salmo salar

ii

3.2.3.1. Amplificación de segmentos del cDNA de los receptores TLR1, TLR22, 31

TLR5S y TLR5M

3.2.3.2. Electroforesis de productos PCR en geles de agarosa 35

3.2.3.3. Ligación de los productos de PCR en vector pGEM-T easy 35

3.2.3.4. Transformación con el producto de ligación y selección de clones 35

3.2.3.5. Secuenciación de los productos de PCR clonados 36

3.2.4. Ensayo de cinética de expresión en células SHK-1 infectadas con P. salmonis 36

viva, P. salmonis inactivada, Proteínas totales de P. salmonis y LPS.

3.2.4.1. Siembra de células SHK-1 36

3.2.4.2. Cuantificación de las células SHK-1 37

3.2.4.3. Infección con P. salmonis viva 37

3.2.4.4. Cuantificación de P. salmonis 37

3.2.4.5. Extracción de proteínas totales de P. salmonis 38

3.2.4.6. Inactivación de P. salmonis 38

3.2.4.7. Verificación de P. salmonis 39

3.2.4.8. Infección con LPS 39

3.2.5. Análisis de las cinéticas de expresión por RT-qPCR 39

3.2.6. Desarrollo de sueros policlonales 43

3.2.6.1. Determinación de péptidos idóneos para la inmunización de animales 43

3.2.6.2. Conjugación de péptidos a hemocianina de Concholepas concholepas 43

3.2.6.3. Inmunización de conejos 43

3.2.6.4. Obtención de sueros inmunes 44

3.2.6.6. Ensayo Dot Blot 44

3.2.7. Extracción de proteínas de membrana 44

3.2.7.1. Cuantificación de proteínas 45

iii

3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes 45

3.2.9. Western Blot 46

4. Resultados 47

4.1. Clonamiento de los receptores tipo Toll (TLR): TLR1, TLR22, TLR5 de 47

membrana (TLR5M) y TLR5 soluble (TLR5S)

4.1.1. Clonamiento del receptor TLR1 48

4.1.2. Clonamiento del receptor TLR22 55

4.1.3. Clonamiento del receptor TLR5M 62

4.1.4. Clonamiento del receptor TLR5S 69

4.2. Desarrollo de sueros policlonales 76

4.2.1. Determinación de péptidos para la inmunización 76

4.2.2. Evaluación de los sueros obtenidos 81

4.3. Cinéticas de expresión utilizando RT-qPCR 84

4.3.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLR 91

4.3.1.1. Evaluación de TLR5M 92

4.3.1.2. Evaluación de TLR5S 92

4.3.1.3. Evaluación de TLR1 95



4.3.1.6. Evaluación de IL-1β 100

4.3.1.7. Evaluación de Myd88 102

5. Discusión 104

5.1. Clonamiento y caracterización de TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S 104

5.1.1. TLR1 105

5.1.2. TLR22 105

iv

5.1.3. TLR5 de membrana 106

5.1.4. TLR5 soluble 106

5.2. Anticuerpos 107

5.3. Cinéticas de expresión 108

5.3.1. Elección de normalizador 108

5.3.2. Evaluación de cinéticas por receptor 109

5.3.2.1. Cinética de expresión de TLR5M 110

5.3.2.2. Cinética de expresión de TLR5S 111

5.3.2.3. Cinética de expresión de TLR1 112



5.3.2.6. Cinética de expresión de IL-1β 115

5.3.2.7. Cinética de expresión de Myd88 116

5.3.3. Evaluación de las cinéticas por desafíos de infección 117

5.3.3.1. Infección causada por P. salmonis viva 117

5.3.3.2. Infección causada por proteínas totales de P. salmonis 117

5.3.3.3. Infección causada por P. salmonis inactivada 118

5.3.3.4. Estimulación causada por LPS 118

6. Bibliografía 120

v

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR 9

Figura 2 Esquema de asociación entre adaptadores y factores de transcripción 15

en la señalización de TLR

Figura 3 Esquema representativo de las moléculas de señalización de TLR 21

descubiertas en peces

Figura 4 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de 49

PCR para el receptor TLR1 en salmón

Figura 5 Secuencia nucleotídica del receptor TLR1 en salmón (Salmo salar), 50

n° de acceso HQ664666.1

Figura 6 Análisis de la secuencia aminoacídicas del receptor TLR1 de salmón 52

Figura 7 Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR1 53

Figura 8 Alineamiento múltiple de TLR1 en peces 54

Figura 9 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR 56

para el receptor TLR22 en salmón

Figura 10 Secuencia nucleotídica del receptor TLR22 en salmón (Salmo salar), 57


Figura 11 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR22 en salmón 59

Figura 12 Alineamiento entre salmón y trucha del receptor TLR22 60

Figura 13 Alineamiento múltiple de TLR22 en peces 61


para el receptor TLR5M en salmón

Figura 15 Secuencia nucleotídica del receptor TLR5M en salmón (Salmo salar) 64


vi

Figura 16 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5M 66

Figura 17 Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR5M 67

Figura 18 Alineamiento múltiple de TLR5M en peces 68


para el receptor TLR5S en salmón

Figura 20 Secuencia nucleotídica del receptor TLR5S en salmón (Salmo salar) 71


Figura 21 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5S 73

Figura 22 Alineamiento entre salmón y trucha para TLR5S 74

Figura 23 Alineamiento múltiple de TLR5S en peces 75

Figura 24 Péptido elegido y su ubicación en la representación de TLR1 77



Figura 27 Ensayo de Dot-Blot para la titulación de los sueros inmune anti 82

TLR1, TLR22 y TLR5

Figura 28 Western-Blot de proteínas de membrana de órganos de Salmo 83

Salar para la detección de TLR1, TLR22 y TLR5

Figura 29 PCR convencional a β-actina de cDNA de cinética de expresión 85

con P. salmonis viva

Figura 30 Curva de disociación para cada juego de partidores 87

Figura 31 Curva de disociación utilizando templados de Cinética de expresión 88

con P. salmonis viva

Figura 32 Curvas de amplificación para los genes normalizadores, β-actina y EF-1a 90

Figura 33 Cinéticas de expresión del receptor TLR5M 93

Figura 34 Cinéticas de expresión del receptor TLR5S 94

vii

Figura 35 Cinéticas de expresión del receptor TLR1 96



Figura 38 Cinéticas de expresión del receptor IL-1β 101

Figura 39 Cinéticas de expresión del receptor Myd88 103

viii

INDICE TABLAS

Páginas

Tabla I TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización 10

Tabla II TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos 18

Tabla III Resumen de partidores utilizados para el clonamiento de TLR5S, 32

TLR22, TLR5M y TLR1

Tabla IV Tm y producto esperado de los juegos de partidores utilizados para 34

clonación.

Tabla V Resumen de partidores utilizados para RT-qPCR y secuencia 41

referencia

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

BSA albúmina de suero de bovino

DAB diaminobencidina

DAMP patrones moleculares asociados a daño

EDTA ácido etilendiamino tetracético

EGTA ácido etilenglicol-bis (β-aminoetileter)-N,N,N,N-tetracético

Ig Inmunoglobulina

IL interleuquina

IFN interferon

LPS lipopolisacárido

LRR regiones ricas en leucina

LRR-CT regiones ricas en leucina C-terminal

MHC complejo mayor de histocompatibilidad

PAMP patrones moleculares asociados a patógenos

PBS tampón fosfato salino

PMSF fosfometilsulfonilfosfato

RIA Respuesta inmune adquirida

RII Respuesta inmune innata

RRP Receptor de Reconocimiento de Patrones

TCR receptor de células T

TIR dominio del receptor Toll/IL-1

TLR receptores tipo Toll

Temed N, N, N´, N´-tetrametildiamina

Tris tris (hidroximetil) aminoacetato

SDS dodecil sulfato de sodio

1

1. RESUMEN

El Sistema Inmune Innato es la primera barrera de defensa de los organismos frente a los

patógenos, en este sistema, los patógenos son reconocidos por diversos receptores, entre los

principales están los Receptores tipo Toll, TLR. Los TLR reconocen Patrones Moleculares

Asociados a Patógenos, PAMPs. Cada TLR es capaz de reconocer uno o varios PAMPs de

diversos patógenos, como virus o bacterias, y desencadenar una Respuesta Inmune Innata contra

ellos, además de activar y dirigir una Respuesta Inmune Adaptativa contra los patógenos en el

organismo hospedero. En peces teleósteos se han descrito algunos TLR y además se han

descubierto TLR específicos de peces.

Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) es uno de los patógenos que causa fuerte mortalidad en las

especies salmonídeas cultivadas en Chile. El mecanismo de reconocimiento de las células blanco,

de invasividad y los tipos de respuesta generada, son hasta ahora desconocidos. Se estudiaron

algunos de los TLR en el tiempo, involucrados en la respuesta inmune de salmón ante la

infección de P. salmonis viva, P. salmonis inactivada, Proteínas totales de P. salmonis y LPS,

usando la línea celular SHK-1 como modelo. Para ello se clonaron parcialmente los receptores

TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, y se analizaron sus cinéticas de expresión

mediante RT-qPCR ante las distintas infecciones. Además se desarrollaron sueros policlonales

dirigidos a segmentos específicos de estos TLR, detectándose por Western Blot.

Con los resultados obtenidos se puede concluir que Salmo salar expresa los receptores TLR1,

TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble. Los que modulan su expresión dependiendo de la

forma de exposición de P. salmonis. Además TLR1 y TLR22 logran estimular su expresión

frente al patógeno indicando que reconocen algún PAMPs.

2

1.1. SUMMARY

The innate immune system is the first line of defense of organisms against pathogens, in this

system, pathogens are recognized by different receptors, the principal are the Toll-like receptors,

TLR. TLR recognize pathogen-associated molecular patterns, PAMPs. Each TLR can recognize

one or more PAMPs of different pathogens, such as viruses or bacteria, and trigger an innate

immune response, in addition to activating and directing an adaptive immune response against

pathogens in the host organism. In teleost fish some TLR were described and some TLR were

discovered specifically in fish.

Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) is one of the pathogens that cause high mortality in

salmonid species cultivated in Chile. The mechanism of recognition of target cells, invasiveness

and type of response generated, are still unknown. We studied some of the TLR in time, involved

in the immune response of salmon to infection by live P. salmonis, inactived P. salmonis, total

proteins of P. salmonis and LPS, using the salmon head kidney SHK-1 cell line as a model. For

this we partially cloned receptors TLR1, TLR22, membrane TLR5 and soluble TLR5, and

analyzed their kinetics of expression by RT-qPCR to the above mentioned infections. Also

polyclonal serums directed against specific segments of these TLR, were generated and

characterized by Western blot analyses.

These results clearly showed that Salmo salar expresses TLR1, TLR22, membrane TLR5 and

soluble TLR5, which modulate their expression depending on the exposure to P. salmonis.

Additionally an increase of expression of TLR1 and TLR22 in response to infection was

observed, indicating that S. salar recognized some PAMPs.

3

2. INTRODUCCIÓN

2.1. Sistema Inmune en peces

El sistema inmune lo poseen todos los vertebrados, incluidos los peces teleósteos, para

defenderse de los diversos patógenos a los que se ven enfrentados diariamente. Se han

desarrollado mecanismos para identificar estos agentes patógenos, diferenciándolos de los

componentes propios del organismo, y así poder eliminarlos (Collado et al., 2008). La defensa

por el sistema inmune se basa en dos respuestas: La Respuesta Inmune Innata (RII) y la

Respuesta Inmune Adquirida (RIA). Debido a que la inmunidad adquirida no ocurre

inmediatamente en respuesta a un antígeno o patógeno nuevo, este retardo en la respuesta podría

tener un efecto devastador en el hospedero, las respuestas innata y adquirida están coordinadas,

de tal forma que la respuesta inmunitaria innata representa el proceso inicial e instructor en la

defensa del hospedero en mamíferos (Bautista et al., 2005). En peces teleósteos, al ser

organismos poiquilotermos, cuando se encuentran a temperaturas muy bajas no son capaces de

activar adecuadamente algunas funciones inmunitarias adaptativas, como la producción de

anticuerpos y una lenta proliferación de linfocitos (Rubio-Godoy, 2010). En cambio la RII es

relativamente independiente de la temperatura (Magnadóttir, 2006).

La RII es la primera línea de defensa que controla los primeros pasos de la respuesta inmune en

organismos multicelulares, es capaz de discriminar entre una variedad de patógenos y lo propio,

deduciéndose que no es completamente no específica como se pensaba (Randon-Barragan, 2009).

La habilidad de reconocer rasgos comunes a los patógenos más frecuentes sin necesidad de haber

estado previamente expuestos a los mismos (Rubio-Godoy, 2010), genera una respuesta inmune

4

más rápida que RIA (Randelli et al., 2008), respuesta que carece de memoria inmunológica y que

sus componentes humorales y celulares juegan un importante papel en activar e instruir la RIA

(Imler et al., 2004; Janeway et al., 2002). La RIA desencadena una respuesta de manera

específica para cada patógeno, por lo tanto es más lenta que RII y además posee la capacidad de

crear memoria inmunológica (Rubio-Godoy, 2010); su respuesta puede ser humoral, mediada por

anticuerpos, donde juegan un rol crucial los linfocitos B, o celular, mediada principalmente por

linfocitos T (Janeway et al., 2002).

Los peces teleósteos poseen elementos para ambas respuestas, RII y RIA. Los diferentes tipos

celulares que trabajan en cada sistema, conocidos en mamíferos, se han reconocido en peces

teleósteos, incluyendo células que son morfológicamente y funcionalmente equivalentes a las de

mamíferos como: neutrófilos, macrófagos, monocitos, trombocitos, células B, células

plasmáticas, células T, células natural killer y eosinófilos (Alvarez-Pellitero, 2008).

Dentro de los órganos del sistema inmune es importante recalcar que los peces teleósteos carecen

de médula ósea o nódulos linfáticos, y la producción de células sanguíneas (hematopoyesis) se da

principalmente en el riñón anterior, órgano en el que se localizan células madre hematopoyéticas

(Rubio-Godoy, 2010). Los órganos principales del sistema inmune en peces teleósteos son el

timo, el bazo y el riñón (Alvarez-Pellitero, 2008; Rubio-Godoy, 2010; Zapata et al., 2006). El

riñón anterior posee similitudes morfológicas con la médula ósea de vertebrados superiores, ya

que también sirve como un órgano linfoide secundario y se ha visto que está implicado en la

eliminación de antígenos que están en circulación, además de ser el principal sitio de producción

de anticuerpos. El bazo ha sido implicado en la eliminación de antígenos y complejos inmunes de

la circulación sanguínea, también tiene un papel en la presentación de antígenos y el inicio de la

5

RIA. El timo puede ser considerado como agregación de macrófagos que procesan la

proliferación de células T (Alvarez-Pellitero, 2008). El riñón anterior y el bazo son reconocidos

como órganos linfoides secundarios (análogos a los ganglios linfáticos de los mamíferos),

órganos donde se localizan poblaciones de macrófagos y linfocitos capaces de iniciar una RIA

(Rubio-Godoy, 2010).

La RII comprende tres mecanismos defensivos: la inflamación, fagocitosis y la citotoxicidad no

específica (Rubio-Godoy, 2010). La fagocitosis en particular es de importancia en la inmunidad

innata y también en la adquirida por la presentación de antígenos derivados de patógenos

fagocitados y procesados por los fagocitos (Randelli et al., 2008). Las células efectoras son los

neutrófilos y macrófagos entre otras; además los macrófagos colaboran con los linfocitos por

medio de la presentación antigénica y secreción de citoquinas (Rubio-Godoy, 2010).

La RIA de los peces teleósteos se compone de subpoblaciones de linfocitos, análogas a los

linfocitos B y T de los mamíferos. Los linfocitos B presentan inmunoglobulinas (Ig), pero un

repertorio más limitado que los mamíferos, de clase IgM, IgD, IgT e IgZ (Rubio-Godoy, 2010;

Alvarez-Pellitero, 2008). Un aspecto importante es que la RIA conduce a una producción más

rápida y abundante de anticuerpos tras una exposición secundaria al mismo antígeno (Alvarez-

Pellitero, 2008; Pancer et al., 2006).

2.2. Sistema inmune innato y sus Receptores de Reconocimiento de Patrones, RRPs

La RII, mediada por sus células, tiene la importante decisión de responder o no frente a un

microorganismo en particular, está decisión está a cargo de un limitado número de receptores de

reconocimiento codificados genéticamente, los Receptores de Reconocimiento de Patrones, RRPs

(Akira et al., 2006; Janeway et al., 2002), los que tienen a su cargo el reconocimiento de un gran

6

número de posibles patógenos (Aderem et al., 2000). Las células de RII que expresan RRPs son

macrófagos, células dendríticas, mastocitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK entre otras

(Janeway et al., 2002). La inmunidad innata inicia los mecanismos de defensa inmediatos

basados en reconocimiento no clonal de los componentes microbianos usando una variedad de

RRPs. Estos RRPs reconocen Patrones Moleculares Asociados a Patógenos, PAMPs y también

Patrones Moleculares asociados a Daño, DAMPs, que son estructuras endógenas liberadas de

tejidos dañados (Randon-Barragan, 2009). Todos los RRPs poseen 3 características comunes, las

que son: 1) Reconocen PAMPs; 2) Son expresados constitutivamente por el hospedero y pueden

detectar al patógeno independiente del ciclo de vida en el que se encuentre; 3) Son codificados en

el genoma, no clonales, expresados en todas las células de un tipo celular, independientes de

memoria inmunológica y dan lugar a distintas respuestas contra patógenos (Akira et al., 2006).

Los PAMPs se caracterizan por ser: i) Estructuras moleculares que sólo están presentes en

patógenos microbianos, no se encuentran en el organismo hospedero. Esta propiedad permite

discriminar entre lo propio y no propio; ii) Estructuras moleculares que son esenciales para la

supervivencia de los patógenos. Sus mutaciones son letales para el patógeno, por ejemplo LPS

(Moreno et al., 2003); iii) Son estructuras compartidas por un gran número de patógenos, lo que

permite que un número limitado de receptores pueda reconocer una gran variedad de patógenos.

Esta información permite identificar el tipo de patógeno que está invadiendo y permite evaluar el

tipo de respuesta contra él (Medzhitov et al., 2000; Bautista et al., 2005).

Los RRPs se pueden encontrar en la membrana celular, en compartimentos dentro de la célula

(Medzhitov et al., 2000) o pueden ser secretados al torrente sanguíneo y fluidos de tejidos

(Janeway et al., 2002). Sus funciones son: i) opsonización de la bacteria o virus por fagocitosis,

7

además de producción de mediadores de la inflamación, con el fin de impedir la diseminación del

patógeno antes de que se desarrolle la inmunidad adquirida (Moreno et al., 2003); ii) captación de

agentes patógenos por los fagocitos y células dendríticas; iii) activación de las vías de

señalización que dan lugar a la inducción de la transcripción de genes de respuesta inmune, tales

como los péptidos antimicrobianos y citoquinas inflamatorias (Medzhitov et al., 2000; Akira et

al., 2006).

Dentro de los RRPs que se expresan en las células del sistema inmune innato se pueden nombrar

el receptor de manosa de macrófagos (Janeway et al., 2002), receptores tipo RIG-1, receptores

tipo NOD (dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) (Kumar et al., 2009), los

Receptores Tipo Toll, TLR (Randon-Barragan, 2009) entre otros.

Los peces teleósteos poseen varios RRPs que están envueltos en la respuesta inmune a patógenos.

Cuatro tipos principales de RRPs han sido descritos, hasta la fecha, en peces teleósteos: TLR,

receptores tipo NOD, receptores tipo-C de lectina, proteínas de reconocimiento de peptidoglican

(Boltaña et al., 2011).

2.3. Receptores Tipo Toll, TLR

Los TLR se encuentran en vertebrados e invertebrados (Imler et al., 2004), son glicoproteínas

transmembranas tipo I, con tamaños moleculares entre 90-115 kDa. Se distinguen por poseer: un

dominio extracelular. El que posee varias Regiones Ricas en Leucina, llamadas LRR, y una

característica Región Rica en Leucina en C-terminal, llamada LRR-CT; y un dominio

intracelular, dominio del receptor Toll/IL-1, llamado dominio TIR, por su homología con el

dominio citoplasmático del receptor de IL-1(Akira et al., 2006; Takano et al., 2010).

8

Las LRRs se encuentran en tándem y consisten en 20-40 aminoácidos de largo, los que contienen

una secuencia consenso de 10 aminoácido, XLXXLXLXXN, característica de las LRR en todos

los TLR (Matsushima et al., 2007; Bell et al., 2003). Además de una secuencia consenso que

sigue a la anterior, XɵXXɵXXXXFXXLX (ɵ corresponde a un aminoácido hidrofóbico), que

sólo la poseen algunas LRR en los TLR. En estas secuencias consenso, inserciones o

irregularidades que en ellas se presenten serían importantes para la unión de cada TLR con su

ligando. Las LRRs en su conjunto forman una estructura tipo “herradura” para el dominio

extracelular del receptor (Bell et al., 2003). También contienen una secuencia consenso, la LRR-

CT, LxxLxLxxNP(F/L)xCxCxxxx (F/L)xxxx, importante para mantener el dominio extracelular

cerca de la membrana plasmática (Matsushima et al., 2007; Bell et al., 2003). El dominio TIR

posee tres regiones funcionales de importancia: box1, box2 y box3 que son conservados en los

TLR de mamíferos y en peces teleósteos (Takano et al., 2010), importantes en la interacción con

proteínas de señalización. El esquema de un TLR se puede observar en la Figura 1.

Los TLR son expresados en células como: neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células

epiteliales mucosas, células B, células T, células trofoblásticas, plaquetas y células

megacariocíticas (Randon-Barragan, 2009; Takano et al., 2010). Se han identificado 21

miembros de TLR en distintas especies (Palti, 2011), de los cuales 10 han sido identificados en

humanos (Kawai et al., 2010; Randon-Barragan, 2009). En la Tabla I se muestra un resumen de

los TLR que se han encontrado en mamíferos junto con los PAMPs que reconocen cada uno de

ellos.

Los TLR una vez activados (al unir su ligando) funcionan en forma de dímeros, ya sean

homodímero o heterodímeros. El TLR2 forma heterodímeros ya sea con TLR1 o con TLR6, se ha

9

Figura 1: Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR. A) Esquema de los dominios

característicos de un TLR. En la región extracelular, LRR: Regiones Ricas en Leucina; TM:

Región transmembrana; En la región intracelular, Dominio TIR (Dominio citoplasmático del

receptor IL-1/Toll). B) Esquema basado en la cristalización del heterodímero TLR1-TLR2 de

humano. En verde y rojo representación de los TLR1-TLR2; en rojo ligando sintético para el

heterodímero; La unión del ligando promueve la dimerización de los dominios TIR (Figura 7 de

Jin et al, 2007).

10 Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización.

TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Expresión

celular

Co-

receptor

Adaptador Factor de

transcripción

Efector

TLR1 Membrana

plasmática

Triacil-Lipopéptidos; factores solu-

bles; Modulina

NC MN; NT;

LB; NK

Heterodímer

o TLR2-1

TIRAP;

Myd88

NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR2 Membrana

plasmática

Lipoproteínas/lipopéptidos; Pepti-

doglican; Ácido lipoteitoico; Pori-

nas; Lipopolisacáridos atípicos;Fac-

tores solubles; Glicolípidos; Protei-

na A membrana externa; Glicoino-

sitolfosfolípidos;Proteínas de es-

tructura viral; Hemaglutininas;Zy-

mosan; Lipoarabinomanano

HSP60; HSP70;

HSP96;HMGB1; Ácido

hialurónico

MN;NT ;

DC; LC

CD36;

RP105

TIRAP;

Myd88

NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR3 Endolisosoma ssRNA; dsRNA mRNA CD; NK MD2;

CD14; LBP;

RP105

TRIF NF-ƙB;

IRF3,7

C.

inflamatorias

; tipo I IFNs

TLR4 Membrana

plasmática

LPS; HSP60 bacterino; Proteínas

envoltura viral; Proteínas fusión

viral; Glicoinositolfos-folípidos;

Taxol

HSP22-60-70-96; HMGB1;

β-defensin2 ; Fibronectina;

Ácido hialurónico ; Heparan

sulfato; Fibrinógeno

MN; CE;

NT; CD

Heterodímer

o TLR6-2

TIRAP;

Myd88;

TRAM;

TRIF

NF-ƙB;

IRF3,7

Citoquinas

inflamatorias

; tipo I IFNs

11 Continuación Tabla I

TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Expresión

celular

Co-

receptor

Adaptador Factor de

transcripción

Efector

TLR5

Membrana

Plasmática

Flagelina NC MN; CD; LT Myd88 NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR6 Membrana

Plasmática

Diacil-lipopéptidos; Ácido

lipoteitoico; Zymosan

NC MN; CD; LB TIRAP;

Myd88

NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR7 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno LC; CD; LB Myd88 NF-ƙB; IRF7 C. inflamatorias;

tipo I IFNs

TLR8 Endolisosoma ssRNA(Virus) RNA endógeno LC; CD; LT Myd88 NF-ƙB; IRF7 C. inflamatorias;

tipo I IFNs

TLR9 Endolisosoma Motivos CpG no metilados DNA endógeno MN; CD, LB;

NK

Myd88 NF-ƙB; IRF7 C .inflamatorias;

tipo I IFNs

TLR10 Extracelular NC NC LB NC NC NC

TLR11 Membrana

Plasmática

Molécula tipo profiling ;bacteria

uropatogénica

NC NC Myd88 NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

NC: No se conoce; MN: Monocitos; NT: neutrófilos; CD: células dendríticas; LC: leucocitos; CE: células endoteliales; NK: células

Natural Killer; LB: linfocitos B; LT: linfocitos T; C. inflamatorias: Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en

Manavalan et al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.

12

reportado en mamíferos que la dimerización con uno o con otro depende del reconocimiento de

distintos PAMPs; por ejemplo, se ha visto que el heterodímero TLR1-TLR2 reconoce

lipoproteínas triacetiladas, en cambio el heterodímero TLR6-TLR2 reconoce lipoproteínas

diacetiladas de bacterias. También se ha reportado que algunos TLR necesitan de moléculas

accesorias para mediar a un reconocimiento eficiente y así poder ejercer su función, tal es el caso

de TLR4 que necesita de CD14 y MD2 para el reconocimiento de LPS en mamíferos (Takano et

al., 2010).

El reconocimiento de los PAMPs por los TLR ocurre en varios compartimientos celulares, como

la membrana plasmática, endosomas, lisosomas y endolisosomas (Kawai et al., 2010). TLR3,

TLR7, TLR8 y TLR9 son expresados en vesículas intracelulares como endosomas y retículo

endoplasmático, en cambio otros como TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6 son expresados en la

membrana plasmática. La apropiada localización celular de los TLR es importante para la

accesibilidad al ligando, requiriendo internalización a la célula de algunos de ellos, para mantener

la tolerancia a las moléculas propias como ácidos nucleicos (Kawai et al., 2010).

2.3.1. Activación de los TLR al reconocer su ligando

Una vez que los TLR se activan, se ha sugerido que los dímeros formados por los TLR

desencadenan la señalización induciendo dimerización de los dominios TIR, lo que provee una

plataforma para el reclutamiento de las proteínas adaptadoras de la cascada de señalización

(O´neill et al., 2007; Jin et al., 2007). Existen dos grandes baterías de genes que son activados

por los TLR: genes inflamatorios y genes de respuesta a interferón (IFN). Un ligando particular

va a desencadenar una, otra o ambas respuestas (Purcell et al., 2006).

13

Al reconocer su ligando el TLR recluta en su dominio TIR diversos adaptadores que contienen el

dominio TIR, las interacciones entre TIR-TIR inician la señalización de los TLR. Los

adaptadores que se han descrito, hasta el momento, en mamíferos son Myd88 (Factor de

diferenciación mieloide 88), TIRAP (Proteína adaptadora con un dominio TIR), TRIF (Adaptador

con dominio TIR que induce IFN-β), y TRAM (Molécula adaptadora relacionada a TRIF)

(Kumar et al., 2009). Las diferentes respuestas de los TLR a sus ligandos, puede explicarse en

parte por el uso selectivo de estas proteínas adaptadoras. Las cascadas de señalización

involucradas, finalmente activan los factores de transcripción: NF-ƙB, AP-1 e IRFs. NF-ƙB

regula la expresión de genes de citoquinas inflamatorias, como por ejemplo IL-1β, IL-2, TNF-α e

IL-12 entre otras (Tripathy et al., 2006) y quimioquinas como MCP-1 (Pasare et al., 2004). AP-1

regula la expresión de TNF-α e IL-6 entre otras, además de moléculas coestimuladoras, como

CD80 y CD86 en células dendríticas (Randon-Barragan, 2009). Se ha visto la activación de los

factores de transcripción IRF3 e IRF7 activan la transcripción de IFNβ e IFNα respectivamente

(Kumar et al., 2009). En la Tabla I un resumen de las moléculas involucradas para la señalización

en los TLR descritos en mamíferos

En un comienzo sólo fue descrita Myd88 como proteína adaptadora, por lo que las vías de

señalización se nombraron como dependiente o independiente de Myd88:

Vía Dependiente de Myd88: Es utilizada por todos los TLR menos el TLR3. La estimulación de

TLR por su ligando recluta Myd88 a su dominio TIR lo que desencadena una cascada de

señalización que finaliza con la activación de los factores de transcripción AP-1, por medio de la

activación de MAPK y NF-ƙB, por medio de la fosforilación de IƙB (Kumar et al., 2009; Takeda

et al., 2005). Se ha descubierto que TIRAP actúa como adaptador entre el dominio TIR y Myd88,

14

siendo esencial para la activación de esta vía en los receptores TLR2 y TLR4 en mamíferos

(Takeda et al., 2005; Janeway et al., 2002). Los receptores TLR7, TLR8 y TLR9 activados, en

células dendríticas aumenta la transcripción de IFN tipo 1 a través de la activación del factor de

transcripción IRF7 (Kumar et al., 2009; O´neill et al., 2007).

Vía Independiente de Myd88: También llamada Vía dependiente de TRIF. La inician TLR3 y

TLR4 activados, desencadenando una inducción en la transcripción de citoquinas

proinflamatorias e interferones tipo I, mediante la activación de los factores de transcripción

IRF3 y NF-ƙB (Kumar et al., 2009). En mamíferos, TRAM participa selectivamente en la

activación de esta vía en TLR4 pero no en TLR3 (Takano et al., 2010) actuando como proteína

adaptadora a TRIF. En la Figura 2 se observa un esquema representativo de cada vía.

La regulación negativa de las respuestas de TLR es importante para la detención de la

inflamación. Hasta el momento se han descubierto diversas moléculas que ayudan a regular de

forma negativa la respuesta inmune generada por los TLR en distintos niveles. Dentro de estas

moléculas se incluyen a varias moléculas empalme de los adaptadores y sus proteínas

relacionadas, ligasas de ubiquitina, deubiquitinasas, reguladores transcripcionales y microRNA

(Kawai et al., 2010). Tollip (proteína que interactúa con Toll) fue el primer inhibidor descubierto,

limitando la activación de NF-ƙB en los receptores TLR2 y TLR4 (Rebl et al., 2010).

15

Figura 2: Esquema de asociación entre adaptadores y factores de transcripción en la

señalización de TLR. Se observan los distintos adaptadores usados para las vías de señalización

Dependiente e Independiente de TIR; Myd88, TIRAP, TRIF y TRAM. Vía Dependiente de

Myd88, se observa como ejemplo los receptores todos los TLR menos TLR3 y TLR2. Vía

Independiente de Myd88, se observa TLR3. TLR4 es capaz de activar ambas vías. La activación

de cada una de ellas logra la activación de diferentes factores de transcripción: NF-ƙB, AP-1,

IRF3, IRF7, que ingresan al núcleo, excepto AP-1que es activado dentro del núcleo, y activan la

transcripción de distintas moléculas de la respuesta inmune.

16

2.3.2. Activación de la respuesta inmune adaptativa por TLR

La fagocitosis, junto con el producto de los genes activados por los TLR, instruyen el desarrollo

de la inmunidad adaptativa, relacionando así a los TLR con esta última. La activación de los TLR

en las células presentadoras de antígenos (APC), como macrófagos y células dendríticas, induce

la producción de citoquinas y la expresión de moléculas co-estimulatorias de superficie,

ayudando en la elaboración de la respuesta inmune adaptativa. La señalización por TLR activa

principalmente a las células dendríticas (induciendo y controlando su maduración al reconocer

algún patógeno) a promover una regulación positiva de la expresión de los MHC (necesarios para

la estimulación de linfocitos T vía TCR), de citoquinas inductoras de respuestas tipo Th-1 tales

como la IL-12 o IL-18 (Randon-Barragan, 2009; Pasare et al., 2004), y moléculas estimuladoras

como CD80, CD86 (necesarias para la expansión clonal de células T) (Abdelsadik et al., 2011).

Las células dendríticas maduras migran a los nódulos linfáticos donde presentan los antígenos a

células T vírgenes (Medzhitov, 2001), generando principalmente una respuesta tipo Th-1, que

permite activar la propiedad microbicida de los macrófagos e induce a los linfocitos B a producir

IgG, efectivos para la opsonización de patógenos extracelulares (Moreno et al., 2003). Algunas

citoquinas expresadas, por la activación de los TLR, son importantes para superar la supresión de

linfocitos T reguladores (Pasare et al., 2004).

Algunos TLR se expresan en los linfocito B y T activando proliferación celular, diferenciación y

afectando la memoria celular y la producción de anticuerpos (Abdelsadik et al., 2011). La

activación de los TLR en los linfocitos B induce su proliferación, expresión de moléculas co-

estimuladoras, secreción de anticuerpos policlonales e incluso la expresión de genes necesarios

para la diferenciación de células plasmáticas (Pasare et al., 2004).

17

2.3.3. TLR en peces teleósteos

Se han descubierto 17 TLR en peces teleósteos, estos pueden diferir entre especies de peces, los

cuales son: TLR1, 2, 3, 4, 5, 5S, 7, 8, 9, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23, perdiéndose TLR6 y 10

con respecto a los humanos. La estructura de las LRRs es altamente conservada entre mamíferos

y peces teleósteos, lo que sugiere la capacidad de reconocer PAMPs similares a los reconocidos

por TLR de mamíferos (Takano et al., 2010). Además la conservación estructural de los TLR

sugiere que la regulación de la respuesta inmune es similar en peces y en mamíferos (Rebl et al.,

2010). En la Tabla II se encuentra un resumen de los TLR que se encuentran en peces teleósteos

junto con la especie en que se han descrito y los PAMPs que reconocen. En el salmón del

Atlántico, Salmo salar, se han sido descubierto hasta el momento: TLR8, 9, 13, 22a, 22b y 5

soluble (Boltaña et al., 2011).

Se han encontrado tres grandes diferencias en los TLR publicados en peces con respecto a los

mamíferos:

1) Existe una forma soluble del ortólogo TLR5 en peces y no en humanos. El TLR5S carece

de región transmembrana y dominio TIR (Rebl et al., 2010). TLR5 se ha descrito que

reconoce flagelina, un compuesto del flagelo bacteriano. La flagelina interactúa primero

con TLR5M, facilitando la expresión de TLR5S el cual sirve después para amplificar la

respuesta celular de TLR5M como un feedback positivo (Tsujita et al., 2004), guiando a

una activación fuerte del NF-ƙB en células TLR5 positivas independiente de los tipos

celulares. Esto evidencia un prototipo de inmunidad humoral que se encuentra conservada

en peces (Randon-Barragan, 2009).

18

Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.

TLR Ligando Especies de peces

TLR1 Triacil-lipopéptidos T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis*2

;

TLR2 Lipopéptidos;

Lipoproteínas; Pam3CSk4

T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; P.

olivaceus; I. punctatus;

TLR3 dsRNA; poly I:C;

componentes bacterianos

T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; O.

mykiss; P. olivaceus; I. punctatus; G .rarus;

TLR4a/b NC D. rerio*1,*2

; G. rarus

TLR5M Flagelina T. rubripes; D. rerio*2

; T. negroviridis; O. mykiss; I.

punctatus

TLR5S Flagelina T. rubripes; O. mykiss; S. salar; I. punctatus;

TLR7 ssRNA T. rubripes; D. rerio; C. carpio; O. mykiss;

TLR8 ssRNA T. rubripes; D. rerio*2

; O. mykiss*2

; T. negroviridis; S.

salar;

NC: No se conoce; *1: TLR4 no está envuelto en el reconocimiento de LPS; *2: Se observa

duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti, 2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al,

2011.

19

Continuación Tabla II:

TLR Ligando Especies de peces

TLR9 CpG DNA no metilado T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar; O. mykiss;

P. olivaceus; S. aurata*2

; P. crocea*2

TLR13 NC S. salar;

TLR14 NC T. rubripes; D. rerio

TLR19 NC D. rerio*2

;

TLR20 NC D. rerio*2

; I. punctatus;

TLR21 CpG DNA no metilado T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; I. punctatus;

TLR22 dsRNA; poly I:C T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar*2

; O.

mykiss*2

; C. aurata*2

TLR23 NC T. rubripes; T. negroviridis;

NC: No se conoce; *1: TLR4 no está envuelto en el reconocimiento de LPS; *2: Se observa

duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti, 2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al,

2011.

20

2) No existe ortólogo de TLR4 en la mayoría de los peces. Los peces son a menudo

resistentes a los efectos tóxicos del LPS. Una explicación para la falta de respuesta a LPS

es la ausencia del gen TLR4 en la mayoría de los peces, además en los genomas que se

encuentran secuenciados de T. rubripes y T. nigroviridis, no se encontró el gen para

TLR4. Aunque se ha encontrado en G. rarus y carpa común (Palti, 2011) e incluso dos

genes para TLR4 en pez cebra, en el cual se observó que la activación de TLR4

disminuye dramáticamente la activación de NF-ƙB. Hasta el momento no se han

encontrado en ningún pez CD14 o MD2, proteínas importantes para el reconocimiento del

LPS por TLR4 en humanos (Rebl et al., 2010). Además en peces teleósteos no se ha

encontrado TRAM, proteína adaptadora importante en desencadenar la señalización

celular en respuesta a la activación de TLR4, en peces teleósteos (Takano et al., 2010).

3) Existen miembros de TLR llamados “TLR específicos de peces". Corresponden a TLR19,

20, 21, 22 y 23. Los roles de estos TLR aún no están definidos (Palti, 2011). Se cree que

TLR22 puede ser un sustituto funcional del TLR3 de humano ya que actúa contra

infecciones de virus dsRNA (Takano et al., 2010).

Se ha visto que los peces teleósteos poseen las proteínas adaptadoras, Myd88, TIRAP y TRIF,

importantes en la cascada de señalización celular que finaliza con la activación de una respuesta

inmune. TRAM no ha sido descubierto hasta el momento en ningún pez (Takano et al., 2010).

También se han descrito moléculas que componen estas cascadas de señalización y moléculas

reguladoras de estas vías en peces teleósteos. La conservación de moléculas envueltas en la

señalización de TLR sugiere que el programa básico de la regulación génica mediada por la

activación de los TLR es conservada entre especies de vertebrados (Purcell et al., 2006). En la

Figura 3 se encuentra un esquema de la activación de los TLR en peces.

21

Figura 3: Esquema representativo de las moléculas de la señalización de TLR descubiertas

en peces. Algunos TLR y moléculas importantes en la señalización a cargo de los TLR con los

respectivos peces teleósteos en los que han sido descubiertos. En cuadrado rojo se señalan los que

se han descubierto en salmón (S. salar). Esquema extraído de la Figura 3 de Rebl et al., 2010.

22

2.4. Relación TLR con Piscirickettsia salmonis.

Chile es uno de los principales países exportadores de salmones del mundo. La exportación de

salmones es una de las industrias más importantes en el sur de Chile, por lo que el estudio de la

inmunidad de los salmones frente a patógenos es primordial. Piscirickettsia salmonis es uno de

los principales patógenos que afecta los cultivos de salmón en Chile, en estos momentos es una

de las principales enfermedades que están afectando a esta industria. Por esta razón es importante

el estudio del mecanismo de acción de los principales receptores involucrados en una infección

causada por bacterias, los TLR y de esta manera poder evaluar su comportamiento y obtener

alguna información de cómo esta bacteria puede sobrevivir a la respuesta inmune.

Piscirickettsia salmonis es una bacteria gram negativa, intracelular facultativa,

predominantemente cocoide, mide entre 0,5 – 1,5 µm, inmóvil, aeróbia y comúnmente aislada de

ambientes marinos (Fryer et al., 2003). P. salmonis ha sido detectada en distintas especies

salmonídeas como salmón Coho, salmón del Atlántico, salmón del Pacífico y trucha arcoíris

(Toranzo et al., 2005). Produce la enfermedad llamada piscirickettsiosis o Síndrome Rickettsial

Salmonídeo, SRS; anualmente Chile pierde cerca de US$100 a causa de esta enfermedad

(McCarthy et al., 2008). Los signos clínicos se caracterizan por un nado errático y lento en la

superficie del agua y, al examinar los peces, se encuentran úlceras puntiformes, nódulos blancos

en la piel, un hígado con nodulaciones blancas y hemorragias petequiales (Leal et al., 2007).

Los peces tienen muchas respuestas humorales específicas y no específicas además de

mecanismos celulares que resisten las enfermedades producidas por bacterias patógenas. Para

infectar al hospedero y multiplicarse en los tejidos, los patógenos bacterianos deben pasar o

evadir esta defensa (Ellis, 1999). P. salmonis es un patógeno bacteriano por lo tanto posee

23

distintos PAMPs que pueden ser reconocidos por diferentes TLR en el salmón del Atlántico. Al

ser una bacteria gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas, lipoproteínas,

peptidoglican (Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano, también se ha descrito que posee la

proteína flagelina (Wilhelmet et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs pueden ser

reconocidos por distintos TLR como por ejemplo: TLR1 y 2 que reconocen proteínas de la pared

bacteriana, peptidoglican y lipopéptidos acetilados; TLR5 reconoce flagelina bacteriana; TLR3,

7, 8 y 9 reconocen ácidos nucleicos microbianos (Boltaña et al., 2011); también pueden actuar

algunos de los TLR específicos de peces como TLR22 y 20. Los TLR trabajan en conjunto en el

reconocimiento de un patógeno, debido a que un patógeno puede presentar más de un PAMPs

que permita su reconocimiento, por lo tanto las células pueden reconocer el patógeno por varios

TLR simultáneamente (Underhill et al., 2002).

Por otro lado es importante el estudio de la interacción de diversas formas de exposición de P.

salmonis con los TLR, lo que permitiría ayudar en la mejora de posibles vacunas en desarrollo;

Los TLR se han descrito como receptores de adyuvantes (Seya et al., 2006), por lo que incorporar

ligandos a TLR de manera preferente en una solución farmacológica, permitiría una mejora en

vacunas contra P. salmonis.

24

Dado los datos presentados, se plantea la siguiente hipótesis:

La infección causada por P. salmonis a la línea celular de salmón SHK-1 promueve una

regulación en la expresión de los Receptores Tipo Toll: TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y

TLR5 soluble.

Como Objetivo General: Evaluar la expresión diferencial de Receptores Tipo Toll: TLR1,

TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, en células SHK-1 infectadas con P. salmonis.

Objetivos Específicos:

1. Clonar los Receptores Tipo Toll: TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, en

órganos linfoides de salmón.

2. Evaluar la expresión de los receptores TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5

soluble, mediante cinéticas de expresión, en línea celular SHK-1 infectada con P.

salmonis; P. salmonis inactivada; Proteínas totales de P. salmonis y LPS, versus línea

celular SHK-1 sin infección.

3. Inmunodetectar los receptores TLR1, TLR22, TLR5 en órganos linfoides de salmón.

25

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Materiales

3.1.1.Reactivos

Merck Winkler Invitrogen

Aceite de Inversión

Acetato de sodio

Ácido acético

Ácido clorhídrico

Acrilamida

Bicarbonato de sodio

Cloroformo

Cloruro de potasio

EGTA

EDTA

Etanol

Formaldehido

Fosfato de potasio diácido

Glicerol

Glicina

Glutaraldehido

Isopropanol

Perhidrol

SDS

Ácido bórico

Albumina de Suero Bovino

Alcohol isoamilico

Azul de bromofenol

Azul de coomasie

Borato de sodio

Chomczynski

Cloruro de sodio

Cloruro de Magnesio

Hidróxido de Sodio

Metanol

Persulfato de amonio

Reactivo de Bradford

Sacarosa

β-Mercaptoetanol

Temed

Tween-20

Eco RI

Suero bovino fetal

Syber safe

Tripsina 0,5%

Sigma

Coadjuvante de Freund

DAB

Glucosa

Inhibidor de proteasa(Mix)

PMSF

Triton X-100

X Gal

LPS

Thermo Scientific

Membrana Nitrocelulosa

Rockland Fermentas, USA.

Anti IgG de conejo unido a

peroxidasa

Marcador de peso molecular de

DNA

Marcador de masa molecular para Biosonda

26

Hemocianina proteínas

Hy Clone Cell Signaling T

L-15

Azul de tripan

RIPA

Ambion Lonza

Agua DEPC Agarosa

Promega UsBio Becton Dickinson

RNAsin

DNA polimerasa

Nucleótidos

Transcriptasa reversa

pGEM-T Easy

Oligo dT; DNAsa

Tris base

Ampicilina

IPT-G

Tinción Gram

Bacto Agar

Bacto triptona

Extracto levadura

3.1.2. Soluciones

- Buffer SB 25X: 10 mM NaOH, ajustado a pH 8 con ácido bórico

- Medio LB: Bacto-triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L. Autoclavado.

- Medio LB-Agar: medio LB, Bacto-agar 15 g/L. Autoclavado

- Medio Hanks modificado: NaCl 145 mM, K2HPO4 8,9 mM, Glucosa 11 mM.

- Medio SOB: bacto triptona 20 g/L; extracto de levadura 5 g/L; NaCl 0,5 g/L; KCl 2,5

mM. Autoclavado.

- Medio SOC: medio SOB, MgCl2 10 mM, Glucosa 20 Mm.

- PBS: NaCl 136.89 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 10.14 mM, KH2PO4 1.76 mM, pH 7.4.

27

- Reactivo de Bradford: Azul de Coomasie G 0,01%; etanol 4,75%; ácido fosfórico 8,5%.

- Ripa +: Tritón X100 10%; Inhibidor de proteasa Mix; RIPA; PMSF 100µM.

- Solución de bloqueo para Westernblot: PBS 1X; BSA 1%; leche descremada 5%;

Tween-20 0,3%.

- Solución de Chomczynski: Tiocianato de Guanidina 4 M; Citrato de Sodio 25mM; N-

lauril sarcosina 0,5% p/v; autoclavado y posteriormente se agregó β-mercaptoetanol

0,1M.

- Solución de desteñido para geles de poliacrilamida: Metanol 30%, Ácido Acético 7%.

- Solución de revelado: 40 mL de PBS; 30 μL de perhidrol 30% y 10 mg DAB.

- Solución de teñido para geles de poliacrilamida: Azul de Coomassie R-250 0.3%,

Metanol 50%, Ácido Acético 10%.

- Solución TES: Tris-HCl 10 mM pH 7.5; EDTA 1 mM pH 8; SDS 0.5%

- Tampón H1: Sacarosa 0,25M; EGTA 5mM; Tris- HCl pH 8, 20 mM; PMSF 100 mM.

- Tampón H2: Tris-HCl pH 7,4 50 mM; Tritón X-100 0,1%.

- Tampón de carga SDS-PAGE: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 20% glicerol, 2% SDS, 5 %

β-Mercaptoetanol

- Tampón de corrida SDS-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1% SDS; pH 8,3.

- Tampón de muestra (5X): Tris-HCl 0.3125 M, pH 6.8, SDS 10%, Sacarosa 50%, Azul

de bromofenol 0.010%.

- Tampón de transferencia SDS-PAGE: Tris 25 mM, Glicina 193 mM, 0,1 % SDS, 20%

Metanol.

- Tampón espaciador SDS-PAGE: Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 04% SDS

- Tampón separador SDS-PAGE: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 0,4% SDS

28

- Solución de lavado, TNT: Tris –HCl 0,1 M pH7,5; NaCl 0,15M; Tween 20 0,05%.

3.1.3. Kits

- E.Z.N.A. Plasmid Miniprep kit I, Omega Bio-tek

- SV total RNA isolation, Promega

- Kit 2X Brilliant III QPCR Master Mix, Stratagene

3.1.4. Equipos

- Agitador Orbital: Heidolph polymax 1040.

- Balanza: Satorius TE4101.

- Baño Termo-regulado: N-Biotec.

- Cámara de electroforesis: Biorad Mini-Protean III.

- Cámara de electroforesis horizontal: Labnet Enduro.

- Cámara de Flujo Laminar: Nuaire NU425-400E.

- Cámara de Transferencia: Labnet.

- Centrifuga: Sigma 2-16 multigene.

- Centrifuga, Boeco C-28A. 35

- Espectrofotómetro: Thermo Scientific Evulution 60.

- Fuente de poder: Biorad Power PacTM Universal Power Supply.

- Fuente de poder: Enduro E0303.

- Incubador: Zhicheng ZSD 1270.

- Microcentrifuga: Sigma 1-14.

- Microondas: Somela Faney WT1700.

- Microscopio: LW-Scientific I4 Series.

- Microscopio invertido: Olympus CKX41.

29

- Micropipetas: Axygen, Labnet.

- Nanoview: Healthcare, Bioscience.

- PH meter: InoLab.

- Shaker: Zhcheng, ZHWY-200B

- Sonicador: Cole Parmer

- Termoblock: Labnet

- Termociclador: Eppendorf Mastercycler personal.

- Termociclador en gradiente: Labnet.

- Termociclador tiempo real: Stratagene MX 3005 P, Stratagene MX 3000P

- Transiluminador: Syngene, INGENIUS

- Ultraturrex: IKA, TioBasic I

- Vortex: Brarnstead International.

3.1.5. Software

- MxPro, Mx3005P

3.2. Métodos

3.2.1. Extracción de RNA total desde tejidos de Salmo salar

Se homogenizó el tejido de órganos linfoides (50 mg aproximadamente) en 1mL de reactivo

Chomczynski (Chomczynski y Sacchi, 1987) utilizando un homogenizador Ultramax. En frio se

adicionaron 400 μL de cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 y se centrifugó a 13000 x g a 4°C por

10 minutos. En seguida se trasladó la capa superior acuosa (conteniendo el RNA) a un tubo

nuevo y se le agregaron 500 μL de isopropanol frio y se dejó precipitando toda la noche a -80°C.

30

Al día siguiente se sedimentó la muestra centrifugándola a 13000 x g por 30 minutos a 4°C, para

luego eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 μL de solución TES y luego

se añadió 400μL de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, mezclando por agitación. Se separaron

las fases centrifugando a 13000 x g a 4°C por 10 minutos, extrayendo la fase superior acuosa y

depositándola en un nuevo tubo. El RNA se precipitó adicionando 600 μL de isopropanol frio e

incubando toda la noche a -20°C. Finalmente, se centrifugó a 13000 x g por 30 minutos a 4°C y

se resuspendió en 20 μL de agua DEPC. Posteriormente se cuantificó el RNA por

espectrofotometría a 260nm (espectrofotómetro tradicional o Nanoview), utilizando la relación 1

U.A. = 40 μg/ml.

3.2.2. Síntesis de cDNA a partir de RNA total

La reacción se realizó en un volumen total de 25 μL; en una primera etapa, se parte con una

solución conteniendo 1 μL de oligo-dT 40µM, 5 µg de RNA y agua DEPC hasta llegar a un

volumen final de 13,5µL. Esta se incubó por 5 minutos a 70°C, luego inmediatamente a hielo. La

segunda etapa consistió en agregar a la solución anterior 5µL M-MLV 5X Buffer, 5µL dNTPs 10

mM, 0,5 µL RNAsin, 1 µL M-MLV-RT, llegando a un volumen final de 25 µL, estos fueron

incubados 1 hora a 37°C y luego 10 minutos a 72°C.

3.2.3. Clonamiento del cDNA de los receptores tipo Toll, TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S,

de Salmo salar

Utilizando como referencia las secuencias de mRNA descritas en NCBI para los receptores en

trucha arcoíris (números de acceso: TLR1: NM_001166101.1; TLR22 NM_001124419; TLR5M:

NM_001124744.1; TLR5S NM_001124208), se realizó una búsqueda BLAST y en la base de

datos de EST para Salmo salar, al encontrarse secuencia EST para algún receptor, estas se

utilizaron para diseñar partidores homólogos a salmón, de esta forma se intentó obtener el mayor

31

fragmento posible para cada receptor. En los casos que no se encontraron secuencias EST, se

diseñaron partidores heterólogos utilizando como secuencia molde, la secuencia de trucha.

Para cada receptor se diseñaron distintos juegos de partidores con la idea de intentar obtener la

secuencia completa del mensajero. En la Tabla III se puede ver en detalle un resumen de los

partidores utilizados.

3.2.3.1. Amplificación de segmentos del cDNA de los receptores TLR1, TLR22,

TLR5S y TLR5M

Para las reacciones de PCR se utilizó como templado cDNA, sintetizado de acuerdo a síntesis de

cDNA, desde RNA total de órganos de riñón, extraído según lo descrito en extracción de RNA.

La reacción de PCR se realizó en un volumen total de 25 μL, conteniendo 0.5 unidades de Taq

DNA polimerasa; 5 μL de buffer de Taq DNA polimerasa 5X; 2,5 mM de MgCl2; 0.2 mM de

cada dNTP; 1 µM de cada partidor; 1 µL de cDNA y agua estéril DEPC 25 μL. Para cada juego

de partidores se realizó un PCR en gradiente de temperatura, para obtener la temperatura

adecuada para cada producto de PCR. Los productos entre 500-1000pb. se les dió un tiempo de

extensión (paso 4) de 30 segundos y productos sobre 1000 pb. de 1,30 minutos. La mezcla fue

incubada en el termociclador con las siguientes condiciones térmicas:

Paso 1.- 3 minutos a 94°C

Paso 2.- 30 segundos a 94°C

Paso 3.- 30 segundos a gradiente (55-65°C) 35 ciclos

Paso 4.- 30 segundos a 72°C

Paso 5.- 10 minutos a 72°C

En la Tabla IV se puede ver un resumen de los juego de partidores con sus respectivas Tm y

producto esperado.

32

Tabla III: Resumen de partidores utilizados para el clonamiento de TLR5S, TLR22,

TLR5M y TLR1.

TLR5S

Nombre Secuencia Juego

TLR5S F1 TTC GTG GCA AAC ACT TTC GG A,B

TLR5S R2 TCC AGG ATT TGT AGG TTT GG A

TLR5S R3 TTA GTA GTC CAC AGG GGC TC B

TLR22


TLR22 F1 GCA GGT GAG AAA GAA CG A

TLR22 R2 GTC TCT TCA CCA GCT TC A,C

TLR22 F3 CTG TAT TGT TGG ATT CTT GC B

TLR22 R4 TGT GGT AAT TGT ATG ATG GG B

TLR22 F5 CCC ATC ATA CAA TTA CCA CA C

TLR22 F6 CTT AAA CTG GGA TCA AAC AA D

TLR22 R7 GTA AAT TCT CCT GCA CCA AC D

TLR22 F8 ATG ACA CTC AAG ATA ACC AT E

TLR22 R9 GTA CTT TCA TGT TAG AGG GG E

33

Continuación Tabla III

TLR5M


TLR5M F1 CAG GAA CCT TAT ACT GCT GG A

TLR5M R2 GGC CCT CTA AGG ATG TAA TC A,C

TLR5M F3 GCT GAT AAT AAG ATT ACA TC B

TLR5M R4 GTT CCA ACT GTC ATA TTT AC B

TLR5M F5 ATG ATG AGG AAC CTT ATA CT C

TLR5M F6 TGG AAC ACA GCA CCA TGG GG D

TLR5M R7 CCT CCA GAC CGC AGT CAC AG D

TLR1


TLR1-F1 CTG GGC CGT GGC TGC GTT AA A

TLR1-R2 GCC GGT TGG CAC TCA GGT CC A

TLR1-F3 GGA TAC TGC AGC TAG ACT TC B

TLR1-R4 GGA AGG GAT CAT GTA CTG AG B

TLR1-F5 ATG AGG GCT GTG GCA GTC AC C

TLR1-R6 CGA TGC TGA CCT TCT CCG CC C

34

Tabla IV: Tm y producto esperado de los juegos de partidores utilizados para clonación

TLR5S

Juego Producto esperado (pb.) Tm (°C)

A 598 60,9

B 1741 60,9

TLR22


A 787 55,8

B 532 60,9

C 2235 60,9

D 857 55,8

E 216 55,8

TLR5M


A 1238 60,9

B 1358 55,8

C 1280 60,9

D 800 60,9

TLR1


A 1440 55

B 1225 60,9

35

3.2.3.2. Electroforesis de productos de PCR en geles de agarosa

Los geles se prepararon fundiendo 0,3 g de agarosa en 30 mL de buffer SB 1X (Brody, et al.,

2004) agregando 4 mL de Syber safe 10.000X. Las muestras se prepararon mezclando 10 µl de

los productos de PCR más 2 μL de buffer de carga 6X. Se cargaron las muestras en los pocillos y

la corrida electroforética se realizó a 70 Volt en buffer SB 1X. Una vez finalizada la corrida

electroforética, el gel fue expuesto a luz ultravioleta en el transiluminador para poder ver los

productos de PCR y capturar una imagen digital.

3.2.3.3. Ligación de los productos de PCR en vector pGEM-T Easy

La ligación del amplicón al vector se realizó en una mezcla conteniendo 50 ng del vector, 5 μL

del Buffer de T4 DNA ligasa 2X, 3 unidades de T4 DNA ligasa y 1μL de producto de PCR en un

volumen final de 10 μL. Se incubó a 4°C toda la noche.

3.2.3.4. Transformación con el producto de ligación y selección de clones

Se descongeló lentamente un tubo conteniendo 100 μL de células competentes E .coli JM109, e

inmediatamente se agregó 50µL de las células componentes a todo el producto de ligación

(10μL) y se dejó por 20 minutos en hielo. Luego el tubo fue incubado a 42°C por 45 segundos

para rápidamente colocarlo en hielo por 2 minutos. El contenido se transfirió a 0.95 mL de medio

SOC mantenido a 37°C y la mezcla se incubó con agitación por 1:30 hora a 150 r.p.m. a 37°C.

Transcurrido dicho tiempo, se sembró el cultivo en una placa de LB-agar-ampicilina 50 μg/mL

más 800 μg de IPTG y 800 μg de X-Gal. Se incubó a 37°C por 12 a 16 horas.

Para buscar los clones conteniendo el vector con el inserto, se tomaron con asa estéril al menos

10 colonias blancas, y 2 azules como control, las cuales fueron sembradas en 5 ml de caldo LB

por 12 horas. Después se realizó una purificación de DNA plasmidial empleando el kit comercial

E.Z.N.A. Plasmid Miniprep kit I, siguiendo las indicaciones del fabricante. Con el fin de

36

visualizar el inserto de DNA incorporado al vector, el plásmido purificado fue sometido a una

digestión con EcoRI. Un fraccionamiento electroforético en gel de agarosa permitió visualizar los

insertos buscados.

3.2.3.5. Secuenciación de los productos de PCR clonados

La secuenciación se realizó por el método de dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977). Este se

llevó a cabo utilizando partidores complementarios a las secuencias de los promotores SP6 y T7,

las que flanquean la región de múltiple clonamiento (MCS) del vector. Este proceso fue realizado

por MACROGEN, Corea.

3.2.4. Ensayo de Cinética de expresión en células SHK-1 infectadas con P. salmonis viva, P.

salmonis inactivada, proteínas totales de P. salmonis y LPS

La cinética se realizó en 10 tiempos: a los 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 horas, 1, 3 y 7 días, para la

infección con P. salmonis viva. La cinética con P. salmonis inactivada, proteínas totales de P.

salmonis y LPS se realizó en los tiempos 2 y 16 horas y 1 día. Cada tiempo se realizó con un n=3.

Para la infección se utilizó la cepa tipo de P. salmonis, LF-89.

3.2.4.1. Siembra de células SHK-1

Para los ensayos de cinética se trabajó con 1x106 células por cada n utilizado en cada tiempo.

Para ello se mantiene un stock de células SHK-1 en botellas de cultivo de 175 cm2 con medio de

cultivo L-15 + 10% SBF (el que fue utilizado en todas las cinéticas realizadas), las necesarias

para poder obtener la cantidad de células requeridas para los tiempos a realizar, pensando que en

confluencia una botella de 175 cm2 se pueden encontrar 7x106 células por botella. Luego de tener

el stock necesario de células se procede a sembrar 1x106 células en botellas de cultivo de 25 cm2.

37

3.2.4.2. Cuantificación de las células SHK-1

Las células fueron soltadas de la botella utilizando tripsina 1X, la que fue neutralizada con medio

de cultivo en una proporción volumen/volumen. Una vez sueltas las células se recolectaron para

proceder a su cuantificación. Para poder visualizar las células se utilizó azul de tripan en una

dilución 1:4 y para su cuantificación se utilizó la cámara de Neubauer. Se contaron las células

que se encuentran en 5 cuadrados del cuadrante central de la cámara y en ambos lados de la

cámara, luego se precedió a utilizar la siguiente fórmula que permite cuantificar las células:

N° de células contadas x dilución x 1000 = X células/mL.

Se calculó el volumen a agregar, que contenga 1x106 células, a cada botella de 25 cm2, y se

agregó medio de cultivo. Una vez sembradas las botellas con 1x106 células, se dejaron en

incubadora a 17°C por 48 horas, tras lo cual se comenzó con la cinética.

3.2.4.3. Infección con P. salmonis viva

La infección se realizó utilizando la proporción de 50 bacterias por célula. Para ello con 14 días

de anticipación, se infectó células SHK-1 (botellas de 175 cm2 en confluencia) con P. salmonis,

para obtener la cantidad necesaria de bacterias para realizar la cinética. La infección se realizó

con 50x106 bacterias, por botella. Botellas control de infección con medio L-15 más 10% SBF.

3.2.4.4. Cuantificación de P. salmonis

Se recolectó el medio de cultivo de las células infectadas con P. salmonis, transcurridos 14 días

necesarios para que las bacterias produzcan su efecto citopático en las células y se encuentren en

el medio de cultivo de las células. Una vez recolectado el medio, se tomó una alícuota de 1 mL y

se centrifugó a 200 x g por 5 minutos para precipitar los restos celulares, luego se tomó el

sobrenadante y se cuantificó, midiendo absorbancia a 600 nm, utilizando como blanco Medio L-

15, y se aplicó la fórmula de Mc. Farland:

38

0,132 1,5x108 CFC/mL A600muestra X

Una vez cuantificadas las bacterias se agregó el volumen necesario, para tener 50x106 bacterias

por botella. Este volumen fue agregado a cada botella con medio de cultivo nuevo.

3.2.4.5. Extracción de proteínas totales de P. salmonis

Se recolectó el medio de las células infectadas con P. salmonis transcurridos los 14 días, este

medio se centrifugó a 200 X g por 5 minutos, se tomó el sobrenadante y se centrifugó a 4000 X g

por 10 minutos a 4°C, el pellet obtenido se lavó dos veces con PBS 1X, luego el sedimento se

resuspendió en 100µL de RIPA+, se incubó por 20 minutos en hielo, luego se sonicó la muestra 3

veces por 5 segundos a potencia 11, se mantuvo la muestra en hielo entre cada pulso, después se

centrifugó a 4000 x g por 10 minutos a 4°C, finalmente se recuperó el sobrenadante y se

cuantificó por el método de Bradford (Bradford, 1976). La infección se realizó con 10µg/mL.

Botellas control de infección medio de cultivo con reactivo RIPA+.

3.2.4.6. Inactivación de P. salmonis (Birkbeck et al., 2004)

Se recolectó el medio de las células infectadas con P. salmonis transcurridos los 14 días, este

medio se centrifugó a 200 x g por 5 minutos, se tomó el sobrenadante y se centrifugó a 4000 x g

por 10 minutos a 4°C, el sedimento se lavó dos veces con PBS 1X, luego fue resuspendido en

PBS 1X hasta llegar a una A600nm igual a 1. Se agregó formaldehido 1 % v/v y se dejó 24 horas a

4°C. Luego se centrifugó a 400 x g por 10 minutos, el sedimento se lavó dos veces con PBS 1%,

y se resuspendió en formaldehido 0,1%. Para preparar la infección se centrifugó a 100 x g por 10

minutos a 4°C y se lavó 3 veces con PBS 1X. Se infectó con 50x106 bacterias por botella, se

cuantificó, según el método cuantificación de P. salmonis, utilizando como blanco PBS. Botellas

control de infección con medio de cultivo más PBS 1X.

39

3.2.4.7. Verificación de P. salmonis

Se realizó Gram para corroborar que sean cocos Gram negativos según la clásica tinción con

Cristal Violeta, lugol, y safranina.

3.2.4.8.Estimulación con LPS

LPS de Sigma fue utilizado para la infección con LPS. La infección se realizó con 10 µg/mL.

Botellas control de infección con medio de cultivo más PBS 1X.

3.2.5. Análisis de las cinéticas por RT-qPCR

Cada n fue tratado de la siguiente manera: Una vez cumplido cada tiempo a cada botella, que

representa un experimento independiente (n), fueron extraídas las células con tripsina y luego se

procedió a extraer el RNA, como dice el protocolo del kit de extracción de RNA. El RNA se

cuantificó en Nanoview y fue tratado con DNAsa, luego se procedió a hacer su respectivo cDNA

según fue descrito. Para verificar la ausencia de DNA genómico se realizó un PCR utilizando

partidores de β-actina que contienen están dirigidos a dos exones adyacentes, separados por un

intron, con lo cual, el DNA genómico rinde un producto sobre los 2000 pb., en cambio el cDNA,

de aprox. 500 pb. Se puede ver como ejemplo la cinética con P. salmonis viva en la Figura 29.

Para las cinéticas se analizaron los receptores: TLR1, TLR22, TLR5S, TLR5M, TLR9 también

Myd88 e IL-1β. Como normalizadores fueron utilizados EF-1a y β-actina. En la Tabla V se

encuentran los partidores utilizados, los que fueron diseñados utilizando la secuencia clonada de

cada receptor o la base de datos de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cada uno de los juegos

de partidores utilizados fueron diseñados para obtener un producto entre 100 a 140 pb., fueron

comprobadas su T° de alineamiento en PCR convencional. Los ciclos y temperaturas utilizados

en RT-qPCR para los normalizadores y los otros mRNAs a analizar (* 62° para normalizadores y

60° para los demás marcadores estudiados):

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

40

00:05 25° 1 ciclo

10:00 95° 1 ciclo

00:15 95°

00:15* 60°/62° 40 ciclos

00:15 72°

00:10 95°

00:10 25° 1 ciclo

00:01 70°

00:0195°

Los datos obtenidos en cada ensayo de qRT-PCR fueron evaluados con la fórmula:

2ΔCt (Ct muestra- Ct normalizador)

41

Tabla V: Resumen partidores utilizados para RT-qPCR y secuencia referencia

TLRS qPCR

Nombre Secuencia Referencia

TLR5S Ftp GCT GCT GGA GCT AAG GAA CA Esta tesis

TLR5S Rtp GAG CCC TCA GCG AGT TAA GC Esta tesis

TLR22 qPCR


TLR22 Ftp1 GCG GCA TTG AGA TGT CTT TC Esta tesis

TLR22 Rtp1 GCC TTG ACC CTC TCT TCA CC Esta tesis

TLR22 Ftp2 AGG GCT GAG GCT GTT GGA TT Esta tesis

TLR22 Rtp2 GCA CAT CCC ATT CCA TGC GT Esta tesis

TLR1 qPCR


TLR1 Ftp1 TCC GGA GAC GTT TCA TCC CA Esta tesis

TLR1 Rtp1 GAG GTT CAG CGC TAA CAG CA Esta tesis

TLR5M qPCR


TLR5M Ftp2 TTG ACC GCC AGG ATC CTT GA Esta tesis

TLR5M Rtp2 AAC AGG GCG GTT CTA CCC A Esta tesis

42

Continuación Tabla V

TLR9 qPCR


TLR9 Ftp2 TGG GCG TTT GCC AAT CTG A NM_001123653

TLR9 Rtp2 TGT TGA AGC AGG GGA AGC AG NM_001123653

Myd88 Qpcr


Myd Ftp2 GAG CAG ACG GAC CAC AAG TT NM_001136545

Myd Rtp2 CTC GAT GAG TTC GCT GGT GA NM_001136545

IL-1β qPCR


IL1-β Ftp1 ATC ACC ATG CGT CAC ATT GC NM_001123582

IL1-β Rtp1 GTC CTT GAA CTC GGT TCC CA NM_001123582

β actina qPCR


Actina F AAG ATG AAA TCG CCG CAC Lockhart et al., 2004

Actina R ATG GAG GGG AAG ACA GCC Lockhart et al., 2004

EF-1a qPCR


EF-1a F GCT TAC AAA ATC GGC GGT AT NM_001173967

EF-1a R CTT GAC GGA CAC GTT CTT GA NM_001173967

43

3.2.6. Desarrollo de sueros policlonales

3.2.6.1. Determinación de péptidos idóneos para la inmunización de animales

Se realizó un análisis de hidrofilicidad de las proteínas en cuestión en búsqueda de las regiones

que pudieran servir como eventuales buenos epitopes para la generación de anticuerpos. Los

péptidos fueron sintetizados en la compañía Genescript, USA.

3.2.6.2. Conjugación de péptidos a hemocianina de Concholepas concholepas

Los péptidos elegidos para la inmunización de los conejos, fueron conjugados con hemocianina

(Bluecarrier, Biosonda) como carrier de acuerdo al siguiente procedimiento: se resuspendieron

los péptidos en buffer borato de sodio 0,5 M pH 9 a una concentración de 8,8 μg/μL. De esta

solución se tomó 225 μL y se agregó 1 mg de hemocianina y 148 μL de agua estéril; luego se

agregó muy lentamente y con agitación 77 μL de de glutaraldehido 2.5%; esta mezcla se dejó 12

horas en agitación, para luego ser dializada en una membrana contra 0.15 M de cloruro de sodio

por 6 horas. Se recuperó la solución desde la membrana de diálisis, con un volumen teórico de

455 μL, lo que arrojó una concentración teórica del péptido de 5 µg/µL.

3.2.6.3. Inmunización de conejos

Los conejos fueron inoculados con una dosis de 500 µg de péptido cada 30 días; para esto, se

preparó una emulsión compuesta de 100 µL de péptido, 500 µL coadyuvante de Freund y 400 µL

PBS; la emulsión del coadyuvante en la solución acuosa se logró por sonicación. La primera

inyección se realizó con coadyuvante completo (incluye Mycobacterium tuberculosis 1 mg/mL

inactivado) y las siguientes con coadyuvante incompleto. Previo a la primera inyección se obtuvo

sangre para extraer suero pre-inmune.

44

3.2.6.4. Obtención de sueros inmunes

Luego de tres inmunizaciones, se extrajo sangre de los conejos (25 mL aprox.) y se dejó coagular

por 15 horas, para luego separar el suero del coagulo y posterior centrifugación para eliminar

células.

3.2.6.6. Ensayo de Dot blot

En membranas de nitrocelulosa de 1 x 5 cm, se colocó 0,5, 1 y 5 µg de muestras: proteínas de

membrana de riñón anterior, proteínas totales de riñón anterior y proteínas de membrana de

células SHK-1, 5 µg de péptido conjugado a hemocianina y 5 µg de BSA como control negativo;

las muestras se aplicaron lentamente de manera que estas no difundieran de manera excesiva en

la membrana. Se realizó un pre-bloqueo, incubando las membranas en solución de bloqueo por 1

hora, para luego aplicar distintas diluciones de los sueros inmunes, usando 1:5000, 1:1000, 1:500

y 1:100, con el fin de evaluar el título de los sueros y determinar la dilución óptima para su uso

en los distintos ensayos; también se incubaron membranas con una dilución 1:1000 de sueros pre-

inmune. La incubación se realizó por 15 horas, para luego lavar 3 veces durante 5 minutos con

TNT, luego se aplicó anti IgG de conejo, conjugado a peroxidasa, en dilución 1:1000. Se

realizaron 3 lavados con TNT por 5 c/u con agitación suave. Para el revelado de las membranas,

se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando 15 μL adicionales de perhidrol a

los 5 minutos de reacción. La reacción se detuvo sumergiendo las membranas en agua.

3.2.7. Extracción de proteínas de membrana

Se homogeniza el tejido en 1 ml de tampón H1 (proporción 1g. de tejido/ 1 mL. De tampón H1/

20 µL PMSF 100mM). Se centrifugó a 1000 x g por 15 minutos a T° ambiente, se recuperó

sobrenadante, el que se centrifugó a 10000 x g por 15 minutos a T° ambiente, se recuperó el

45

sobrenadante, el que se centrifugó a 20000 x g por 90 minutos a 10°C, se eliminó sobrenadante.

El precipitado se resuspendió en 50 µL de tampón H1, luego se agregó 10 µL de SDS 10% y 10

µL de β-mercaptoetanol 14,3M, se hirvió la mezcla a 95°C por 5 min., luego se agregó 30 µL de

tampón H2, se centrifugó a 20000 x g por 20 minutos a 4°C, se recuperó sobrenadante.

3.2.7.1. Cuantificación de proteínas

Basado en el método de Bradford (Bradford et al., 1976), se fabricó una curva de calibración

entre 5 a 30 µg/mL de reactivo Bradford, utilizando BSA en agua destilada como estándar. La

lectura se realizó después de 10 minutos en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595

nm.

Para determinar la concentración de proteínas de las muestras se tomaron alícuotas de 1, 5 o 10

μL cada una, en dilución determinada y se le agregó 1 mL del reactivo de Bradford. Transcurrido

10 minutos, la absorbancia fue leída y su valor fue interpolado en la curva de calibración. Todas

las lecturas se realizaron contra su respectivo blanco, en este caso se utilizó agua destilada, (que

también se usó para las diluciones de las muestras), con el reactivo de Bradford.

3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes

Se prepararon geles, gel separador y gel espaciador, con el sistema de tampón discontinuo en

condiciones denaturantes descrito originalmente por Laemmli (1970). Las dimensiones de los

geles fueron las siguientes 95 x 100 x 0,75 mm y 30 x 100 x 0,75 mm respectivamente,

organizados entre dos placas de vidrio y espaciadores de teflón. El gel separador se preparó con

acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una concentración final de 12%, tamponado con Tris-HCl

1,5 M, pH 8.8 y SDS 0,4%. El gel espaciador se preparó a una concentración final de 30% (p/v)

tamponado con Tris-HCl 0,5 M, pH 6.8 y SDS 0,4%. Ambos geles fueron polimerizados con

46

persulfato de amonio 0,05% (p/v) y TEMED 0,15% (p/v) de concentración final. Las muestras

con tampón de muestra y con un 5% (p/v) fueron denaturadas calentándolas por 5 minutos a 95ºC

en termociclador, para luego ser cargadas cuidadosamente en los pocillos del gel. Una vez que el

sistema fue montado e inmerso en tampón de corrida, se le aplicó una corriente de 20 mA hasta

que el indicador del frente iónico llegó al borde inferior del gel.

3.2.9. Western blot

Luego de realizada la electroforesis, se procedió a realizar la electro-transferencia a una

membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia aplicando una corriente de 50 mA por al

menos 15 horas. Posteriormente se tomó la membrana y se bloqueó los sitios inespecíficos con

solución de bloqueo para western blot. Luego se incubó, durante una noche, con el primer

anticuerpo dependiendo del experimento a la dilución indicada en la Figura 28, luego se

realizaron 3 lavados de 5 min c/u con TNT, con agitación suave. Se incubó por 1 hora con el

segundo anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa, a una dilución de 1:1000. Se

realizaron 3 lavados con TNT por 5 minutos c/u con agitación suave. Para el revelado de la

membrana, se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando a los 5 minutos de

reacción 15 μL más de perhidrol. La reacción se detuvo sumergiendo la membrana en agua.

47

4. RESULTADOS

4.1. Clonamiento de los receptores tipo Toll (TLR): TLR1, TLR22, TLR5 de membrana

(TLR5M) y TLR5 soluble (TLR5S)

Todos los receptores fueron estudiados y analizados de la siguiente manera: a partir de muestras

de RNA de órganos de salmón, se sintetizó cDNA, el cual fue utilizado como templado para las

reacciones de PCR realizadas con los juegos de partidores correspondientes para cada receptor,

obteniéndose así los productos esperados de la región codificante.

Una vez obtenidos los productos de PCR esperados, estos fueron clonados en el vector p-GEM-T

easy y enviados a secuenciar. Recibidas las secuencias nucleotídicas de cada receptor, estas

fueron analizadas por BLAST (para observar si existe similitud con el receptor TLR esperado),

ensambladas y traducidas por la herramienta “Translate” de Expasy, para obtener la secuencia

aminoacídica y el marco de lectura correcto.

Obtenidas las secuencias aminoacídicas se procedió a estudiar la presencia de dominios

característicos de los TLR: las Regiones Ricas en Leucina (LRR), Región Rica en Leucina C-

Terminal (LRR-CT), región transmembrana y el dominio TIR, utilizando las herramientas

bioinformáticas de “SMART” y “SOSUI”, esta última en caso de que la región transmembrana

no fuera detectada por SMART. También se analizó si las regiones LRR poseen los residuos

consenso presentes en la mayoría de los TLR (Matsushima et al., 2007): XLXXLXLXXN y

XɵXXɵ (X: cualquier aminoácido; L y F: cualquier aminoácido hidrofóbico; N puede ser C, S o

T; ɵ: cualquier residuo hidrofóbico) y para LRR-CT se estudió sus residuos consenso

LXXLXLXXNP(F/L)XCXCXXXX (Tsoi et al., 2006). El dominio TIR posee regiones consenso

Box1, Box 2 y Box 3 las que también fueron analizadas (Slack et al., 2000; Jault et al., 2004).

48

Además, las secuencias aminoacídicas se analizaron por alineamiento múltiple, utilizando

ClustalW, pesquisando su similitud aminoacídica respecto a TLR descritos en otras especies, y

realizando una comparación de la posición de los dominios característicos (análisis SMART). En

primer lugar se realizó un alineamiento entre la secuencia obtenida de salmón, trucha y humano

en el caso de los TLR1 y TLR5M. En segundo lugar se realizó un alineamiento múltiple entre la

secuencia obtenida de salmón con secuencias de otros peces ya descritas en la base de datos

NCBI y así poder determinar si poseen homología entre ellas.

4.1.1. Clonamiento del receptor TLR1

Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del receptor TLR1 se utilizaron 2

juegos de partidores, juego A y juego B, utilizando como referencia la secuencia ya descrita en el

banco de datos para el receptor TLR1 en trucha (GenBank NM_001166101.1), como se muestra

en la Figura 4. Una vez obtenido el producto esperado de la reacción de PCR de cada juego de

partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados son para el juego A un

producto de aprox. 1440 pb. y para el juego B un producto de aprox. 1225 pb., como se observa

en la Figura 4.

Una vez ensambladas y analizadas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR, se dedujo

una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR1 en salmón, de un tamaño de 2248 pb., la que

se puede observar en la Figura 5. La secuencia ya está publicada en NCBI con el N° de acceso

HQ664666.1. La cual fue analizada por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 96% de identidad

con la secuencia de trucha utilizada como referencia.

49

A

B

Figura 4: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR para el

receptor TLR1 en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia del cDNA del

TLR1 en trucha, con un tamaño de 2773 pb., indicando la ubicación de cada partidor diseñado.

En rojo, el juego de partidores A y en azul el juego B, señalando el tamaño del producto esperado

en cada caso. B: Fraccionamiento, en gel de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A

de partidores. B: juego B de partidores. Carril 1: Estándar de tamaño molecular de 100 pb. Carril

2: 10 µL de cada producto de PCR

.

50

CTGGGCCGTGGCTGCGTTAATGGGAGTCCATCAGTGCACCCCCTCCTCCT 50

CAGAAATCCACACCATTATTGTCAACCTCTCCTCCAAAAACATATCCTCT 100

GTTCCCAGAAACCTACCTCCATGCACCGAAGCCCTGGACCTCTCCCAGAA 150

CAACATACACAAACTTGGCCATGAGGATTTCCAAGTTACAACTCACCTGA 200

GATTCCTCAACCTTTCTTGGAATGTCTTGGAGGATATTGATCCGGAGACG 250

TTTCATCCCACTCCGCTCCTGGAGAGTCTGGACCTCTCACACAACCAGCT 300

CCAGAACCTATCTGATCAACGGTACTTGCTGTTAGCGCTGAACCTCAGAG 350

ACCTAGATCTGACCTTTAACATGTTCCACACCATGACCCTGGGGGTGGAG 400

TTCCACAGCCTGACGAAGCTGGAGAGACTGGGGCTCGGAGCAAAAATCAT 450

CAGGGTGGAGGATTTCATCAACATCACTGATGTACACCTGCAAACTTTGA 500

CCCTTCGTCTGGAGAATCTCACAGCCTATGAGAGCGGCAGCCTGAGTGAC 550

GTCCAGGCGGAGAAGGTCAGCATCGGCCTGACGAACAAACCCACCGATCG 600

AAATCTGATCGCAGACGCCCTGTTGATGTTCGACAAGGTTGAGCTGATGG 650

GTATGAACATCAATGGCTACCACAGTTACCTGGTGGAACTTGTGAAGGAG 700

AAAAGGGCAGTCAACACCACACATCTTTACCTGACAAATATGGCCATCAC 750

CTGGGAGCACCTGACAAACACCATAAACGCCTTGTTGCAATCCCCCATCA 800

TCCACCTGAGCACTTCAGACGTGGCCATCCACATCCCACCTTCGATTGAC 850

ACCCCAGGAAGAAACACGTCCCACACTAAATCCTTCTCTGCCAGGCGAGC 900

GGGGGTGGTTAGCTTTTTCTTCTCCCTGGAAGCCCTCTGTAACTTCTTCA 950

TCAACATGCCGGTGGAGCGCCTGGCGATGACTGAGACATCCATCATACAC 1000

ATGACCTGCCCCAAGTCACCCAGCGGGATACTGCAGCTAGACTTCTCAGA 1050

TTGTGCCTTGACTGATACGGTCTTCTCCAGAGTAGAACAGCAAGTCACTG 1100

TAGAGTGTACAACCCTGAATAAAGTAAACATACTGGTTCTGAGAGGGAAC 1150

AACCTCAGGTGCCTTCAAACCCTGAGCAAGAGGGTCCAGAACATGATCTC 1200

TCTGCGTCACCTGGACCTCAGCCTCAACTCGTTGGTTTACAGCGGCCAGG 1250

AATGCCACTGGCCACCGAACATTGTCCACCTGAACCTATCTTCCAATGGG 1300

CTGAGTGAGTCGATATTCAGCTGCCTGCCGAATGGCACCGCCAGCCTGGA 1350

CCTCCAGAACAACCAGATCTCCACTGTACCAGAGACCCTGCTGGCCCTGG 1400

ACTCCCTCCTGGCCCTGGACCTGAGTGCCAACCGGCTGAGGGACCTCCCG 1450

GTGTGCACTGGATTCCCACACCTTAAGTATCTCCTTCTCGGGGAAAACTC 1500

CCTCCATGCCCCATCTGTGAGCTTTCTGGAGACTTGCCCTGTTCTACAGG 1550

TTCTAGATGCTGGCCGAAACCCCTTCACCTGTACGTGTGGCCTGAGGGGC 1600

TTCAGGGATCTGGGTGCTGGGACTGGCCTGGGCAGCGGACACTCTGCAAT 1650

CCAAGTTCTCCACTGGCCAGGAGCCTATCGCTGCAGCTATCCCGAAGCCT 1700

GGAGGAACTCCACACTGGGGGGCTTCCAGATCCCTGAGATCTCCTGCAAT 1750

GTCGGCCTTCTGGCAACGGCCATCTTGTGCCCTGCAGTGGCTATTATCAT 1800

TATTATGGTGACTCTGTGCCACCACCTGGACGTTCCGTGGTACCTGGGCA 1850

TGATCTGGCAGTGGACCCGGGCAAAGCACCGTGCCAGGACCCAGCAGGTC 1900

CGGCCCGAGGAACTGGAGGGGGTGGTGTTCCACGCCTTTGTGTCCTACAG 1950

CCAGCATGATGCAGACTGGGTCAAGGGCCAGCTCTTGCCTAATCTGGAAG 2000

GCTCCGGCGGGGGCCTCCACATCTGCCGCCATGAGAGGGACTTCGTCCCG 2050

GGGAAGACGATCGTGGAGAACATCATCCAATGCGTGGAGAGGAGCCGGCG 2100

CTGTGTGTTCGTCCTCTCTCGCCACTTCGTCCGGAGCGAGTGGCGCCACT 2150

ATGAGCTGTACTTTGCTAGCCATCAGCGGTTGACTCGAGGGTCTGACAGT 2200

GTAATCCTGGTGCTCCTGGAGCCTCTGCCTCAGTACATGATCCCTTCC 2248

Figura 5: Secuencia nucleotídica del receptor TLR1 en salmón (Salmo salar), n° de acceso

HQ664666.1. Secuencia nucleotídica obtenida a partir de las secuenciaciones de los productos de

los juegos de partidores A y B.

51

Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR1 se obtuvo una secuencia de 749

aminoácidos (marco de lectura en posición +2), la que se puede observar en la Figura 6. La

secuencia se analizó para localizar las regiones características de los TLR: fueron encontradas 5

LRR, una LRR-CT y el dominio TIR, por análisis con SMART y la región transmembrana se

encontró utilizando SOSUI, como muestra la Figura 6. Debido a que la secuencia no incluye el

extremo 5´ de la región codificante (extremo amino terminal), no fue posible encontrar el péptido

señal. También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.

Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que posee la secuencia

aminoacídica del TLR1 en salmón, se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la

proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha y con la secuencia aminoacídica

descrita en humano para el receptor, obteniéndose con la secuencia de trucha un 93% de

identidad y con la secuencia de humano un 47% de identidad; este alineamiento se puede

observar en la Figura 7. El segundo alineamiento múltiple se realizó para comparar la secuencia

de salmón con la secuencia ya descrita del TLR1 en otros peces: el pez cebra (Danio rerio), el

pez globo ocelado (Takifugu rubripes), el pez globo (Tetraodon nigroviridis), el pez mero de

pintas naranjas (Epinephelus coioides), el pez pargo (Lutjanus sanguineus) y el pez gato

(Ictalurus punctatus) con un 48%, 54%, 54%, 58%, 58%, 49% de similitud respectivamente; este

alineamiento se puede observar en la Figura 8.

52

A NH2-WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLG

HEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLR

DLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAY

ESGSLSDVQAEKVSIGLTNKPTDRNLIADALLMFDKVELMGMNINGYHSYLVELVEKRAV

NTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPGRNTSHTKSFSA

RRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKSPSGILQLDFSDCALTDTV

FSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLRCLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQE

CHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSAN

RLRDLPVCTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDL

GAGTGLGSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLGGFQIPEISCNVGLLATAILCPAVA

IIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWV

KGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPGKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHY

ELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS-COOH

B

C XLXXLXLXXNXɵXXɵ

LRR1 TTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHP

LRR2 TPLLESLDLSHNQLQNLSDQ

LRR3 MISLRHLDLSLNSLVYSGQECHWP

LRR4 PNGTASLDLQNNQISTVPET

LRR5 LDSLLALDLSANRLRDLPVC

D

VFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPGKTIVENI

Box1 Box2

IQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEP

Box3

LPQYMIPS

Figura 6: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR1 de salmón. A: Secuencia

de 749 aminoácidos del receptor TLR1. En rojo se encuentran señaladas las secuencias de las

Regiones Ricas en Leucina (LRR), en naranjo Regiones Ricas en Leucina C-Terminal (LRR-CT),

en azul región transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con residuos (en

oscuro) consenso en LRR-CT. B: esquema SMART para el receptor TLR1, indicando en rojo las

LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde el dominio TIR. C: residuos

consenso en las LRR, en amarillo se muestran los residuos conservados; L: leucina o residuo

hidrofóbico; X: cualquier aminoácidos; N: puede ser C, S o T; ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.

D: Box1, Box2 y Box3, residuos y regiones consenso para el dominio TIR.

53

S.salar --------WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGHEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLES 92

O.mykiss MRAVAVTLWAVAALMGVHQSTPSSSEIQTLIVNLSSRNISAVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGREDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLES 100

H.sapiens ---MTSIFHFAIIFMLILQIRIQLSEESEFLVDRSKNGLIHVPKDLSQKTTILNISQNYISELWTSDILSLSKLRILIISHNRIQYLDISVFKFNQELEY 97

. :* : * . ** ::*: *...: **::*. * *::*** * :* .*: ::**:* :* * :: :* ..*: . **

S.salar LDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYESGS--LSDVQAEKVS 192

O.mykiss LDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYDSGS--LSDVQAEKVS 200

H.sapiens LDLSHNKLVKIS----CHPTVNLKHLDLSFNAFDALPICKEFGNMSQLKFLGLSTTHLEKSSVLPIAHLNISKVLLVLGETYGEKEDPEGLQDFNTESLH 193

******:* ::* ::**:.***:** *.::.: ** .:::*: ***.:. :. ...: *:.:::..: * * : . .... *.*.::*.:

S.salar IGLTNKPTDRNLIADALLMFDKVELMGMNING----YHSYLVELVKEKRAVNTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPG 286

O.mykiss IGLTNKPTDRNLIADALLMFNEVELMGMNINGL---VASYVVELVKERRAVNTTHLYLTNMAITWKHLTNTINAVFESPIIHLSTSDVAIHIPPVSDTPG 295

H.sapiens IVFPTNKEFHFILDVSVKTVANLELSNIKCVLEDNKCSYFLSILAKLQTNPKLSSLTLNNIETTWNSFIRILQLVWHTTVWYFSISNVKLQGQLDFRDFD 293

* :..: : :: :: . ::** .:: :: *.* : : : * *.*: **: : . :: : .:.: ::* *:* :: .

S.salar RNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKSPSGILQLDFSDCALTDTVFSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLR 386

O.mykiss RNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEVLCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKLPSGILQLDFSDCALADTVFSRVEQQITVECTTLNKVNILVLRGNNLR 395

H.sapiens YSGTSLKALSIHQVVSDVFGFPQSYIYEIFSNMNIKNFTVSGTRMVHMLCPSKISPFLNLDFSNNLLTDTVFEN--------CGHLTELETLILQMNQLK 393

. : *::* ::. * *. . : ::* ** ::.:::: * ::** **. * :*:****: *:****.. * *.::: *:*: *:*:

S.salar CLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPV 484

O.mykiss SLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESVFSCLPNGTVSLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPV 493

H.sapiens ELSKIAEMTTQMKSLQQLDISQNSVSYDEKKGDCSWTKSLLSLNMSSNILTDTIFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSIPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPG 493

*..::: . :* **::**:* **: *. : :* *. .:: **:*** *::::* *** ***:.*:*.::*: :: *::* *::: * * ***

S.salar CTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDLGAGTGLGSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLGGFQIPEISCNV 584

O.mykiss CAGFPHLKYLLLRENSLHAPSVRVLETCPVLQVLDASRNPFTCTCGLRGFSDLGAGTGLGSGHPAIQLLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLEGFQIPEISCNV 593

H.sapiens CGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELGEFVKN------IDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGTLLKDFHMSELSCNI 579

* .*. *. *:: .**: **. .:::* :: :.*. *** *** * * . . .: : **.:*:*.***::*.: * .*::.*:***:

S.salar GLLATAILCPAVAIIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPG 684

O.mykiss GLLAMAILCPAVAVIIVMVTLCHHLDIPWYLGMIRQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHPFVSSTQPDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPG 693

H.sapiens TLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCIYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRN-LQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKE--GMQICLHERNFVPG 678

** :*:.. :.: : :.:** :**:**** *: ***::::***. :. : : : **.*:* : *: ***.:****** . *::** ***:****

S.salar KTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS----------------------------------- 749

O.mykiss KTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWCPYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPSKYYQLKAMMGRHTYLEWPQDRGKHRLFWANLRAAL 793

H.sapiens KSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAI 776

*:****** *:*:* :.:** ** :**:*** ****** *: : .**:*:**:****:*** ***

S.salar ---------------

O.mykiss QADLPTAPVRDDVDE 808

H.sapiens NIKLTEQAKK----- 786

Figura 7: Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR1. En rosado se muestra el

péptido señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En

verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART, para región transmembrana con SOSUI.

Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank NP_001159573.1), Humano: H. sapiens

(GenBank AAI09118). (*) se encuentra el mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares

(iguales características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición

espacial.

54

S.salar -----------------------WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGHEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSH 97

O.mykiss ---------------MRAVAVTLWAVAALMGVHQSTPSSSEIQTLIVNLSSRNISAVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGREDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSH 105

E.coioides ---------------MRPVNAALWAAAILMGLQLSSSSPN-----FVDLSSKNLSSVPSDLPETVEFLDLSCNHIQQLHQGDFKSTPLLRFLNISWNNLEGIDPETFLDTSLLEDLDLSH 95

L.sanguineus ---------------MGDSIVVFRTAATLMLQPTVWYLHS-----YIDLSSRNLSSVPRDLPKEAAQIDLSRNFIQVLQRGEFRDTTILRFNNSSWICLQSIHPLVFVGTSLLQDLDLSH 95

T.rubripes MSQNSFCPLVLFRLMMGSTIAIFCAAAMLMPQLSVSYLRN-----YIDLSSRNLSSVPGDLPKEAEYIDLSLNHIRQLKRGDFRNTPILRFLNISGNCLDSIHPETFLHTPLLEDLDLSH 115

T.nigroviridis ---------------MGPSILVFCTAATLMLQPSVSYLRN-----YIDLSSRNLSSVPGDLPKEAELIDLSRNLIQLLQRGDFRNTPILRFLNISWNCLESIHPEVFLGTPLLQDLDLSH 100

D.rerio ---------------MKPS-SGWWLVSVYLTCFHPSLIPA-IQRIIVNYSSQNLSSVPDDLKPSTEDLDLSLNHIQSLNCRDFNTTPRLRFLNLSWNILENIDRDTFTSTPALEMLDLSH 103

I.punctatus ---------------MKAQGLPWLSVVALLVSLPYSSLLN-METFILDYSSRNLSAVPPDLPPSVQCLDVSQNRIWTLKKHDFHRTPRLHFLNLSWNILEDIHPDTFISTPLLATLDLSH 104

. : :: **:*:*:** :* . :*:* * * * :*. *. *:* * * *:.*. .* *. * *****

S.salar NQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYESGSLSDVQAEKVSIGLT--NKPTDRNLIADALLMFDKVEL 215

O.mykiss NQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYDSGSLSDVQAEKVSIGLT--NKPTDRNLIADALLMFNEVEL 223

E.coioides NRLTNLSGQRYLLHTENLRVLNLTCNNFLTMTLGSEFSFLVKLESLAVGAPNISVGDFKNIAQVKLRTLTLSLEDQLNYTPGSLKDVNAKRLQITFS-RHQKIDLHVIDDALSLFAEVEL 220

L.sanguineus NRLKNLSGQQYLHHTQNLLVLNLTCNKFPTMTLGNEFRSLVKLEKLALGAKNIKMGDFKNIAGAKLHILTLSLEGDLVYEAGSLKNVQAQRLQIGLTLRTQRVDRDLFADALLLFPELEL 220

T.rubripes NELKDLMDQPYLQHTENLVALNLAHNKFLTMTLAREFGSLVKLQRLTLGGSTISVGDFRNIADVELRVMSLFLEGVLVYEPGSLQDVYARRLQVKFN---NKFPHDLMEDALSFFPEVEL 235

T.nigroviridis NCLKNLTDQPYLQRAGNLLFLNLAYNKFVTMTLAREFSSLAKLERLTLGGNVIRVGDFGNIADVELRLLSLHLEGKLLYEPGSLKDAYARRLQVELN---KEFPLHLINDALSFFPEVEL 220

D.rerio NGLQNLSEQPYLLHLGCLELLDLSSNRFSAMALGEEFSMLKRLQWLGLSAKSISIQDFTHISNLTLRTLFINADGLLTYEGNSLDDVHAEKAVIALS--STNVDIAIANDVFARFKEVEF 223

I.punctatus NSLKNLSHQQYLVKAQNLQYLDLSSNLFAVMALGYEFSKLMKLKWLGLSARIIQNNNFVNVSDLHLQTLFIQAQDLTVYENGSLTGAKSDKIVILMP--SNVFDLPIIVDALTSFKQVEL 224

* * :* * ** * *:*: * * .*:*. ** * :*: * :.. * :* : :: *:: : :. * .** .. : : : : : *.: * ::*:

S.salar MGMNING-YHSYLVELVKEKRAVNTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPGRNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHM 335

O.mykiss MGMNINGLVASYVVELVKERRAVNTTHLYLTNMAITWKHLTNTINAVFESPIIHLSTSDVAIHIPPVSDTPGRNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEVLCNFFINMPVERLAMTETSIIHM 343

E.coioides MDLTHDY---SNLSQQLSERKEILTSHLYLTNISIEWSSLTHFVKAVLRTSIRHLSASDVAMSKLPYFDTVVTYTSQMESFTASRAVVTTFFFSQEAVYNFFINLPVKRLVINETSIIHM 339

L.sanguineus MNLTGGY---KDQSDQLIKTAEIHTSHLYLTNISIEWSDLTHYVNVILQTSITHFTASDVAMYKLPYIDTKVVNTSKLQSFTAIRAVVTSFFFSQESVYNFFINLPVEKLAIVETSIIHM 340

T.rubripes LELSRGY---QELSKQLSQRSEIYTSCLYLTHISINWPDFTQYVHVALNTTVTHLGVSGVTMYRLPQNATPVAETSRVKSLTFRRAVVRSFLFSQEAVYNFFINMPVENLALTETSIIHM 352

T.nigroviridis LKLPEGC---RELSRQLSQRAEIYTSRLFLTNVSINWSDFTRCVTVALNTTVSHLSVSDVTLHRLPQTDTPMANTSRVKSVTVREVTVKSFLFSQEAVYNFFINMPVESLALTDTAIIHM 337

D.rerio TKVDGKM---EVVQQMRSR-ALMRTVRLEISNVKTTWEFLTSSVNTILSSTIRELSLTDLTLTEMKDGAN-QSSTHILESFSTKRASVTTFIFDQKMLYDFFINTPARKVSLTESPIIFM 341

I.punctatus RGLYNPE---DFLGILVTRKVRIQTVNLHLSSVWSTWKVITALTNRALMSTICQFSMSNLTLYDMYGDYF-VIQGYSLDSFSIRQASVTVFIFNQLSLYDFIINIPARNLTFAQSPIVHM 342

: . : * * :: : * :* : :.: .: :.: :: .*.: .. * *:*. : :*:** *.. : : ::.*:.*

S.salar TCPKSPSGILQLDFSDCALTDTVFSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLRCLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQ 454

O.mykiss TCPKLPSGILQLDFSDCALADTVFSRVEQQITVECTTLNKVNILVLRGNNLRSLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESVFSCLPNGTVSLDLQ 463

E.coioides TCPGSQSPIRELDFSYCAMSDSIFTTADATGIKECMNLGNLTKLNLAGNSLKSLQRLSQRVQYMTSLQDVDLSFNSLTYDGLT-ECIWPPKITNMTLASNSLTDSVFKCLPKETETLDLQ 455

L.sanguineus TCPKSQSHIQQLDFSSCALSDSIFSTVQGQTIVECENLANVRKLILGGNNLKNLQLLSKRMQHMKSLQHLDLSLNLLVYDGVK-ECVWPPNITNMTLSSNGLTDTVFKCLPTGIETLDLQ 456

T.rubripes TCPKSESPITQLNFSYCSMTDTIFSRVEGLITVECKTLGNVRTLALAGNNLKSLKSLSIRMQYMKSLQDLDLSLNLLVYDGQK-GCVWPQNISSMSLSSNGLTDSVFQCLPENVERLDLQ 468

T.nigroviridis TCPKSQSPVTHLSFSHCSLSDTIFSRVEGLITIECKTLGNLRTLTLARNNFKSLQSLSKRMRYMKSLQDLDLSFNRLVYDGQG-ECYWPQNISILHLSSNSLTSSAFQCLPTGVERLDLQ 453

D.rerio TCPGTISKIQELDLSDCALTEKIFS---VNPETECGTLVNLTRLVLRGNNLKHLSPLTSRINLMDSLQYIDLSQNTLTYSENQGRCFWPPRVLHVDLSRNGFDEVVFKCLPDSVQVLNLR 456

I.punctatus TCPKVVSMIQMLDLSDCVLTENVF----KDPLGECNTLSNLEILVLKRNNLRQLMPLTSRVQLMSSLRHVDFSQNSLTYEETQGRCNWPSKISHLDLSFNEFEQTVFKCLPTALVNLNLQ 458

*** * : *.:* * :::.:* ** .* :: * * *.:: * *: *:. * **: :*:* * *.*. * ** .: : *: * : . *.*** *:*:

S.salar NNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPVCTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDLGAGTGL-----GSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAW 572

O.mykiss NNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPVCAGFPHLKYLLLRENSLHAPSVRVLETCPVLQVLDASRNPFTCTCGLRGFSDLGAGTGL-----GSGHPAIQLLHWPGAYRCSYPEAW 581

E.coioides NNQISVIPSSILKLENLKSLNLNSNRLRDLPACNGFPILSELLLRSNSLNTPSVNNLESCAKLKTLDVSNNPFACTCALKNFISLGVRSET-----KKSLTGIELVSWPLDYCCSYPDNV 575

L.sanguineus NNQVSVVPPSILKLENLSSLNLNENRLRDLPVCNGFPILNELLLKTNSLHAPSVNKLESCPKLRTLDISNNPFTCTCALRSFINLGIQSEN-----KKSHTGIQLLSWPLNYYCSYPEAD 576

T.rubripes NNQISAVSSSTLGLVRLWYLNLNANKLLDLPVCHNFPLLQELLLKSNSLHTPSVDRLKSCRSLKTLDASSNPFTCTCDLIGFIQLGLKFE-------KGGAAVTFLQWPHGYYCSYPEAV 588

T.nigroviridis NNQLSVVSSSTLKLKRLLSLNLNANRLLDLPVCDNFPLLQELLLRSNSLHAPSVDRLESCPRLKTLDVSYNAFMCICPLRGFIRLGLESE-------KNRTGVTFLQWPQGYYCSYPEAF 573

D.rerio HNRVSTVPADIHTFDTLQVIDLTFNRLLDLPTCRSFPSLQKLLIRSNSIHSPVPGSLKTCQHLQDLDLSHNPFICTCALRDFASLINAQG-------IKTFKSTLKHWPDGYRCSYPESW 573

I.punctatus NNHISAIPANISGLDSLKVLDLTANRLLDLPDCLGYPKLQKLVLRGNFLHAPSTGSLKTCSHLTVVDMSMNPYICTCPLREFTNLIDEKGTLGGSNSWKYQRITVAHWPDGYRCSYPEYW 574

:*::*.:. : * ::*. *:* *** * .:* *. *:: * :::* *::* * :* . *.: * * * * * . ** * ****:.:

S.salar RNSTLGGFQIPEISCNVGLLATAILCPAVAIIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGS----GGGLHICRHERDFVP 683

O.mykiss RNSTLEGFQIPEISCNVGLLAMAILCPAVAVIIVMVTLCHHLDIPWYLGMIRQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHPFVSSTQPDADWVKGQLLPNLEGS----GGGLHICRHERDFVP 692

E.coioides RDSTLKDTQIPEISCNVGLLATTILCPAIAVIIVVVTACHRLDVPWYMGMIWQWTRAKHRARMRQVRPEDLAGVEFHAFVSYSQHDADWVHNSLLPNLEGP----AGGLRICHHEKNFVP 686

L.sanguineus RNSTLQKISIPEVSCDVGLLAATILCPAAVVIVLVLILCHRLDIPWYIGMIWQWTRAKHRARTRQVRPEDLVGVEFHAFVSCSQHDADWVHNSLIPNLEG------GGLRICHHERHFVP 686

T.rubripes RDSNLNNFWIPEISCNSYLLAAAILCPAVVVMTVVLTLCRHFDIPWYLGMIWQWMQAKHRARQRQPRPEVLLGIEFHAFVSYSQKDAAWVFDHLLPNLESP----AGGLRICHHGKNFVP 697

T.nigroviridis KDSNLNNIWISEISCNTGLLAAAILCPAVVTISVVLMLCRHFDIPWYVGMIWQWTRAKHRAR-HQLRPQDLVGIKFHAFVSYSQKDRDWVWDYLLPNLEGP----AGGLRICHHEKNFVP 682

D.rerio SNSTLEDFYLPEISCNAWILAITILIPTISLIVAVSLLCNRLDIPWYVRMMWKWTRAKHYSITSQLKEEDVERLHFHAFVSYSQKNAGWVKSQFLPKLEG-----DCGLRMCHHERDFIP 681

I.punctatus RKAMLKNFSMLEITCNAGLLAVTILVPAIILIIAVGILCQQLDLPWYISMIWKWTRAKHHARSSQQRQEDLQGVHFHAFISYSQRNANWVIGQLLPKLEGEDSSTQNGLRVCHHERDFIP 690

* : *::*: :** :** *: : : *.::*:***: *: :* :*** : * : : : : **.*:* :* : ** . ::*:**. **::*:* :.*:*

S.salar GKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS-------------------------------------------------- 749

O.mykiss GKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWCPYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPSKYYQLKAMMGRHTYLEWPQDRGKHRLFWANLRAALQADLPTAPVRDDVDE 808

E.coioides GKTIIENIIGCVEKSRRSVFVLSAHFVKSEWCHYELYFASHQRLAWGSDSIVLVLLEPLPQYLIPSKYYQLKSMMGRHTYLEWPQDTKKHRLFWANLRAALQTDLPDAPVTGLEE- 801

L.sanguineus GDTIIKNIINCVEKSRRSVFVLSGHFIKSEWCHYELYFASHQRLSQGSDSVVLVLLEPLPQYLIPAKYYQLKSMMGRHTYLEWPQDRAKHRLFWANLRAALQADLPYAPVIELEE- 800

T.rubripes GKPIINNIMTCVEKSRRCVFVLSAHFVKSDWCHYELYFTSHQHLALGSDSVVLVLLEPVPQYLIPSKYYQLKFMMARHTYLEWPQDRAKQRLFWANLRAALQADLPHLTVTEIEE- 812

T.nigroviridis GRTIINNILTCVETSRRCVFVLSAHFIKSNWCHYELYFASHQHLARSSDSVVLVLLEPVPQYLIPSKYYQLKAMMARHTYLEWPQDKAKQRLFWANLRAALQADLPDLTVSDTEE- 796

D.rerio GKTVVQNILRCIEQSRRCVFVLSSHFVQSEWCHYELYFANHQKLTRGMDSILLILLEPLPLYLIPSKYYQLKTMMSRRTYLEWPQEGAKQKLFWANLRAALQAELPNTPDREEE-- 795

I.punctatus GRPILDNILHCIEQSRCCVFVLSSHFVQSDWCHYELYFASHQWITRGMDNIILILLEPLPTYLIPSKYYQLKAMMARRTYLEWPQDTAKQRLFWANLRAALQADLPDCGEREWE-- 808

* .::.**: *:* ** .***** **::*:* *****:.** :: . *.::*:****:* *:**:

Figura 8: Alineamiento múltiple de TLR1 en peces. En rosado se destaca péptido señal. En

rojo secuencias LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio

TIR. (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos similares, (.) residuos parecidos en tamaño y

disposición espacial. Analizado por SMART y SOSUI(*). Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss

(GenBank NP_001159573.1), pez Mero de pintas naranjas: E. coioides (GenBank AEB32452.1),

pez pargo: L. sanguineus (GenBank ADX01348.1), pez globo ocelado: T. rubripes (GenBank

AAW69368.1), pez globo: T. nigroviridis (GenBank ABO15772.1), pez cebra: D. rerio

(GenBank AAI63271) y pez gato: I. punctatus (GenBank AEI59662.1).

55

4.1.2. Clonamiento de TLR22

Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR22 se utilizaron 5 juegos

de partidores, juego A, juego B, juego C, juego D y juego E, utilizando como referencia la

secuencia ya descrita en el banco de datos para receptor TLR22 en trucha (GenBank

NM_001124419), como se muestra en la Figura 9. Una vez obtenido el producto de PCR para

cada juego de partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados para el

juego A un producto de aprox. 787 pb., para el juego B un producto de aprox. 532 pb., para el

juego C un producto de aprox. 2235 pb., para el juego D un producto de aprox. 857 pb. y para el

juego E un producto de aprox. 216 pb., como se muestra en la Figura 9.

Una vez analizadas, estudiadas y ensambladas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR,

se dedujo una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR22 en salmón, de un tamaño de 2755

pb. (Figura 10). La secuencia ya está publicada en NCBI con el N° de acceso HQ664669.1. La

cual se analizó por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 93% de identidad con su par en trucha,

además de un 97% de identidad con el TLR22a (GenBank AM233509.1) y un 90% de identidad

con TLR22b (GenBank FM206383.1) de Salmo salar.

56

A

B


receptor TLR22 en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del

TLR22 de trucha, con un total de 2919 pb., indicando la ubicación de cada partidor. En morado

se indica el juego A, en verde el juego B, en naranjo el juego C, en azul el juego D y en rojo el

juego E de partidores, señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B:

Fraccionamiento, en gel de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A. B: juego B

(carril 1) y juego C (carril 2). C: juego D. D: juego E de partidores. A, C, D en carril 1: Estándar

de tamaño molecular de 100 pb. Carril 2: 10 µL de cada producto de PCR. B en carril 3: Estándar

de tamaño molecular de 100 pb. Carril 1 y 2: 10 µL de cada producto de PCR.

57

ATGACACTCAAGATAACCATGCCGGGAAAACAAAGTGGGTCTACATTCTCTCAGCTGAGA 60

CTCTTTCTTTGTTTCCTGCTGTATTGTTGGATTCTTGCTGGTCCAGTGTGCGGGTACTTC 120

CTGAAAAACTGCCCAATCCGGGGTAATCTCAGTGACAACTTTAACATGAAAGTACTCTGT 180

TATAACAGGAATCTTGAAGTCATGCCTATAAATATTCTGTGGAAAGTAAGTGTTTTAGAC 240

GTGGCCATGAATAACATTTCCAAAATTGGAAAGTTTGATTTTAAAGGCCTGTCAAACCTC 300

AAAATTCTAAACATGTTCATGAACCAGATCTCTCAAGTGGACAATGACGCTCTTGCACAC 360

TTAGAGGCTCTTCAAGAGCTGTATCTGGCTTATAACAGACTCACAACCCTGTCAGACCAT 420

TTGTTTCAGGACCTGGCCAACCTCTCCCTGCTACATCTGGACAACAACCTGATCACAACC 480

ATCGGGTCCTCATCCTTTCAACTTCTCTCCAGTTTGAAGACAGTGAATTTAACCAAGAAC 540

AACCTTCATAATATGAAGGAAGTTCAGCCCATCATACAATTACCACACTTACGGGAATTG 600

TACATTGGGAGCAACAGATTCACCTCTTTCCAATCACAAGAAATATCAAACAAGTCAATA 660

GGGCTGAGGCTGTTGGATTTATCCCGGAATCCATGTATCACGGCAGATGTTCTTCCTTAT 720

CTTGAGGTGTTAGACATCGCCTACTGTGGCCAACTTGGACGCATGGAATGGGATGTGCTG 780

GACAGGTCTTTTCTGAGCAACATCAAAGGTCTCAACTTGAGCGGCATTGAGATGTCTTTC 840

GAGAGGATGGCTATGGAGCTGCAGACTGTCAACTCCTCATTAGTCCATCTGAGACTGTAT 900

GACATTGGTGAAGAGAGGGTCAAGGCTCTCACTGATATTGCCTGCCATATACCTACACTT 960

AGCTTGCTCCGACTGCATCATAACAACATAAGTTCTTTGTCTGAGGAATTTCTGCAGTCA 1020

TGTAAACAAGTGACCGAAGTGGACTTAGAAAATAATAATATTATTCAGCTTTCGGCAGTA 1080

TCATTCAGATCAATGGAGCAACTAAGTACTTTGAGACTGGGCCACAACATGCTTTCTTCT 1140

GTACCAGATGCCACAAGAAATGTATCCACACTAAAGTTCCTGGATCTCAGCTTCAATATC 1200

ATCCTTAAACTGGGATGCTCAGATTTCGCCAATCTTACAGGACTCACACAACTCTTTCTT 1260

TTCCACAATCAAATCTCCAACCTTCCAGGATGTGTATTCAAGGATTTGAAAGAATTAAGG 1320

ATCCTTAAACTGGGATCAAACAAAATCCTGACCTTGAATGATGACTTTATGAGTGGTTTG 1380

TACAAACTAGAATATTTGTCAATGTCATACAATAAGCTGAGCTCAATCTCTAAAGGAGAC 1440

TTTAAAGGCTTAGCATCAATCAAGGCTCTGCTTTTATTTGACAATCAGATTGCTAGTCTT 1500

GAAGATGGAGCCTTTGAGGGATTGGTGAATCTTGCAGAACTTAGACTGCAGTCAAATAAG 1560

ATCACTCAAATAGACATAAGAAAGACTGTGCTCTCAGGACTTCCGCGCTTAAGAACTCTT 1620

GATATATCCTGTAATTATATCACATATGTAAATGATCATAAAGGAAACCCTCCACCCTTC 1680

TCTCATCTGACATCTCTGGAGAACCTTTTGATATTTAGTCAACGTCACAAGGGACTGTGT 1740

CATCTACCAATCAACTTCCTTGAAGGTCTGAAATCTTTATTGTCATTCGAGGCAGGGAGT 1800

CTTAATATTAAGGAGCTGCACCCAGACACATTCATTCACACACCCCAGTTGTGGTTCCTT 1860

GATATCAGTAAGAATGAGTTCACAGCCCTCACTCTAAAGCTGTTTCACCCAATCCCAAGT 1920

CTCAACAGCCTGTACCTGTCCAAAGCCCGACTTCAGTCCTTAGATTTCCTCATAGGAGCA 2980

AACCTCAGTAGAGTCACTTTCTTGCAGGTGAGAAAGAACGACATAACAGTAGTCAATGAG 2040

ACAGTGTTGCATTCTCTCCCTGCCTTGACATACCTGGACATGCAAGATAATGCTTTCACC 2100

TGTGGCTGCAGCGATGCTTGGTTTGTCAATTGGATGGAGAACGACAACCAAACACAAGTT 2160

GTTGGTGCAGGAGAATTTACCTGCAACTATCCTGCCGACCTAAAGGACACCAAGCTGTTG 2220

GATGTTGAGCTTCAGTTCTGTACAGTACACTTAGGACTTTACTACTACATCTCTACCACT 2280

TGTCTGGTCCTCCTCACCCTGGTAGCATCCTTTGCCTACCACTTCCTGAAATGGCAGGTC 2340

ATTTACGGCTATTACCTCATCCTGGCTTTCCTCTATGACACCAAGCAAAGGAATAAGCTC 2400

ACTCCTCATGGCTGTCAATACGATGCCTTCATCTCCTACAACGCCCATGATGAGCCCTGG 2460

GTCCTGAGGGAGCTGGAGGGAGAGCAGGGCTGGAAACTGTGTCTCCACCACCGGGACTTC 2520

CAGCCAGGCAAACCAATCATAGATAACATTATGGAAGGCATCTACGGAAGCCGCAAGACC 2580

ATCTGTGTGATCAGCCGCCGCTACCTGGAGAGTGAGTGGTGCTCCCGGGAGATCCAGGTG 2640

GCCAGCTTCCGGCTCTTTGATGAGCAGAAGGACGTCCTGATTCTGGTGTTCCTGGAGGAG 2700

GATCCCTACCCACCAGCTGTCACCCTACCACCGGATGAGGAAGCTGGTGAAGAGAC 2755

Figura 10: Secuencia nucleotídica del receptor TLR22 en salmón (Salmo salar), N° de

acceso HQ664669.1. Secuencia nucleotídica de 2755 pb., deducida a partir de las

secuenciaciones y análisis de los productos de los juegos de partidores A, B, C, D y E.

58

Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR22 se obtuvo una secuencia de 918


secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR: fueron encontradas 15

LRR, una LRR-CT, la región transmembrana tipo I y el dominio TIR por análisis con SMART,

como muestra la Figura 11. También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-

CT y Dominio TIR.

Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que posee la secuencia

aminoacídica del TLR22 en salmón se realizaron dos alineamientos. El primero, para corroborar

que la proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha; obteniéndose un 88% de

similitud, este alineamiento se puede observar en la Figura 12. El segundo Alineamiento múltiple

se realizó para comparar la secuencia de salmón con la secuencia ya descrita de TLR22 en otros:

pez gato (Ictalurus punctatus), para el pez cebra (Danio rerio), para la carpa china

(Ctenopharyngodon idella), para la carpa común (Cyprinus carpio), para el pez globo ocelado

(Takifugu rubripes) con un porcentaje de similitud de un 45%, 44%, 45%, 45%, 44%

respectivamente. En la Figura 13 se puede observar el alineamiento y sus regiones características.

59

A NH2-MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKNCPIRGNLSDNFNMKVLC

YNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNLKILNMFMNQISQVDNDALAHLEA

LQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMK

EVQPIIQLPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPCITADVLPYLEVLDIAYC

GQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNSSLVHLRLYDIGEERVKALTD

IACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQLSTLRLGH

NMLSSVPDATRNVSTLKFLDLSFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKE

LRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLFDNQIASLE

DGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLT

SLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSFEAGSLNIKELHPDTFIHTPQLWFLDISKNEF

TALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALT

YLDMQDNAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVHLGL

YYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQRNKLTPHGCQYDAFISYNAH

DEPWVLRELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRKTICVISRRYLESEWCSREIQ

VASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR-COOH

B

C --XLXXLXLXXNXɵXXɵ

LRR1 LSNLKILNMFMNQISQVDNDAL

LRR2 LEALQELYLAYNRLTTLSDHLFQD

LRR3 LANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQL

LRR4 LPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISN

LRR5 IPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQS

LRR6 CKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRS

LRR7 MEQLSTLRLGHNMLSSVPDATRN

LRR8 LTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKD

LRR9 LKELRILKLGSNKILTLNDDF

LRR10 LYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKG

LRR11 LASIKALLLFDNQIASLEDGAFEG

LRR12 LVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSG

LRR13 LPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNP

LRR14 TPQLWFLDISKNEFTALTLKLFHP

LRR15 IPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGAN

D QYDAFISYNAHDEPWVLRELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYG

Box1 Box2

SRKTICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLS

Box3

PYHRMRKLVKR

Figura 11: Análisis secuencia aminoacídica del receptor TLR22 de salmón. A: Secuencia de

918 aminoácidos del receptor TLR1. En rojo se encuentran señaladas las secuencias LRR, en

naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con

residuos (oscuro) consenso en LRR-CT. B: Esquema SMART para el receptor TLR1, indicando

en rojo las LRR, LRRCT en naranjo, en azul región transmembrana y el dominio TIR en verde.

C: residuos consenso en las LRR, en amarillo residuos conservados, L: leucina o residuo

hidrofóbico, X: cualquier aminoácidos, N: puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.

D: Box1, Box2 y Box3, residuos y regiones consenso para el dominio TIR.

60

S.salar MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKNCPIRGNLSDNFNMKVLCYNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNL 100

O.mykiss MTLKITMPGEQSGSTFSQLRLCLCFLMYCWVLADPVCGYFLKNCTIRGNLSDPSNMKVLCEKRNLEVVPKDIPRKVSVLNVAMNNISKIGKLDFKGLSNL 100

*********:*********** ****:***:**.**********.******* ****** :*****:* :* *****:***********:********

S.salar KILNMFMNQISQVDNDALAHLEALQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIIQLPHLREL 200

O.mykiss KILNMSRNQISSVDDGSLSHLEALQELGLAHNRLTTLSDHLFQGLANLSLLHQDNNLIATISSSSFQPLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIVQLPHLQEL 200

***** ****.**:.:*:******** **:************.******** *****:**.***** ***********************:*****:**

S.salar YIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPC----ITADVLPYLEVLDIAYCGQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNSSLVH 296

O.mykiss YIGSNRFTSFQSQEISNTSIELRLLDLSRNPLGIFRITADVLPYLEVLDIAYCGQLGHMEWDVLDRSFLSNVKRLNLSGIEMSLERMGMVLQTVNSSLVH 300

*****************.** ********** *********************:*************:* *********:***.* **********

S.salar LRLYDIGEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQLSTLRLGHNMLSSVPDATRNVSTLKFLDL 396

O.mykiss LRLYDISEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISVLSKEFLQSCKQLTEMDVCDNNINQLSELLFRSMEQLSTLKLGHNRLSSMPKATRNLPTLKILDL 400

******.**************************** **:********:**:*: :*** *** : **********:**** ***:*.****:.***:***

S.salar SFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKELRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLFDNQ 496

O.mykiss SFNIIHKLGCSDFSNLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFQDLKDLRILKLGSNKILTLNDDFMSGLHKLEFLSMSYNKLSSISKGDFKGLASLKTLLLFDNQ 500

***** *******:***********************:***:**********************:***:*********************:*:*******

S.salar IASLEDGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSF 596

O.mykiss IASLEDGAFEGLVNLTELRLQSNKITQIDIRNTVLTGLPHLRTLDISCNYITYVNYDKLDPPPLSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLTSLLSF 600

***************:***************:***:***:*************** .* :***:******************************.*****

S.salar EAGSLNIKELHPDTFIHTPQLWFLDISKNEFTALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALTYLDMQD 696

O.mykiss QAGSLNIKDLHPDTFIHTPQLWFLDMSKNEFTALTPKLFHPTPSLNRLYLPKARLQSLDFLKGANLSRVTFLQVRKNDITAVNETVLQSLPALTYLDMQD 700

:*******:****************:********* ***** **** ***.********** ******************.******:************

S.salar NAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVHLGLYYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQ 796

O.mykiss NPFTCGCSDAWFVQWMESNNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVDLGLYYYISTTCLVLLTLIASFAYHFLKWEVIYGYYLFLAFLYDTKQ 800

*.***********:***.:**********************************.*****************:**********:*******:*********

S.salar RNKLTPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLR----ELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRKTICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDV 892

O.mykiss RNKHKPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLRELLPELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMDGIYGSRKTICVISHRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDV 900

*** .********************** ****************************:*************:**************************

S.salar LILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR------------------------------------------- 918

O.mykiss LILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKKRTYLSWPRVGEHTGVFWQQLRLALETKERPAEENPILSGVQAL 969

*************************:

Figura 12: Alineamiento entre salmón y trucha del receptor TLR22. En rosado se muestra


verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss

(GenBank NP_001117891.1). (*) Se encuentra el mismo residuo, (:) se encuentran residuos

similares (iguales características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y

disposición espacial.

61

S.salar MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKN-CPIRGNLSDN-FNMKVLCYNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNLKILNMFMNQISQVDNDALAHLEA 123

O.mykiss MTLKITMPGEQSGSTFSQLRLCLCFLMYCWVLADPVCGYFLKN-CTIRGNLSDP-SNMKVLCEKRNLEVVPKDIPRKVSVLNVAMNNISKIGKLDFKGLSNLKILNMSRNQISSVDDGSLSHLEA 123

C.idella -------MKKESRKSMGKLQQITLYIVLCGFIS-ACSAFSLKN-CTISTPLRDI--QPKVLCYNMGFFRIPWWIPRNTRILDISFNDFAQIQIGDFRHLSNLQDLNISNNRISQIQEGALDDLSN 114

C.carpio ---------------MGTLKQITLYVAVCSFIS-SSSAFSLNN-CTIRTPLKDI--QPKVLCYKMGFFGIP-WIPRNTRILDISFNAFAQIQIGDFSHLSNLQDLNISNNKISQIQEGALDNLSN 106

D.rerio ---------------MGTLQQITVCITICAMVS-PCSTFSLTN-CTISSSQKDIKTQPKVLCYKMNFFTIP-RVPNNTWILDISFNSFAQIQIEDLNILLNLQYLNVSNNKISKIQDGAFGSLFN 108

I.punctatus -------MTANLDKLCSKATISLAVLCICIFSF-QVNAFSLTN-CTVSGALNDT-EGLKVLCYNMGFCKVPSPIPSNVRYLDMSFNSISNIRVEEFDDLSYLSYLNLSNSKISWIQEGTAEHFPH 116

T.rubripes -------MGSRIKRSTFFFSPAFFLLSFSQFVI-PLKGFALKNACKISFNVAIC------SGNFVKLQDVPQDIPPTVKGFDLSTNKISRIRTTDFKEFRLLEVLDLKNNIISQVDEGAFINLRS 111

: . . : *.* * : : :* : .. :::: * ::.* : : : *. *:: . ** :::.: :

S.salar LQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIIQLPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPC----ITADVLPYLEVL 244

O.mykiss LQELGLAHNRLTTLSDHLFQGLANLSLLHQDNNLIATISSSSFQPLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIVQLPHLQELYIGSNRFTSFQSQEISNTSIELRLLDLSRNPLGIFRITADVLPYLEVL 248

C.idella LTYLNLASNRLEAVSSGMLHGLSNLLVLRLDENNIKDIEESAFSTLQNLKVLNLTKNHLHYIDKVKPVLASPLLEELYIGSNNFDVFNSYEMSTKPLSLKKLDFSNNPLATFQLTDNIFPSLNHL 239

C.carpio LSRLNLASNRLREISRGMLHGLTNLLVLRLDNNYIKDIDVTAFSTLQNLKVLNLTKNHLHYIEKIKPVLASPYLEELYIASNHFDAFKSYEMSTNPLSLKILDLSKNPFATFQLTDNIFPFLNHL 230

D.rerio LTDLNLASNRLNAVSNGMLRGLTNLLVLRLDRNYISVIKESAFSTLHSLQVLNLSKNHLRHIDDVKPVLASLYLEELYIGSNYFNVFNSSELSTKPLSLKRLDLSNNRFAAFQLTNNIFPTLNHL 232

I.punctatus LINLNLANNNLKGVSRGLLDGLADLQVLRLDGNNIEHIDKLAFSNLRNMKVLNLTKNNLQQIANIKPVILSPGLEELLIGSNNFDVFNSYDMPRTSLSLKKIDFSYNPLTKFQITENIFPNLDYL 240

T.rubripes LKKLNLNRNKLGKLDAGLFDGLQNLTELRVTRNRLKMVEPSALKSLL------------------------PNLSVLSMAGNNMRFFESGHLTNTSLQLKSLDLSRNPITVFRITADILPNLTWL 218

* * * *.* :. :: .* :* *: * : : ::. * * * :..* : *:* .:. ..: *: :*:* * :* :::* * *

S.salar DIAYCGQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNS-SLVHLRLYDIGEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQL 369

O.mykiss DIAYCGQLGHMEWDVLDRSFLSNVKRLNLSGIEMSLERMGMVLQTVNS-SLVHLRLYDISEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISVLSKEFLQSCKQLTEMDVCDNNINQLSELLFRSMEQL 373

C.idella DLSYCGQNGSMTWNVTEKTYFSSVQTLYFMDVNMSPQNVANVLLSFKN-SLNKIRFNGNVELNKTNLLLSAC-SPMLRVVRLNANKIKHLTDNMFDPCSDLTELDLGDNEISKLSPSMFRGFTQL 364

C.carpio DLSYCGQNGTMTWNITEKTFFSSVKTLYFMDVHISAQNAANVLQSFQN-LLNKIRLNGNVELNKTDLLLNAC-SPMLQVLRLKANKIKHLTEHMFDPCSNLTEVDLGDNEISRLWPSIFIGFTQL 355

D.rerio DLSYCGHNGTMAWNVTEKSYLASVKTLYFMDVNMSIQTADNVLQSFNN-TLNKIRLNGNVRLNKTSLLLSVC-SPMLRVLRLIATKIKHLTNHMFDPCSELSELDLGGNEISNLSQSMFRGFKQL 357

I.punctatus DISYCGQNRTMLWNITDKTFLNSVKVLNLTAVHIPEENIAAILHEVSWASLFKLRLNELKRMNTKTLLQYAC-LPGIRVLRMQRNKISKLTAYMLDPCSNLTELDFGDNEISYISLPVFKELTQL 365

T.rubripes NLRGTFKKRQVTWDV--RTFLGNVSLLDISELRLSLRYMTSLLASVNS-SLTVLRMDKMS-CSLAELINISCSIPTMSALQLQNNKLGSINSSVFHLCTNVKDLDLQRNQINSTDEGAFRSMKEL 337

:: : : *:: :::: .:. * : :.:. . * .. * :*: * * * : ::: .:: :. .:. *.::.::*. *:* * : :*

S.salar STLRLGHNMLSSVPDATRNVSTLKFLDLSFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKELRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLF 493

O.mykiss STLKLGHNRLSSMPKATRNLPTLKILDLSFNIIHKLGCSDFSNLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFQDLKDLRILKLGSNKILTLNDDFMSGLHKLEFLSMSYNKLSSISKGDFKGLASLKTLLLF 497

C.idella KKLLLQINKLTQITNSFQILTTLEFIDLSRNSINKLTCNDFANLTQVKTLYLYGNKISLIRSCLFKDLKSLEVLKLGTNDLLRIDDAFSNGPHSLKDLQINFNKLSKIEKYTFRNLSQLNSLTLN 497

C.carpio KTLRLQINKLTQITNSFQMLSTLEFIDLSRNSIDTLTCNDFANLTQLKNLYLYSNKISIIKSCLFKDLKSLEVLKLGTNNLLRIGDAFSNGPYSLVELQLTFNKLSKIEKYTFRNVSQLNSLSLQ 478

D.rerio KKLQLQINKLTRVTNSFQILTSLEFIDLSRNHIHKLSCNDFANLTQVKTLYLYSNKISSIRSCLFKDLKSLEVLRLGTNNLLKIDDVFSNGPYFLKELQLSYNKLSLIKSHTFGNLPQLNNLSLE 470

I.punctatus RVLHLQINRLTKVENLFRNLPLLEFLDLSRNRITRLTCSDFANLTQLSSLYLYSNRISKLPSCAFKDLNNLEILRLGSNKLLTIDTAFENDLPSLKVLQLTYNKLSTLPKESFKGLSNLRTLDIG 489

T.rubripes KVLTLSDNRLQSVPVATRNLPNLMKLDLSKNKINALHCDDFANITKLRHLKLNANLISALPSCVFKEVTKLEVLKLQNNSISQLNTAFKMYLPNLKQLHLNSNKLVAINHGEFGGLRSLQNLSLH 458

* * * * : : :. * :*** * * * *.**:*:* : * * * ** : .* *:::..*.:*:* .*.: :. * * *: . *** : * .: .:. * :

S.salar DNQIASLEDGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIR--KTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSFEAGSLNIKELHPDTFIHTPQ 618

O.mykiss DNQIASLEDGAFEGLVNLTELRLQSNKITQIDIR--NTVLTGLPHLRTLDISCNYITYVNYDKLDPPPLSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLTSLLSFQAGSLNIKDLHPDTFIHTPQ 622

C.idella DNQISEIEAQAFKGLKNLTSLFLSSNKITAKTLTRHPNVFSGMPNLQNLDLYANSISFA-DNKLKHPPFKDLKQLRVLTLHSQR-RGINKIPSNLLQGLSSMEMFYVGNTNLGHLNPDTFKFSPQ 612

C.carpio DNQISEIESHAFGGLKNLTYLLLSSNKISAKTLTKNQDVFSGMPNLKSLGLDTNSISFS-DDQLKFPPFKDLKHLRVLALHSQR-RGIGKIPSNLLQGLSSLEMFYAGNINLAHLNPDTFKFSPQ 603

D.rerio DNQISEIEGYAFGGLENLTSLFLSSNKITGKTLTTHPNVFSGMPNLQNLDLFANSISFA-YDKLKYPLFKDLKNLRELSLYSQR-RGIGQLPSNLLEGLSSLQMFYIGNTNLNQLNPNLFNFTPQ 604

I.punctatus ENQISEIEPHAFSGLLNLTELLLSSNRITDKAIR-DEEVFSGMPELKTLEIYSNLISYV-DDTLRMPPFLLLGSLEILSIHSQR-RGFGKIPSNLLQGLTSLKMFYGGSMNLKYLHPDTFSSTPK 613

T.rubripes SNQIKKLGMGSFLGLKNLTDIHLQLNMIETEQIAG--GVFNDLINLRRLDLSNNHIRYYNSRPLRNPPFLHLSLLETLYIPSQRRRGRSQLPSNILKGLSNLLEFTCRNSQLVWLPVDTFSYTPR 583

.*** .: :* ** **: : *. * * : *:..: .*: * : * * : * : * *. * : *** :* ::* *:*:**..: * . :: * : * :*:

S.salar LWFLDISKNEFT---ALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALTYLDMQDNAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTK 741

O.mykiss LWFLDMSKNEFT---ALTPKLFHPTPSLNRLYLPKARLQSLDFLKGANLSRVTFLQVRKNDITAVNETVLQSLPALTYLDMQDNPFTCGCSDAWFVQWMESNNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTK 745

C.idella LWFLDLSKNALSEDNSIPAELFHPISRLTKLILSRTQLRSLNFLLNANLSRLSTLRAPGNEIDTINKTLIQSLPRLEVLDLQRNTFTCDCHNEFFIEWAMKTNSTQVFYFNRYTCSYPRSLRGMS 737

C.carpio LWFLDLSKNALSEDHSTPAELFHPISRLTKLILSRTQLRSLNFLLNANLSRLLSLKASGNEIDTINKTLIQSLPRLEVLDLGKNTFTCDCTNEFFIDWAKNSNSTQVLYLNKYMCSYPSSLRGMS 728

D.rerio LWFLDLSKNALREDDAIPPELFHPIPNLTKLIISRTQLRSLNFLLGANLNKLSTLRASGNEIDSVNETLIKSLPRLAVLDLQNNTFTCDCNNAFFIDWAKKNESTQVYYLSRYTCSYPRTLRGTS 730

I.punctatus LWFLDLSKNSFADDKSITANVFHPIPKLSKLIISRSQIHSLNFVLNANLSRLSVIKASENMLDVINQTLIRSLPKLRFLDLMKNTFTCDCNNAFFIEWALKSNYTQVVYLSRYTCSYPLSLRGKS 738

T.rubripes LQRLDISSNEFQD---LSPALFHPIKDVRSLYISRTRLGSLEFLKDARLGKLNFLQSKRNVFSVISEDVLESLPELVYVDFQGNNFTCDCDNAGFLQWVKENNKTQVFDAYNFECNYPLELKSKK 706

* **:*.* : . :*** : * :.:::: **:*: .*.*.:: :: * : :.: ::.*** * :*: * ***.* : *::* . : *** .: *.** *:. .

S.salar LLDVELQFCTVHLGLYYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQRNKLTPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLR----ELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRK 859

O.mykiss LLDVELQFCTVDLGLYYYISTTCLVLLTLIASFAYHFLKWEVIYGYYLFLAFLYDTKQRNKHKPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLRELLPELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMDGIYGSRK 867

C.idella LTAFNIESCTLNIDFICFLCSSIVVTLTLLLSFVWHFLRYQVIYAYYLFLAFLYDNKKKQTVST--IRYDTFISYNTEDEPWVMEELVPKLEGEQGWKLCLHHRDFVPGRPIIDNIIDGIYSSRK 858

C.carpio LSAFNTESCTLNIDFICFLCSSIVVILTLLLSFVWHFLRFQVVYAYYLFIAFLYDNKKKQSGST--FQYDAFISYNAKDEPWVMEELIPKLEGEQDWRLCLHHRDFEPGRPIIDNIIDGIYSSRK 849

D.rerio LAEFNTDSCTFNWDYICFVCSSILVILTLLLSFIWNFLRYQVVYTYYLFLAFLYDSRRNQSGQT--FQYDAFISYNTLDEAWVMEELIPKLEGEQGWRLCLHHRDFEPGRPIIDNIVDGIYSSRK 851

I.punctatus ILDLKTEWCNVNIDFIMFVLSSVIVTLTLLVSFIYQFFQWQILYAYYLFVAFLYDSKRKQIHQQHGYKYDAFISYNARDEPWVVKELLPNLEGEQGWRLCLHHRDFEPGRSIIDNIMDGIYSSRK 861

T.rubripes LLDLDTQSCTVNTDFICFISTTCTILLFMAMSFTYHFLRWQLTYAYYFFLALLADKKRKNQQTP--RQYDAFVSYNAHDEHWVLRNLLPKLEEEQGWALCLHHRDFEPGKPIIENITDAIYGSRK 826

: .. : *... . :: :: : * : ** ::*::::: * **:::*:* *.::.: :**:*:***: ** **:. :** **.* ******** **:.**:** :.**.***

S.salar TICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR----------------------------------------------------- 918

O.mykiss TICVISHRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKKRTYLSWPRVGEHTGVFWQQLRLALETKERPAEE--------NPILSGVQAL-- 969

C.idella TICLITRNYLKSNWCSSEVQVASYRLFDEQKDVLILVFLEDIPAHQLSPHHRMRKLVKKRTYLRWPKPGEDTKIFWQKLKMALETKEGHNPE--------SAIL-------- 954

C.carpio TTCLITRNYLKSNWCSSEVQVASFRLFDEQKDVLILVFLEDIPTHQPSPYHRMRKLVKKRTYLRWPKPGEDTKVFWQKLKMALEVKEGHKSD--------FLIP-------- 945

D.rerio TICLITRNYLKSNWCSSEVQVASFRLFDEQKDVLILVFLEDIPTHQLSPYHRLRKLVKKRTYIRWPKPGEDNKIFWQKLKMALETKDSHKSE--------NCIL-------- 947

I.punctatus TICVITNNYLRSTWCSKEIQMANFRLFDEQKDVLILIFLEDIPTHQLSPYHRIRKLVKKKTYLKWPQNGEYTRFFWQKLRMALETKEGPEGE--------KPLLNGQGECDY 965

T.rubripes TICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILIFLEDIPTRQLSPFYRMKKMLKSKTYLSWPRAEGHPEVFWEKLRQALLSKDMLDLKPLARGISHKVILSASGS--- 935

* *:*:..**.* *** *:*:*.:************:***:**::* **.:*::*::*

Figura 13: Alineamiento múltiple de TLR22 en peces. En rosado se destaca péptido señal. En



disposición espacial. Analizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank

NP_001117891.1), pez globo ocelado: T. rubripes (GenBank NP_001106664.1), pez cebra: D.

rerio (GenBank NP_001122147.1), pez gato: I. punctatus (GenBank AEI59679.1), carpa china:

C. idella (GenBank ADX97523.1) y carpa común: C. carpio (GenBank ADR66025.1).

62

4.1.3. Clonamiento de TLR5M

Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR5 de membrana, TLR5M,

se utilizaron 4 juegos de partidores, juego A, juego B, juego C y juego D, utilizando como hebra

de referencia la secuencia ya descrita en el banco de datos para el receptor TLR5M en trucha

(GenBank NM_001124744.1), como se muestra la Figura 14. Una vez obtenidos los productos

esperados de la reacción de PCR de cada juego de partidores, se clonaron y se enviaron a

secuenciar. Los tamaños esperados son para el juego A un producto de aprox. 1283 pb., para el

juego B un producto de aprox. 1358 pb., para el juego C un producto de aprox. 1288 pb., y para

el juego D un producto de aprox. 800 pb., como se muestra en la Figura 14.

Una vez analizada, estudiada y ensambladas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR se

dedujo una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR5M de salmón, de un tamaño de 2637

pb., la que se puede observar en la Figura 15, la secuencia ya está publicada en NCBI con el N°

de acceso HQ664667.1. La que fue analizada por BLAST y se obtuvo un 96% de identidad con la

secuencia de trucha utilizada como molde.

63

A

B

Figura 14: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de para el

receptor TLR5M en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del

TLR5 de Membrana (TLR5M) en trucha, con un tamaño de 2640 pb., indicando la ubicación de

cada partidor. En rojo el juego A, en amarillo juego B, en azul juego C y en verde juego D de

partidores, señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B: Fraccionamiento, en gel

de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A de partidores. B: juego B de partidores. C:

juego C de partidores. D: juego D de partidores. En carril 1: Estándar de tamaño molecular de

100 pb. Carril 2: 10 µL de cada producto de PCR.

64

ATGATGAGGAACCTTATACTGCTGGCTATCTTTGGAGAATACCTGCAGGTGGTGAAATGC 60

ACCCCAAAATGCCCAATATATGGCTCTATAGCAGCTTGCACCAGCCAGTCTCTACATCAG 120

GTCCCTGCGCTGCCTCCATACATTACCATTGTGTATATGAGGGATAACTACATCAGTGAG 180

ATCAATGAGACATCCTTCTCTGGGCTTGAAGGGTTAACGGAACTGGACCTCAGTTGGCAA 240

CAGGTGAATGGGCTTATTATAAGAACTAACACCTTTCAAAGGCTGGAAAACTTGGCAGTG 300

CTTTATTTAGGGTATAACACAGGTTTACAAATTGAGCCAGATGCGTTTGTGGGACTGTCC 360

AACCTGAGAGCTCTCTCGCTGTATAGGTGTGACCTGACTGAATCTATTTTACAGGGTGAC 420

TATCTCAGGCCCCTGGTTTCCTTGGAAACACTAGATCTGTATGGTAACCAGGTGAAAAGA 480

ATCCAACCTGCTCTGTTCTTTGTGAACATTACAGATTTCCATGAACTAAACGTTTCCCTA 540

AACCAGATGGAATACATATGTGAGGAAGATTTGCTTGGCTTTCAAGGCAAACACTTTCGC 600

CTCCTCAAGTTGAACAGCCTCTATCTAAATAGCATGACTCAGTATGGCTTTGACTGGAAA 660

CGATGCGGAAATCCTTTTCGGAACATGTCCATGGAGACACTTGATTTATCTTCCAATGGA 720

TTCGATGTGGACAAGGCAAAACTGTTTTTCAATGCAATCCGAGGGACAAAAATCCACCAT 780

CTTATTCTGGAACACAGCACCATGGGGAAATCATTTGGTTTCAGCAACGTGAAAGACCCA 840

GACAGGCAAACATTTGAGGGCCTCAAGAATAGTAGTGTCAAGATTCTAGATTTGTCCAAA 900

TGCTTTATATTTACATTGCAATATGCAGTATTCAGTCCGCTGAGAGAGGTAGAGGACATA 960

ACAATAGCCCAAAACAAAATTAACCAGATTGACAGGGAGGCGTTTTTTGGTCTTCAAAAT 1020

CTACAAAAGCTCAACCTATCACACAATCTTATAGGGGAAATCTATTCTTACACGTTTGAC 1080

AAACTACCCAATATTTTAGAACTAGATTTATCTTACAACCATATTGGTGCATTGGGATAT 1140

CATGCATTTAAAGGACTTCCAAACCTACAATTTCTGGATCTTACAGGAAACTCTATTCGG 1200

GAACTAGGTACATATGGTTCCCTTGCACCACTACCAAACATCCAACATCTTCGTTTGGCT 1260

GATAATAAGATTACATCCTTAGAGGGCCTCGCTGGCTTTGCTGATAGTACGATCATACTT 1320

AATATTCAAAACAACAGGTTAACTAATTTAGAGGATGTATACATTGTTTTAGCTAAATTA 1380

ATGCACATTAAGCTTCTCTGGTATGGTAACAACTTCATAAAGTGGTGCACCGTTAACAAT 1440

AATATTTCAGTGCCAGCTGTGAACTATTTAAAGCTGCTTGAGCTAAGGAACATCGCCTTG 1500

CAGGTGATATGGGCACGGGGAGAGTGTTTGCATGTTTTTGAAAATCTTGGCAACCTTTTT 1560

AGTCTGGATTTAAGCTTGAACTCCCTGCAGGCTCTCCCAGATGGTATATTTAAAGGCCTC 1620

ATCTCTCTGGAAGAGATGAGATCTCCACTTCAACTTCCTCACATACCTCCAACCAGACAT 1680

TTTCCCAGAGACTCTCAAAACACTTCACCTCCCTTACAATTCCTGGCCTCTCCTGACCCA 1740

GCGGCTTTCCATTCTCTCAGCTGGATCAACCTGTATAGGAATCAATTCCACTGTGACTGC 1800

GGTCTGGAGGACTTTCTGACGTGGCTGAAAGGGACTAACGTGACTTTTCCTGACCCTGGC 1860

GTGAATGAATTTAGCTGTGAGTTTCCTTCAGATCTCCATGGCATCAGCCTGTTGAATTAC 1920

AGCTCAGTCATATCGTGTGAGGAGGATGACGAGAGGCTGGTTCAGGAGCTGAGGCTCTCG 1980

CTCTTCATCGGCTGCACAGCGCTCATCATCCTGACCATGGTCGGAACAATCGTTTTCGCT 2040

CGTCTCCGTGGATTCCTCTTCAAAGTTTACAAAAAGTTGACCGCCAGGATCCTTGAGGGC 2100

CCTAGGAGGGATCTTTCTGCTGGTGGGCCTCGGTACGACGCTTACTTATGCTTCAGCAAC 2160

AACGACTACAAGTGGGTAGAAACCGCCCTGTTGAACAGACTAGACTCTCAGTTCTCGGAG 2200

CGAAACGTCCTCCGCTGCTGCTTCGAGGTCAGAGACTTCATCCCAGGTGAAGATCACCTG 2280

TTCAATATCAGGGACGCCATATGGGGGAGCAGGAAGGCGGTTTGTATTGTGTCTAAAGAG 2340

TTCCTCAAGGACGGCTGGTGCCTGGAGGCCTTTACCCTGGCTCAGAGCAGGATGCTGGAG 2400

GAGCTCAGAGATGTTCTCATCATGGTGGTTGTGGGGAATGTCCCCCATTACAGACTGATG 2460

AAACATGAAGGCATTAGGACCTTTGCCCGGAAGAGGGAGTACCTGCAGTGGCCGGAGGAC 2520

ACACAGGATATTCAATGGTTCTATGAGAAGCTCATGTCCAAGATTCTTAAGGACAAAAAC 2580

GAACACCGCCAAAGATAACAATGGGGATATCACACTTGTAAATATGACAGTTGGAAC 2637

Figura 15: Secuencia nucleotídica del receptor TLR5M en salmón (Salmo salar) N° de

acceso HQ664667.1. Secuencia nucleotídica de 2637 pb., deducida y analizadas de las

secuenciaciones de los productos de los juegos de partidores A, B, C y D.

65

Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR5M, se obtuvo una secuencia

aminoacídica de 878 aminoácidos (marco de lectura en posición +1), la que se puede observar en

la Figura 16. La secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR:

fueron determinadas 8 LRR, una LRR-CT, la región transmembrana tipo I y el dominio TIR por

análisis con SMART, como muestra la Figura 16. También fueron analizados los residuos

consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.

Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que poseen la secuencia

aminoacídica del TLR5M en salmón se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la

proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha y también con la secuencia

aminoacídica descrita en humano para el receptor, obteniéndose con la secuencia de trucha un

91% de similitud y con la secuencia de humano un 38% de similitud. Este alineamiento se puede

observar en la Figura 17. El segundo Alineamiento múltiple se realizó para comparar la secuencia

de salmón con la secuencia descrita en otros: el pez dulce (Plecoclossus altivelis), el pez

lenguado japonés (Paralichthys olivaceus) y el pez cebra (Danio rerio) con un porcentaje de

similitud de 52%, 52%, y 46 % respectivamente. En la Figura 18 se puede observar el

alineamiento y sus regiones características.

66

A NH2-MMRNLILLAIFGEYLQVVKCTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVPALPPYITIVYMRDNY

ISEINETSFSGLEGLTELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFV

GLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELN

VSLNQMEYICEEDLLGFQGKHFRLLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLS

SNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSSVKILD

LSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNLQKLNLSHNLIGEIYSY

TFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQFLDLTGNSIRELGTYGSLAPLPNIQHL

RLADNKITSLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCT

VNNNISVPAVNYLKLLELRNIALQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIF

KGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWINLYRNQFH

CDCGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSSVISCEEDDERLVQEL

RLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFKVYKKLTARILEGPRRDLSAGGPRYDAYLC

FSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIV

SKEFLKDGWCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQW

PEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKNTAKDNNGDITLVNMTVG-COOH

B

C

--XLXXLXLXXNXɵXXɵ

LRR1 LENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVG

LRR2 LVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFV

LRR3 LREVEDITIAQNKINQIDREAFFG

LRR4 LQNLQKLNLSHNLIGEIYSYTFDK

LRR5 LPNILELDLSYNHIGALGYHAFKG

LRR6 LPNLQFLDLTGNSIRELGTYGSLA

LRR7 LPNIQHLRLADNKITSLEGLAGFA

LRR8 LGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKG

D

RYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAI

Box1 Box2

WGSRKAVCIVSKEFLKDGWCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKH

EGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKD

Box3

Figura 16: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5M. A: Secuencia de 878

aminoácidos del receptor TLR5M. En rojo las LRR, en naranjo LRR-CT, en azul la región

transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con residuos (oscuro) consenso en

LRR-CT. B: Esquema SMART para TLR5M, indicando las LRR en rojo, LRR-CT en naranjo, en

azul región transmembrana y el dominio TIR en verde. C: Regiones conservadas en las LRR, en

amarillo residuos consensos. L: leucina o residuos hidrofóbico, X: cualquier aminoácido, N:

puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico. D: Box1, Box2, y Box3, residuos y

regiones consenso para el dominio TIR.

67

S.salar MMRNLILLAIFGEYLQVVKCTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVPALPPYITIVYMRDNYISEINETSFSGLEGLTELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAV 100

O.mykiss MMRNLILLAIFGEYLQVVKCNPKCPIYGSIAACTSQSLYQVPALPPYITILYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAV 100

H.sapines MGDHLDLLLGVVLMAGPVFGIPSCSFDGRIAFYRFCNLTQVPQVLNTTERLLLSFNYIRTVTASSFPFLEQLQLLELGSQYTP-LTIDKEAFRNLPNLRI 99

* :* ** . * *.*.: * ** .* *** : : : *** :. :**. ** * *:*. * . * * .::*:.* ** :

S.salar LYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELNVSLNQMEYICEEDLLGFQGKHFR 200

O.mykiss LYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLKPLVSLETLDLYGNQVKIIQPALFFVNMTDFQELNVSLNRMESICEEDLLGFQGKHFR 200

H.sapiens LDLGSSKIYFLHPDAFQGLFHLFELRLYFCGLSDAVLKDGYFRNLKALTRLDLSKNQIRSLYLHPSFGKLNSLKSIDFSSNQIFLVCEHELEPLQGKTLS 199

* ** .. :.**** ** :* * ** *.*::::*:..*:: * :* *** **:: : * ::..::.::.* *:: :**.:* :*** :

S.salar LLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSSVKILDLSK 300

O.mykiss LLKLNSLYLYSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIQGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLENSSVKILDLSK 300

H.sapines FFSLAANSLYSRVS--VDWGKCMNPFRNMVLEILDVSGNGWTVDITGNFSNAISKSQAFSLILAHHIMGAGFGFHNIKDPDQNTFAGLARSSVRHLDLSH 297

::.* : * * .. .** :* ****** :* **:*.**: ** : * *** :: . *** * ** .*** *:****::** ** .***: ****:

S.salar CFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNLQKLNLSHNLIGEIYSYTFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQFLDLTGNSIR 400

O.mukiss CFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNVQKLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDISYNHIGALGYQAFKGLPNLQVLDLTGNSIR 400

H.sapiens GFVFSLNSRVFETLKDLKVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQVLNLSYNLLGELYSSNFYGLPKVAYIDLQKNHIAIIQDQTFKFLEKLQTLDLRDNALT 397

*:*:*: **..*:::: :.:* ****:* ***:**:*:* ****:**:**:** .* **:: :*:. ***. : ::** * :** *** .*::

S.salar ELGTYGSLAPLPNIQHLRLADNKITSLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCTVNNNISVPAVN-YLKLLELRNIA 500

O.mykiss GLGTYGSLAPLPNIQLLRLADNKITSLEGLSVFAPSTIILNVQNNRLTNLEDVYTVLAKLMHIEFLWYGNNFIKWCTLNNNISVPAVN-SLKLLELRNIA 500

H.sapiens ------TIHFIPSIPDIFLSGNKLVTLPKINLTAN---LIHLSENRLENLDILYFLLR-VPHLQILILNQNRFSSCSGDQ---TPSENPSLEQLFLGENM 487

:: :*.* : *:.**:.:* : * ::::.:*** **: :* :* : *:::* .:* :. *: :: .*: * *: * * :

S.salar LQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWINLYRNQFHCD 599

O.mykiss LQMIWARGECMHVFQHLGKLLSLDLSFNSLQAPPDGIFKGLISLEEMDLHFNSLTYLKQDIFPESLKTVDLSYNFLASPDPEAFHSLSWINLYRNQFHCD 599

H.sapiens LQLAWETELCWDVFEGLSHLQVLYLNHNYLNSLPPGVFSHLTALRGLSLNSNRLTVLSHNDLPANLEILDISRNQLLAPNPDVFVSLSVLDITHNKFICE 584

**: * * .**: *.:* * *. * *:: * *:*. * :*. : : :* . : . . : * :*:* .* *** ::: :*:* *:

S.salar CGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSSVISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFKVYKKLTARILE 699

O.mykiss CGLEDFLTRLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNFSSVISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILIMVGSIFFTRLRGFLFKVYKKLTARILE 699

H.sapiens CELSTFINWLNHTNVTIAGP-PADIYCVYPDSFSGVSLFSLS-TEGCDE--EEVLKSLKFSLFIVCTVTLTLFLMTILTVTKFRGFCFICYKTAQRLVFK 680

* *. *:. *: ****:..* :: * :*..: *:**:. * . .*:* *.:::.*::**** **. : * :: : .:::*** * **. :::

S.salar GPRRDLSAGGPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIVSKEFLKDGWCLEAFTLAQSRML 799

O.mykiss GPRRDPSADGPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFAERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKTVCIVSKGFLKDGWCLEAFTLAQSRML 799

H.sapiens DHPQGTEPDMYKYDAYLCFSSKDFTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDFVPGENRIANIQDAIWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCLEAFSYAQGRCL 780

. :. ... :********.:*:.**:.***::**:*::::* :. *** ***:***::: **:****.*** **:**: **:********: **.* *

S.salar EELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKNTAKDNNGDITLVNMTVG- 878

O.mykiss EELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFAQKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKYTSKDNNRDITLVNMTVGT 879

H.sapiens SDLNSALIMVVVGSLSQYQLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDLQDVGWFLHKLSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS-- 858

.:*...*******.:.:*:****:.** *.:*::**:**** **: ** .** .:***.:* . **** : *

Figura 17: Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR5M. En rosado se muestra


verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss

(GenBank NP_001118216.1), Humano: H. sapiens (GenBank AAI09119.1). (*) se encuentra el

mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares (iguales características químicas), (.) se

encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición espacial.

68

S.salar MMRNLILLAIFGEYLQVVK-----CTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVP-ALPPYITIVYMRDNYISEINETSFSGLEGLTELDLSWQ-QVNGLIIRTNTFQ 94

O.mykiss MMRNLILLAIFGEYLQVVK-----CNPKCPIYGSIAACTSQSLYQVP-ALPPYITILYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQ-QVNGLIIRTNTFQ 94

P.altivelis MATKRRNVALLAVLVYLDAAISKECFLQVSLSETKAHCSGCLLREVPKLLPPSTTHLDISSNYILEVNATSFSGLWKLLELNLAWQ-QGEGLTIRSNTFL 99

P.olivaceus MWTLAPQLAFIGLYLQVTA-----CYPSCTLYGLVAACSSQGHYWVP-ALPPNITHLYLEMNYISEINSTALRPYEQLQELDLGMQSESVQLVIRNNAFS 94

D.rerio -MGYTFILILFGLCLNTEVVK---STSVCSVIGYNAICINRGLHQVP-ELPAHVNYVDLSLNSIAELNETSFSRLQDLQFLKVEQQ--TPGLVIRNNTFR 95

: ::. : . .: * * . ** **. . : : * * *:* *:: * *.: * * **.*:*

S.salar RLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELNVSLNQMEYICEEDLLG 193

O.mykiss RLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLKPLVSLETLDLYGNQVKIIQPALFFVNMTDFQELNVSLNRMESICEEDLLG 193

P.altivelis YLRDLRRLYLGNSLRLHLEPFAFVGLSNLRLLSMFKCGLNESVLEDRYLSPLVSLEILDLFANNVQRIRPAPFFANMMELKELNLTLNRMGRICETDLVH 199

P.olivaceus KQRKLIRLVLGNNIHLQLEPRAFVGLFRLQQLFLDHCTLNESILADNYLQPLFSLEMLDLLGNQIKRLQPGLFFSSLRKFTQLNLKLNPIKRLCEDDLVG 194

D.rerio GLSSLIILKLDYNQFLQLETGAFNGLANLELLTLTQCNLDGAVLSGNFFKPLTSLEMLVLRDNNIQKIQPASFFLNMRRFHVLDLTFNKVKSICEEDLLN 193

.* * *. . *::*. ** ** .*. * : :* * ::* . :: ** *** * * *::: ::*. ** .: : *::.:* : :** **:

S.salar FQGKHFRLLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHS-TMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSS 292

O.mykiss FQGKHFRLLKLNSLYLYSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIQGTKIHHLILEHS-TMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLENSS 292

P.altivelis FKNKHFRLLDLKSVYLKDMNEEGFDWEVCGNPFRSMSFDTLDLSVNGFDINMLTRFFKAIEGSKISHLVVKH--GVGKGFSYNNFRDPDKRTYEGLRSSE 297

P.olivaceus FRGKYFTILNLNSNHLAKMYEGDFDEGSGGNPFRDMAFHTLDLSSNGFNVDQTRRFFKAIQGTPIAHLILSG--HIGRGFSYDNLPDPDESTFEGLSNSA 292

D.rerio FQGKHFTLLRLSSITLQDMNEYWLGWEKCGNPFRNSSITTLDLSGNGFKESMAKRFFDAIAGTKIQSLILSNSYNMGSSFGHTNFKDPDNFTFKGLEASG 293

*:.*:* :* *.* * .* : :. *****. :: ***** ***. . **.** *: * *::. :* .*.. *. ***. *::** *

S.salar VKILDLSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQN-LQKLNLSHNLIGEIYSYTFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQF 391

O.mykiss VKILDLSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQN-VQKLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDISYNHIGALGYQAFKGLPNLQV 391

P.altivelis IKTLDLSNGHIFALQEEVFRPFGSAEEINLSYNTINQINAGAFRGLER-LATLNLSRNLLGEIHRHTFENLHSLSVLDLSYNNIGAFEHNALNGLLNLQG 396

P.olivaceus VNVFDLSKNFIFVLQRAIFSPLKTVVTIDISKNKINQIQRNAFNGLQGHLSILNLSSNLLGEIYSDTFANLKNLSALDLSYNHIGALGHQAFSDLPELRW 392

D.rerio VKTCDLSKSKIFALLKSVFSHFTDLEQLTLAQNEINKIDDDAFWGLTH-LLKLNLSQNFLGSIDSRMFENLDKLEVLDLSYNHIRALGDQSFLGLPNLRN 392

:: ***: **.* :* : : :: * **:*: ** ** : **** *::*.* * :* .: **:***:* *: ::: .* :*:

S.salar LDLTGNSIRELGTYGSLAPLPNIQHLRLADNKIT--SLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCTVNNNISVPAVNY 489

O.mykiss LDLTGNSIRGLGTYGSLAPLPNIQLLRLADNKIT--SLEGLSVFAPSTIILNVQNNRLTNLEDVYTVLAKLMHIEFLWYGNNFIKWCTLNNNISVPAVNS 489

P.altivelis LDLRGNSIRIIP---TLSPLPKLLILRLDDNKIVPQSLPGIISLASNSLILNVQNNRLTNLEDVYTLLSNLQHLQMLQYGSNFIMWCTLNGNISIPVSNS 493

P.olivaceus LFLTGNSLRDLG---SPASLPNLDFLLLGDNKLK--SVHSIANLGMNSTHVDIRDNRLTNLDDFYSIVTDFKRLQNFFYSSNFIKGCTLSKNITIPYNNT 487

D.rerio LNLTGNAVESVH---TFAALPNLNKLYLGKNRIS--SVSSLPNIAHNLSTLDLEFNKLHALSDLYTILREFPQIENIFLQGNTFSSCYNQK--QIVLSDK 487

* * **::. : : :.**:: * * .*:: *: .: :. . :::. *:* *.*.* :: .: ::: : .* : * . : :

S.salar LKLLELRNIALQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWI 589

O.mykiss LKLLELRNIALQMIWARGECMHVFQHLGKLLSLDLSFNSLQAPPDGIFKGLISLEEMDLHFNSLTYLKQDIFPESLKTVDLSYNFLASPDPEAFHSLSWI 589

P.altivelis LKVLDLERSSLQTIWAQGKCLDLFNNLSQLDILTLNHNSLQSLPQGIFKGLNSVTFIDLSFNLLTYLQPDIFPKSLVRVDLSYNVLAHPDPLALRSLRFI 593

P.olivaceus LRVLDLSDSSLQIIWAQGKCLDVFDHLNNLLGLSISSNSLTALPQGIFRGLSSIIELDLSTNSLTFLQPDVFPVSLNKLDLSNNFLAFPDPMTFQSLLFL 587

D.rerio LQLLHLGLSSMQLIWSEEKCLNVFADLHQLQQLSLTANGLQSLPKDIFKDLTSLFFLDLSFNSLKYLPTDVFPKSLQILNLDYNSIYSVDPNLFSTLGYL 585

*::*.* ::* **:. :*:.:* .* :* * :. *.* : *..**:.* *: : : ** . . : : ** : :* ::

S.salar NLYRNQFHCDCGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSS-VISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFK 688

O.mykiss NLYRNQFHCDCGLEDFLTRLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNFSS-VISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILIMVGSIFFTRLRGFLFK 688

P.altivelis NLAGNLFYCDCNLVGFLTFLNTTNATFLSP-TEELRCEFPSQFHGTRLQELN--TEGCEADDEAQVRALKLSLFIVCTVFLVIIIAGAIAFAHLRGYLFN 690

P.olivaceus NLAENRFYCDCNLESFLQWLNVTNVTLLSP-AEGFRCEFPAALHNLPLLDYATIVEPCEKDDEMAVQDLKFALFIFSALLIITVTLSGVIYARLRGHIFV 686

D.rerio SLMNNDFRCDCDLKDFQTWLNQTNVTFVHS-IEDVTCASPEDQYMVPVVRSS--IQCEDEEEERRTEKLRLVLFISCTVLIILFTASTIVYISRRGVIFK 682

.* * * ***.* .* *: **.*: . : . * * : : : ::* .. *:: *** .: ::: . : : ** :*

S.salar VYKKLTARILEGPRRDLSAG---GPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIVSKEFLKDG 785

O.mykiss VYKKLTARILEGPRRDPSAD---GPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFAERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKTVCIVSKGFLKDG 785

P.altivelis LYKRVKGRILQGPPQEPATDPDADAPYDAFLCFSNHDYQWVETALLKRLDAQFSDDNVLRCCFEARDFLPGENHLSNIRDAVFASRMTVCVVSREFLRDG 790

P.olivaceus IYKKIVGRVLEGPKPTPTVE---EVQYDVFFCFSNSGYGWVEAALLKKLDNQFSEENVFHCCFEVRDFLPGEDHLSNIRDAIWGSRKTVCVISKEFLKDG 783

D.rerio MYKKLIGELVDEKREEPDPD---RFLYDVYLCFSSKDMKWVERALLKRLDSQFSEHNTLRCCFEERDFIPGEDHLTNMRSAIQNSRKTICVVSEHFLKDG 759

:**:: ..::: **.::***. . *** ***::** **:: *.::**** ***:***:** *:*.*: ** ::*::*. **:**

S.salar WCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDK--KNTAKDN---------NGDITLVN 874

O.mykiss WCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFAQKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDK--KYTSKDN---------NRDITLVN 874

P.altivelis WCLEAFSLAQGRMLEELRNMLIVVVAGKVPHYRLMRQQSIRTFIQKREYLRWPEDEQDLEWFYDRLISQILKN---RKEAKERPDADRNN--TVDVELEN 885

P.olivaceus WCLEAFTLAQTRMVEELTNVLILLVIGKVAHYQLMRYNAIRTFIQKREYLTWPEDPQDLEWFYERLISQILRNTKMKKFAEDKPQPARPQPQNEAIDLED 883

D.rerio WCLETFTLAQKRMQAELEDILVVLVVGNIPQYRLLKYKQVRSFIENRSYLVWPDDGQDLEWFYDQLLHKIRKDIKINQTTKETK--------REEANFNT 871

****:*:*** ** ** ::*:::* *::.:*:*:: : :*:* .:*.** **:* **::***::*: :* :: . ::: :

S.salar MTVG---- 878

O.mykiss MTVGT--- 879

P.altivelis VEVLEMCE 893

P.olivaceus IRAVAM-- 889

D.rerio NTAV---- 875

.

Figura 18: Alineamiento múltiple de TLR5M en peces. En rosado se destaca péptido señal. En



disposición espacial. Analizado por SMART. Salmó: S. salar, trucha O. mykiss (GenBank

NP_001118216.1), pez dulce: P. altivelis (GenBank BAI68383.1), lenguado japonés P. olivaceus

(GenBank BAJ16366.1) y pez cebra: D. rerio (GenBank NP_001124067.1).

69

4.1.4. Clonamiento TLR5S

Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR5 soluble, TLR5S, se

utilizaron 2 juegos de partidores, juego A y juego B, utilizando como referencia la secuencia

publicada en el banco de datos para receptor TLR5S en trucha (GenBank NM_001124208), como

se muestra la Figura 19. Una vez obtenido los productos esperados de la reacción de PCR de cada

juego de partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados son para el

juego A un producto de aprox. 598 pb. y para el juego B un producto de aprox. 1741 pb., como

se muestra en la Figura 19.

Una vez analizada, estudiada y solapada las secuencias obtenidas de cada producto se dedujo una

secuencia nucleotídica, para el receptor TLR5S en salmón, de un tamaño de 1732 pb., la que se

puede observar en la Figura 20. La secuencia ya está publicada en NCBI con el número de acceso

HQ664668.1. La secuencia fue analizada por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 95% de

identidad con la secuencia de trucha utilizada como referencia.

70

A

B


receptor TLR5S en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del

TLR5 soluble (TLR5S) en trucha, con un tamaño de 2530 pb., indicando la ubicación de cada

partidor en la secuencia de trucha. En rojo el juego A de partidores, en azul juego B de partidores,

señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B. Fraccionamiento, en gel de agarosa

1%, de los productos obtenidos. A: juego A de partidores. B: juego B de partidores. En carril 1:

Estándar de tamaño molecular de 100 pb. En carril 2: 10 µL de cada producto de PCR juego A.

En carril 3: 10 µL de cada producto de PCR juego B.

71

TTCGTGGCAAACACTTTCGGTTGCTCAACTTGAACAGCGTCTATCTATATGGTATGACTC 60

AAAATGATTTTGACTGGAAACGATGTGGAAATCCCTTTAGGAACATGTCTATAGAGACAC 120

TTGACTTATCTTCCAATGGATTCAACGTGGACAAGGCTAAATTGTTTTTCAATGCAATCC 180

AAGGAATGAAAATTCACCATATTATTCTGAAACACAGCACCATGGGAAAATCATTTGGTT 240

TCAGCAATGTCAAAGACCCAAACAAGAAAACATTCAATGGCCTCAAGAATAGTGGCATCA 300

AGATTCTAGATTTTTCCAAATGCTTTATATTTGCTTTGCAATATGCAGTATTCAGTTCAC 360

TAAGAGGGGTAGAGGACATAACATTAGCCCAAAACAAAATTAATCAGATTGACAGGGGAG 420

CGTTTTGGGGTCTTGAAAATTTACAAAGGCTCAACCTGTCACACAATCTTATTGGGGAAA 480

TCTATTCTTACACATTTGACAATCTACCCAATATTTTAGAATTAGATTTATCTTACAATC 540

ATATTGGTGCATTGGGATATCAAGCATTTACAGGACTTCCAAACCTACAAATCCTGGATC 600

TTACAGGAAACTCTATTCGGCAACTAGGTACATATGGTTACCTTGCACCACTACCAAACC 660

TGCAACTTCTTCATTTGGCTGATAATAAGATCACATCCTTAGAGGGCCTCTTGGGCTTTG 720

CTAACAGTACTATCATACTGAATGTTCAAAACAACAGGTTAACTAATTTAGAGGATGTAT 780

ACATTGTGTTAGCTAAATTCATGCGCATTGAGCGTATCTGGTATGGTAACAACAACATTA 840

AGTGGTGCATCTTTAGCAATAATATTTCAGTGCCTGCTGTAACCTCTCTAAAGCTGCTGG 900

AGCTAAGGAACATCGCCCCTGCAGATTTTATGGGGACATGGAGGAGGTTTGGATGTTATT 960

TGAAATCTATCAAGCTTTTTAGTCTGGAATTTAAGCTTAACTCGCTGAGGGCTCTCCCAA 1020

ATGGCATATTCAAAGGTCTCGTCTCTCTGGAAGAGATGGATCTCAGCTTCAACTCTCTCA 1080

CATACCTCCAACCAGACATTTTCCCAGCGAGTCTCAAAACAGTTGACCTCTCTTACAATT 1140

TCCTCTCCTCTCCTGACCCAGCGGCTTTCAGGTCTCTCAGCTGGATCAACTTATATAGGG 1200

ATCGTTTCCACTGTGACGGTGGCCTGAAGGACTTTCTGACGTGGATGAACAGGACTAATG 1260

TGACTTTTCCAGACCCCGGTGTGGCTGAATTCAGCTGTGAGTTCCCCTTGGATCTCCATG 1320

GTGTCAGCCTGTTGAATTACAGCAAAGTCATAATGGAAAAGTACCCAAAACCATCTTTGA 1380

CAAAAATGTAAAACAAGACCATTAGAGTTTGGTATTACGTGTGTCATTTTCCATGCTATC 1440

TACTCTGTTTACGTTTGCTATTGGGAATCACATTTTATTTTGTTGCCTACAATATCCTGA 1500

CTGTCATATGGAATAACGTATGATATAAATACCTCATCAACACATCTTTAGTTTGTCACA 1560

CAGCGTAAAACAAATCAGCCAAAAGACAGTAAAAAGGTGTCTTCCAAAAGCATTATTTCC 1620

AAATGTTTGTATAAAGGAAAATACATATATATATTGTCATTCTGTGCGTTTTTCCGTTAT 1680

CTCACCACAAGACCCAATCCTTTGGGAAGTGTGAGCCCCTGTGGACTACTAA 1732

Figura 20: Secuencia nucleotídica del receptor TLR5S en salmón (Salmo salar) N° de acceso

HQ664668.1. Secuencia nucleotídica de 1732 pb., deducida y analizadas de las secuenciaciones

de los productos de los juegos de partidores A y B.

72

Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR5S, se obtuvo una secuencia de 462


secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR: LRR, LRRCT, región

transmembrana y dominio TIR. Fueron encontradas 8 LRR, una LRR-CT, la región

transmembrana tipo I y el dominio TIR por análisis con SMART, como muestra la Figura 21.

También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.

Para estudiar la similitud con respecto a otras secuencias descritas, que poseen la secuencia

aminoacídica del TLR5S en salmón se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la

proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha, obteniéndose un 91% de

similitud. Este alineamiento se puede observar en la Figura 22. El segundo Alineamiento se

realizó para comparar la secuencia de salmón con la secuencia descrita en otros peces: para el pez

lenguado japonés (Paralichthys olivaceus), para el pez mero de pintas naranjas (Epinephelus

coioides) y para el pez gato (Ictalarius punctatus con un porcentaje de similitud de 48%, 46%, y

44 % respectivamente. En la Figura 23 se puede observar el alineamiento y sus regiones

características.

73

A NH2–RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVD

KAKLFFNAIQGMKIHHIILKHSTMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNSGIKILD

FSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNL

IGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQILDLTGNSIRQLG

TYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIV

LAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVTSLKLLELRNIAPADFMGTWRR

FGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFP

ASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSWINLYRDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVT

FPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM-COOH

B

C ----XLXXLXLXXNXɵXXɵ

LRR1 --LRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWG

LRR2 --LENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDN

LRR3 --LPNILELDLSYNHIGALGYQAFTG

LRR4 --LPNLQILDLTGNSIRQLGTYGYLA

LRR5 --LPNLQLLHLADNKITSLEGLLGF

LRR6 LKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKG

LRR7 --LVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPA

LRR8 ----SLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRS

Figura 21: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5S. A: Secuencia de 462

aminoácidos del receptor TLR5S. B: esquema SMART para el receptor TLR5M. A y B se indica

en rojo secuencias LRR, en naranjo LRRCT, en azul región transmembrana y en verde dominio

TIR. C: residuos consenso en las LRR, en amarillo se muestran los residuos conservados, L:

leucina, X: cualquier aminoácidos, N: puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.

74

S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------

O.mykiss MSAHHFRGMMRNCILLVIFGVYLQVVKCTPRCPLYGYIAVCTNLSLYQVPALPPYITHVYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQRVNGLTIRTNTF 100

S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------

O.mykiss QRLANLAVLYLGHNRGLKIEPGAFVGLSNLRTLSLYVCDLTESILQGDYLRPLVSLKTLDLYGNQVKRIQPSPFFVNMTDFQELNITLNQMESICEEDLL 200

S.salar --RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGMKIHHIILKHSTMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNSG 98

O.mykiss GFCGKHFRLLKLNSVSLYGMTQNGFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGTKIHHIILEHSTMGKSFGFSNFKDPNKKTFNGLKNSG 300

*******:**** *******.*************************************** *******:************.***************

S.salar IKILDFSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQIL 198

O.mykiss IKILDLSKCFIFALQYAVFSPLREVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQIL 400

*****:**************.** ****************************************************************************

S.salar DLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVTSLKL 298

O.mykiss DLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLNLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSSNISVPAVNSLKL 500

*************************:*************************************************************.*******.****

S.salar LELRNIAPADFMGTWRRFGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSWINLY 398

O.mykiss LELRNIALQILWGHGVCLDVFENLIKLFSLDLSFNSLRALPDGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFSSLSWINLY 600

******* : * :. : : ******::.:*******:************************************************* ********

S.salar RDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM 462

O.mykiss RNRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPSDLHGVSLLNYSKVITEKYPKPSLTKI 664

*:*********************************** ************** **********:

Figura 22: Alineamiento entre salmón y trucha para TLR5S. En rosado se muestra péptido

señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En verde

dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank

NP_001117680.1). (*) se encuentra el mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares (iguales

características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición espacial.

75

S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------

O.mykiss MSAHHFRGMMRNCILLVIFGVYLQVVKCTPRCPLYGYIAVCTNLSLYQVPALPPYITHVYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQRVNGLTIRTNTF 100

P.olivaceus --------MWRLFLQLVTICVFLQMPACFPSCLIIGSVANCALKNLKSVPALPPHITHLFLEMNHIGEINSTSLSGLERLQQLDLGRQFVP-LLIRNNAF 91

E.coicoides --------MWTLGLQVAVICVFLQVPGCFPSCLIVNSVANCAYKNLRSVPPLPPHITHLYLEGNRISEINSNSLSGLKELQELDLGGQFVR-LMIRNNAF 91

I.punctatus -----MASGPSLILALLNLCICFLLAESTSKCFIKGDEAYCALKNLYTVPVLPPYIAYLDLTLNYISEIHEKSFYGLEALQILLIQQQEGR-LVLRNNAF 94

S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------

O.mykiss QRLANLAVLYLGHNRGLKIEPGAFVGLSNLRTLSLYVCDLTESILQGDYLRPLVSLKTLDLYGNQVKRIQPSPFFVNMTDFQELNITLNQMESICEEDLL 200

P.olivaceus GRQSRLRKLMIDSNVGLRLEPEAFVGLSSLQKLDLGYCSLNESILKENFLQPLSSLETLDLFGNHIKRLQPSAFFANMSNLKDVNLKLNRIDRICESDLV 191

E.coicoides REQRHLRRLVLGGNVHLQLEPQAFVGLSSLQNLYLYHCSLQQSILEEDYLEPLTSLETLDLFGNKIKRLQPSMFFANMTNLKILNLKLNEIDKICESDLV 191

I.punctatus SGLSNLIRLDLAYNKDLQVDPGAFNGLFNLRVLNLTECKLNGSILSGDYLRPLVSLEQLSLSGNNIPKIRPASFFVNMSKLHIVDVSRNGIYSFCEEDLF 194

S.salar --RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGMKIHHIILKH-STMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNS 97

O.mykiss GFCGKHFRLLKLNSVSLYGMTQNGFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGTKIHHIILEH-STMGKSFGFSNFKDPNKKTFNGLKNS 299

P.olivaceus GFQGKHFKALNLDSVHLRAMFTDRFDWQECGNPFRGMSFQTLDLSHNGFNVNRLRQFLRAIEGTKISHLKLS--GHMGRSFSFKNLPDPDRSTFAGLRNS 289

E.coicoides GFQGKHFEVLNLDSVCLKTMFKKR-EWQKCGNPFRGMSFQTLDLSNNGLSVSKSKQLSTAIRGTKISNLKLSL-GLMGKGFSFNIYPDPDSSMFESLNDS 289

I.punctatus HFQGKHFTLLKLQDIKMTDMTPYWSGWNKCGNPFKNMSMTLLDLSQNGFSVDVAVLFFKAIRGTKIHTLILNHSGSMGKGVWYNNLKDPDQNTFTDLSES 294

**** *:*:.: : * *:.*****:.**: **** **:.*. : **.* ** : *. . **:.. :. **: . * .* :*

S.salar GIKILDFSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLEN-LQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQ 196

O.mykiss GIKILDLSKCFIFALQYAVFSPLREVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLEN-LQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQ 398

P.olivaceus SVLTLDLSKSWIFALQQGVFSPLRDVVNIDVSQNRVNQINRNAFEGLQGHLASLNLSHNLLGEIYSHTFASLSNLRVLDLSYNHIGALGYGAFRGLPKLE 389

E.coicoides SVHTLDLSKNKIFALQEGVFSALKEVAIIDVSQNNVNQIHRNAFEGLQGHLQMLNLSHNLLGEIHSDTFASLTNLQVLDLSYNHIGVLGHDSFSELPKLK 389

I.punctatus GVKALDLSNARIFALRNSVFRHMPDLEEISLSANLINQIERDAFYGLDN-LRTLNLSHNLLDKIDSGTFKNVRSLETLDLSNNNIRILGSESFQGLPNLV 393

.: **:*: ****: .** : : * :: * :***.*.** **:. * *******:.:* * ** .: .: **** *:* ** :* **:*

S.salar ILDLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEG--LLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVT 294

O.mykiss ILDLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLNLADNKITSLEG--LLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSSNISVPAVN 486

P.olivaceus VLSLTGNALRELG---FPAALPRLDHLLLSDNRLIHSSVRSITEFAHNVVHLDIKDNRFINLANVYTFLTRLKRLQQLSYGGNSFRGCTLSAQV---GPN 486

E.coicoides VLNLTGNSLRDIG---FPALLPSLDYLLLSDNKLIDSPGRSIHRFAGDILHLDIRDNRLTNLGGVYTLVTLLDRLQHLSYGGNPIKWCNLGREVRFIDSN 486

I.punctatus HLSLSENSLQYVH---TLARLPQLKKLFLDSNKITSLYG--LPRQARNVTTIDLRNNRLRNAEDVYTILVEFPNIETIFLGGNVFSWCVLNAKYSVSPLN 488

*.*: *::: : * ** *. * * .*:: : * . :::::**: * .** .:. : .:: : *.* : * :. : .

S.salar SLKLLELRNIAPADFMGTWRRFGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSW 394

O.mykiss SLKLLELRNIALQILWGHGVCLDVFENLIKLFSLDLSFNSLRALPDGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFSSLSW 596

P.olivaceus DLQVLDLHRSSLQSVWAQGECLNLFDKLGRVIDINLSLNALRSLPQGIFKGLTSVVQMDLSSNSLTYLRPDVLPRTLEVLDLSNNFIASPDPDAFRSLRL 583

E.coicoides NVTTLDLHGSSLQSVWSQWTCLDLFDNFGHVITLNLSHNALQSLPRGIFKGLTSVVEMDLSSNSLTYLQPDVLPKSLKVLDLSNNFIASPDPDAFRSLSS 586

I.punctatus KVQFLDLHMTGLQNLWLQGRCLDMFDHLHQLQTLLLQQNMIHSLPKDIFKGLTSLNTLDLSFNSLTYIPNDIFPRSLRILKLAHNHLGSVDPQAFSTLTT 588

.: *:*: . . :. : : :: : :. * :::** .*****.*: :*** *****: *::* :*. :.*: *.:.* ** ** :*

S.salar INLYRDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM 462

O.mykiss INLYRNRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPSDLHGVSLLNYSKVITEKYPKPSLTKI 664

P.olivaceus LDLKMNRFHCDVDLKSFVTWLNKTNVTFLSP-VQELRCEFPSRFNKVPLLNYIAQVTQE--------- 641

E.coicoides LDLNMNRFHCDANLKSFLNWVTNTTVTLLTP-VKELKCEFPSDFYNVPLLRFSDDITQQ--------- 644

I.punctatus LELFGNRFLCDCTLRDFQRWLSQTNVKMFTP-AGKLTCAYPEQQRGKSLLHAALCKDKKY-------- 647

::* :** ** *:.* *:..*.*.: * . :: * :* .**. ::

Figura 23: Alineamiento múltiple de TLR5S en peces. En rosado se destaca péptido señal. En

rojo secuencias LRR y en naranjo LRR-CT (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos

similares, (.) residuos parecidos en tamaño y disposición espacial. Analizado por SMART.

Salmón: S. salar. Trucha: O. mykiss (GenBank NP_001117680.1). Pez gato: I. punctatus

(GenBank NP_001187158.1). Lenguado japonés: P. olivaceus (GenBank BAJ16368.1). Pez mero

de pintas naranjas: E. coioides (GenBank ACV04459.1).

76

4.2. Desarrollo de sueros policlonales

4.2.1. Determinación de péptidos para la inmunización

Para la detección de los receptores TLR1, TLR22 y TLR5 en salmón, se desarrollaron sueros

policlonales a partir de la inmunización de conejos. Para ello, se analizaron las secuencias

aminoacídicas, correspondientes a cada receptor, buscando las regiones con mayor hidrofilicidad.

Estas regiones representarían eventuales buenos epítopes para la unión de un anticuerpo.

Las secuencias utilizadas corresponden a secuencias aminoacídicas deducidas desde las

secuencias nucleotídica de cada receptor. Se analizó sólo la secuencia aminoacídica

correspondiente a la parte extracelular de los receptores, donde se encuentran las LRR, para

permitir la unión de anticuerpos en células no permeabilizadas. Para el receptor TLR5 se utilizó

la secuencia correspondiente al TLR5S, el cual posee una alta identidad con la región extracelular

del TLR5M, de esta manera podría reconocer ambos receptores. El tipo de análisis realizado es

de Hoop-Woods (Hoop y Woods, 1981), que permite predecir regiones antigénicas potenciales a

través de una gráfica donde la abscisa corresponde al N° de aminoácido en la proteína (de amino

a carboxilo) y el eje de las ordenadas entrega valores asignados al nivel de hidrofilicidad para las

distintas regiones de la proteína, donde los valores mayor a 0 son hidrofílicos y probables de estar

expuestos en la superficie de una proteína en su forma nativa. Un requisito para los péptidos es

que deben contener al menos un residuo de Lisina (Lys), para que aporte su grupo ε-amino a la

reacción de crosslinking con hemocianina. Los péptidos elegidos fueron sintetizados y utilizados

para la inmunización de los conejos. En las Figuras 24, 25 y 26 se pueden observar los gráficos

de hidrofilicidad para cada receptor: TLR1, TLR22 y TLR5 respectivamente.

77

A

B

Figura 24: Péptido elegido y su ubicación en la representación del TLR1. A: gráfico de

hidrofílicidad destacando en rojo zona elegida para la realización del péptido para TLR1,

indicando también la secuencia elegida. B: Esquema del receptor TLR1, basado en el modelo

entregado por SWISS MODEL. En negro se representa la región extracelular del receptor

indicando en rojo la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la región

transmembrana y en morado se representa el dominio intracelular, TIR.

78

A

B


hidrofilicidad destacando en verde zona elegida para la realización del péptido para TLR22,

indicando también la secuencia elegida. B: Esquema del receptor TLR22, basado en el modelo

entregado por SWISS MODEL. En negro se representa la región extracelular del receptor

indicando en verde la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la región

transmembrana y en rosado se representa el dominio intracelular, TIR.

79

A


hidrofilicidad destacando en amarillo zona elegida para la realización del péptido para TLR5,

indicando también la secuencia elegida. B y C: Basados en el modelo entregado por SWISS

MODEL. B: Esquema del receptor TLR5S, en negro se representa el receptor soluble indicando

en amarillo la ubicación el péptido elegido. C: En negro se representa la región extracelular del

receptor indicando en amarillo la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la

región transmembrana y en rosado claro se representa el dominio intracelular, TIR.

80

Para poder ubicar el péptido en el receptor, se realizó un modelamiento utilizando la herramienta

informática SWISS-MODEL. Para el receptor TLR1 se obtuvieron dos modelos para su

secuencia: el primero corresponde a la región extracelular, la cual posee un 63,48% de identidad

con la estructura descrita por Jin et al. (2007) para el heterodímero TLR1-TLR2 en humano, y el

segundo corresponde al dominio TIR, el cual tiene un 17,18% de identidad con el dominio TIR

humano descrito por Xu et al. (2000). Para el receptor TLR22 también se obtuvieron dos modelos

a partir de la secuencia: el primero corresponde a la región extracelular, el cual posee un 22% de

identidad con la estructura descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano y el

segundo corresponde al dominio TIR el cual tiene un 40,98% de identidad con el dominio TIR

humano descrito por Xu et al. (2000). Para el receptor TLR5M también fueron obtenidos dos

modelos: el primero corresponde a la región extracelular, posee un 21,64% de identidad con la

estructura descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano y el segundo corresponde

al dominio TIR el cual tiene un 23,27% de identidad con el dominio TIR humano descrito por Xu

et al. (2000). Para el receptor TLR5S fue obtenido un modelo representativo para su secuencia

que corresponde a la región extracelular, la cual posee un 15,30% de identidad con la estructura

descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano. En la Figuras 24, 25 y 26 se puede

observar una representación de cada receptor y la ubicación del péptido diseñado para cada uno

de ellos.

81

4.2.2. Evaluación de los sueros obtenidos

Luego del periodo de inmunización de los conejos (3 meses), se obtuvieron los sueros inmunes y

estos fueron evaluados para determinar su titulo a través de ensayos de dot-blot, lo que muestra la

Figura 27. El suero anti TLR1 presentó una reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) hasta la

dilución 1:1000 con 4 µg de péptido sin conjugar; no se detecta reacción con BSA y el suero pre-

inmune presenta una baja reacción con proteínas de membrana de SHK-1. El suero anti TLR22

presentó buena reacción Ag-Ac hasta la dilución 1:500 con 4 µg de péptido sin conjugar; no se

detecta reacción con BSA ni en el suero pre-inmune. Finalmente, el suero anti TLR5 presentó

buena reacción Ag-Ac hasta la dilución 1:5000 con 4 µg de péptido sin conjugar; sin detectar

reacción con BSA, el suero pre-inmune presenta una muy baja reacción con las proteínas de

membrana de SHK-1. Posteriormente se realizó un ensayo de Western-blot a partir de un extracto

de proteínas membrana de riñón medio y branquia, para determinar la masa aproximada de las

proteínas detectadas por los anticuerpos y así confirmar si estas correspondían a los receptores en

estudio, lo que se muestra en la Figura 28. Lo primero fue estudiar el tamaño de la proteína

completa según lo descrito en trucha para cada receptor. Para ello se utilizó la herramienta

bioinformática “Compute pI/Mw” de Expasy, analizándose las secuencias para los receptores

TLR1 (GenBank NP_001159573.1), TLR22 (GenBank NP_001117891.1), TLR5M (GenBank

NP_ 001118216.1) y para TLR5S (GenBank NP_001117680.1), esto debido a que no se obtuvo

toda la secuencia de la proteína en salmón. Los tamaños aproximados son: para el receptor TLR1

90 kDa, para el receptor TLR22 110 kDa, para el receptor TLR5M 100 kDa y para el TLR5S 75

kDa. Debido a que los ensayos de western blot fueron realizados con proteínas de membrana no

se evaluó TLR5S.

82

Figura 27: Ensayo de Dot-Blot para la titulación de los sueros inmunes anti TLR1, TLR22,

y TLR5. Se utilizaron las diluciones 1:100, 1:500, 1:1000 y 1:5000 y como control suero pre-

inmune 1:500. Fueron evaluados con 0,5 , 1 y 5 µg/µL de proteínas de membrana de cabeza de

riñón (RHM) , de SHK-1 (SHK1M), y de proteínas totales de cabeza de riñón (RHT), también con

4 µ de péptido sin conjugar (s/c) y con 2 µg de BSA. A: suero anti-TLR1, B: suero anti-TLR22 y

C: suero anti-TLR5.

83

Figura 28: Western-Blot de proteínas de membrana de órganos de Salmo salar para la

detección de TLR1, TLR22 y TLR5. Se evaluaron los sueros inmunes y pre-inmunes para la

inmunodetección, previamente separados por SDS.PAGE 12%. La dilución utilizada en ambos

sueros fue de 1:250. Se cargaron 20 µg de proteína de membrana de Riñón medio para TLR1 y

TLR5 y Branquia para TLR22. A: Suero inmune para TLR1, B: suero pre inmune para TLR1. C:

suero inmune para TLR22, D: suero pre-inmune para TLR22. E: suero inmune TLR5, F: suero

pre-inmune TLR5. En cuadrado se muestra la banda de la proteína esperada.

84

En todos los ensayo de Western-Blot realizados se observa una banda que podría corresponder a

la esperada para cada receptor, pero también se observan otras bandas. Debido a esto se

realizaron ensayos de Western-Blot utilizando el suero pre-inmune del conejo correspondiente a

cada receptor, de esta manera se puede evaluar la presencia de anticuerpos creados con

anterioridad a la inmunización por el conejo.

4.3. Cinéticas de expresión utilizando RT-qPCR

Para evaluar la expresión de los receptores TLR5M, TLR5S, TLR22 y TLR1 frente a la infección

causada por Piscirickettsia salmonis se realizó una cinética a distintos tiempos (0,5 h, 1 h, 2 h, 4

h, 8 h, 12 h, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días) y se analizó la expresión de ellos por RT-qPCR. También

se realizaron otras cinéticas de expresión, a los tiempos 2 h, 16 h y 1 día, infectando las células

con: i) proteínas totales de P. salmonis; ii) P. salmonis inactivada con formaldehido y; iii) LPS.

De esta manera se pudo evaluar la expresión de los distintos genes en estudio frente a los mismos

patrones moleculares expuestos de distintas maneras. Junto con analizar los receptores en estudio

se evaluó el receptor TLR9, la proteína Myd88 y la citoquina IL-1β, todos involucrados en la

respuesta inmune del pez frente a una infección bacteriana.

Las distintas cinéticas se realizaron de la siguiente manera: Cada tiempo en estudio se evaluó con

un n=3, una vez transcurrido el tiempo correspondiente se procedió a obtener las células en

estudio y extraer el RNA de ellas, una vez extraído el RNA fue tratado con DNAsa para asegurar

que no exista contaminación con DNA genómico y posteriormente se sintetizó a cDNA. Este

cDNA se cuantificó y comprobó su integridad por PCR convencional, amplificando β-actina (ya

que los partidores diseñados para β-actina posee un intron entre los partidores), los productos de

PCR obtenidos de la cinética de expresión con P. salmonis viva se muestran en la Figura 29, se

puede observar que las muestras se encuentran libre de DNA genómico.

85

Figura 29: PCR convencional a β-actina de cDNA de cinética de expresión con P. salmonis

viva. Gel de agarosa al 1%, producto esperado para cDNA es de aprox. 400 pb. y para DNA

genómico es de aprox. 2500 pb. Control corresponde a tiempo 0, sin infección. G: DNA

genómico de salmón. Los cDNA de las otras cinéticas también se comprobaron de esta forma,

obteniendo todas las cinéticas este resultado.

86

El análisis de la expresión de los distintos genes a estudiar se realizó mediante PCR tiempo real.

Para ello fue necesario diseñar partidores para cada uno de los genes a estudiar (se ve en material

y métodos) los que fueron verificados por RT-qPCR que sólo se obtuviera un producto para cada

uno de ellos y la ausencia de dimerización de los partidores, en la Figura 30 se muestra el gráfico

de curva de disociación del producto de PCR de cada juego de partidores, en donde la ordenada

corresponde a fluorescencia (emitida por el producto) y en la abscisa a la T° de melting de cada

producto, donde se puede observar sólo un pick de amplificación a una T° de melting lo que

corresponde a que sólo se obtiene un producto de PCR y al mismo tiempo se observa que el

control no presenta pick de fluorescencia lo que corrobora la ausencia de dimerización de los

partidores. En la Figura 31 se puede observar el ensayo de cinética de expresión con células

infectadas con P. salmonis viva para cada juego de partidores, utilizando como templado todas

las muestras a evaluar, se muestra como ejemplo sólo esta cinética ya que en las otras cinéticas

estudiadas ocurre lo mismo.

Una vez realizados los ensayos de RT-qPCR para todas las muestras (en triplicado) de cada

cinética se revisó cada curva de disociación obtenida y se corroboró que la T° de melting

corresponda al producto esperado para cada juego de partidores.

Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen son: EF-1a 87°C, β-actina 85°C,

TLR5S 81°C, TLR1 83°C, TLR5M 85°C, TLR9 87°C, TLR22 82°C, IL-1β 83°C, Myd88 84°C.

87

Figura 30: Curva de disociación para cada juego de partidores. En azul se muestra el pick de

cada producto de PCR. En rojo el control de la reacción. A: partidores para EF-1a, B: partidores

para β-actina, C: partidores para TLR5S, D: partidores para TLR1, E: partidores para TLR5M, F:

partidores para TLR9, G: partidores para TLR22, H: partidores para IL-1β, I: partidores para

Myd88.

88

Figura 31: Curvas de disociación utilizando los templados de la cinética de expresión con P.

salmonis viva. A: partidores para EF-1a, B: partidores para β-actina, C: partidores para TLR5S,

D: partidores para TLR1, E: partidores para TLR5M, F: partidores para TLR9, G: partidores para

TLR22, H: partidores para IL-1β, I: partidores para Myd88.

89

Como normalizador para los ensayos de cinética en RT-qPCR se analizaron dos: β-actina y EF-

1a. Se decidió utilizar EF-1a debido a que presenta valores menores de Ct que β-actina. En la

Figura 32 se muestran los gráficos de amplificación para los dos genes normalizadores

estudiados, se muestra como ejemplo lo que ocurre con los templados de la cinética de expresión

con P. salmonis viva, debido a que en las otras cinéticas ocurre lo mismo. En ellos se demuestra

que la amplificación del producto de PCR comienza en un ciclo mucho menor utilizando los

juegos de partidores para EF-1a al compararlo con el juego de partidores para β-actina.

90

Figura 32: Curvas de amplificación para los genes normalizadores, β-actina y EF-1a. El eje

de las ordenadas corresponde a Fluorescencia y el eje de las abscisas corresponde a los ciclos de

amplificación.

91

4.3.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLR

La evaluación se realizó utilizando la formula descrita en material y métodos, de esta manera se

cuantificó la expresión relativa de cada gen estudiado. Una vez obtenido el resultado de la

fórmula, se calculó la media de la expresión relativa en los n de los controles de cada cinética,

esta media se utilizó como expresión basal de cada gen estudiado y equivale en el gráfico de

cinética de expresión a: 1 de razón de expresión, en el eje de las ordenadas. De esta manera se

puede calcular la relación entre la media de la expresión relativa de cada tiempo con la media

calculada para los controles y así poder observar si aumenta o disminuye la expresión al

compararla con el control, esto se realizó para todas las muestras de las cinéticas.

En el caso de TLR5S, las cinéticas de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada

y estimuladas con LPS no se observó amplificación del producto esperado en los controles

utilizados, por lo que se cuantificó la expresión relativa, con la fórmula de material y métodos, de

TLR5S en estas cinéticas. Sus gráficos de expresión corresponden en el eje de las ordenadas a

expresión relativa y en el eje de las abscisas al tiempo.

En el caso de TLR22 las cinéticas de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada

y proteínas totales de P. salmonis no se observó amplificación de los productos esperados en las

muestras de cDNA por lo que se concluyó que no hay expresión de este receptor. Para las

cinéticas de expresión con células estimuladas con LPS en los controles utilizados no se observó

amplificación de los productos esperados, por lo que se cuantificó la expresión relativa de

TLR22, su gráfico de expresión corresponde en el eje de las ordenadas a expresión relativa y en

el eje de las abscisas al tiempo.

92

La evaluación realizada a los receptores en estudio, junto con el receptor TLR9, IL-1β y Myd88

se realizó analizando de forma independiente cada cinética, debido a que la presentación de los

patrones moleculares en cada una de ellas es de manera diferente.

4.3.1.1. Evaluación de TLR5M (gráficas se pueden observar en la Figura 33)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: A las 0,5 hora y 1 hora se ve un

leve aumento de expresión de 0,4 veces con respecto al control. Entre los tiempos estudiados 2

horas y 12 horas disminuye su expresión, hasta 0,7 veces con respecto al control, lo que se

recupera al día de infección donde se ve un aumento de 0,2 veces con respecto al control. En los

días 2, 3 y 7 disminuye su expresión cerca de 0,8 veces con respecto al control.

Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas Totales de P. salmonis: Se ve un

aumento de expresión en los tiempos estudiados de infección observándose un pick de expresión

de 1,5 veces con respecto al control a las 16 horas.

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis Inactivada: Disminuye la

expresión durante todos los tiempos estudiados observándose una mayor disminución, de 0,6

veces con respecto al control, al día (24 horas) de infección.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye su expresión durante todos

los tiempos estudiados, 2 horas, 16 horas y 24 horas, en 0,8 veces con respecto al control.

4.3.1.2. Evaluación a TLR5S (gráficas se pueden observar en la Figura 34)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: A las 0,5 horas, 1 y 2 horas

disminuye su expresión observándose un pick de disminución de 0,8 veces con respecto al

control a las 0,5 horas. A la 4 hora se observa un aumento de 0,8 veces con respecto al control.

93

TLR5M

Figura 33: Cinéticas de expresión del receptor TLR5M. A: Cinética de expresión con células

infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas

totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis

inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para

cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada

cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.

P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis

P. salmonis inactivada LPS

94

TLR5S

Figura 34: Cinéticas de expresión del receptor TLR5S. A: Cinética de expresión con células








95

Luego disminuye su expresión durante los tiempos restantes estudiados, observándose un pick de

disminución de 0,9 veces con respecto al control a las 8 horas.

Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se

mantiene la expresión con respecto al control a las 2 horas y se ve un aumento entre las 16 horas

y 1 día (24 horas) de infección de 3 y 2 veces, con respecto al control, respectivamente.

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: No hay expresión

del receptor hasta el día (24 horas) de infección donde se observa una expresión relativa de 0,001

con respecto al control.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: No hay expresión del receptor en

control, entre los tiempos estudiados de 2 horas, 16 horas y 1 día de infección hay expresión

relativa del receptor de 0,00007, 0,00004 y 0,0007, con respecto al control, respectivamente.

4.3.1.3. Evaluación de TLR1 (gráficas se pueden observar en la Figura 35)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Disminuye su expresión a las

0,5 hora cerca de 0,7 veces con respecto al control. Comienza a aumentar por sobre el control

desde 1 hora hasta la 4 hora de infección con un pick de expresión de 1,5 veces con respecto al

control a las 2 horas de infección. Entre las 8 y 12 hora disminuye su expresión con respecto al

control en 0,7 y 0,4 veces respectivamente. Al día de infección se ve un aumento de expresión de

1,2 veces con respecto al control. En los tiempos: 2 día y 3 día se mantiene la expresión con

respecto al control. Al 7 día se ve una disminución de 0,8 veces con respecto al control.

Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se ve un

aumento de expresión en todos los tiempos estudiados: 2 horas, 16 horas y 1 día de 3, 15 y 30

veces, con respecto al control, respectivamente.

96

TLR1

Figura 35: Cinéticas de expresión del receptor TLR1. A: Cinética de expresión con células








97

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: Disminuye la

expresión durante todos los tiempos de estudio: 2 horas, 16 horas y 1 día de 0,8, 0,85 y 0,7 veces,

con respecto al control, respectivamente.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión casi total del

receptor durante todos los tiempos estudiados, 2 horas, 16 horas y 1 día (24 horas) con respecto al

control.

4.3.1.4. Evaluación de TLR22 (gráficas se pueden observar en la Figura 36)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Comienza a aumentar la

expresión con respecto al control a las 0,5 horas de 0,1 veces. A 1 y 2 horas se ve un aumento de

expresión de 0,3 veces con respecto al control. Se mantiene la expresión al igual que el control a

las 4 y 8 horas estudiadas, observándose a las 12 horas una disminución de 0,5 veces con respecto

al control. Al día de infección se ve un aumento de 0,6 veces con respecto al control el que

disminuye por bajo el control en los tiempos estudiados restantes, 2, 3 y 7 días de infección, de

0,4, 0,5 y 0,7 veces, con respecto al control, respectivamente.

Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: No hay

expresión del receptor en control, entre las 2 y 16 horas de infección hay expresión del receptor

de 0,0001 y 0,00028 respectivamente. Al día (24 horas) no hay expresión al igual que en el

control.

4.3.1.5. Evaluación a TLR9 (gráficas se pueden observar en la Figura 37)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Comienza disminuyendo de

expresión 0,7 veces con respecto al control a las 0,5 horas y luego aumenta 1,5 veces con

98

TLR22


infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS.

Control: tiempo 0 para cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión

del control en cada cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con

respecto al control. En el caso de las cinéticas con P. salmonis inactivada y proteínas totales de P.

salmonis no se observó amplificación del producto esperado en las muestras de cDNA.

P.salmonis viva LPS

99

TLR9









100

respecto al control a 1 hora de infección. En los tiempos 2 y 4 horas mantiene expresión al igual

que el control. A la 8 hora aumenta 1,3 veces con respecto al control, en los tiempos 12 horas, 1,

2, 3 y 7 días disminuye de expresión por debajo del control observándose un pick de disminución

a las 12 horas de 0,8 veces con respecto al control.

Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se ve un

aumento de expresión durante todos los tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día (24 horas) de 2.5,

7 y 4 veces, con respecto al control, respectivamente.


expresión a las 2 horas en 0,6 veces con respecto al control. En los tiempos 16 horas y 1 día (24

horas) desaparece casi totalmente la expresión del receptor.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión durante todos

los tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día de 0,7, 0,4 y 0,3 veces, con respecto al control,

respectivamente.

En general al analizar la expresión de los TLR en las cinéticas estudiadas, existe una variación de

la expresión de ellos, esto debido a que la forma de exposición de los diversos PAMPs que

presenta P. salmonis puede variar de una forma positiva o negativa en la expresión de los TLR.

4.3.1.6. Evaluación de IL-1β (gráficas se pueden observar en la Figura 38)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Aumenta la expresión durante

todos los tiempos estudiados, 2, 12 horas y 1 día en 1,5, 6 y 1 veces, con respecto al control,

respectivamente.

101

IL-1β

Figura 38: Cinéticas de expresión del receptor IL-1β. A: Cinética de expresión con células








102


mantiene la expresión a las 2 horas con respecto al control y aumenta en los tiempos 12 horas y 1

día de infección en 12 y 8 veces, con respecto al control, respectivamente.


expresión en los tiempos 2 y 16 horas en 0,8 y 0,6 veces, con respecto al control,

respectivamente. Se ve un aumento al día de infección de 0,8 veces con respecto al control.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Aumenta su expresión 1,5 veces con

respecto al control a las 2 horas. En el tiempo 16 horas aumenta 0,3 veces con respecto al control.

Al día de infección disminuye su expresión 0,6 veces con respecto al control.

4.1.3.7. Evaluación de Myd88 (gráficas se pueden observar en la Figura 39)

Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Aumenta la expresión a las 2

horas en 0,8 veces con respecto al control. En los tiempos 12 horas y 1 día mantiene expresión

con respecto al control.


mantiene la expresión a las 2 horas con respecto al control. A los tiempos 16 horas y 1 día

aumenta su expresión 0,5 y 0,3 veces, con respecto al control, respectivamente.


expresión en todos los tiempos estudiados. A las 2 y 16 horas disminuye 0,7 veces con respecto al

control. Al día de infección disminuye 0,3 veces con respecto al control.

Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión en todos los

tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día en 0,6, 0,4 y 0,8 veces, con respecto al control,

respectivamente.

103

Myd88

Figura 39: Cinéticas de expresión del receptor Myd88. A: Cinética de expresión con células








104

5. DISCUSIÓN

5.1. Clonamiento y caracterización de TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S

Los TLR son de gran importancia en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados (Imler et

al., 2004). Cumplen variadas funciones como: detectar la presencia de algún patógeno en el

organismo hospedero y desencadenar una respuesta inmune innata, además de activar y guiar la

respuesta inmune adaptativa contra ellos (Moreno et al., 2003). Los TLR forman parte de los

RRPs, receptores que reconocen PAMPs (Randon-Barragan, 2009). A cada TLR se le ha

atribuido uno o varios PAMPs como ligandos de reconocimiento (Tabla I), estos PAMPs son

característicos de los patógenos y así, mediante cascadas de señalización, se desencadena una

respuesta contra el patógeno en particular (Kumar et al., 2009).

Por esta razón es de gran interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos y así poder

comprender de una mejor manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos. En

Salmo salar, hasta el momento del inicio de la tesis, no se encontraba secuenciado el mRNA de

los receptores para TLR1, TLR5 de membrana y soluble y TLR22, por lo que fueron

seleccionados para ser clonados y secuenciados como parte de esta tesis. Todas las secuencias

aminoacídicas obtenidas, las que fueron deducidas de la secuencia nucleotídica del clonamiento

de cada receptor, presentan las regiones y dominios característicos de los TLR. Todas son

proteínas transmembrana tipo I, presentan en su región extracelular LRRs y también LRRCT; y

presentan en su región intracelular el dominio TIR (Akira et al., 2006), importante en

desencadenar la cascada de señalización en respuesta a algún patógeno. A su vez cada LRR

encontrada contiene la secuencia consenso descrita por Bell et al. (2003) que contienen todos los

TLR. También el dominio TIR contiene las secuencias consenso para Box1, Box2 y Box3

105

descritas por Slack et al. (2000). En conjunto todas estas características encontradas, en las

secuencias aminoacídicas deducidas, nos dice que corresponderían a TLR y podrían ser

funcionalmente activos.

5.1.1. TLR1

El receptor TLR1 forma un heterodímero con TLR2, en mamíferos. Este receptor es importante

debido a que reconoce lipopéptidos de la pared bacteriana, además en conjunto con TLR2

reconocen distintos PAMPs de bacterias gram negativas y gram positivas (Kumar et al., 2009).

Este receptor fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la

región codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad

(96%) con trucha, especie que forma parte de los peces salmonídeos y que además fue utilizada

como referencia para la creación de partidores que permitieron el clonamiento. También se

observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (93%) con trucha y una homología

en la posición aminoacídica en donde se encuentran los dominios y regiones características de los

TLR (Figura 7 resultados).

5.1.2. TLR22

El receptor TLR22 es específico de peces, hasta el momento su rol y PAMPs que reconoce son

poco conocidos (Rebl et al., 2010). Se ha descrito que reconoce dsRNA (Matsuo et al., 2008), y

también se ha reportado que aumenta su expresión en ensayos de infección con Aeromona

salmonicida y Mycobacterium cheloni, por lo que se piensa que podría estar involucrado en el

reconocimiento de diversos patógenos acuáticos (Rebl et al., 2010). Este receptor fue clonado y

secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región codificante de su

mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (93%) con trucha.

106

También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (88%) con trucha y una

homología en la posición aminoacídica en donde se encuentran los dominios y regiones

características de los TLR (Figura 12 resultados). Se observan 2 gaps de 4 aminoácidos cada uno,

con respecto a la secuencia de trucha, en las posiciones: aminoácido 232 y aminoácido 823. Este

receptor, en el comienzo de la tesis, se pensó que correspondía a TLR2 debido a que en la Base

de datos de NCBI aparecía con el nombre de TLRII (Rebl et al., 2007). Una vez obtenida la

secuencia se comprobó por homología de secuencia que correspondía al receptor TLR22.

5.1.3. TLR5 de Membrana

El receptor TLR5M se ha descrito que reconoce flagelina, proteína característica del flagelo

bacteriano, TLR5M se encuentra en peces teleósteos y en humanos (Tsujita et al., 2004). Este

receptor fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región

codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (96%)

con trucha. También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (91%) con

trucha y una homología en los dominios y regiones características de los TLR (Figura 17

resultados).

5.1.4. TLR5 soluble

TLR5S se ha descrito que reconoce flagelina, además trabaja en conjunto con TLR5M en activar

la respuesta una vez que se ha detectado flagelina en el hospedero (Tsujita et al., 2004). TLR5S

lo expresan los peces teleósteos, en humanos no se encuentra (Rebl et al., 2010). Este receptor

fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región

codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (95%)

con trucha. También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (91%) con

107

trucha y una homología en los dominios y regiones características de los TLR (Figura 22

resultados). Una vez obtenida la secuencia nucleotídica, al estudiarla por BLAST, se comprobó

que correspondía a TLR5 soluble y que esta secuencia ya se encontraba descrita en salmón del

Atlántico, con el nombre “Toll like Leucine rich repeat” (Tsoi et al., 2006).

5.2. Anticuerpos

Para los TLR en estudio se diseñaron péptidos para generar anticuerpos en conejo y así poder

utilizarlos como herramientas para analizar la expresión proteica de estos receptores. Al evaluar

los anticuerpos generados por los péptidos para cada TLR, se obtuvieron las bandas esperadas

para cada uno, la que no se encontraba presente en el suero pre-inmune de cada conejo. Para

TLR1 se obtuvo una banda de 90 kDa. Para TLR22 se obtuvo una banda de 110 kDa y para

TLR5 una banda de 100 kDa (Figura 28 resultados). Es importante seguir con el estudio de los

anticuerpos, para ello, resultaría primordial realizar una pre-absorción de los anticuerpos con una

mezcla de proteínas de órganos donde no se expresen estos receptores en particular, de manera de

depletar anticuerpos inespecíficos y lograr limpiar la reacción de bandas inespecíficas. Esto

motivado porque en algunos de ellos se pudo observar bandas inespecíficas que no correspondían

al tamaño esperado y por tanto al antígeno que se deseaba pesquizar. Además para poder estudiar

la presencia de TLR5 soluble, es necesario estudiarlo a nivel sanguíneo en condiciones de peces

sanos y desafiados o que hayan estado sometidos a alguna infección por una bacteria que

contenga flagelina. Todo esto es de vital importancia por cuanto hasta ahora sólo se han

reportado análisis de expresión a nivel de RT-qPCR en diferentes formas y bajo diferentes

estímulos, pero sin lograr pesquisar hasta ahora la proteína en sí (Tsujita et al., 2006; Matsuo et

al., 2008; Palti et al., 2010). Con esta herramienta es posible esclarecer los órganos de síntesis de

108

cada TLR, ya que hasta el momento estos estudios sólo se han realizado en base a la expresión de

mRNA en órganos de peces. En el desarrollo de la tesis se priorizó los ensayos de cinéticas,

quedando esta parte pendiente para trabajos posteriores.

5.3. Cinéticas de expresión

La investigación de las formas de TLR en peces puede abrir puertas y estrategias terapéuticas

para la profilaxis humana y animal. Adicionalmente, el entendimiento de la función de los TLR

en peces y sus especificidades de patógenos puede guiar al desarrollo de mejores

inmunoestimulantes para el uso en acuicultura comercial, así como agonistas para el control y

prevención de enfermedades (Randon-Barragan, 2009).

5.3.1. Elección de normalizador

Los estudios de las cinéticas se realizaron mediante RT-qPCR por lo que resulta primordial una

buena elección del normalizador a utilizar. Se estudiaron dos normalizadores para realizar las

cinéticas de expresión, β-actina y EF-1a. β-actina es una de las principales proteínas del

citoesqueleto de la célula, posee importantes funciones en el andamiaje, forma y movilidad de la

célula eucariótica además de ser una de las proteínas más abundantes (Hennessey et al., 1993).

EF-1a sigla que corresponde al Factor de Elongación Eucariótico 1A (alpha) juega un papel

importante en la traducción por catalizar la unión aminoacil-tRNA al sitio aceptor del ribosoma

además de otras funciones y constituye de 1-3% de las proteínas citoplasmáticas de la célula

(Olsvik et al., 2005). Ambos fueron probados, utilizando como muestra la cinética con P.

salmonis viva, para comparar los Ct de cada uno de ellos. Para poder compararlos, este estudio se

basó en el razonamiento de Peña et al. que en el año 2010 descubrieron que los valores de Ct

entre 16.17 y 24.99 indican niveles de expresión en un rango dinámico. Al compararlos, EF-1a

109

tiene Ct dentro de estos valores, en cambio β-actina tiene valores mucho más altos (Figura 32

resultados). Además los autores Peña et al. (2010), Jorgensen et al. (2006) y Olsvik et al. (2005)

hacen referencia que como gen normalizador EF-1a los Ct son más estables, y no existe mayor

diferencia entre los Ct de las muestras a estudiar, así como tampoco hay variación en el tiempo de

ellos, en comparación con β-actina. Por estas razones se utilizó como gen normalizador EF-1a.

5.3.2. Evaluación de Cinéticas por receptor

La expresión de los TLR no es estática, sino más bien modulada en respuesta a patógenos, a una

variedad de citoquinas o estrés ambiental (Akira et al., 2006). El estudio de las cinéticas de

expresión se basó principalmente en la infección causada por Piscirickettsia salmonis en salmón

del Atlántico. P. salmonis al ser un patógeno bacteriano posee diversos PAMPs que pueden ser

reconocidos por los TLR que se describieron en esta tesis. Como por ejemplo: P. salmonis es una

bacteria gram negativa (Fryer et al., 2003), que posee en su membrana lípidos, proteínas e

hidratos de carbono (que podrían reconocidos por TLR1 y TLR22), además se ha descrito que

posee algunos tipos de flagelina en su membrana (Wilhelm et al., 2006) los que podrían ser

reconocidos por TLR5 de membrana y TLR5 soluble.

Además del estudio de P. salmonis, se estudió la infección con LPS, componente de las bacterias

gram negativas (Sepulcre et al., 2009), para poder evaluar el comportamiento de los distintos

marcadores en estudio y aportar de esta manera al estudio del reconocimiento de LPS en peces.

En el desarrollo de la tesis se realizaron 4 cinéticas de expresión. Las cinéticas realizadas

utilizaron como elemento de infección a: P. salmonis viva, proteínas totales de P. salmonis, P.

salmonis inactivada con formaldehido y LPS. En todas las cinéticas se evaluó: la expresión de

TLR5M, TLR5S, TLR1, TLR22, TLR9, IL-1β y Myd88 por RT-qPCR. La idea de estudiar IL-1β

110

y Myd88 es para poder visualizar como es el comportamiento de la cascada de señalización en

respuesta al reconocimiento de los ligandos por sus respectivos TLR. Myd88 es una de las cinco

proteínas adaptadoras al dominio TIR, y es utilizada por todos los TLR menos TLR3. Al

activarse desencadena una cascada de señalización que finaliza con la activación del factor de

transcripción NF-ƙB (Kumar et al., 2009), el cual dentro de los genes que activa se encuentra IL-

1β. Esta interleuquina es el mediador central de la respuesta inmune y respuesta inflamatoria, e

inicia una variedad de funciones, como activación de macrófagos y expresión de otras citoquinas

(Bjornsdottir et al., 2009). Además se agregó la evaluación de TLR9, receptor que reconoce CpG

DNA no metilado, característico en el genoma de las bacterias (Akira et al., 2006). Las cinéticas

se realizaron con el fin de evaluar la expresión de los mRNA de los distintos marcadores, en

presencia de diversas formas de presentación de P. salmonis (P. salmonis viva; P. salmonis

inactivada con formaldehido y Proteínas totales de P. salmonis) además de evaluar lo que ocurre

con la infección de LPS, el cual es un activador prototipo del sistema inmune (Aderem et al.,

2000).

5.3.2.1. Cinéticas de expresión de TLR5M

El ligando de TLR5 es flagelina, componente principal del flagelo bacteriano (Akira et al., 2006).

La cinética de expresión con P. salmonis viva presentó un aumento de expresión en las primera

horas (de 0,5 veces por sobre el control) y luego cae su expresión. Esto se podría explicar debido

a que P. salmonis a pesar de ser inmóvil y sin flagelo, posee flagelina en su membrana la que es

reconocida por TLR5M (Tsujita et al., 2004).En cambio se ve un aumento de expresión en la

cinética realizada con Proteínas totales de P. salmonis, de cerca de 1,5 veces por sobre el control.

111

Lo que se explica a que flagelina se encuentra mucho más libre y puede interactuar de una mejor

manera con el receptor.

La cinéticas con P. salmonis inactivada, en todo los tiempos estudiados disminuye su expresión

bajo el control, lo que podría deberse a que la metodología de inactivación (formaldehido)

provoca que esta proteína pueda quedar oculta en la membrana y menos accesible a unirse al

receptor, producto de la fijación por el formaldehido.

La cinética frente a LPS también disminuye su expresión bajo el control, en todos los tiempos

estudiados. Esto es debido a que LPS no es ligando para TLR5 (Tsujita et al., 2004).

5.3.2.2. Cinéticas de expresión de TLR5S

TLR5S genera una curva de retroalimentación positiva en respuesta a flagelina en células TLR5

positivas (Randon-Barragan, 2009), además puede ser requerido por el pez para amplificar la

respuesta inflamatoria generada por TLR5 de membrana (Tsujita et al., 2004). En la cinética de

expresión con P. salmonis viva sólo se observa un aumento a las 4 horas (de 1 vez por sobre el

control), en los demás tiempos la expresión es bajo el control. Esto se corrobora con el estudio

realizado por Tsujita et al., en el año 2004, quienes describen un aumento de la expresión de

TLR5 en trucha a las 4 horas, después de la estimulación con Vibrio anguillarum (bacteria gran

negativa flagelada) y que se mantiene hasta 12 horas post-infección. Los mismos autores

reportaron que TLR5S en trucha sólo se expresa en hígado, por lo que su ensayo fue realizado en

línea celular de hígado de trucha, RTH-149. La diferencia de expresión en el ensayo con salmón

del Atlántico puede deberse a que la línea utilizada fue SHK-1, línea que proviene de cabeza de

riñón del salmón del Atlántico.

112

En la cinética de expresión con Proteínas totales de P. salmonis, existe un gran aumento de

expresión a las 16 horas y 1 día de infección post-infección (aprox. 3 veces por sobre el control).

Lo que se explica a que flagelina está mucho más accesible a ser detectada. Al igual que el

ensayo con P. salmonis viva se observa una respuesta tardía, esto podría ser debido a que primero

flagelina debe ser reconocida por la célula, mediante TLR5M, para que exista un aumento de

expresión de TLR5S (Tsujita et al., 2004). Este dato es importante para una posible creación de

vacuna contra P. salmonis, ya que su expresión es amplificada a través del tiempo, además de ser

una especie de citoquina que alarma al organismo hospedero de la presencia de una infección

causada por una bacteria que contiene flagelina (Tsujita et al., 2006).

En la cinética de expresión con P. salmonis inactivada, no existe expresión del receptor en

control y en los tiempos de la cinética estudiados esta es muy baja. Al igual que TLR5M esto

puede deberse a que la metodología de inactivación ocultó a flagelina.

En la cinética de expresión con LPS, no existe expresión del receptor en control pero en los

tiempos estudiados es muy baja. Al igual que TLR5M puede deberse a que LPS no es ligando

para el TLR5S (Tsujita et al., 2004).

5.3.2.3. Cinéticas de expresión de TLR1

TLR1 en peces, aún no se ha descubierto cual es su ligando (Palti, 2011), en mamíferos se ha

reportado que forma un heterodímero con TLR2, y que reconocen peptidoglican y lipoproteínas

de origen bacteriano (Palti et al., 2010). P. salmonis podría poseer algún PAMPs que TLR1

reconozca como lípidos, proteínas e hidratos de carbono que se encuentran en su membrana. En

la cinética de expresión con P. salmonis viva se observó un aumento bifásico de la expresión, a

113

las 2 horas y 1 día. Debido a este aumento de expresión, P. salmonis podría poseer algún ligando

que TLR1 reconozca.

En la cinética de expresión con Proteínas totales de P. salmonis. Se ve un gran aumento durante

toda la cinética, logrando aumentar más de 30 veces con respecto al control. Esto también podría

corroborar la idea que P. salmonis posee un ligando para TLR1.

En la cinética con P. salmonis inactivada, la expresión se encuentra por bajo el control. Al igual

que los receptores anteriores, podría ocurrir que la metodología de la inactivación ocultó el

ligando y ya no es accesible al receptor.

Las cinéticas con LPS también la expresión se encuentra por bajo el control. Lo que podría

descartar que el ligando para TLR1 fuera LPS.


TLR22 es un receptor específico de peces, en humanos se encuentra como pseudogen (Rebl et

al., 2010). Se ha reportado, en pez cebra, que existe una modulación positiva de la expresión de

TLR22 frente a patógenos acuáticos como Aeromona salmonicida, Mycobaterium marinum (Rebl

et al., 2010). Además en lenguado japonés, peptidoglican y dsRNA inducen un aumento de la

expresión de TLR22 (Rebl et al., 2007; Matsuo et al., 2008). Por estas razones se piensa TLR22

reconoce diversos ligandos de patógenos acuáticos, ya sean virus o bacteria. En la cinética con P.

salmonis viva, existe un aumento leve en forma bifásica, y en general mantiene su expresión

hasta llegar a 1 día de infección donde baja la expresión, con respecto al control. Se ha reportado

que la estimulación declina con la infección (Rebl et al., 2007). Esto podría deberse a que P.

114

salmonis, al igual que para TLR1, presenta algún ligando para TLR22 aún no identificado en

peces.

En la cinética con LPS, no existe expresión en control, pero si a las 2 y 16 horas, pero es muy

baja la expresión. Podría explicarse a que LPS no es ligando para TLR22.

Las cinéticas con Proteínas totales de P. salmonis y P. salmonis inactivada no se encontró

expresión del receptor, incluido en control.


TLR9 se encuentra en endosomas dentro de la célula y reconoce como ligando CpG-DNA no

metilado, los motivos CpG no metilados son abundante en el genoma bacteriano (Akira et al.,

2006). En la cinética con P. salmonis viva, existe un aumento en las primeras horas post-

infección, con respecto al control. Este comportamiento puede deberse a que la bacteria en

primera instancia es fagocitada, donde las condiciones ácidas y reductoras degradan la doble

hebra de DNA en múltiples motivos de CpG que subsecuentemente interactúa con TLR9 (Akira

et al., 2006). También se ha reportado en lenguado japonés que TLR9 aumenta su expresión

después de una infección con Edwardsiella tarda, bacteria gram negativa y en pes cebra también

aumenta su expresión frente a una infección con Mycobacterium marinum (Rebl et al., 2010).

En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, se ve un aumento de expresión durante toda la

cinética, de aprox. 7 veces con respecto al control. Esto se explica porque la metodología

utilizada para la extracción de proteínas totales, en ningún momento se trató con DNAsa por lo

que el genoma parcialmente degradado de la bacteria quedó en la solución, por lo tanto

secuencias CpG no metiladas quedaron accesibles (a la solución se le midió su relación 260/280

115

=1,410 y concentración de DNA 1,257µg/µL). Además se ha reportado que existe una inducción

de la expresión de TLR9 en leucocitos de salmón del Atlántico después del desafío con CpG

(Skajaeveland et al., 2008).

En la cinética con P. salmonis inactivada, la expresión disminuye bajo el control. La inactivación

de la bacteria impide que el genoma sea tratado en endosomas y expuesto a TLR9.

En la cinética con LPS, la expresión también disminuye bajo el control. Esto porque LPS no es

ligando para TLR9 (Randon-Barragan, 2009).

5.3.2.6. Cinéticas de expresión de IL-1β

IL-1β es una citoquina de respuesta inflamatoria, la que se encuentra descrita en especies

salmonídeas (Ingerslev et al., 2010). En la cinética con P. salmonis viva, se ve un aumento de

expresión durante toda la cinética, con un pick de 7 veces por sobre el control. Como se observó

en la mayoría de las cinéticas anteriores, existe la activación de distintos TLR, lo que

desencadena una cascada de señalización que finaliza con la activación de distintas citoquinas,

como IL-1β. Ingerslev et al. (2010) reportaron ensayos in vivo en salmón del Atlántico, en los

cuales IL-1β presenta una estimulación de su expresión al 7 día post-infección.

En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, existe un aumento de expresión de hasta 12

veces por sobre el control. Esto debido a que los ligandos se encuentran más “libres” y expuestos

para poder interactuar con sus respectivos TLR y se ejerce una respuesta inmune mayor. Este

dato es importante para una posible creación de vacunas contra P. salmonis.

En la cinética de expresión con P. salmonis inactivada, se observa una estimulación tardía de la

expresión. Esto debido a que la inactivación con formaldehido oculta los ligandos de los TLR.

116

En la cinética de expresión con LPS, existe un aumento a las 2 horas y luego disminuye. Esto

podría ser indicio de que existe algún RRP que reconoce LPS y genera una respuesta inmune. Lo

que podría comprobar que el reconocimiento de LPS es distinto en los peces que en mamíferos

(Rebl et al., 2010). Idea que se basa en que la mayoría de los peces carece de TLR4 y en ningún

pez se ha descrito la presencia de MD-2 y CD14. TLR4 se ha descrito en mamíferos por

reconocer LPS utilizando como molécula adaptadora para este reconocimiento a MD-2 y CD14

(Sepulcre et al., 2009).

5.3.2.7. Cinéticas de expresión de Myd88

Myd88 es una de las cinco proteínas adaptadoras que se encuentran a cargo de desencadenar la

respuesta inmune una vez que TLR han reconocido su ligando (O´neill et al., 2007). Además,

hasta el momento, es la única proteína adaptadora descrita en salmón del Atlántico (Skjæveland

et al., 2009). En las cinéticas con P. salmonis viva y proteínas totales de P. salmonis se mantiene

su expresión, con respecto al control. Aumentando levemente en el inicio de la infección, en

aprox. 0,5 veces con respecto al control. Esto podría relacionarse a que su expresión permanece

constante, independiente del aumento de expresión de los TLR.

En cambio en las cinéticas con P. salmonis inactivada y LPS existe una regulación negativa de la

expresión, pero nunca llegando a cero expresión. Importante porque sigue existiendo activación

de la respuesta inmune, por medio de esta vía.

117

5.3.3. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección

5.3.3.1. Infección causada por P. salmonis viva

En general se observa una modulación de la expresión de los distintos marcadores estudiados. Lo

que podría concluir que P. salmonis posee la capacidad de modular la expresión de los TLR en su

beneficio, lo que se apoya con el hecho de que P. salmonis puede vivir y replicarse dentro de la

célula del hospedero, por lo tanto podría evadir la respuesta inmune contra ella (McCarthy et al.,

2008). En particular el hecho de que TLR5M y TLR5S no exista una gran expresión de ellos en

esta cinética, podría ser debido a las razones anteriores, porque en general se pensaría que por

poseer flagelina en su membrana, la infección con P. salmonis causaría una gran activación de

ellos, en particular de TLR5. La modulación de la expresión diferencial de los TLR estudiados se

apoya con el hecho de que las células del sistema inmune usan múltiples TLR para detectar varias

características de un patógeno simultáneamente (Underhill et al., 2002), productos microbiales

pueden también inducir otros TLR más de los específicos para su propio reconocimiento

(Randon-Barragan, 2009).

5.3.3.2. Infección causada por proteínas totales de P. salmonis

En general todos los marcadores evaluados, menos TLR22, se ve un aumento de la expresión de

ellos. Al observar este resultado se podría concluir que esta forma de exposición de P. salmonis

podría ayudar en la creación de un adyuvante efectivo contra P. salmonis, ya que se ven

activados varios TLR, lo que sería importante en activar y modular una respuesta adaptativa en el

hospedero (Seya et al., 2006). Esta forma de exposición de la bacteria lograría que los ligandos

estén más libres de poder interactuar con sus respectivos TLR y desencadenarían una respuesta

inmune apropiada. Además se observo TLR5S e IL-1β se encuentran aumentadas, pensando en

118

que son las posibles respuestas humorales que se verían en el organismo hospedero. También

sería importante evaluar otras citoquinas, como IL-12, que es importante en activar la respuesta

por linfocitos Th1 (Pasare et al., 2004).

5.3.3.3. Infección causada por P. salmonis inactivada

En general todos los marcadores estudiados, su expresión disminuyo o fue nula, con respecto al

control. Lo que concluye que esta forma de inactivación no es buena para generar una respuesta

inmune, al menos vía TLR. Podría explicarse porque la bacteria queda fija y oculta, y los

ligandos no pueden interactuar con sus TLR y de esta manera no habría activación de la respuesta

inmune contra ella.

5.3.3.4. Estimulación causada por LPS

En general en la mayoría de los genes evaluados, menos IL-1β, se ve una disminución de

expresión en comparación con el control. En cambio para IL-1β se ve un aumento durante las

primeras horas de infección. Esto concluye que ninguno de los TLR evaluados presenta como

ligando a LPS, pero que sí existiría algún otro RRP que lo reconozca y que ejercería una

respuesta inmune contra él (Rebl et al., 2010).

Es importante recordar que este estudio se realizó en cultivo celular, por lo tanto las interacciones

entre distintos tipos celulares y compuestos humorales no son posibles. Por lo que es necesario el

estudio en cultivo primario y luego en el organismo (in vivo) para comprobar que el

comportamiento de los TLR concuerda con el estudio realizado in vitro. Además se podrían

agregar mayores factores para poder comprender el comportamiento del sistema inmune más

global frente a la infección con P. salmonis.

119

Basándose en los resultados obtenidos, podemos concluir que:

Existe RNA mensajero para los receptores tipo Toll, TLR1, TLR22, TLR5 de membrana

y TLR5 soluble en salmón del Atlántico. Todas las proteínas resultantes poseen las

características estructurales propias de los receptores tipo Toll descritos hasta ahora.

Se desarrollaron sueros inmunes policlonales que detectan proteínas cuyas masas

corresponden a los receptores estudiados.

P. salmonis logra modular la expresión de los receptores estudiados y de TLR9, Myd88 e

IL-1β, importantes en las cascadas de señalización de TLR. Lo que puede representar una

forma de cómo esta bacteria logra evitar la respuesta inmune en peces y causar

mortalidades altísimas en los cultivos de salmón del Atlántico en Chile.

El estudio de Proteínas totales de P. salmonis, indicó que esta podría ser una certera forma

de exposición de P. salmonis para una posible vacuna contra ella.

120

6. REFERENCIAS

Abdelsadik, A. y Trad, A. (2011). Toll like receptors on the fork roads between innate and

adaptative immunity. Hum. Immuno. En prensa.

Aderem, A. y Ulevitch, R. (2000). Toll-like receptors in the induction of the innate immune

response. Nature. 406, 782-787.

Akira, S., Uematsu S. y Takeuchi, O. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell.

124, 783-801.

Alvarez-Pellitero P. (2008). Fish immunity and parasite infections: from innate immunity to

immunoprophylactic prospects. Vet. Immuno. and Immunopat. 126, 171-198.

Bautista, C. y Mosqueda, J. (2005). Papel de los receptores tipo toll en la inmunidad innata y su

implicación en medicina veterinaria. Vet. Mex. 36, 453-468.

Bell, J., Mullen, G., Leifer, C., Mazzoni, A., Davies, D. y Segal D. (2003). Leucine-rich repeats

and pathogen recognition in Toll-like receptors. TRENDS in Immunol. 24, 528-533.

Bell, J., Botos, I., Hall, P., Askins, J., Shiloach, J., Segal, D. y Davies, D. (2005). The molecular

structure of the Toll-like receptor 3 ligand-binding domain. PNAS. 102, 10976-10980.

Birkbeck, T., Rennie, S., Hunter, D., Laidler, A. y Wadsworth, S. (2004). Infectivity of a Scottish

isolate of Piscirickettsia salmonis for Atlantic salmon Salmo salar and immune response of

salmon to this agent. Disease of Aquatic Organism. 60, 97-103.

121

Bjornsdottir, B., Fast, M., Sperker, S., Brown, L. y Gudmundsdottir, B. (2009). Effects of

Moritella viscosa antigens on pro-inflammatory gene expression in an Atlantic salmon (Salmo

salar Linnaeus) cell line (SHK-1). Fish and Shellfish Immunology. 26, 858-863.

Boltaña, S., Roher, N., Goetz, F. y McKenzie, S. (2011), PAMPs, PRRs and the genomics of

gram negative bacterial recognition in fish. Dev. Comp. Immunol. En prensa.

Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemestry. 72, 248-254.

Brody, J. y Scott, K. (2004). Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA

electrophoresis. Biotechniques. 36, 214-216.

Chomczynski, P. y Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium

thiocyanate-phenol-chlotoform extraction. Analytical Biochemestry.162, 156-159.

Collado, V., Porras, R., Cutuli, M. y Gómez-Lucia, E. (2008). El sistema inmune innato I: sus

mecanismos. RCCV. 2, 1-16.

Ellis, A. (1999). Immunity to bacteria in fish. Fish and Shellfish Immunology. 9, 291-308.

Fryer, J. y Hedrick, R. (2003). Piscirickettsia salmonis: a gram negative intracellular bacterial

pathogen of fish. Journal of fish Deseases. 26, 251-262.

Hannessey, E., Drummond, D. y Sparrow, J.(1993). Molecular genetics of actin function.

Biochem. J. 282, 657-671.

Hoop, T. y Woods, K. (1981). Prediction of protein antigenic determinants from aminoacid

sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 3824-3828.

122

Ingerslev, H., Lunder, T. y Nielsen, M. (2010). Inflammatory and regenerative responses in

salmonids following mechanicals tissue damage and natural infection. Fish and Shellfish

Immunology. 29, 440-450.

Imler, J. y Zheng, L. (2004). Biology of Toll receptors: lessons from insects and mammals.

Journal of Leukocyte Biology. 75, 18-26.

Janeway, C. y Medzhitov, R. (2002). Innate Immune Recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-

216.

Janssens, S. y Beyaert, R. (2003). Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical

Microbiology Reviews. 16, 637-646.

Jault, C., Pichon, L., Chluba, J.(2004). Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in

Danio rerio. Molecular Immunology. 40, 759-771.

Jin, M., Kim, S., Heo, J., Lee, M., Kim, H., Paik, S., Lee, H. y Lee, J. (2007). Crystal structure of

the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated-lipopeptide. Cell. 130, 1071-

1082.

Jorgensen, S., Kleveland, E., Grimholt, U. y Gjoen, T. (2006). Validation of reference genes for

Real-Time polymerase chain reaction studies in Atlantic salmon. Marine Biotechnology. 8, 398-

408.

Kawai, T. y Akira, S. (2010). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:

update of toll like receptors. Nature Immunology. 11, 375-384.

123

Kumar, H., Kawai, T. y Akira S. (2009). Toll-like receptors and innate immunity. BBRC. 388,

621-625.

Laemli, V. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

Leal, J. y Woywood, D. (2007) Piscirickettsiosis en Chile: advances y perspectivas para su

control. Salmo-ciencia. 34-42.

Lockhart, K., Gahlawat S., Soto-Mosquera, D., Bowden, T., Ellis, A. (2004) IPNV carrier

Atlantic salmon growers do not express Mx mRNA and poly I:C-induced Mx response does not

cure the carrier estate. Fish and Shellfish immunology. 17, 347-352.

McCarthy, Ú., Bron, J., Brown, L., Pourahmad, F., Bricknell, I., Thompson, K., Adams, A. y

Ellis, A. (2008). Survival and replication of Piscirickettsia salmonis in rainbow trout head kidney

macrophages. Fish and shellfish immunology. 25, 477-484.

Magnadóttir, B. (2006). Innate immunity of fish (overview). Fish and Shellfish Immunology. 20,

137-151.

Manavalan, B., Basith, S. y Choi, S. (2011). Similar structures but different roles-an update

perspective on TLR structures. Frontiers in physiology. 2, 1-13.

Matsuo, A., Oshiumi, H., Tsujita, T., Mitani, H., Kasai, H., Yoshimizu, M., Matsumoto, M. y

Seya T. (2008). Teleost TLR22 recognizes RNA duplex to induce IFN and protect cells for

birnaviruses. J. Immunol. 181, 3474-3485.

124

Matsushima, N., Tanaka, T., Enkhbayar, P., Mikami, T., Taga, M., Yamada, K. y Koruki, Y.

(2007). Comparative sequence analysis of leucine-rich repeats (LRRs) within vertebrate toll like

receptors. BMC Genomics. 8, 124-144

Medzhitov, R. (2001). Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews. 1, 95-104.

Mezhitov, R. y Janeway, C. (2000). Innate immune recognition: mechanism and pathways.

Immuno. Reviews. 173, 89-97.

Moreno, C. y Sánchez-Ibarrola, A. (2003). Receptores tipo toll: bases moleculares de la relación

entre respuestas innatas y adaptativas del sistema inmunitario. Rev. Med. Uni. 3, 29-33.

Olsvik, P., Lie, K., Jordal, A., Nilsen, T. y Hordvik, I. (2005). Evaluation of potential reference

genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon. BMC Molecular Biology. 6, 1-9.

O´neill, L. y Bowie, A. (2007). The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll like

receptor signalling. Nature Reviews. 7, 353-364.

Palti Y. (2011) Toll-like receptors in bony fish: From genomics to functions. Dev. Com.

Immunol. En Prensa.

Palti, Y., Rodriguez, M., Gahr, S., Purcell, M., Rexroad III, C. y Wiens, G. (2010). Identification,

characterization and genetic mapping of TLR1 loci in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish

and Shellfish Immunology. 28, 918-926.

Pancer, Z. y Cooper, M. (2006). The evolution of adaptative immunity. Annu. Rev. Immunol. 24,

497-518.

125

Pasare, C. y Medzhitov, R. (2004). Toll-like receptors: linking innate and adaptative immunity.

Microbes and infection. 6, 1382-1387.

Peña, A., Bols, N. y Marshall, S. (2010). An evaluation of potential reference genes for stability

of expression in two salmonid cell lines after infection with either Piscirickettsia salmonis and

IPNV. BMC Research notes. 3, 1-9.

Purcell, M., Smith, K., Aderem, A., Hood, L., Winton, J. y Roach, J. (2006). Conservation of

toll-like receptor signaling pathways in teleost fish. Comp. Biochem. and physio. Part D1, 77-88.

Randelli, E., Buonocore, F. y Scapigliati, G. (2008). Cell markers and determinants in fish

immunology. Fish and Shellfish Immu. 25, 326-340.

Randon-Barragan (2009). Receptores similares a toll en peces: el inicio de la divergencia. InVet.

11, 15-30.

Rebl, A., Siegl, E., Köllner, B., Fischer, B. y Seyfert, H. (2007). Characterization of twin toll like

receptors from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Evolutionary relationship and induced

expression by Aeromonas salmonicida salmonicida. Developmental and Comparative

Immunology. 31, 499-510.

Rebl, A., Goldammer, T. y Seyfert, H. (2010). Toll-like receptors signaling in bony fish. Veter.

Immuno. and Immunopath. 134, 139-150.

Rubio-Godoy, M. (2010). Inmunología de los peces óseos. Revisión. Rev. Mex. Cienc. Pecu.1,

47-57.

126

Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Procedings National Academy of Science USA. 74, 5463-5467.

Skjæveland, I., Iliev, D., Zou, J., Jørgensen, T. y Jørgensen, J. (2008). A TLR9 homolog that is

up-regulated by IFN-γ in Atlantic salmon (Salmo salar). Developmental and Comparative

Immunology.32, 603-607.

Slack, J., Schooley, K., Bonnert, T., Mitcham, J., Qwarnstrom, E., Sims, J. y Dower, S. (2000).

Identification of two major sites in the type I Interleukin-1 receptor cytoplasmic region

responsible for coupling to pro-imflammatory signaling pathways. The journal of Biologycal

Chemestry. 275, 4670-4678.

Sepulcre, M., Alcaraz-Pérez, F., López-Muñoz, A., Roca, F., Meseguer, J., Cayuela, M. y

Mulero, V. (2009). Evolution of Lipopolisaccharide (LPS) recognition and signaling: Fish TLR4

does not recognize LPS and negatively regulates NF-ƙB activation. The J. of Immunology. 182,

1836-1845.

Seya, T., Akasawa, T., Tsujita, T. y Matsumoto, M. (2006). Role of toll-like receptors in adjuvant

–aumented immune therapies. eCAM 3, 31-38.

Takano, T., Hwang, S., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T. y Sano, M. (2010). Evidence of

Molecular Toll-like receptors mechanism in teleosts. Fish Pathology. 45, 1-16.

Takeda, K. y Akira, S. (2005). Toll-like receptors in innate immunity. International Immunology.

17, 1-14.

Tripathy, P. y Aggarwal, A. (2006). NF-ƙB transcription factor: a key player in the generation of

immune response. Current Sciencie. 90, 519-531.

127

Tsoi, S., Park, K., Kay, H., O´Brien, T., Podor, E., Sun, G., Douglas, S., Brown, L. y Johnson, S.

(2006). Identification of a transcript encoding a soluble form of toll-like receptor 5 (TLR5) in

Atlantic salmon during Aeromonas salmonicida infection. Veter. Immunol. and Immunopathol.

109, 183-187.

Tsujita, T., Tsukada, H., Nakao, M., Oshiumi, H., Matsumoto, M. y Seya, T. (2004). Sensing

bacterial flagellin by membrane and soluble orthologs of toll-like receptor 5 in rainbow trout

(Onchorhynchus mikiss). The journal of biological chemistry. 47, 48588-48597.

Tsujita, T., Ishii, A., Tsukada, H., Matsumoto, M., Che, F. y Seya, T. (2006). Fish soluble Toll-

like receptor (TLR)5 amplifies human TLR5 response via physical binding to flagellin. Vaccine.

24, 2193-2199.

Toranzo, A., Magariños, B. y Romalde, J. (2005). A review of the main bacterial fish diseases in

mariculture systems. Aquaculture. 246, 37-61.

Underhill, D. y Ozinsky, A. (2002). Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.

Current Opinion in Immunology. 14, 103-110.

Wilhelm, V., Miquel, A., Burzio, L., Rosemblatt, M., Engel, E., Valenzuela, S., Parada, G. y

Valenzuela, P. (2006). A vaccine against the salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis based on

recombinant proteins. Vaccine. 24, 5083-5091.

Xu, Y., Tao, X., Shen, B., Horng, T., Medzhitov, R., Manley, J. y Tong, L. (2000). Structural

basis for signal transduction by the Toll/Interleukin 1 receptor domain. Nature. 408, 111-115.

Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Gutiérrez-de Frías, C. y Cortés, A. (2006). Ontogeny of the

immune system of fish. Fish and Shellfish Immu. 20, 126-136.

CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, …

Documents

Transcript of CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, …