Profesor Patrocinante

Dr. Jaime Figueroa V.

Instituto de Bioquímica y

Microbiología

Facultad de Ciencias

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES TIPO

TOLL: TLR1, TLR9 Y TLR22 FRENTE A INFECCIÓN CON

Piscirickettsia salmonis EN CULTIVO PRIMARIO DE RIÑÓN

ANTERIOR DE TRUCHA ARCOIRIS (O. mykiss)

Tesis de Grado presentada como

parte de los requisitos para optar al

grado de Licenciado en

Bioquímica y Título Profesional de

Bioquímico

BÁRBARA DANIELA PEÑA SAYAGO

VALDIVIA – CHILE

2013

“El miedo es la más grande

discapacidad de todas”

Nick Vujicic

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero agradecer al Dr. Jaime Figueroa por su ayuda, guía y

entretenidas historias. A Coty por tener la mejor disposición para enseñarme cada cosa que

necesité. A Tamy por ser mi mentora, por su buena onda, amistad y paciencia desde mis

inicios en el laboratorio, además, por estar siempre presente, ayudándome, apoyándome y

aconsejándome. A Clara y Alexei, por su compañía, consejos y risas. A Pablo por su

amistad y por sobre todo, por la prolactina salvadora. A los integrantes del LabBMP

Denise, Adolfo, Mary, Maty, CC, Fran, Conchita, Nato y Profe Gudy por la buena onda,

entretenida compañía, amenas conversaciones que hacían que los días fueran más que sólo

rutina y por todos los HH que arreglaban cualquier problema. Fueron y serán un gran

apoyo, cada uno de ellos colaboró en mi tesis, quizás no en experimentos, pero si con una

sonrisa o una palabra de apoyo o simplemente con alguna canción adecuada para alegrar la

vida.

Muy en especial a mis queridos amigos, Willy por ser mi cómplice, Nano por

quererme tal cual soy y Andrés por estar siempre conmigo, incluso en la distancia. A los

tres les doy gracias por su compañía, cariño y amistad durante toda esta travesía, y por

hacer de ésta etapa la mejor de toda la universidad, les deseo todo el éxito del mundo.

A la Esme por ser tan especial, una gran persona y amiga.

A mi familia, mis padres por estar a mi lado apoyándome y alentándome siempre. A

mi hermanita adorada por ayudarme, apoyarme, comprenderme y acompañarme.

Esta tesis fue financiada por el proyecto INNOVA Chile Código 07CN13: IBM-259

y el proyecto FONDAP 15110027: “Interdisciplinary Center for Aquaculture Research”

(INCAR).

i

INDICE GENERAL

Página

1. RESUMEN 1

1.1. Summary 2

2. INTRODUCCIÓN 3

2.1. Generalidades del Sistema inmune 3

2.2. Sistema inmune de peces Teleósteos 4

2.2.1. Órganos del sistema inmune de peces 5

2.2.2. Sistema Inmune Innato de peces 6

2.3. Receptores tipo Toll 8

2.3.1. TLR en peces 17

2.4. Prolactina 22

2.5. Piscirickettsia. Salmonis 25

2.6. Relación TLR, P. salmonis y PRL 26

3. MATERIALES Y MÉTODOS 30

3.1. Materiales 30

3.1.1. Equipos e instrumentos 30

3.1.2. Reactivos 32

3.1.3. Soluciones 34

3.1.4. kit de reactivos 35

ii

3.1.5. Material Biológico 35

3.1.6. Animales de experimentación 35

3.2. Métodos 36

3.2.1. Extracción de órganos 36

3.2.2 Extracción de RNA total de distintos órganos de O. mykiss 36

3.2.2.1. Cuantificación y evaluación de pureza del RNA 37

3.2.3. Transcripción reversa 37

3.2.4. Diseño de partidores 38

3.2.5. Amplificación de segmentos del cDNA de los genes en estudio 38

3.2.6. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa 40

3.2.7. Siembra de células SHK-1 40

3.2.7.1. Cuantificación de las células SHK-1 41

3.2.8. Cultivo de P. salmonis 41

3.2.8.1. Cuantificación de P. salmonis por el método de Mc Farland 43

3.2.8.2. Verificación de P. salmonis 43

3.2.9. Extracción de proteínas totales de P. salmonis 43

3.2.9.1. Cuantificación de proteínas 44

3.2.10. Inactivación de P. salmonis 44

3.2.11. Estandarización de Prolactina 45

3.2.11.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida 45

3.2.11.2. Western blot confirmatorio de Prolactina 46

3.2.11.3. Ensayo de actividad de prolactina 47

iii

3.2.12. Ensayos de cinéticas de expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 47

en cultivo primario

3.2.12.1. Cultivo primario y purificación de leucocitos 47

de riñón anterior de trucha

3.2.12.2. Conteo y evaluación de células 48

3.2.12.3. Cinéticas de expresión 49

3.2.12.4. Infección con P. salmonis 49

3.2.12.5. Estimulación con prolactina 49

3.2.12.6. Recolección de los puntos de la cinética y 49

extracción de RNA

3.2.12.7. Cuantificación de la expresión génica de 50

las cinéticas mediante RT-qPCR

4. RESULTADOS 52

4.1. Análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en 52

distintos órganos de trucha arcoíris .

4.2. Evaluación de Prolactina 54

4.2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot confirmatorio 54

4.2.2. Ensayo de actividad de prolactina 54

4.3. Inactivación P. salmonis cepa IB-40 56

4.4. Cinéticas de expresión 59

4.4.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLRs 67

iv

4.4.1.1. Evaluación de la cinética de expresión frente 68

a infección con P. salmonis IBM-40 viva________________________________

4.4.1.2. Evaluación de la cinética de expresión frente 70

a infección con P. salmonis LF-89 viva_________________________________

4.4.1.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR 70

frente a infección IBM-40 inactivada por calor____________________________

4.4.1.4. Evaluación de la cinética de expresión frente 73

a estimulación con proteínas totales de IBM-40_________ __________________

4.4.1.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética 75

con prolactina y prolactina más IBM-40 viva_____________________________

4.4.1.6. Evaluación de expresión en la cinética infectada 78

con IBM-40 respecto a infectada con LF-89____________________

4.5. Clonamiento de TLR2 80

5.- DISCUSIÓN 82

5.1. Evaluación semi-cuantitativa de la expresión de TLR1, 82

TLR22 y Myd-88 en distintos órganos de trucha arcoíris

5.2. Inactivación P. salmonis cepa IBM-40 84

5.3. Clonamiento de TLR2 85

5.4. Cinéticas de expresión 86

5.4.1. Evaluación de Cinéticas por receptor 86

5.4.1.1. Cinéticas de expresión de TLR1 88

5.4.1.2. Cinéticas de expresión de TLR22 89

v

5.4.1.3. Cinéticas de expresión de TLR9 90

5.4.1.4. Cinéticas de expresión de Myd88 91

5.4.1.5. Cinéticas de expresión de IL-1β 92

5.4.2. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección 95

5.4.2.1. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección 95

con IBM-40 viva

5.4.2.2. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con 96

la cepa LF-89 viva

5.4.2.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a 96

infección con la cepa IBM-40 inactivada por calor

5.4.2.4. Evaluación de la cinética de expresión frente a 97

estimulación con proteínas totales de IBM-40

5.4.2.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina 98

e infección con IBM-40 viva previa estimulación con PRL

5.4.2.6. Evaluación de expresión en la cinética infectada con IBM-40 99

respecto a infectada con LF-89

6. REFERENCIAS 102

vi

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR 10

Figura 2 Esquema comparativo de las vías dependiente e 16

independiente de MyD88 _______ _______ __________________________ __

Figura 3 Esquema de los dominios de organización de TLRs de O. mykiss 21

Figura 4 Esquema representativo de las moléculas de la señalización 23

de TLR descubiertas en peces ______ ___________________________________

Figura 5 Análisis de expresión de TLR1, TLR22 y Myd-88 en distintos 53

órganos de O. mykiss _____ ______ ____________________________________

Figura 6 Western blot confirmatorio para prolactina 55

Figura 7 Evaluación de actividad de prolactina 57

Figura 8 Curva de inactivación de IBM-40 a distintas temperaturas 58

Figura 9 PCR convencional para β-actina de cDNA de riñón anterior 60

infectado con LF-89 viva_____ .________________

Figura 10 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR1 61

Figura 11 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR9 62

Figura 12 Estandarización de partidores para la amplificación de TLR22 63

Figura 13 Estandarización de partidores para la amplificación de Myd-88 64

Figura 14 Estandarización de partidores para la amplificación de IL-1β 65

Figura 15 Estandarización de partidores para la amplificación de EF1-α 66

Figura 16 Gráficos de cinéticas de expresión frente a IBM-40 viva 69

vii

Figura 17 Gráficos de cinéticas de expresión frente a LF-89 viva 71

Figura 18 Gráficos de cinéticas de expresión frente a la cepa IBM-40 inactivada 72

Figura 19 Gráficos de cinéticas de expresión frente a proteínas totales 74

de la cepa IBM-40_____________ ___________________ _________________

Figura 20 Gráficos de cinéticas de expresión de células infectadas con 76

IBM-40 viva e inmuno-estimuladas previamente con PRL .

Figura 21 Comparación de Cinéticas de expresión frente a infección con 79

una cepa patógena respecto a una no patógena de P. salmonis .

Figura 22: Esquema representativo del entrecruzamiento en las vías de señalización 100

de TLR y receptor de Prolactina .

viii

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla I TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización 12

Tabla II TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos 18

Tabla III: Resumen partidores utilizados para RT-qPCR, producto esperado 39

y referencia

ix

Lista de Abreviaturas

ABSA albúmina de suero de bovino

DAB 3,3’-diaminobencidina

DAMP Patrones moleculares asociados a daño

IFN Interferón

IL Interleuquina

LPS Lipopolisacárido

LRR Regiones ricas en leucina

LRR-CT Regiones ricas en leucina C-terminal

MHC Complejo mayor de histocompatibilidad

MyD88 Myeloid differentiation primary response 88

NF-ƙB Factor nuclear ƙB

O. mykiss Oncorhynchus mykiss

P. salmonis Piscirickettsia salmonis

PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos

PBS Tampón fosfato salino

PMSF Fosfometilsulfonilfosfato

PRL Prolactina

rPRL Receptor de prolactina

RRP Receptor de Reconocimiento de Patrones

SDS Dodecil sulfato de sodio

SHK-1 Salmon Head Kidney-1

x

Temed N, N, N´, N´-tetrametildiamina

TIR Dominio del receptor Toll/IL-1

TLR Receptores tipo Toll

Tris Tris (hidroximetil)aminometano

1

1.- RESUMEN

El Sistema Inmune Innato, es la primera barrera de defensa de los organismos frente a

patógenos, los receptores tipo Toll (TLR) son parte fundamental de este sistema, siendo los

encargados de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y desencadenar

una respuesta en el hospedero. Existen varios TLR, cada uno de ellos es capaz de reconocer uno o

más PAMPs de diversos patógenos, como virus, bacterias u hongos, y desencadenar una

respuesta inmune mediante una cascada de señales. En peces teleósteos se han descrito algunos

TLR y además se han descubierto otros específicos de peces.

Piscirickettsia salmonis es uno de los principales patógenos que afecta a cultivo de

salmónidos, produce una infección sistémica, caracterizada por la colonización de varios órganos

incluyendo riñón, hígado, bazo, intestino, cerebro y las branquias.

Debido a que el mecanismo de reconocimiento de las células blanco, los mecanismos de

invasividad y los tipos de respuesta generada frente a P. salmonis, son hasta ahora prácticamente

desconocidos, es importante el estudio del mecanismo de acción involucrado en una infección

bacteriana. Se estudiaron algunos de los TLR involucrados en la respuesta inmune de trucha, a

distintos tiempos, ante la infección de P. salmonis viva, P. salmonis inactivada y proteínas totales

de P. salmonis, además de evaluar el rol inmunoestumulador de Prolactina. Para ello se realizaron

cinéticas en cultivo primario de riñón anterior de O. mykiss, y se analizaron mediante RT-qPCR

la expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 ante los distintas tratamientos.

Con los resultados obtenidos se puede concluir que O. mykiss expresa los receptores TLR1,

TLR22 y MyD88en distintos órganos. Los receptores estudiados modulan su expresión

dependiendo de la forma de exposición de P. salmonis sugiriendo que reconocen algún PAMPs

de éste patógeno.

2

1.1 SUMMARY

The innate immune system is the first line of defense of organisms against pathogens, Toll-

like receptors (TLR) are a key part of this system, being responsible for recognizing pathogen-

associated molecular patterns (PAMPs) and triggering the host response. Each TLR can

recognize one or more PAMPs of various pathogens, such as viruses, bacteria or fungi, and

trigger an immune response through signaling cascade. Some TLR were described in teleost fish

and some of them are fish specific.

Piscirickettsia salmonis is one of the main pathogens that affect salmonid farming, produces a

systemic infection, characterized by colonization of several organs including kidney, liver,

spleen, intestine, brain and gills.

Because, the mechanism of recognition of target cell and response generated, invasion

mechanisms and type of response generated against P. salmonis, are virtually still unknown, it is

important to study the mechanism of action involved in a bacterial infection. We studied the

response of the TLR in time, involved in the immune response of trout to infection by live P.

salmonis, inactive P. salmonis and total protein P. salmonis. In addition, we evaluate the

inmunostimulator role of prolactin, using primary culture kinetics from O. mykiss anterior kidney,

and analyzing the expression of TLR1, TLR22 and TLR9 by RT-qPCR in response to

P.salmonis.

Our results suggest that O. mykiss express receptors TLR1, TLR22, TLR9 in different organs.

Studied receptors modulate their expression in response to P. salmonis, suggesting a recognition

of some PAMPs of this pathogen.

3

2.- INTRODUCCIÓN

2.1 Generalidades del Sistema Inmune

El sistema inmune provoca una reacción coordinada ante sustancias extrañas, ya sea

microbiológicas (virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos multicelulares) o contra

macromoléculas (proteínas y polisacáridos), sin implicar una consecuencia patológica de tal

reacción (Abbas et al., 2001). Los tipos celulares, tejidos y moléculas que conforman el sistema

inmune, ante un agente o sustancia extraña al organismo, median una respuesta coordinada y

colectiva, la cual se denomina respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria comienza con el

reconocimiento del patógeno o del material extraño y finaliza con el desarrollo de un mecanismo

capaz de eliminarlo (Male et al., 2007). Existe una gran diversidad de agentes infecciosos,

requiriendo una gran variedad de respuestas para así poder combatir cada tipo de infección (Male

et al., 2007).

Las respuestas inmunitarias pueden ser divididas en dos categorías: Respuesta inmune

innata (natural o inespecífica) y Respuesta inmune adaptativa (adquirida o específica), ambas se

diferencian en la especificidad y el tiempo que tardan en provocar su efecto. La respuesta innata

no se modifica tras la exposición reiterada a un determinado patógeno, sin embargo, es capaz de

discriminar entre una variedad de patógenos y lo propio, deduciéndose que no es completamente

no específica como se pensaba (Randon-Barragan, 2009). La habilidad de la respuesta innata, de

reconocer rasgos comunes a los patógenos más frecuentes sin necesidad de haber estado

previamente expuestos a los mismos (Rubio-Godoy, 2010) genera una respuesta inmune más

rápida (Randelli et al., 2008). Además, carece de memoria inmunológica y sus componentes

humorales y celulares juegan un rol importante en activar e instruir la respuesta inmune

adaptativa (Janeway et al., 2002; Imler et al., 2004). Por su parte, la respuesta adaptativa,

4

responde de manera específica a cada patógeno, por lo tanto es más lenta en su desarrollo,

además posee la capacidad de crear memoria inmunológica (Rubio-Godoy, 2010). En resumen,

las dos características claves de la respuesta adaptativa son especificidad y memoria (Male et al,

1996).

Las respuestas innata y adaptativa actúan de forma integrada y coordinada, de tal forma

que la respuesta inmunitaria innata representa el proceso inicial e instructor en la defensa del

hospedero en mamíferos (Bautista et al., 2005). La respuesta inmune innata, constituye la primera

línea de defensa que controla los primeros pasos de la respuesta inmune, está conformada por

barreras físicas, células fagocíticas, eosinófilos, células citotóxicas naturales (NK) y diversas

moléculas que circulan en la sangre (complemento y proteínas de la fase aguda) (Male y Roitt,

1996; Abbas et al., 2001).

La respuesta inmune adaptativa puede ser humoral, mediada por anticuerpos, donde

juegan un rol crucial los linfocitos B, o celular, mediada principalmente por linfocitos T

(Janeway et al., 2002). Los linfocitos son capaces de reconocer un patógeno específico, tanto si

están dentro de las células hospedera, como si se encuentran en el torrente sanguíneo o fluidos

(Male y Roitt, 1996).

2.2 Sistema inmune de peces teleósteos

El sistema inmune de peces teleósteos muestra características similares al de aves y

mamíferos, presentando respuestas celulares y humorales que poseen características de ser

específicas y de tener memoria (Van Muiswinkel et al, 1995). Dentro de la repuesta humoral

están: las barreras físicas (piel, mucosas y escamas) y secreciones (lisozima, proteasas, factores

del complemento, entre otros) (Du Pasquier et al., 2000; Rubio et al., 2010). Por su parte, el

componente celular está conformado por: macrófagos, granulocitos, células eosinófilas y las

5

células citotóxicas no específicas. La inmunidad celular no específica comprende tres mecanismo

defensivos: inflamación, fagocitosis y citotoxicidad no específica; en cambio, la inmunidad

celular específica depende de que células portadoras de receptores del MHC clase I sean capaces

de presentar antígenos a los linfocitos T CD8+ (Ohta et al., 2006; Rubio, 2010). Los diferentes

tipos celulares que trabajan en cada sistema, conocidos en mamíferos, se han reconocido en peces

teleósteos, incluyendo células que son morfológica y funcionalmente equivalentes a las de

mamíferos como: neutrófilos, macrófagos, monocitos, trombocitos, células B, células

plasmáticas, células T, células natural killer y eosinófilos (Alvarez-Pellitero, 2008).

Pese a las similitudes entre el sistema inmune de teleósteos y el de otros vertebrados,

existen claras diferencias. La más clara es que los peces dependen en mayor grado de los

mecanismos de respuesta innata que los mamíferos. Al ser los peces organismos poiquilotermos,

no son capaces de activar adecuadamente algunas funciones inmunitarias adaptativas a bajas

temperaturas, como la producción de anticuerpos, asociado a una lenta proliferación de linfocitos

(Rubio-Godoy, 2010), debido a que la respuesta inmune adaptativa es dependiente de la

temperatura (Abruzzini et al., 1982; Clem et al., 1991). En consecuencia, en peces prevalece la

respuesta inmunataria innata, que es relativamente independiente de la temperatura (Magnadóttir,

2006).

2.2.1 Órganos del sistema inmune de peces

Peces teleósteos carecen de médula ósea y nódulos linfáticos, de hecho, todos los órganos

y tejidos del sistema inmune de especies de teleósteos presentan un carácter mixto, no habiéndose

encontrado órganos exclusivamente linfoides.

6

Los órganos principales del sistema inmune en peces teleósteos son el timo, el bazo y el

riñón (Alvarez-Pellitero, 2008; Rubio-Godoy, 2010; Zapata et al., 2006). En peces el riñón consta

de dos partes, la anterior con función hematopoyética y la porción posterior con función

excretora. En los peces, la hematopoyesis se produce en el riñón anterior, que es la ubicación para

la producción de todos los tipos de células hematopoyéticas y comparable a la médula ósea de

mamíferos (Sepulcre et al., 2002), también se ha visto que está implicado en el aclaramiento de

antígenos en circulación, además de ser el principal sitio de producción de anticuerpos.

El riñón anterior y el bazo son reconocidos como órganos linfoides secundarios, órganos

donde se localizan poblaciones de macrófagos y linfocitos capaces de iniciar una respuesta

inmune adquirida (Rubio-Godoy, 2010). En peces no existen ganglios linfáticos, por lo que el

órgano linfoide secundario más importante es el bazo, ha sido implicado en el aclaramiento de

antígenos y complejos inmunes de la circulación sanguínea, también tiene un papel en la

presentación de antígenos y el inicio de la respuesta adaptativa.

El timo, representado por masas de tejido linfo-mieloide que aparecen junto a las

branquias, puede ser considerado como agregación de macrófagos que procesan la proliferación

de células T (Alvarez-Pellitero, 2008).

2.2.2 Sistema inmune innato de peces

El sistema inmune innato desempeña un papel significativo en todos los organismos

multicelulares. La característica clave del sistema es su capacidad para reconocer y responder a

los microorganismos invasores, reconoce y detecta patógenos potencialmente nocivos y

rápidamente desencadena mecanismos apropiados de defensa que previenen o minimizan el daño

tisular.

7

Los vertebrados, incluidos los peces teleósteos, han desarrollado una serie de receptores

de reconocimiento de patógenos (RRP) para detectar y responder a diversos patrones moleculares

asociados a patógenos (PAMP). RRPS reconocen (PAMP), que incluyen proteínas, lípidos y

nucleótidos, y como resultado la activación de la respuesta inmune innata del huésped (Pichlmair

y Reise Sousa, 2007). Después de detectar los PAMPs, las células del sistema inmune innato del

huésped inician un amplio espectro de respuestas de defensa que resultan en el desarrollo de la

inflamación y la defensa del huésped frente a la infección (Akira et al., 2006). Se han

identificados tres clases principales de RRPs: i) Los receptores de tipo Toll (TLRs) que

reconocen ligandos tanto en la superficie extracelular como dentro del endosoma, ii) receptores

tipo NOD (NLRs) que son receptores citoplasmáticos, y iii) receptores tipo RIG-I (RLRs), un

grupo de receptores intracelulares que reconocen virus (Akira et al., 2006, Meylan et al., 2006,

Chen et al., 2009, Franchi et al., 2010 y Hansen et al., 2011). De estos receptores, los TLR fueron

los primeros caracterizados y más ampliamente estudiados en vertebrados e invertebrados

(EwaSnaar-Jagalska et al., 2004, Jault et al., 2004 y Hansen et al., 2011). Las células de la

respuesta inmunitaria adquirida que expresan RRPs son: macrófagos, células dendríticas,

mastocitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK entre otras (Janeway et al., 2002).

La inmunidad innata inicia los mecanismos de defensa inmediatos basados en RRPs que

reconocen Patrones Moleculares Asociados a Patógenos, PAMPs y también Patrones Moleculares

asociados a Daño, DAMPs, que son estructuras endógenas liberadas de tejidos dañados (Randon-

Barragan, 2009). Todos los RRPs son expresados constitutivamente por el hospedero y pueden

detectar al patógeno independiente del ciclo de vida en el que se encuentre ya que reconocen

PAMPs, son expresados en todas las células de un tipo celular, independientes de memoria

inmunológica dando lugar a distintas respuestas contra patógenos (Akira et al., 2006).

8

Los PAMPs son estructuras moleculares que sólo están presentes en patógenos

microbianos y no se encuentran en el organismo hospedero, son estructuras esenciales para la

supervivencia de los patógenos, es decir, sus mutaciones son letales para el patógeno (Moreno et

al., 2003), además, son estructuras compartidas por un gran número de patógenos. Las

características antes mencionadas, permiten que un número limitado de RRPs logre discriminar lo

propio de lo ajeno y puedan reconocer una gran variedad de patógenos. Esta información permite

identificar el tipo de patógeno que está invadiendo y permite evaluar el tipo de respuesta contra él

(Medzhitov et al., 2000; Bautista et al., 2005).

Los RRPs se pueden encontrar en la membrana celular, en compartimentos dentro de la

célula (Medzhitov et al., 2000) o pueden ser secretados al torrente sanguíneo y fluidos de tejidos

(Janeway et al., 2002). Las funciones de estos receptores son: i) opsonización de la bacteria o

virus, por fagocitosis o activación de la vía de las lectinas, además de producción de mediadores

de la inflamación, con el fin de impedir la diseminación del patógeno antes de que se desarrolle la

inmunidad adquirida (Moreno et al., 2003); ii) captación de agentes patógenos por los fagocitos y

células dendríticas; iii) activación de las vías de señalización que dan lugar a la inducción de la

transcripción de genes de respuesta inmune, tales como los péptidos antimicrobianos y citoquinas

inflamatorias (Medzhitov et al., 2000; Akira et al., 2006).

2.3 Receptores tipo Toll

Los TLR son los principales receptores de reconocimiento de patrones (PRR) de la

superficie celular en el reconocimiento de los componentes microbianos y la inducción de

respuestas inmunes (Akira y Takeda, 2004). Los TLR son expresados en células como:

neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células epiteliales mucosas, células B, células T,

células trofoblásticas, plaquetas y células megacariocíticas (Randon-Barragan, 2009; Takano et

9

al., 2010). También se encuentran en algunas células no inmunitarias como fibroblastos y células

epiteliales (Takano et al., 2010).

Los TLR se encuentran en vertebrados e invertebrados (Imler et al., 2004), son

glicoproteínas transmembrana de tipo 1, con tamaños moleculares entre 90-115 kDa. Se

distinguen por poseer un dominio extracelular de unión al ligando compuesta de repeticiones

ricas en leucina (LRR), así como uno intracelular, dominio del receptor Toll/IL-1, llamado

dominio TIR, por su homología con el dominio citoplasmático del receptor de IL-1 (Akira y

Takeda, 2004; Takano et al., 2010). La estructura de un receptor tipo Toll se puede observar en la

figura 1.

Las LRRs se encuentran en tándem y consisten entre 20-40 aminoácidos de largo, los que

contienen una secuencia consenso de 10 aminoácido, XLXXLXLXXN, característica de las LRR

en todos los TLR (Bell et al., 2003; Matsushima et al., 2007). Además de una secuencia

consenso, XɵXXɵXXXXFXXLX (ɵ corresponde a un aminoácido hidrofóbico), que sólo la

poseen algunas LRR en los TLR. También contienen una secuencia consenso, la LRR-CT,

LxxLxLxxNP(F/L)xCxCxxxx (F/L)xxxx, importante para mantener el dominio extracelular cerca

de la membrana plasmática (Bell et al., 2003; Matsushima et al., 2007). Las LRRs en su conjunto

forman una estructura tipo “herradura” para el dominio extracelular del receptor (Bell et al.,

2003). La estructura tipo herradura es característica de estos dominios, las variaciones en la

secuencia y el largo de la inserción de las LRR generan diferentes conformaciones y se cree que

esto está relacionado con el reconocimiento especifico de los PAMP (Bell et al., 2003).

El dominio intracelular, TIR, está compuesto de aproximadamente 200 residuos de

aminoácidos (Jault et al., 2004), se pueden distinguir tres regiones importantes funcionalmente:

10

Figura 1: Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR. A) Esquema de los dominios

característicos de un TLR. Dominio extracelular (morado) que contiene repeticiones ricas en

leucina (LRR); TM: Región transmembrana (rosado) y Región intracelular que contiene el

dominio TIR (Dominio citoplasmático del receptor IL-1/Toll) en verde. B) Esquema basado en la

cristalización de TLR9 humano (Figura 3 de Brandl et al, 2012).

11

box1, box2 y box3, importantes en la interacción con proteínas de señalización y conservados

entre los TLR de mamíferos y peces teleósteos (Takano et al., 2010).

Los ligandos para TLRs son motivos estructurales conservados de los microbios,

denominado PAMP, éstos incluyen lipopolisacárido (LPS), flagelina, lipoproteínas, glicolípidos,

y los ácidos nucleicos de origen bacteriano, viral, parasitario o fúngica. En la Tabla I se muestra

un resumen de los TLR que se han encontrado en mamíferos junto con los PAMPs que reconocen

cada uno de ellos.

Los TLR una vez unidos a su ligando se dice que están activados, formando dímeros con

otros TLRs, ya sean homodímero o heterodímeros. Se ha sugerido que una vez que los TLR se

activan, desencadenan la señalización induciendo dimerización de los dominios TIR, lo que

provee una plataforma para el reclutamiento de las proteínas adaptadoras de la cascada de

señalización (O´neill et al., 2007; Jin et al., 2007). Este grupo de moléculas adaptadoras, se

caracteriza por poseer un dominio TIR. Las interacciones TIR-TIR entre la molécula adaptadora

y el dominio intracelular del TLR desencadenan la cascada de señalización. Los adaptadores que

se han descrito, hasta el momento, en mamíferos son Factor de diferenciación mieloide 88

(MyD88), proteína adaptadora con un dominio TIR (TIRAP), adaptador con dominio TIR que

induce IFN-β (TRIF), y molécula adaptadora relacionada a TRIF (TRAM) (Kumar et al., 2009).

El descubrimiento de varios adaptadores que contienen TIR, llevaron a la comprensión que tipos

individuales de TLR reclutan distintos adaptadores citosólicas que pueden desencadenar

respuestas específicas a microbios determinados (Akira et al, 2006; Kawai etal., 2010). Además,

el tipo de señalización celular específicas definidas por sus propiedades inmunológicas pueden

alterar la respuesta desencadenada por la señal de un mismo TLR en diferentes tipos de células

(Barbalat et al., 2009).

12

Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización.

TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Adaptador Factor de

transcripción

Efector

TLR1 Membrana

plasmática

Tracil-Lipopéptidos;

factores solubles; Modulina

NC TIRAP;

MyD88

NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR2 Membrana

plasmática

Lipoproteínas/lipopéptidos;

Peptidoglican; Ácido

lipoteitoico; Porinas;

Lipopolisacáridos atípicos;

Factores solubles;

Glicolípidos; Proteina A

membrana externa;

Glicoinositolfosfolípidos;

Proteínas de estructura viral;

Hemaglutininas; Zymosan;

Lipoarabinomanano

HSP60; HSP70;

HSP96;HMGB1;

Ácido hialurónico

TIRAP;

MyD88

NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR3 Endolisosoma ssRNA; dsRNA mRNA TRIF NF-ƙB; IRF3,7 Citoquinas

inflamatorias;

IFNs tipo I

TLR4 Membrana

plasmática

LPS; HSP60 bacterino;

Proteínas envoltura viral;

Proteínas fusión viral;

Glicoinositolfos-folípidos;

Taxol

HSP22-60-70-96;

HMGB1; β-efensin2;

Fibronectina; Ácido

hialurónico; Heparan

sulfato; Fibrinógeno

TIRAP;

MyD88;

TRAM;

TRIF

NF-ƙB; IRF3,7 Citoquinas

inflamatorias;

IFNs tipo I

NC: No se conoce; Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en Manavalan et

al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.

13

Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización (continuación).

TLR Localización Ligando Exógeno Ligando

Endógeno

Adaptador Factor de

transcripción

Efector

TLR5 Membrana

plasmática

Flagelina NC MyD88 NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR6 Membrana

plasmática

Diacil-lipopéptidos;

Ácido lipoteitoico;

Zymosan

NC TIRAP; MyD88 NF-ƙB Citoquinas

inflamatorias

TLR7 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas

inflamatorias;

IFNs tipo I

TLR8 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas

inflamatorias;

IFNs tipo I

TLR9 Endolisosoma Motivos CpG no

metilados

DNA endógeno MyD88 NF-ƙB; IRF7 Citoquinas

inflamatorias;

IFNs tipo I

TLR10 Extracelular NC NC NC NC NC

NC: No se conoce; Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en Manavalan et

al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.

14

En un comienzo sólo fue descrita MyD88 como proteína adaptadora, por lo que las vías

de señalización han sido categorizadas dentro de dos vías mayores: la vía dependiente de MyD88

y la vía independiente de MyD88 (o vía dependiente de TRIF) (Kawai y Akira., 2007).

Vía Dependiente de MyD88: Es utilizada por todos los TLR menos el TLR3. La

estimulación de TLR por su ligando recluta MyD88 a su dominio TIR lo que desencadena

una cascada de señalización que finaliza con la activación de los factores de transcripción

AP-1, por medio de la activación de MAPK y NF-ƙB, por medio de la fosforilación de

IƙB (Takeda et al., 2005; Kumar et al., 2009). Se ha descubierto que TIRAP actúa como

adaptador entre el dominio TIR y MyD88, siendo esencial para la activación de esta vía

en los receptores TLR2 y TLR4 en mamíferos (Janeway et al., 2002; Takeda et al., 2005).

Los receptores TLR7, TLR8 y TLR9 activados, en células dendríticas aumenta la

transcripción de IFN tipo 1 a través de la activación del factor de transcripción IRF7

(O´neill et al., 2007; Kumar et al., 2009).

Vía Independiente de MyD88: También llamada Vía dependiente de TRIF. La

inician TLR3 y TLR4 activados, desencadenando una inducción en la transcripción de

citoquinas proinflamatorias e interferones tipo I, mediante la activación de los factores de

transcripción IRF3 y NF-ƙB (Kumar et al., 2009). En mamíferos, TRAM participa

selectivamente en la activación de esta vía en TLR4 pero no en TLR3 (Takano et al.,

2010) actuando como proteína adaptadora a TRIF.

Las dos cascadas de señalización respectivamente, implican la activación de factores de

transcripción: NF-ƙB, AP-1 e IRFs. Por su parte, NF-ƙB regula la expresión de genes

codificantes para citoquinas inflamatorias, como por ejemplo IL-1β, IL-2, TNF-α e IL-12 entre

otras (Tripathy et al., 2006) y quimioquinas como MCP-1 (Pasare et al., 2004). AP-1 regula la

15

expresión de TNF-α e IL-6 entre otras, además de moléculas coestimuladoras, como CD80 y

CD86 en células dendríticas (Randon-Barragan, 2009). Se ha visto la activación de los factores

de transcripción IRF3 e IRF7 activan la transcripción de IFNβ e IFNα respectivamente (Kumar et

al., 2009). En la Tabla I un resumen de las moléculas involucradas para la señalización en los

TLR descritos en mamíferos. En la Figura 2 se observa un esquema representativo de cada vía.

La fagocitosis, junto con el producto de los genes activados por los TLR, instruye el

desarrollo de la inmunidad adaptativa, relacionando así a los TLR con esta última. La activación

de los TLR en las células presentadoras de antígenos (macrófagos y células dendríticas), induce

la producción de citoquinas y la expresión de moléculas co-estimulatorias de superficie,

ayudando en la elaboración de la respuesta inmune adaptativa. La señalización por TLR activa

principalmente a las células dendríticas a promover una regulación positiva de la expresión de los

MHC, de citoquinas inductoras de respuestas tipo Th-1 tales como la IL-12 o IL-18 (Pasare et al.,

2004; Randon-Barragan, 2009), y moléculas estimuladoras como CD80, CD86 necesarias para la

expansión clonal de células T (Abdelsadik et al., 2011). Las células dendríticas maduras migran a

los nódulos linfáticos donde presentan los antígenos a células T inmaduras (Medzhitov, 2001),

generando principalmente una respuesta tipo Th-1, que permite activar la propiedad microbicida

de los macrófagos e induce a los linfocitos B a producir IgG, efectivos para la opsonización de

patógenos extracelulares (Moreno et al., 2003). Algunas citoquinas expresadas, por la activación

de los TLR, son importantes para superar la supresión de linfocitos T reguladores (Pasare et al.,

2004). Algunos TLR se expresan en los linfocito B y T activando la proliferación celular,

diferenciación y afectando la memoria celular y la producción de anticuerpos (Abdelsadik et al.,

2011).

16

Figura 2: Esquema comparativo de las vías dependiente e independiente de MyD88. Se

ilustran los distintos adaptadores descritos en estas vías de señalización: MyD88, TIRAP, TRIF y

TRAM. Vía Dependiente de MyD88: se observa como ejemplo TLR2 y todos los receptores TLR

excepto TLR3. Vía Independiente de MyD88: se observa TLR3 y TLR4. TLR4 es capaz de

activar ambas vías. La activación de cada una de ellas logra la activación de diferentes factores de

transcripción: NF-ƙB, AP-1, IRF3, IRF7, que ingresan al núcleo, excepto AP-1 que es activado

dentro del núcleo, y activan la transcripción de distintas moléculas de la respuesta (Figura 2

modificada de Seya et al, 2006).

17

El reconocimiento de los PAMPs por los TLR ocurre en varios compartimientos celulares,

como la membrana plasmática, endosomas, lisosomas y endolisosomas (Kawai et al., 2010).

TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 son expresados en vesículas intracelulares como endosomas y

retículo endoplasmático, en cambio otros como TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6 son expresados en

la membrana plasmática. La apropiada localización celular de los TLR es importante para la

accesibilidad al ligando, requiriendo internalización a la célula de algunos de ellos, para mantener

la tolerancia a las moléculas propias como ácidos nucleicos (Kawai et al., 2010). Se han

identificado 21 miembros de TLR en distintas especies (Palti, 2011), de los cuales 10 han sido

identificados en humanos (Randon-Barragan, 2009; Kawai et al., 2010).

2.3.1 TLR en peces

Se han descubierto 21 TLR en peces teleósteos, estos pueden diferir entre especies de

peces, los cuales son: TLR1, 2, 3, 4, 5, 5S, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25 y 26.

Diversos informes indican que TLR6 y TLR10 no existen en los peces teleósteos (Roach et al.,

2005; Rebl et al, 2010; Palti, 2011); mientras que TLR25 y TLR26 sólo han sido identificados en

el Ictalurus punctatus (Zhang et al., 2013).

Se han descrito TLRs 'específicos de pez' entre ellos TLR18, TLR19, TLR20, TLR21,

TLR22 y TLR23 (Roach et al., 2005; Huang et al, 2008; Oshiumi et al, 2008; Rebl et al, 2010;

Hansen et al, 2011; Palti, 2011). Sin embargo, todos estos TLRs de peces y sus cascadas de

señalización representan una alta semejanza estructural a los factores del sistema de TLR

mamíferos (Palti, 2011). En la Tabla II se encuentra un resumen de los TLR que se encuentran en

peces teleósteos junto con la especie en que se han descrito y los PAMPs que reconocen. En

trucha arcoiris, Oncorhynchus mykiss, se han sido descrito hasta el momento: TLR1, 3, 5M, 5S,

7, 8, 9, 20 y 22.

18

Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.

TLR Ligando Especies de peces

TLR1 Triacil-

lipopéptidos

T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis*;O. mykiss; I. punctatus

TLR2 Lipopéptidos;

Lipoproteínas;

Pam3CSk4

T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis;

P. olivaceus; I. punctatus

TLR3 dsRNA; poly

I:C;

componentes

bacterianos

T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; O. mykiss;

P. olivaceus; I. punctatus; G .rarus

TLR4a/b NC D. rerio*; G. rarus; ; I. punctatus; C. carpio

TLR5M Flagelina T. rubripes; D. rerio*; T. negroviridis; O. mykiss;

I. punctatus; S. salar

TLR5S Flagelina T. rubripes; O. mykiss; S. salar; I. punctatus

TLR7 ssRNA T. rubripes; D. rerio; C. carpio; O. mykiss; ; I. punctatus

TLR8 ssRNA T. rubripes; D. rerio*; O. mykiss*; T. negroviridis; S. salar; I.

punctatus

TLR9 CpG DNA no

metilado

T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar; O. mykiss;

P. olivaceus; S. aurata*; P. crocea* ; I. punctatus

NC: No se conoce; *: Se observa duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti,

2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al, 2011; Jianjian, 2012; Zhang et al., 2013.

19

Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.

TLR Ligando Especies de peces

TLR13 NC S. salar

TLR14 NC T. rubripes; D. rerio

TLR19 NC D. rerio*

TLR20 NC D. rerio*; I. punctatus

TLR21 CpG DNA no

metilado

T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; I. punctatus

TLR22 dsRNA; poly I:C T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar*; O. mykiss*;

C. aurata*; P. Olivaceus; ; I. punctatus; C. idella

TLR23 NC T. rubripes; T. negroviridis

TL25 NC I. punctatus

TLR26 NC I. punctatus

NC: No se conoce; *: Se observa duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti,

2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al, 2011; Jianjian, 2012; Zhang et al., 2013.

20

Además, en la base de datos NCBI (HE979560) se encuentra disponible TLR2, pero aún no ha

sido publicado por Brietzke y Rebl. En la figura 3 se muestra los TLR presentes en trucha y sus

respectivos dominios.

Se han encontrado tres grandes diferencias en los TLR descritos en peces con respecto a

los mamíferos:

1) Existe una forma soluble del ortólogo TLR5 en peces y no en humanos. El TLR5S

carece de región transmembrana y dominio TIR (Rebl et al., 2010). TLR5 se ha descrito que

reconoce flagelina, un compuesto del flagelo bacteriano. La flagelina interactúa primero con

TLR5M, facilitando la expresión de TLR5S el cual sirve después para amplificar la respuesta

celular de TLR5M como un feedback positivo (Tsujita et al., 2004), guiando a una activación

fuerte del NF-ƙB en células TLR5 positivas independiente de los tipos celulares. Esto evidencia

un prototipo de inmunidad humoral que se encuentra conservada en peces (Randon-Barragan,

2009).

2) No existe ortólogo de TLR4 en peces salmónidos. Se ha encontrado únicamente en G.

rarus, C. carpio (Palti, 2011), D. rerio e I. punctatus. Hasta el momento no se han encontrado en

ningún pez CD14 o MD2, importantes proteínas para el reconocimiento del LPS por TLR4 en

humanos (Rebl et al., 2010). Además en peces teleósteos no se ha encontrado TRAM, proteína

adaptadora importante en desencadenar la señalización celular en respuesta a la activación de

TLR4 (Takano et al., 2010).

21

Figura 3: Esquema de los dominios de organización de TLRs de O. mykiss. Los dominios de

organización de TLR1, 3, 5M, 5S, 9 y 22 son predichos desde las secuencias aminoacídicas

usando los programas SMART, TMHMM y SignalP. LRR: región de repeticiones ricas en

leucina. TIR: dominio citoplasmático del receptor IL-1/Toll. NT: N-terminal. CT: C-terminal.

Dominio tansmembrana ( ), Segmentos de baja complejidad conformacional ( ) y péptido

señal ( ) (Figura 1 de Palti, Y., 2011).

22

3) Existen miembros de TLR llamados “TLR específicos de peces". Corresponden a

TLR18, TLR19, 20, 21, 22 y 23 (Roach et al., 2005, Huang et al, 2008; Oshiumi et al, 2008;

Rebl et al, 2010; Hansen et al, 2011; Palti, 2011). Los roles de estos TLR aún no están definidos

(Palti, 2011). Se cree que TLR22 puede ser un sustituto funcional del TLR3 de humano ya que

actúa contra infecciones de virus dsRNA (Takano et al., 2010).

Se ha visto que los peces teleósteos poseen las proteínas adaptadoras, MyD88, TIRAP y

TRIF, importantes en la cascada de señalización celular que finaliza con la activación de una

respuesta inmune. TRAM no ha sido descubierto hasta el momento en ningún pez (Takano et al.,

2010). También se han descrito moléculas que componen estas cascadas de señalización y

moléculas reguladoras de estas vías en peces teleósteos. La conservación de moléculas envueltas

en la señalización de TLR sugiere que el programa básico de la regulación génica mediada por la

activación de los TLR es conservada entre especies de vertebrados (Purcell et al., 2006). Figura 4

se encuentra un esquema de la activación de los TLR en peces.

2.4 Prolactina

En todos los vertebrados PRL se produce en la glándula pituitaria como una prohormona

y el péptido señal N-terminal se escinde rápidamente después de la biosíntesis para producir la

hormona madura. Se ha informado la producción ectópica de PRL en varias especies de

teleósteos, lo que sugiere que también puede actuar como un factor paracrino en peces (Santos et

al., 1999). PRL circula en los vertebrados principalmente como un monómero y comprende un

polipéptido de cadena simple de entre 177 y 200 residuos de aminoácidos.

Las funciones principales de PRL en mamíferos se refiere con la lactancia y la

reproducción, sino que también influye en otros biológica procesos, incluyendo el crecimiento y

23

Figura 4: Esquema representativo de las moléculas de la señalización de TLR descubiertas

en peces. Algunos TLR y moléculas importantes en la señalización a cargo de los TLR con los

respectivos peces teleósteos en los que han sido descubiertos. En recuadrado rojo se señalan los

que se han descubierto en trucha (O. mykiss). Esquema de la Figura 3 de Rebl et al., 2010.

24

la diferenciación celular, la síntesis de proteínas y la respuesta inmune (Freeman et al, 2000;

Hovey et al, 2001; Grimm et al, 2002). Es la hormona más versátil en cuanto a su variedad de

acciones en los vertebrados, más de 300 actividades biológicas diferentes han sido atribuidas a

PRL, cifra que supera el total de todas las otras hormonas hipofisarias combinados. Debido al

gran número de actividades de PRL, éstas se han agrupado en 6 áreas: (1) equilibrio hídrico y

electrolítico, (2) crecimiento y el desarrollo, (3) endocrinología, (4) metabolismo, (5)

comportamiento y reproducción, e (6) inmunorregulación y protección. (Bole-Feysot et al., 1998;

Sakamoto et al., 2005).

Estudios evolutivos de genes y proteínas sugieren, basándose en la secuencia, estructura,

conservación de unión, y funcionales, que PRL pertenece a una familia de genes que incluye

hormona de crecimiento (GH), y somatolactina (SL) en teleósteos (Freeman et al., 2000). La

presencia de PRL en pituitarias de teleósteos fue claramente establecida en 1978 (Ensor, 1978) y

fue aislada por primera vez en peces teleósteos en 1983 a partir de la glándula pituitaria de

Oncorhynchus keta (Kawauchi et al., 1983), luego se logró aisladar de Oncorhynchus

tschwytscha (Prunet y Houdebine, 1984). En el salmón del Atlántico (S. salar), PRL fue

localizada por primera vez en 1971 (Aler G., 1971), varios años más tarde, en 1988 fue purificada

y caracterizada biológicamente (Andersen et al., 1988). PRL de S. salar tiene un tamaño

molecular de 23kDa y un largo de secuencia de 210 residuos de aminoácidos, donde los primeros

23 corresponden al péptido señal.

En los peces, varias funciones fisiológicas se han atribuido a PRL, tal como sinergismo

con la producción de hormonas esteroides en las gónadas (Ruiter et al., 1986), una dispersión de

pigmentos en los cromatóforos tegumentarias (Kitta et al., 1993), y la reproducción (Cavaco et

25

al., 2003). PRL también se conoce para mejorar las funciones inmunes en peces como en

mamíferos (Balm, 1997; Harris et al., 2000).

2.5 Piscirickettsia salmonis

La bacteria Piscirickettsia salmonis, es el agente etiológico causante de la Septicemia

Rickettsial Salmonidea (SRS) o Pisciricketsiosis. Esta es una infección bacteriana sistémica de

diferentes especies salmonideas. Afectando la acuicultura en la zona sur de Chile. Este

microorganismo es el responsable de una mortalidad anual cercana al 10% y causando pérdidas a

la industria chilena cercanas a los $100 millones de dólares (Rojas et al. 2008; McCarthy et al.,

2008).

Piscirickettsia salmonis, es una bacteria aerobia, Gram negativa, inmóvil, no encapsulada,

pleomorfa, predominando la forma cocoide con un diámetro entre 0,2 y 1,5 μm (Bravo y

Campos, 1989). ). Inicialmente se describió como un patógeno intracelular obligado, replicando

en vacuolas citoplasmáticas tanto in vivo como en líneas celulares derivadas de peces (Fryer y col

1990, Garcés y col 1991, Almendras y col 1997, Mauel y Miller 2002, McCarthy y col 2008).

Actualmente es considerado un patógeno intracelular facultativo (Fryer y Hedrick, 2003).

Durante el proceso infeccioso en peces y líneas celulares derivadas de estos organismos, P.

salmonis replica asociado a una envoltura membranosa en el interior de vacuolas citoplasmáticas

(Manuel y Miller, 2002; Fryer y Hedrick, 2003).

Los signos clínicos y mortalidad causados por Piscirickettsia salmonis se desarrollan

entre 6 y 12 semanas luego de que los salmónidos se encuentran en agua salada (Rojas et al.,

2009). La patología que presenta un individuo infectado es coloración obscura en la piel,

inapetencia, nado letárgico superficial y/o en el borde de las jaulas. Los peces que presentan una

infección leve no presentan signos externos. En especímenes de salmón Coho donde se ha

26

observado nado irregular, se ha aislado cepas de P. salmonis desde el cerebro de estos peces.

También algunos individuos pueden presentar lesiones en la piel que aparecen como pequeñas

manchas blancas que pueden progresar a ulceras (Fryer y Hedrick, 2003).

Algunos de los signos externos más consistentes observados durante una infección por P.

salmonis son decoloración de las branquias, como resultado de una anemia significativa.

Internamente, el daño es sistémico, donde los signos más comunes son inflamación y alteraciones

en la coloración en el riñón y bazo. Además pueden presentarse ascitis y hemorragias en tejido

adiposo visceral, estomago, vejiga natatoria y la musculatura corporal. El hígado de los peces

afectados (< 20%) es de color pálido y puede presentar una coloración crema, con nódulos

circulares opacos de 5-6 mm de diámetro (Fryer y Hedrick, 2003).

2.6 Relación TLR, P. salmonis y PRL

Chile, está posicionado como uno de los más importantes productores de salmones a nivel

mundial, siendo la exportación de salmones una de las industrias más importantes en el sur de

nuestro país. Sin embargo, estos cultivos se han visto afectados por diversos patógenos que han

mermado esta producción, por lo que el estudio de la inmunidad de los salmónidos frente a

patógenos es primordial, para así disminuir pérdidas económicas asociadas a la mortandad de

estas especies de cultivo.

Piscirickettsia salmonis es uno de los principales patógenos que afecta los cultivos de

salmón en Chile, SRS, ha sido hasta la fecha la principal causa de pérdidas en la etapa de engorda

del cultivo de las tres especies salmonídeas más importantes en Chile, en su aparición e impacto

coexisten una serie de factores propios del agente, de los mismos peces y de los sistemas de

cultivo a que están sometidas las especies (Leal et al., 2007).

27

Los patógenos son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR),

de éstos, los principales receptores involucrados en una infección bacteriana es la familia bien

caracterizada de receptores tipo Toll (TLR).

Los peces tienen muchas respuestas humorales específicas y no específicas además de

mecanismos celulares que resisten las enfermedades producidas por bacterias patógenas. Para

infectar al hospedero y multiplicarse en los tejidos, los patógenos bacterianos deben pasar o

evadir esta defensa (Ellis, 1999). P. salmonis es un patógeno bacteriano por lo tanto posee

distintos PAMPs que pueden ser reconocidos por diferentes TLR en trucha arcoiris. Al ser una

bacteria Gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas, lipoproteínas, peptidoglicano

(Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano, también se ha descrito que posee la proteína

flagelina (Wilhelm et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs pueden ser reconocidos por

distintos TLR como por ejemplo: TLR1 y 2 que reconocen proteínas de la pared bacteriana,

peptidoglicano y lipopéptidos acetilados; TLR3, 7, 8 y 9 reconocen ácidos nucleicos microbianos

(Boltaña et al., 2011); también pueden actuar algunos de los TLR específicos de peces como

TLR20, 21, y 22. Los TLR trabajan en conjunto en el reconocimiento de un patógeno, debido a

que un patógeno puede presentar más de un PAMPs que permita su reconocimiento, por lo tanto

las células pueden reconocer el patógeno por varios TLR simultáneamente (Underhill et al.,

2002).

En los mamíferos, hay evidencia que implica a PRL en la regulación de las respuestas

inmunes humoral y mediada por células (Russell et al., 1985; Pellegrini et al., 1992; Matera,

1996). PRL es una hormona que comparte muchas propiedades con citoquinas, es decir,

homología estructural del receptor, vía de transducción de señales similares, y la acción

inmunomoduladora (Kooijman et al., 1996; Yu-Lee et al., 2002), jugando un rol importante en la

28

modulación de la respuesta inmune en animales y humanos, este rol depende de la unión del

receptores de prolactina (rPRL) a receptores específicos expresados en la membrana de células

inmunitarias y células hematopoyéticas (De Bellis et al., 2005). Entre los receptores específicos,

secretados por la membrana de células inmunitarias, encontramos a la súper familia de

citoquinas, que incluye a los receptores para IL-2, 3, 4, 6, 7, 9, 12 y 15, por ultimo IFNγ (De

Bellis et al., 2005). De manera similar a las citoquinas, PRL y su receptor son ampliamente

expresado en las células del sistema inmune (Russell et al., 1985; Pellegrini et al.,1992). En

peces, se ha descrito a PRL capaz de aumentar la actividad fagocítica de macrófagos (Sakai et al.,

1996), estimular la producción de inmunoglobulinas (Yada et al., 1999), poseer efecto

mitogénico (Wang et al., 1996), producir anión superóxido e incrementar la producción de

lisozima en salmón (Paredes, 2008), además de aumentar de la actividad citotóxica en células

NCCs (Haussmann, 2011).

Por lo antes descrito, es importante el estudio de la interacción de diversas formas de

exposición de P. salmonis con los TLR, y al mismo tiempo evaluar el rol inmunoestimulador de

PRL, ya que puede llevar a una mejora en conocimiento y entendimiento de la función de los

TLRs en peces y sus especificidades frente a patógenos y de esta forma guiar al desarrollo de

inmunoestimulantes y vacunas para el control y prevención de enfermedades provocadas por

patógenos recurrentes en la industria salmonera.

29

Con los antecedentes antes descritos se plantea la siguiente hipótesis:

1.- “P. salmonis modula la expresión de los receptores tipo Toll: TLR1, TLR9 y TLR22

en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)”.

2.- “Prolactina tiene un efecto inmunoestimulante en cultivo primario de riñón anterior de

trucha arcoíris infectado con P. salmonis”.

Objetivo general:

1.- Evaluar la expresión de TLR1, TLR9 y TLR22 y la interacción de éstos con MyD88 e

IL-1β frente a infección con P. salmonis en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoiris.

2.- Determinar si PRL tiene un efecto inmunoestimulante en cultivo primario de riñón

anterior de trucha arcoíris, sobre la infección con P. salmonis.

Objetivos específicos:

1.- Verificar la expresión de mRNA de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos órganos de

trucha arcoiris.

2.- Analizar la expresión de mRNA de los receptores tipo Toll: TLR1, TLR9 y TLR22,

además de IL-1β y MyD88, en cultivo primario de riñón anterior sometido a infección con P.

salmonis cepa IBM-40 viva, IBM-40 inactivada y proteínas de IBM-40.

3.- Analizar y comparar la expresión de mRNA de estos TLRs en cultivo primario

sometido a infección con P. salmonis cepa LF-89 versus la cepa patógena, IBM-40.

4.- Evaluar el rol inmuno-estimulador de Prolactina, analizando la variación en la

expresión de mRNA de TLR1, TLR9, TLR22, IL-1β y MyD88 en cultivo primario de riñón

anterior estimulado previamente con PRL y sometido a infección con P. salmonis cepa IBM-40

viva.

30

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Materiales

3.1.1. Equipos e instrumentos

Agitador magnético Ika big-squid, Ikamäleon.

Agitador Orbital: Heidolph polymax 1040.

Autoclave Orthman.

Balanza: Sartorius TE4101.

Baño Termo-regulado: N-Biotec.

Cámara de electroforesis horizontal: Labnet Enduro.

Cámara de electroforesis: Biorad Mini-Protean III.

Cámara de Flujo Laminar: Nuaire NU425-400E.

Cámara de Transferencia: Labnet.

Centrifuga termorregulada, 2-16pk, Sigma

Centrifuga: Sigma 2-16 multigene.

Espectrofotómetro, Vision SP2001, AAHoeffer

Fuente de poder: Bio Rad Powerpac Universal Power Supply.

Fuente de poder: E0303, Enduro.

Incubador: Zhicheng ZSD 1270.

Microcentrifuga: D37520, Sigma.

Microondas: Somela Faney WT1700.

31

Micropipetas: Axygen, Labnet.

Microscopio confocal: Zeiss (Axiovert 100 M

Microscopio invertido: Olympus CKX41.

Microscopio: LW-Scientific I4 Series.

Microscopio: Olympus BKX41

Nanovue: General Electric.

pH metro WTW (pH 720): InoLab.

Propipeta fastpette v2, labnet.

Refrigerador, Consul 260

Shaker: Zhcheng, ZHWY-200B

Sistema desionizador de agua Cole Palmer

Sonicador: Cole Parmer

Termobloque: Accublock, Labnet

Termociclador en gradiente: Multigene, Labnet.

Termociclador para qPCR: MX 3000 y Mx 300, Stratagene.

Termociclador: Eppendorf Mastercycler personal, Eppendorf.

Transiluminador UV: Syngene, Ingenius.

Vortex: Brarnstead International.

32

3.1.2. Reactivos

Merck, Alemania Winkler, Chile Promega, USA

Aceite de Inmersión

Alcohol isoamílico

Acetato de sodio

Ácido acético

Ácido clorhídrico

β-Mercaptoetanol

Cloroformo

Etanol

Glicina

Isopropanol

Perhidrol

SDS

Hidróxido de Sodio

Cloruro de Potasio

Ácido bórico

Acrilamida:Bisacrilamida

Albumina de suero bovino

β-Mercaptoetanol

Chomezynski

Cloruro de sodio

Fosfato de Potasio

monobásico

Hidróxido de sodio

Metanol

Persulfato de amonio

Reactivo de Bradford

Sacarosa

Temed

Tween-20

GoTaq Flexi

M-MLV Transcriptasa

reversa

Nucleótidos (dNTPs)

Inhibidor de RNAsa

GoTaq qPCR Master

Thermo Scientific Rockland Hy Clone

Membrana de

nitrocelulosa

Anti-IgG de conejo

conjugado con peroxidasa

Medio Leibovitz L-15

Azul de tripan

33

G.E.Heathcare, USA Quigen Ambion

Percoll DNAeasy Blood &Tissue Agua DEPC

UsBio Sigma Fermentas, USA

Tris base

Ampicilina

L-cisteina

Acido Bórico

DAB

Glucosa

Inhibidor de proteasas

PMSF

Triton X-100

Marcador de peso

molecular para DNA

Marcador de peso

molecular para proteínas

Invitrogen, USA Arquimed Becton Dickinson

Syber-Safe

Tripsina 0,5%

Etanol Tinción de Gram

Lonza. Suiza Cell Signaling

Agarosa Buffer Ripa 10X

34

3.1.3. Soluciones

Medio suplementado: Medio L-15 Suplementado con 10 %, 5% y 2 % de suero bovino fetal.

PBS: NaCl 136.89 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 10.14 mM, KH2PO4 1.76 mM, pH 7.4.

Reactivo de Bradford: Azul de Coomassie G 0,01%; etanol 4,75%; ácido fosfórico 8,5%.

Ripa+: Tritón X100 10%; Inhibidor de proteasa Mix; RIPA; PMSF 100 μM.

Solución de bloqueo para Western blot: PBS 1X; BSA 1%; leche descremada 5%; Tween-

20 0,3%.

Solución de Chomczynski: Tiocianato de Guanidina 4 M; Citrato de Sodio 25 mM; N-lauril

sarcosina 0,5% p/v; autoclavado y posteriormente se agregó β-mercaptoetanol 0,1 M.

Solución de desteñido para geles de poliacrilamida: Metanol 30%, Ácido Acético 7%.

Solución de lavado, TNT: Tris–HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M; Tween 20 0,05%.

Solución de revelado: 40 mL de PBS; 30 μL de perhidrol 30% y 10 mg DAB.

Solución de teñido para geles de poliacrilamida: Azul de Coomassie R-250 0.3%, Metanol

50%, Ácido Acético 10%.

Tampón de carga SDS-PAGE: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 20% glicerol, 2% SDS, 5%

β-mercaptoetanol.

Tampón de corrida SDS-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1% SDS; pH 8,3.

Tampón de muestra (5X): Tris-HCl 0,3125 M, pH 6.8, SDS 10%, Sacarosa 50%, Azul de

bromofenol 0.010%.

Tampón de transferencia SDS-PAGE: Tris 25 mM, Glicina 193 mM, 0,1 % SDS, 20%

Metanol.

Tampón espaciador SDS-PAGE: Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 04% SDS.

35

Tampón SB (25x): 10 mM NaOH, ajustando pH 8.2 con ácido bórico.

Tampón separador SDS-PAGE: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 0,4% SDS.

3.1.4. kit de reactivos

GoTaq® qPCR Master Mix, Promega (USA)..

LightCycler® FastStart DNA Marter SYBR Green I, Roche (USA).

Wizard® Genomic DNA Purification, Promega (USA).

3.1.5. Material Biológico

El microorganismo patógeno intracelular facultativo Piscirickettsia salmonis cepa LF-89

y cepa IBM-40, además, línea celular derivada de leucocitos de riñón anterior de Salmo salar,

SHK-1.

3.1.6. Animales de experimentación

Se utilizaron truchas arcoíris de 0,2 kg aproximadamente provenientes de una piscicultura

artesanal de la ribera de Punucapa, en la periferia de la ciudad de Valdivia.

36

3.2 Métodos

3.2.1. Extracción de órganos

Los peces fueron anestesiados disolviendo BZ-20 en el agua donde se sumergieron los

peces, y fueron sacrificados por decapitación, se cortaron en forma sagital para visualizar los

distintos órganos de interés: corazón, bazo, intestino, hígado y músculo esquelético, luego se

cortó en forma longitudinal para dejar expuesto el riñón y extraer: riñón anterior, riñón medio,

riñón posterior, finalmente se extrajo: cerebro, branquias y ojo. Los órganos fueron almacenados

a -80 °C para la posterior extracción de RNA. En el caso de requerirse el órgano para cultivo

primario, este fue procesado inmediatamente luego de la extracción.

3.2.2 Extracción de RNA total de distintos órganos de O. mykiss

Las muestras de tejido (1 g), se homogeneizaron en hielo, agregando 1000 μL de solución

de Chomczynski (Chomczynski & Sacchi, 1987) utilizando un potter. Se dejaron en reposo por

5min a temperatura ambiente, se adicionó a cada tubo 200 μL de cloroformo: alcohol isoamílico

24:1, la mezcla se agitó por inversión del tubo y posteriormente se centrifugó a 12.000 xg a 4ºC

durante 15 min. Una vez finalizada la centrifugación, se transfirió la fase acuosa (conteniendo el

RNA) a un tubo estéril de 1,5 mL al cual se agregó 500 μL de isopropanol frío y se dejó

precipitando toda la noche a -20ºC.

Al día siguiente, el RNA precipitado se recuperó centrifugando a 16.600 xg por 13 min a

4ºC, se eliminó el sobrenadante, se lavó el sedimento con 200 uL etanol 70% frio, se secó al aire.

Finalmente se resuspendió el precipitado en 100 μL de agua ultra pura con pipeteo suave. Al

precipitado de RNA proviene de hígado, previo a la resuspensión en agua, se propició la

eliminación de glicógeno re-suspendiendo la muestra en 400 uL de LiCl 4 M, luego se almacenó

37

a -20°C durante 4 horas y se precipitó el RNA por centrifugación a 10.000 xg por 30 minutos a

4°C, se descartó el sobrenadante se lavó el sedimento y se resuspendió con agua como se

mencionó anteriormente. Finalmente, las muestras fueron cuantificadas para ser procesadas de

inmediato.

3.2.2.1 Cuantificación y evaluación de pureza del RNA

La concentración del RNA se estimó por espectrofotometría, midiendo la absorbancia de

las muestras a 260 nm utilizando el equipo NanoVue, y luego se calculó la concentración

utilizando la relación 1 OD = 40 μg/mL (Sambrook y Russel, 2001). La pureza del RNA obtenido

se estimó calculando la razón 260nm/280nm para la determinar contaminación por proteínas, y la

razón 260nm/230nm para la contaminación por compuestos fenólicos.

3.2.3 Transcripción reversa

De los RNA recién extraídos, se seleccionó aquellos cuya razón 260nm/280nm era

superior a 1,8. La transcripción reversa se realizó en un volumen total de 20 μL, con la M-MLV

Reverse Transcriptase (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Sambrook et al.,

1989). Primero se mezclaron 1,6 μL (40 μM) de oligo-dT; 1 μL 10 mM mix dNTP; 3 μg de RNA

total y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 14,9 μL. La mezcla se incubó por 10

minutos a 60ºC, para luego enfriarla directamente en hielo previniendo así la formación de

estructuras secundarias. Paso seguido se le adicionó la segunda mezcla comprendida de 100

Unidades de transcriptasa reversa, 4 μL del tampón de la transcriptasa reversa 5X, 6 Unidades de

inhibidor de RNasa, incubándose 60 min a 42ºC seguido de 10 min a 60ºC. Los cDNA fueron

almacenados a -20°C.

38

3.2.4 Diseño de partidores

Basado en las secuencias nucleotídicas de TLR1, TLR22, TLR9, MyD88, IL-1β, EF-1α y

Phox-47 presentes en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology

Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para O. mykiss, se diseñó partidores para cada uno de

los genes antes mencionados, con el uso del programa Geneious y OligoAnalyser (Tabla III).

3.2.5. Amplificación de segmentos del cDNA de los genes en estudio

Las reacciones de PCR se realizaron usando como templado cDNA de los distintos

órganos de trucha, sintetizado como se describe en transcripción reversa (3.2.3). La reacción se

realizó en un volumen de total de 25 μL, conteniendo 0,5 unidades de Taq DNA polimerasa; 5 µL

de Green GoTaq® Reaction Buffer 5 X; 2 mM de MgCl2; 0,1 mM de cada dNTP; 0,5 µL de cada

oligonucleótido sentido y antisentido (25 μM) y agua estéril DEPC para completar el volumen

final (25 μL). La mezcla fue incubada en el termociclador, se utilizó el siguiente programa:

Ciclo Temperatura Tiempo N° de ciclos

Desnaturalización

inicial 94ºC 5 minutos 1

Desnaturalización 94ºC 30 segundos

Alineamiento 58ºC 30 segundos 35

Extensión 72ºC 30 segundos

Extensión final 72ºC 5 minutos 1

El montaje del análisis RT-qPCR de múltiples genes implicaba optimizarlos para una

misma temperatura de apareamiento y así analizarlos en paralelo en la misma placa en el

termociclador de tiempo real.

39

Tabla III: Partidores utilizados para RT-qPCR, producto esperado y referencia.

TLR1 qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

TLR1F AAG GGC AGT CAA CAC CAC AC 122 NM_001166101

TLR1R CCA CGT CTG AAG TGC TCA GG 122 NM_001166101

TLR9 qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

tTLR9-F TGG TGT TCA CTG CCT TAC CC 123 NM_001129991

tTLR9-R GAC TCT GGA AGT TTG CCC CA 123 NM_001129991

TLR22 qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

TLR22F CCA CAA CAG GCT TTC TTC CG 110 NM_001124412

TLR22R TGG AGA AAT CTG AGC AGC CC 110 NM_001124412

MyD88qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

tMyD88-F GTT CCT GAC GGT GTG TGA CT 123 NM_001124421

tMyD88-R CCT GTG CTG ATT GGT TGC TG 123 NM_001124421

IL-1β qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

tIL-1B-F CTG AAG CCA GAC CTG TAG CC 112 NM_001124347

tIL-1B-R TGA TCC TTG TCC GCA ACC TC 112 NM_001124347

EF1-α qPCR

Nombre Secuencia Producto esperado (pb) Referencia

tEF1aF CTG AAG GCC GGT ATG ATC GT 110 NM_001124339

tEF1aR GCC ATG CCT GGT GAC AAT GT 110 NM_001124339

40

3.2.6 Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa

Para los fragmentos en estudio, que están en el rango menor a 500 pb, se utilizó un gel al

1 % (p/v) de agarosa (Sambrook et al., 1989). Los geles se prepararon fundiendo la agarosa

necesaria en buffer SB 1X (Brody, et al., 2004), se enfrió a temperatura ambiente hasta alcanzar

50°C, se agregó 15 μL de SybrSafe 1x que intercala las bases nitrogenadas y lo hace brillar bajo

luz UV, y así lograr visualizar las moléculas de DNA. Las muestras se cargaron directamente, ya

que el tampón de la reacción de PCR de Promega contiene el tampón de carga. En un gel de 8 cm

de largo se realizó la corrida electroforética a 90V constante y amperaje variable. Una vez

finalizada la corrida, el gel fue expuesto a luz ultravioleta en el transiluminador para visualizar

los productos de PCR y se capturó la imagen digitalizada con una cámara para documentar el

avance electroforético de los fragmentos del DNA.

Para el análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88, la imagen

digitalizada del fraccionamiento de los productos de PCR, fue evaluada de acuerdo a la

intensidad de los pixeles de las bandas utilizando el programa ImageJ.

3.2.7 Siembra de células SHK-1

Para los ensayos de actividad de prolactina como para la propagación de P. salmonis se

trabajó con la línea celular SHK-1 proveniente de salmón.

Se mantuvo un stock de células SHK-1 a 20°C en botellas de cultivo de 175 cm² con

medio de cultivo L-15 10% SBF, pensando que en confluencia una botella de 175 cm² se pueden

encontrar 7x10⁶ células. Luego de tener el stock necesario de células para el ensayo de actividad

de PRL como para propagar P. salmonis, se tripsinizan las células stock, y se cuentan para

sembrar 1x10⁶ células en botellas de cultivo de 25 cm².

41

3.2.7.1 Cuantificación de las células SHK-1

Las células fueron soltadas de la botella utilizando tripsina 1 X, la que fue neutralizada

con medio de cultivo en una proporción volumen/volumen. Una vez sueltas las células se

recolectaron para proceder a su cuantificación. Para poder visualizar las células y su viabilidad se

utilizó azul de tripan en una dilución 1:4 y para su cuantificación se utilizó la cámara de

Neubauer. Se contaron las células que se encuentran en 5 cuadrados del cuadrante central de la

cámara y en ambos lados de ésta. Luego se precedió a utilizar la siguiente fórmula que permite

cuantificar las células:

N° de células contadas x dilución x 1000 = X células/mL

Se calculó el volumen a agregar, que contenga 1x106 células, a cada botella de 25 cm², se

agregó medio de cultivo L-15 10% SBF y se almacenaron a 20°C.

3.2.8 Cultivo de P. salmonis

Piscirickettsia salmonis es el agente etiológico del síndrome ricketssial salmonídeo

(SRS), causante de una agresiva infección sistémica en especies salmonídeas de varias partes del

mundo (Bravo y Campos 1989; Rojas et al., 2009), siendo Chile uno de los países más afectados

donde ha causado importantes pérdidas económicas para la industria salmonera (McCarthy et al.,

2008). La cepa LF-89 es la de referencia, aislada en el sur de Chile en el año 1989 desde cultivos

de salmón coho afectados por altas mortalidades (Bravo y Campos, 1989), se encuentra

depositada en la American Type Culture Collection (ATCC), registrada como VR-1361 y

corresponde al primer aislado de P. salmonis. LF-89 es sensible a un amplio rango de

antibióticos, excepto a penicilina G (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). Pertenece al

genogrupo II, según la genotipificación realizada por el proyecto INOVA IBM-259. Tarda

alrededor de 7 días en provocar efecto citopático en la línea celular SHK-1.

42

En una tesis en curso se ha hecho un análisis bioinformático de distintas cepas estudiadas

por el proyecto INOVA IBM-259, la información obtenida indica que IBM-40 posee el mayor

número de islas de patogenicidad. La cepa IBM-40, es una cepa de campo aislada en el sur de

Chile. Se determinó, en función de LF-89, que IBM-40 posee 28 islas y mediante BLAST a 3 de

éstas se puede ver que IBM-40 es la que posee el menor porcentaje de cada isla y que el

porcentaje que ella tiene es diferente al que poseen todas las demás cepas (Lagos, 2013). Si a la

información anterior le sumamos que tarda tan solo 3 días en provocar efecto citopático en SHK-

1, se puede decir que es una cepa altamente patogénica.

Para realizar las cinéticas se utilizó P. salmonis cepa IBM-40 y cepa LF-89. Para ello se

descongeló una alícuota de células IBM-40 almacenadas a -80°C. La alícuota se descongeló

rápidamente en la mano, de inmediato se centrifugó a 5.000 xg por 7 minutos, y se eliminó el

sobrenadante. Luego se lavaron las células, para ello se agregó 500µL de medio L-15 10% SBF,

resuspendiéndolo cuidadosamente, posteriormente, se centrifugaron a 4000 xg por 10 min y se

eliminó el sobrenadante. Nuevamente se resuspedió cuidadosamente en 500µL de medio L-15

10% SBF y con esta suspensión bacteriana se infectó una botella de 25 cm² que contenía la línea

celular SHK-1, la botella se incubó a 20°C por 5 días.

Para infectar línea celular SHK-1 con P. salmonis, previamente se sincronizaron las

células en L-15 2% SBF durante 48 h, esto aumenta la proporción de células que se infectan y

disminuye la velocidad de replicación de la línea celular.

Luego de los 5 días, P. salmonis provocó un efecto citopático en las células infectadas y

las bacterias se liberaron al medio de cultivo, se tomó 100 μL, 150 μL y 200 μL del medio y se

mezcló con 7 mL de medio de cultivo líquido, CASO suplementado (Vera et al., 2012), en 3

43

tubos de 15 mL distintos. Los tubos fueron almacenados en un incubador shaker protegido de la

luz a 18°C durante 3 días a 150 rpm.

3.2.8.1 Cuantificación de P. salmonis por el método de Mc Farland

Luego de 3 días, las bacterias fueron cuantificadas por turbidimetría, tomando una

alícuota de 1 mL de cada tubo, se midió el DO a 600 nm, utilizando como blanco el medio CASO

suplementado y se aplicó la fórmula de Mc. Farland:

DO600 nm 0,132 1.5x108 CFU/ml

DO600 nm muestra X CFU/ml

3.2.8.2 Verificación de P. salmonis

De las alícuotas tomadas para cuantificar la bacteria, se tomaron los tubos Eppendorf con

el volumen restante, se centrifugaron a 4.000 xg durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y

el precipitado de bacterias fue resuspendido con PBS 1X para realizar la tinción de Gram, se

corroboró que sean cocos Gram negativos según la clásica tinción de Cristal Violeta, lugol, y

safranina.

Además, se tomó otra alícuota para extraer DNA genómico según el kit Wizard de

Promega, y luego se verificó mediante PCR confirmatorio según Mauel (Mauel et al., 1996). Los

productos del PCR se resolvieron en una corrida electroforética y se visualizaron con luz UV para

corroborar que eran del tamaño deseado.

3.2.9. Extracción de proteínas totales de P. salmonis IBM-40 .

Se tomó uno de los tubos con P. salmonis en medio líquido en fase exponencial de

crecimiento y se centrifugó a 4.000 xg por 10 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante, el

44

sedimento se lavó dos veces con PBS 1 X, luego el sedimento se resuspendió en 100 µL de

RIPA+, se incubó por 20 minutos en hielo, luego se sonicó 3 veces por 5s a potencia 25%, se

mantuvo la muestra en hielo entre cada pulso, después se centrifugó a 4000 xg por 10 minutos a

4°C, finalmente se recuperó el sobrenadante y se cuantificó por el método de Bradford (Bradford,

1976). Para la cinética, la infección se realizó con 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40.

3.2.9.1 Cuantificación de proteínas

Basado en el método de Bradford se fabricó una curva de calibración entre 1 a 20 μg de

proteínas por mL de reactivo, utilizando BSA en agua destilada como estándar. Transcurridos 10

minutos, se realizó la lectura en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Para

determinar la concentración de proteínas de las muestras se tomaron alícuotas de 5μL de cada una

en dilución determinada y se le agregó 1 mL de reactivo de Bradford. Luego de 10 minutos, su

absorbancia fue leída de igual manera que la curva de calibración. Todas las lecturas se realizaron

contra blanco de agua destilada más el reactivo. El valor de la muestra se obtuvo interpolando su

valor de absorbancia en la curva de calibración.

3.2.10 Inactivación de P. salmonis IBM-40

La inactivación de la cepa IBM-40 se realizó por calor, intentando alterar lo menos

posible la estructura externa de la bacteria, para ello se realizó una gradiente de inactivación a

distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10 minutos.

Se repicaron 7 tubos estériles de 15mL con 7mL de medio Caso suplementado más 150uL

de IBM-40 en fase exponencial de crecimiento, se incubaron a 18°C durante 2 días, pasado este

tiempo, bajo campana de flujo, se tomó una alícuota de 1mL de cada tubo para cuantificar

suspensión bacteriana por turbidimetría, además, se realizó la tinción de Gram confirmatoria. De

45

inmediato, cada tubo fue incubado durante 10min a 200 rpm a una temperatura distinta, luego se

incubó nuevamente a 18°C por 24 horas más. El tubo control se mantuvo siempre a 18°C.

Pasadas 17 horas, se midió nuevamente la DO a 600nm para cuantificar el crecimiento

bacteriano, y se realizó una nueva tinción de Gram a cada muestra para observar y comparar la

estructura de los cocos Gram negativos respecto al control.

3.2.11 Estandarización de Prolactina

La prolactina de salmón utilizada en esta tesis fue purificada según el protocolo descrito

por Andersen et al. (1988), con algunas modificaciones (Olavarría et al., 2010), a partir de

glándulas pituitarias de peces adultos almacenadas a -80°C, procedentes del stock del Laboratorio

de Biología Molecular de Peces. El protocolo consta de múltiples etapas, las cuales incluyen una

extracción ácida, una cromatografía de filtración en gel y una cromatografía de intercambio

iónico.

Para este tesis se entregó el producto final de este protocolo, por lo tanto, se debió

cuantificar y confirmar la presencia y pureza de la hormona, además de realizar un ensayo de

actividad. La muestra fue cuantificada según 3.2.9.1, basado en el método de Bradford.

3.2.11.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Se preparó un gel con sistema de tampón discontinuo en condiciones denaturantes

(Laemmli, 1970). Las dimensiones del gel fueron 95 x 100 x 0,75mm, organizados entre dos

placas de vidrio. El gel separador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una

concentración final de 15%, tamponado con Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 y SDS 0,4%. El gel

espaciador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una concentración final de 4%,

tamponado con Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 y SDS 0,4%. Ambos geles fueron polimerizados con

46

persulfato de aminio 0,05% (p/v) y TEMED 0,15% (p/v) de concentración final. Las muestras

con tampón de muestra fueron denaturadas en termociclador por 3 minutos a 95°C, para

posteriormente ser cargadas en los pocillos del gel. Una vez que el sistema fue montado e

inmerso en tampón de corrida se le aplicó una corriente de 70 Volt por 20 minutos y luego 120

Volt por 2 horas. Terminada la corrida electroforética, la mitad del gel se tiñó durante toda la

noche, con el fin de visualizar las proteínas. Para eliminar el exceso de colorante se sumergió en

agua destilada y se calentó en el microondas durante aproximadamente 5 minutos a potencia

media.

3.2.11.2 Western blot confirmatorio de Prolactina

Luego de realizada la electroforesis, se procedió a realizar la electro-transferencia a una

membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia con 20% de metanol, aplicando una

corriente de 50mA por 10 horas. Posteriormente se tomó la membrana y se bloqueó los sitios

inespecíficos con solución de bloqueo para western blot, por una hora a temperatura ambiente.

Luego, se incubó durante una noche con el anticuerpo primario, anti prolactina de salmón hecho

en conejo (Tesis de María Soto, 2013), a una dilución de 1:4000 en solución de bloqueo. Luego

se realizaron 3 lavados con TNT cada uno de 5 minutos y agitación suave. Se incubó por 1 hora

con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa, a una dilución de

1:2000. Se realizaron 3 lavados con TNT por 5 minutos con agitación suave. Para el revelado de

la membrana, se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando a los 5 minutos de

reacción 15 µL más de perhidrol. La reacción se detuvo sumergiendo la membrana en agua

destilada.

47

3.2.11.3 Ensayo de actividad de prolactina

Para probar si la prolactina en stock poseía actividad estimulando el sistema inmune, se

realizó una estimulación a células SHK-1. Se sembraron 250.000 células por pocillo en placas de

6, se dejaron durante 12 horas con medio L-15 sin suplementar a 20°C. Luego, se eliminó el

medio y se cambió por L-15 5% SBF y se estimuló con 3 dosis distintas de PRL: 250, 500 y

1.000 ng/mL, se prepararon diluciones a partir del stock de PRL de 1,2μg/μL, así todos los

pocillos fueron estimulados con igual volumen (50μL). A los pocillos control se le adicionó 50μL

del vehículo, PBS 1X. Pasadas 16 h de la estimulación, se recolectaron las células y se

centrifugación a 16.000 xg durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de

células fue almacenado a -80°C hasta la extracción RNA y síntesis de cDNA, tal como se

describe en la sección 3.2.12.6.

Finalmente la actividad de prolactina se midió mediante RT-qPCR, analizando la

expresión de IL-1β y graficando como se describe en 3.2.12.7.

3.2.12 Ensayos de cinéticas de expresión de TLR1, TLR22 y TLR9 en cultivo

primario

Las cinéticas se realizaron en 4 tiempos: 3, 6, 12 y 24 horas. Los estímulos fueron:

infección con IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor y proteínas totales de IBM-

40. Además, se realizó una cinética con prolactina y prolactina más IBM-40 viva.

3.2.12.1 Cultivo primario y purificación de leucocitos de riñón anterior de trucha

Se extrajo el riñón anterior por disección longitudinal del pez. El órgano se depositó en

placa Petri con medio L-15 suplementado con 2% suero bovino fetal. Trozos del órgano se

depositaron una malla de 70μm puesta en un tubo Falcon con 2 mL de L-15 suplementado, el

48

órgano se disgregó con la ayuda de un vástago de jeringa previamente autoclavado, una vez

disgregado el tejido en su totalidad, el tubo con las células se centrifugó a 600 xg por 10 min a

4ºC, luego se eliminó el sobrenadante y se resuspendió suavemente las células en 15 mL medio

L-15 al 2% SBF.

Con el propósito de separar y recuperar leucocitos renales se preparó un gradiente

continuo de Percoll al 60 %, se depositó 3 mL de Percoll en el fondo de 8 tubos Falcon de 15 mL,

y se cargó en cada Percoll aproximadamente 1,8 mL de suspensión celular utilizando pipeta

Pasteur y cuidando de no dañar el gradiente. Los tubos se centrifugaron a 700xg por 60 min a

20ºC. Luego de la centrifugación, se procedió a la recuperación del anillo leucocitos, aspirando

con pipeta Pasteur un volumen aproximado de 1 mL correspondiente a la línea blanca,

depositando todos los anillos en un mismo tubo de 15 mL. Posteriormente se centrifugó a 400 xg

por 10 min a 4°C. Se desechó el sobrenadante y se repitió el lavado 2 veces más. Finalmente las

células fueron resupendidas en 3 mL L-15 2% SBF, se tomó una alícuota de 50 μL de la

suspensión celular y se depositó en un tubo Eppendorf para su conteo. Las células se mantuvieron

a 4°C por algunos minutos hasta su utilización.

3.2.12.2 Conteo y evaluación de células

Se contaron las células y se estimó el porcentaje de viabilidad utilizando en cámara de

Neubauer. Para ello, se prepararon diluciones (1:10 v/v) de la alícuota de suspensión celular, las

diluciones se mezclaron con azul de Tripan en PBS al 0,04% de concentración final. Se depositó

15μL de la mezcla sobre la cámara y se contabilizó células viables y no viables. Se utilizó un

criterio de 95% de viabilidad para la utilización de las células en las cinéticas de expresión. Las

suspensiones se ajustaron a 1x10⁶ cel/mL para su uso.

49

3.2.12.3 Cinéticas de expresión .

Para los ensayos de cinética se sembraron 1x10⁶ células por pocillo, con un n=3 en placas

de 6 pocillos, cada placa tenía sus células estimuladas y respectivos controles para cada punto.

Las células de cabeza de riñón, previamente contadas y sembradas, se dejaron asentando por 2

horas en incubador a 18°C, para luego ser infectadas y/o estimuladas.

3.2.12.4 Infección con P. salmonis

La infección se realizó utilizando la proporción de 50 bacterias por célula para el caso de

la cepa tipo, LF-89, y con 25 bacterias por células para la cepa patógena IBM-40, tanto viva

como inactivada. Por lo tanto, la infección se realizó con 50x10⁶ y 25x10⁶ bacterias por pocillo,

las bacterias fueron resuspendidas en PBS 1X y se ajustó la dosis infectante a un volumen de

50μL, a los pocillos control se les adicionó únicamente 50 μL de PBS 1 X autoclavado.

En la cinética con proteínas totales de IBM-40, la infección se realizó con 10 µg de

proteínas por mL de medio de cultivo.

3.2.12.5 Estimulación con prolactina

Las células de cabeza de riñón ya sembradas se dejaron asentando por 2 horas en

incubador a 18°C conteniendo 500 ng/mL de PRL. Pasado este tiempo se estimuló con 25x10⁶

IBM-40 vivas en 50 μL de PBS 1 X, y los controles solo con el vehículo.

3.2.12.6 Recolección de los puntos de la cinética y extracción de RNA

Transcurrido los tiempos de las cinéticas, las células de cada punto fueron recolectadas en

un Eppendorf de 2 mL y centrifugadas a 16.600 xg durante 10 minutos a 4°C, lavadas con

50

PBS1X autoclavado y centrifugadas nuevamente a 16.600xg por 10 min a 4°C, luego se eliminó

el sobrenadante y el sedimento de células fue almacenado a -80°C hasta la extracción de RNA.

El RNA fue extraído como se describe en la sección 3.2.2 con algunas modificaciones, los

volúmenes utilizados fueron disminuidos a un quinto, o sea, se utilizaron solo 200 μL de solución

de Chomczynski y 40 μL de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1. La fase acuosa que contiene el

RNA fue precipitada adicionando 200 μL de una mezcla de glicógeno 50 μg/mL + acetato de

amonio 0,5 M en isopropanol frío y se dejó precipitando toda la noche a -20ºC.

Al día siguiente, se centrifugó y lavó el RNA, luego se dejó secar a aire. Finalmente, se

resuspendió el precipitado en 40 μL de agua ultra pura con pipeteo suave. Las muestras fueron

cuantificadas según la sección 3.2.2.1 para luego ser utilizadas de inmediato en la síntesis de

cDNA como se describe en 3.2.3.

3.2.12.7 Cuantificación de la expresión génica de las cinéticas mediante RT-qPCR

Para analizar la expresión de los receptores: TLR1, TLR22, TLR9, también MyD88 e IL-1ß, se

utilizó el kit GoTaq® qPCR Master Mix, de acuerdo a las instrucciones del proveedor, en un

termociclador de tiempo real Mx3000 y Mx3005 (Stratagene). El equipo se programó con los

siguientes ciclos: denaturación inicial a 95ºC por 10 min, 45 ciclos de 94ºC por 20 s, 63ºC por 10

s y 72ºC por 20 s. Además se agregó en cada corrida un paso para elaborar la curva de

disociación, con 95ºC por 20s, 63ºC por 10s y 95ºC por 1s. La fluorescencia fue medida al final

de cada uno de los 45 ciclos y durante la última rampla de aumento de temperatura para la

elaboración de la curva de disociación. Se utilizó EF-1α como gen normalizador. Cada

cuantificación se realizó por triplicado. La línea base para el cálculo del ciclo umbral (ct) de cada

muestra fue calculada por el programa MxPRO (Stratagene) utilizando un algoritmo LMS (Least-

Mean-Square algorithm) y el mismo programa entregó los datos de ct. La cuantificación relativa

51

se hizo según la fórmula del "ΔΔct" (Pfaffl, 2001) y se graficaron los datos y se les realizó la

prueba estadística T de Student, usando el programa Sigmaplot 10.0, seleccionando los p<0.01

como altamente significativo (**) y p<0.05 como significativo (*).

52

4. RESULTADOS

4.1. Análisis semi-cuantificación de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en

distintos órganos de trucha arcoíris

Se diseñaron partidores homólogos a partir de las secuencias disponibles en la base de

datos para los mensajeros de TLR1, TLR22, MyD88y EF1-α. Se realizaron ensayos de RT-PCR

utilizando como templado cDNA de riñón anterior y bazo probando distintas temperaturas de

apareamiento para estandarizar los juegos de partidores, así, se optimizaron las condiciones

térmicas para la amplificación de los productos esperados de 122, 122, 123 y 110pb

respectivamente, a una temperatura de 61°C.

Posteriormente, se realizaron ensayos de RT-PCR para TLR1, TLR22, MyD88y EF1-α,

utilizando como templado cDNA de riñón anterior y bazo obtenidos de truchas sanas. Los

productos fueron fraccionados en un gel de agarosa (Figura 5: A, B, C y D) y luego evaluados de

acuerdo a la intensidad de los pixeles de las bandas; dichas intensidades permitieron obtener

valores de expresión relativa para cada órgano estudiado respecto a la intensidad de los pixeles de

las bandas del normalizar EF1-α. Con los valores de intensidad se logró elaborar una gráfica con

los niveles de expresión relativa de los receptores en cada órgano (Figura 5E). Se aprecia

expresión de TLR1 y TLR22 en todos los órganos analizados, preferentemente se detectó altos

niveles de mensajero en bazo y riñón anterior, mientras que, cerebro mostró la expresión más

baja de estos receptores. Sorprendentemente, en órganos incluidos como controles negativos,

como corazón, se observó una expresión comparable con branquias pero menor que en órganos

involucrados en la respuesta inmune. El mensajero de la proteína adaptadora MyD88 se expresa

53

h

Figura 5: Análisis de expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos órganos de O.

mykiss: A) Productos de PCR fraccionados en gel de agarosa al 1%, producto esperado para

TLR1 de 122pb, B) para TLR22 110pb, C) para MyD88123pb y D) para EF1-α 110pb. En todos

los geles de observa en 1: bazo, 2: músculo, 3: corazón, 4: branquias, 5: intestino, 6: riñón

anterior, 7: riñón medio, 8: riñón posterior, 9: cerebro, 10: hígado y 11 control de reacción sin

cDNA templado. E) Cuantificación relativa de TLR1, TLR22 y MyD88, se realizó una

cuantificación de las intensidades de las bandas en base a EF1-α. En negro se observa la

expresión relativa del gen TLR1, en gris TLR22 y en blanco MyD88. Como estándar se utilizó

DNA ladder de 100pb.

54

en todos los órganos estudiados, prevaleciendo en riñón, siendo incluso mayor que la expresión

de los TLR en éste órgano. Además, se observa una alta expresión de MyD88en bazo,

comparable con TLR22 pero inferior a TLR1, la expresión más baja se observa en músculo.

4.2 Evaluación de Prolactina purificada de purificada de pituitaria de salmón

Se debió cuantificar proteínas en el producto final de una purificación de proteínas a partir

de pituitaria de salmón, confirmar la presencia y pureza de la hormona prolactina, además de

realizar un ensayo de actividad. La muestra fue cuantificada según método de Bradford y la

concentración obtenida fue 1,2 µg/mL de proteína contenida en la solución.

4.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot confirmatorio

Para confirmar la presencia y la pureza de prolactina, se cargó en un gel de poliacrilamida

al 15% dos concentraciones distintas de la proteína purificada, 1 y 5 µg totales. La membrana de

nitrocelulosa, obtenida de la electrotransferencia, se incubó con el anticuerpo anti PRL de salmón

a una dilución de 1:4000, obteniéndose una única banda de masa de 23 kDa (Figura 6).

4.2.2 Ensayo de actividad de prolactina

Para comprobar la actividad biológica de prolactina en el sistema inmune, se realizó un

ensayo de estimulaciónde la expresión de IL-1β en células SHK-1. Para ello, se sembraron

250.000 células con medio L-15 sin suplementar y se dejaron durante 12 horas a 20°C. Luego, se

eliminó el medio y se cambió por L-15 al 5% SBF y se estimuló con 3 dosis distintas de PRL:

250, 500 y 1.000 ng/mL. Pasadas 16 h post estimulación, se recolectaron las células, se

centrifugaron y el pellet de células fue almacenado a -80°C hasta la extracción RNA y síntesis de

cDNA. Finalmente, la actividad de prolactina se obtuvo mediante RT-qPCR, midiendo la

55

Figura 6: Western blot confirmatorio para prolactina. La electrotransferencia se efectuó a

partir de un gel SDS-PAGE al 15% y se detectó una banda de 23kDa a una dilución de 1:4000 del

anticuerpo anti-PRL de salmón. Carril 1: 5 µg de proteínas totales. Se incluye además un estándar

preteñido y sus correspondientes valores de a la izquierda.

56

expresión del mensajero de IL-1β y graficando su expresión respecto al gen constitutivo EF1-α de

salmón (Figura 7 C).

Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen de Salmo salar en estudio

son: EF1-α 87,5°C e IL-1β 84°C (Figura 7, A y B).

En el gráfico de la figura 7C se observa que el nivel de expresión de IL-1β aumenta

significativamente únicamente con la dosis de 500ng/mL de prolactina.

4.3 Inactivación P. salmonis cepa IBM-40

Con el fin de alterar lo menos posible la estructura externa de la bacteria, se realizó una

gradiente de inactivación a distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10

minutos, luego se dejaron a 18°C durante 17 h. Pasado este tiempo se midió por turbidimetría si

había crecimiento bacteriano, para ello se restó el valor de OD a 600nm de las muestras justo

antes de la inactivación. Además, se realizó tinción de Gram a cada muestra para observar y

comparar la estructura respecto al control.

En la Figura 8 se observa que el crecimiento de la solución bacteriana disminuye con

todas las temperaturas, pero es 45°C la temperatura más baja a la cual se inhibe por completo el

crecimiento, además, las tinciones de Gram muestran integridad de la forma cocoide de la

bacteria en todas las temperaturas de inactivación (Datos no mostrados). Por lo tanto, la

temperatura utilizada para la cinética de estimulación con IBM-40 inactivada es de 45°C.

57

Figura 7: Evaluación de actividad de prolactina. En A) y B) se muestra las curvas de

disociación de EF1-α e IL-1β respectivamente. En C) se muestra el gráfico de expresión de IL-1β

en células SHK-1 estimuladas con distintas dosis de prolactina respecto al control sin estimular,

utilizando como gen normalizador EF1-α.

58

Figura 8: Curva de inactivación de IBM-40 a distintas temperaturas. En el eje X se muestran

las distintas temperaturas de inactivación, como control (en verde) se muestra el valor de OD a

600nm para una muestra sin inactivar, incubada a 18°C. En el eje Y, los valores de OD 600nm

pasadas 17 horas post inactivación por calor. Con rojo se destaca la menor temperatura a la cual

se logra una completa inactivación.

59

4.4 Cinéticas de expresión

Para evaluar la expresión de los receptores TLR1, TLR22 y TLR9 frente a la infección

causada por Piscirickettsia salmonis se realizaron cinéticas a 4 tiempos: 3, 6, 12 y 24 horas. Los

estímulos fueron: infección con las cepas IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor

y proteínas totales de IBM-40. Además, se realizó una cinética con prolactina y prolactina más

IBM-40 viva. De esta manera, se pudo evaluar la expresión de los distintos genes en estudio

frente a los mismos patrones moleculares expuestos de maneras distintas. Junto con analizar los

receptores en estudio, se evaluó la proteína MyD88 y la citoquina IL-1β, ambos involucrados en

la respuesta inmune del pez frente a una infección bacteriana.

Las distintas cinéticas se realizaron de la siguiente manera: Cada tiempo en estudio se

evaluó con n=3, una vez transcurrido el tiempo correspondiente se procedió a recolectar las

células en estudio, congelarlas y extraer el RNA de ellas, posteriormente se sintetizó a cDNA.

Este cDNA se cuantificó y comprobó su integridad por PCR convencional, amplificando β-actina

(ya que los partidores utilizados para β-actina posee un intrón entre los partidores), los productos

de PCR obtenidos algunas muestras de la cinética de expresión con LF-89 viva se muestran como

ejemplo en la Figura 9, en todas las cinéticas ocurre lo mismo, pudiendo observarse que las

muestras se están libres de contaminación con DNA genómico.

El análisis de la expresión de los distintos genes a estudiar se realizó mediante PCR

tiempo real. Para ello fue necesario diseñar partidores para cada uno de los genes de interés, los

que fueron verificados por RT-qPCR que sólo se obtuviera un producto y ausencia de

dimerización para cada juego de los partidores, en la Figuras 10 a la 15 se muestran los gráficos

de las curvas de disociación del producto de qPCR de cada juego de partidores, en donde la

60

Figura 9: PCR convencional para β-actina de cDNA de riñón anterior infectado con LF-89

viva. Gel de agarosa al 1% teñido con Syber safe, producto esperado para cDNA es de 467 pb y

para DNA genómico es de aprox. 1300 pb. C+ es el control positivo con cDNA de riñón anterior

como templado, G: DNA genómico de trucha y C- el control de reacción sin templado. Los

triplicados de pocillo también se comprobaron de esta forma, obteniendo en todos los cDNA el

mismo resultado.

61

Figura 10: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR1. A) secuencia de

TLR1 de 122pb, amplificado por los partidores TLR1F y TLR1R. B) Curva de disociación de los

productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el software

MxPro, luego de finalizada la amplificación.

62

Figura 11: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR9. A) secuencia de

TLR9 de 123pb, amplificado por los partidores t-TLR9-F y t-TLR9-R. B) Curva de disociación

de los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el

software MxPro, luego de finalizada la amplificación.

63

Figura 12: Estandarización de partidores para la amplificación de TLR22. A) secuencia de

TLR22 de 110pb, amplificado por los partidores TLR22F y TLR22R. B) Curva de disociación de

los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el

software MxPro, luego de finalizada la amplificación.

64

Figura 13: Estandarización de partidores para la amplificación de MyD88. A) secuencia de

MyD88de 123pb, amplificado por los partidores tMyD88-F y tMyD88-R. B) Curva de

disociación de los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p

mediante el software MxPro, luego de finalizada la amplificación.

65

Figura 14: Estandarización de partidores para la amplificación de IL-1β. A) secuencia de

IL-1β de 112pb, amplificado por los partidores tIL1b-F y tIL1b-R. B) Curva de disociación de los

productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el software

MxPro, luego de finalizada la amplificación.

66

Figura 15: Estandarización de partidores para la amplificación de EF1-α. A) secuencia de

EF1-α de 110 pb, amplificado por los partidores tEF1aF y tEF1aR. B) Curva de disociación de

los productos de RT-qPCR, realizada por el equipo Stratagene MxPro 3000p mediante el

software MxPro, luego de finalizada la amplificación.

67

ordenada corresponde a derivada de la fluorescencia emitida por el producto y la abscisa a la

Temperatura en °C, se puede observar sólo un pick de amplificación lo que corresponde a un solo

producto de PCR para cada par de partidores. Como normalizador para los ensayos de cinética se

analizó EF1-α.

Una vez realizados los ensayos de RT-qPCR en triplicado para todas las muestras de cada

cinética se revisó cada curva de disociación obtenida y se corroboró que la T° de melting

corresponda al producto esperado para cada juego de partidores.

Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen son: TLR1 83°C, TLR9

88°C, TLR22 81°C, MyD88 86°C, IL-1β 86°C, EF1-α 86°C.

4.4.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLRs

La evaluación se realizó utilizando la formula descrita en material y métodos, de esta

manera se cuantificó la expresión relativa de cada gen estudiado. Una vez obtenido el resultado

de la fórmula, se calculó la media de la expresión relativa en los controles de cada cinética, esta

media se utilizó como expresión basal de cada gen estudiado y equivale en el gráfico a: 1 de

razón de expresión, en el eje de las ordenadas. De esta manera se puede calcular la relación entre

la media de la expresión relativa de cada tiempo con la media calculada para sus controles

correspondientes, y así, poder observar si aumenta o disminuye la expresión al compararla con el

control, esto se realizó para todas las muestras de las distintas cinéticas.

La evaluación realizada a los receptores tipo Toll en estudio, junto a MyD88 e IL-1β se

realizó analizando de forma independiente cada cinética, debido a que la presentación de los

patrones moleculares en cada una de ellas es de manera diferente.

68

4.4.1.1 Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa IBM-40 viva

(Gráficos se pueden observar en la Figura 16)

La cinética se realizó utilizando 25 bacterias por célula.

Evaluación de TLR1: Se observa un aumento en la expresión en todos los tiempo

estudiados, la expresión a las 3 h es de 5,5 veces, a las 6 h de 33,9 veces respecto al control,

teniendo un pico máximo de 47 veces a las 12 h para luego disminuir la expresión a 30 veces a

las 24 h.

Evaluación de TLR22: Se observa un perfil de expresión similar a TLR1, a las 3 y 6 horas

la expresión es prácticamente la misma que el receptor antes mencionado, siendo 7,8 y 39,4

respectivamente. Sin embargo, la expresión a las 12 h aumenta mucho más, llegando a 82 veces

para luego disminuir drásticamente a 15,8 a las 24 h.

Evaluación de TLR9: Se ve un aumento progresivo en la expresión, siendo 3,5; 49,8; 64,2

y 180,8 veces respecto al control a las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.

Evaluación de MyD88: Se observa aumento en la expresión solo en los 3 últimos tiempos,

una razón de expresión de 16,6 a las 6 h, un pick máximo de expresión de 36,8 y luego disminuye

a 14,8 veces respecto al control a las 24h.

Evaluación de IL-1β: Al igual que TLR9 se ve un aumento progresivo en todos los

tiempos estudiados, a las 3 h se observa un aumento no significativo de 3,2 veces. A las 6 y 12 h

se ve una razón de expresión de 70,5 y 219,4 respectivamente, con un máximo de expresión a las

24 h de 536,2 veces respecto al control.

69

Figura 16: Gráficos de cinéticas de expresión frente a IBM-40 viva. Utilizando RNA total de

cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris, se evaluó la expresión a nivel de transcrito

de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección IBM-40,

utilizando 25 bacterias por célula. Todos los genes fueron analizados mediante RT-qPCR en

triplicado, usando como gen constitutivo EF1-α. Los gráficos representan la cuantificación

relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con IBM-40 (n=3) respecto a los pocillos

control (n=3), las barras indican el error estándar. Se considera p<0.01 como altamente

significativo (**) y p<0.05 como significativo (*) según la prueba estadística T de Student.

A B C

D E

70

4.4.1.2 Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa LF-89 viva

(Gráficos se pueden observar en la Figura 17)

La cinética se realizó utilizando 50 bacterias por célula.

En todos los TLR estudiados, así como, en MyD88no se observan cambios significativos

en la razón de expresión respecto a los controles. Sin embargo, se ve un aumento no significativo

en la expresión de TLR 9 de 2 veces a las 12 h y 5,5 veces a las 24 h.

Evaluación de IL-1β: Se ve un perfil de expresión particular, con un máximo de expresión

al primer tiempo estudiado de 48,4 veces, para luego disminuir a 18,9 a las 6 h y posteriormente

aumentar progresivamente a 20,7 y 27,2 veces a las 12 y 24 h respectivamente.

4.4.1.3 Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a infección con la cepa IBM-40

inactivada por calor (Gráficos se pueden observar en la Figura 18)

La cinética se realizó utilizando 25 bacterias inactivadas por célula, la inactivación fue a

45°C durante 10 minutos.

Al igual que en la cinética con la cepa no patógena, LF-89, aquí no se observan cambios

significativos en la expresión de todos los TLR estudiados ni de MyD88, a pesar de ello, si se

observa un claro perfil de expresión de MyD88con una disminución progresiva en el tiempo de 3;

2,6; 1,8 y 0,8 veces a las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.

Evaluación de IL-1β: Se ve un aumento progresivo en la expresión de 2; 2,6; 57,1 y 65,4 a

las 3, 6, 12 y 24 h respectivamente.

71

Figura 17: Gráficos de cinéticas de expresión frente a LF-89 viva. Se evaluó la expresión a

nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a

infección con 50 bacterias por célula, utilizando la cepa tipo, LF-89. Todos los genes fueron

analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como gen constitutivo EF1-α. Los gráficos

representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con LF-89

(n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el error estándar. Según la prueba

estadística T de Student, se considera p<0.01 como altamente significativo (**).

A B C

D E

72

Figura 18: Gráficos de cinéticas de expresión frente a la cepa IBM-40 inactivada. Utilizando

RNA total de cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris se evaluó la expresión a nivel

de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a

infección con IBM-40 (25 bacterias por célula) inactivada a 45°C durante 10 min. Todos los

genes fueron analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los

gráficos muestran la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con

IBM-40 inactivada por calor (n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el

error estándar. Se indica p<0.01 como altamente significativo (**) y p<0.05 como significativo

(*) según la prueba estadística T de Student.

A B C

D E

73

4.4.1.4 Evaluación de la cinética de expresión frente a estimulación con proteínas totales de

la cepa IBM-40 (Gráficos se pueden observar en la Figura 19)

La cinética se realizó utilizando 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40. Se observa un

aumento significativo en la expresión de todos los genes en los tiempos estudiados.

Evaluación de TLR1: Se observa una disminución progresiva en la expresión, alcanzando

un valor máximo de 1.241,8 veces a las 3 h, seguida de 461,6 y 407,6 veces a las 6 y 12 h

respectivamente. La expresión mínima se observa a las 24 h y es de 116,7 veces.

Evaluación de TLR22: Aquí, al igual que el receptor TLR1, se ve una disminución

progresiva en la expresión. Se observa un aumento en la expresión de 3.453,9 veces a las 3 h,

para luego disminuir bruscamente a 804; 173,5 y 153,2 veces a las 6, 12 y 24 h respectivamente.

Evaluación de TLR9: Se ve un aumento progresivo en la expresión, con una leve

pendiente en los primeros tiempos evaluados, con razón de expresión de 520,5; 567,2 y 572,3 a

las 3, 6 y 12 h respectivamente. Luego, a las 24 h la expresión aumenta al doble, llegando a

1.151,4 veces respecto al control.

Evaluación de MyD88: Se observa aumento en la expresión en los primeros 2 tiempos

para luego disminuir en la segunda mitad de la cinética. La expresión a las 3 h fue de 105 veces

respecto al control, con un máximo de 140,6 a las 6 h, luego disminuye a 96,2 y 69,1 a las 12 y

24 h.

Evaluación de IL-1β: Al igual que MyD88, aquí se ve un aumento en la primera mitad de

la cinética, para luego disminuir notoriamente en la segunda mitad del experimento. A las 3 y 6 h

se ve una razón de expresión de 221,5 y 272 respectivamente, luego baja la expresión a 92,5 a las

12 h y 36,3 a las 24.

74

Figura 19: Gráficos de cinéticas de expresión frente a proteínas totales de la cepa IBM-40.

Utilizando RNA total de cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoíris se evaluó la

expresión a nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β

frente a infección con 10 µg/mL de proteínas totales de IBM-40. Todos los genes fueron

analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los gráficos

representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados con proteínas

totales de IBM-40 (n=3) respecto a tres pocillos control (n=3), las barras indican el error estándar

p<0.01 como altamente significativo (**) según la prueba estadística T de Student.

A B C

D E

75

4.4.1.5 Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina y prolactina más IBM-

40 viva (Gráficos se pueden observar en la Figura 20)

Se realizó un análisis comparativo de los gráficos de expresión de los distintos genes

estudiados, utilizando una variable extra, prolactina. Se observa la expresión frente a infección

con IBM-40 utilizando 25 bacterias por célula. Además, se estimuló con una dosis de 500ng/mL

de PRL para poder evaluar su rol inmuno-estimulador. Finalmente, se observa la expresión de los

genes de interés en infección con 25 bacterias IBM-40 por célula, en células que fueron

estimuladas dos horas antes con PRL. Como control para los 3 estímulos se utilizó la expresión

de los genes adicionando solamente el vehículo, PBS 1X.

Evaluación de TLR1: Se observa que la expresión de este receptor a las 3 h aumenta 6,1;

5,9; 2,1 veces según sea infectado con IBM-40, estimulado con prolactina y con PRL más IBM-

40 respectivamente. A las 6 h la expresión es 33,9 para infección con IBM-40, 4,2 para PRL, en

cambio para PRL+IBM-40 la expresión es igual al control (1,0), de la misma manera, a las 12 h

la expresión es de 30,6 y 2,2 veces para IBM-40 y PRL respectivamente y para PRL + IBM la

expresión no varió respecto al control. A las 24 h se ve un aumento únicamente en la infección

con IBM-40 de 32,2 veces, para la estimulación con PRL la expresión disminuye a la mitad

respecto al control y para PRL + IBM la expresión es prácticamente la misma del control (1,1).

Evaluación de TLR22: Se observa un aumento significativo en la expresión frente a infección con

IBM-40 en todos los tiempos analizados, siendo éstos de 8,7; 39,5; 85,6 y 8,0 para las 3, 6, 12 y

24 h respectivamente. Para PRL y PRL + IBM-40 la expresión es de 11,3 y 2,1 a las 3 h, 3 y 0,6 a

las 6 h, 2,3 y 1,5 a las 12 h y a las 24 h la expresión disminuye respecto al control alcanzando

valores de 0,1 y 0,8 respectivamente.

76

Figura 20: Gráficos de cinéticas de expresión de células infectadas con IBM-40 viva e

inmuno-estimuladas previamente con PRL. Utilizando RNA total de cultivo primario de riñón

anterior de trucha arcoíris se evaluó la expresión a nivel de transcrito de los genes A) TLR1, B)

TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección con IBM-40, 500 ng/mL de PRL, y

500 ng/mL PRL 2 horas antes de infectar con IBM-40. Como control para los 3 estímulos se

utilizó la expresión de los genes adicionando solamente el vehículo, PBS 1X. Todos los genes

fueron analizados mediante RT-qPCR en triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los

gráficos representan la cuantificación relativa al gen normalizador de tres pocillos tratados (n=3)

respecto a tres pocillos control sin ninguno de los tratamientos (n=3), las barras indican el error

estándar. Se indica **p<0.01 y *p<0.05 según la prueba estadística T de Student.

A B C

D E

77

Evaluación de TLR9: Para la infección con IBM-40 a las 3, 6, 12 y 24 h la expresión es

respectivamente de 2,8; 51,8; 64,1 y 178,6 veces. En la estimulación con prolactina se observan

mínimas variaciones en la expresión de TLR9, aumentando 3,5; 4,7; 3,5 y 1,3 veces para las 3, 6,

12 y 24 h. Del mismo modo, no se observan variaciones significativas en la expresión del

receptor frente a estimulación con IBM-40 + PRL, alcanzando valores de 1,8; 0,8; 1,3 y 3,6 en

orden cronológico para cada hora analizada.

Evaluación de MyD88: Se ve un aumento significativo en la expresión frente a IBM-40 de

1,3; 16,6; 41,1 y 16,4 para las 3, 6, 12 y 24 h. En el caso de estimulación con PRL y estimulación

con PRL más infección con IBM-40 no se ven grandes variaciones en la expresión, siendo 3 y 8,5

a las 3 h, 2,3 y 4,9 a las 6 h, 2,8 y 5,3 a las 12 h y 0,8 y 5,4 a las 24 h.

Evaluación de IL-1β: Se observa un aumento significativo prácticamente en todos los

tiempos estudiados y bajo los tres estímulos. Al primer tiempo, se ve expresión de 3,2; 8,7 y 95,2

veces frente a IBM-40, PRL y PRL + IBM-40 respectivamente. A las 6 h la expresión fue de 70,5

veces frente a IBM-40; 14,9 veces ante estimulación con PRL y 144 veces frente a ambos

estímulos. A las 12 h la expresión observada es 219,4; 16,7 y 3.270,7 para IBM-40, PRL y PRL +

IBM-40. A las 24 h se observan valores muy elevados de expresión para cada estímulo, siendo

536,2 veces para infección con IBM-40; 154 veces PRL y 27.290,8 veces frente a IBM-40+PRL.

Además, se midió la expresión de p47phox ya que se conoce que es la única subunidad de

NADPH oxidasa que varía su expresión ante el tratamiento con prolactina (Olavarría et al.,

2012). Se observa que a las 3 h la expresión de p47phox es igual en células tratadas con PRL

respecto a infección con IBM-40 en células previamente estimuladas con PRL. A las 6 h la

expresión frente a IBM-40 + PRL alcanza 0,76 veces respecto a las células estimuladas con PRL.

78

Luego, la expresión de p47phox es mayor en las células tratadas con IBM-40 + PRL, alcanzando

3,5 y 5,6 veces a las 12 y 24 h respectivamente (datos no mostrados).

4.4.1.6 Evaluación de expresión en la cinética de infección con IBM-40 respecto a infección

con LF-89 (Gráficos se pueden observar en la Figura 21)

Aquí se realiza una comparación de la expresión de los distintos genes en estudio frente a

infección de una cepa patógena (IBM-40, 25 bacterias por célula) respecto a la expresión frente a

infección con la cepa tipo de P. salmonis (LF-89, 50 bacterias por células), para ellos se utilizan

los datos de las cinéticas antes evaluadas en esta tesis y los valores de expresión para la cepa LF-

89 son llevados a 1 y se usan como control, para así poder comparar la variación entre las

expresión frente a infección con dos cepas distintas de P. salmonis.

Para todos los TLR analizados la expresión frente a la cepa IBM-40 es superior, pero sólo

para 6, 12 y 24 h la diferencia es significativa.

Evaluación de TLR1: Se observa que la expresión de este receptor es 3,1 veces mayor

frente a la cepa patógena respecto a la cepa tipo a las 3 h post infección. Dicha diferencia es

máxima a las 6 h, siendo 56,8 veces, luego la brecha se estrecha levemente a 40 y 45 veces de

diferencia a las 12 y 40 h.

Evaluación de TLR22: Se ve, al igual que en TLR1, que la diferencia mínima de

expresión se da a las 3 h y la máxima a las 6 h, siendo de 6,4 y 98,8 veces respectivamente.

Luego disminuye, alcanzando a las 12 h una diferencia de 48,8 y a las 24 h la diferencia es de

23,2 veces.

79

Figura 21: Comparación de Cinéticas de expresión frente a infección con una cepa

patógena respecto a una no patógena de P. salmonis. Se evaluó la expresión a nivel de

transcrito de los genes A) TLR1, B) TLR22, C) TLR9, D) MyD88y E) IL-1β frente a infección

con la cepa patógena IBM-40 (25 bacterias por célula) respecto a la cepa no patógena LF-89 (50

bacterias por célula) de P. salmonis. Todos los genes fueron analizados mediante RT-qPCR en

triplicado, usando como constitutivo EF1-α. Los niveles de expresión de los transcritos frente a

infección con LF-89 son llevados a valor =1 y son representados en los gráficos como basales.

Las barras indican el error estándar. Se indica p<0.01 como altamente significativo (**) y p<0.05

como significativo (*) según la prueba estadística T de Student.

A B C

D E

80

Evaluación de TLR9: Se observa, al igual que en los receptores antes evaluados, una

diferencia mínima de expresión a las 3 h y máxima a las 6 h, siendo éstas de 7,2 y 119,4 veces. A

las 12 h se ve una diferencia de 32,1 veces y de 29,8 veces a las 24 h.

Evaluación de MyD88: En este gen se observa que a expresión a las 3 h post infección es

mayor para LF-89, sin embargo, en los siguientes tiempos la expresión del receptor vuelve a ser

mayor frente a infección con la cepa IBM-40. A las 3 h la expresión de MyD88frente a infección

con la cepa patógena es de tan solo 0,64 veces respecto a Lf-89, luego a las 6, 12 y 24 h la

expresión es de 36; 40,9 y 59,6 veces mayor en favor a la infección con IBM-40.

Evaluación de IL-1β: Aquí se observa lo mismo que en la evaluación de MyD88, una

mayor expresión a las 3 h para la infección con la cepa tipo, y en los siguientes tiempos la

diferencia en la expresión favorece a la cepa patógena. Se ve que IL-1β tan sólo se expresa 0,067

veces frente a la cepa patógena comparada con la expresión al mismo tiempo (3 h) post infección

con LF-89. Luego la diferencia es 3,7, 10,7 y 19,7 veces a las 6, 12 y 24 h respectivamente en

favor a la infección con IBM-40.

4.5 Clonamiento de TLR2

Al inicio de esta tesis, se desconocía la secuencia nucleotídica de TLR2. Utilizando como

referencia las secuencias de mRNA descritas en NCBI para el receptor en otras especies de peces,

se realizó una búsqueda BLAST y en la base de datos de EST para O. mykiss, no encontrandose

secuencia EST para TLR2. Luego, se diseñaron varios juegos de partidores heterólogos,

utilizando como molde la secuencia de Danio rerio, Ictalurus punctatus y Paralichythys

olivaceus, con la idea de intentar obtener la secuencia del mensajero.

81

A partir de muestras de RNA de riñón anterior de trucha, se sintetizó cDNA, el cual fue

utilizado como templado para las reacciones de PCR realizadas con los juegos de partidores,

obteniéndose así productos de los tamaños esperados. Los productos de PCR fueron clonados en

el vector p-GEM-T easy y enviados a secuenciar. Las secuencias nucleotídicas obtenidas, fueron

analizadas por BLAST sin encontrar similitud con el receptor esperado (Datos no mostrados).

82

5. DISCUSIÓN

5.1. Evaluación semi-cuantitativa de la expresión de TLR1, TLR22 y MyD88 en distintos

órganos de trucha arcoíris

Los TLR son de gran importancia en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados

(Imler et al., 2004). Cumplen funciones como: detectar la presencia de algún patógeno en el

organismo hospedero y desencadenar una respuesta inmune innata, además de activar y guiar la

respuesta inmune adaptativa contra ellos (Moreno et al., 2003). Los TLR forman parte de los

RRPs, receptores que reconocen PAMPs (Randon-Barragan, 2009). A cada TLR se le ha

atribuido uno o varios PAMPs como ligando de reconocimiento (Tabla I), estos PAMPs son

característicos de los microorganismos y así, mediante cascadas de señalización, se desencadena

una respuesta contra el patógeno en particular (Kumar et al., 2009). Por esta razón es de gran

interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos, y así poder comprender de una mejor

manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos.

Antecedentes previos muestran que la expresión entre TLR3, TLR7 y TLR8 en trucha

arcoíris, presentada patrones similares, detectándose una mayor expresión en bazo, seguido de

riñón anterior y posterior (Palti et al., 2010a). En esta tesis se evaluó la expresión de TLR1,

TLR22 y MyD88 en distintos órganos.

Se aprecia que la expresión de TLR1 está presente en todos los órganos analizados,

mostrando una mayor expresión del mensajero en bazo (7,6 veces) y riñón anterior (5,8 veces)

(Figura 5). Estos resultados mantienen el mismo perfil de los obtenidos por Palti en 2010, en que

realizó el mismo análisis. Sin embargo, los valores de expresión distan bastante entre ambos

estudios, ya que los autores muestran valores de expresión de TLR1 en bazo de 80 veces, es

83

decir, 10 veces más de la expresión obtenida en esta tesis, lo que sugiere que las truchas

utilizadas en 2010 pueden haber estado expuestas a algún patógeno que estimule TLR1. Además,

hay que tener en cuenta no sólo diferencias en su estado inmunológico, sino también la etapa de

desarrollo y antecedentes genéticos de los peces.

En el caso de TLR22, se aprecia expresión en todos los órganos analizados, mostrando

una mayor expresión del mensajero en riñón anterior (5 veces) seguida de bazo (4,7 veces)

(Figura 5). Estos datos concuerdan con los mostrados en porcentaje por Rebl et al en 2007, donde

se asignó un valor de 100 de expresión relativa al mensajero de TLR22 de bazo y un valor de 60

al mensajero en riñón anterior, siendo ambos los valores más elevados entre los distintos órganos

analizados por los autores .

El mensajero de la proteína adaptadora MyD88 se expresa en todos los órganos

estudiados, prevaleciendo en riñón, siendo incluso mayor que la expresión de los TLR en éste

órgano. Además, se observa una alta expresión de MyD88 en bazo. Esto concuerda con el hecho

de que, en pez cebra se demostró experimentalmente que TLRs necesitan utilizar directamente

MyD88 para desencadenar la cascada de señales, lo que confirmó la ruta de transducción de

señales iniciada por la activación de la vía de MyD88 dependiente (Liu et al., 2010). Ya que,

tanto TLR1 como TLR22 fueron detectados en todos los órganos analizado,s es totalmente

factible la presencia de MyD88 en los mismos. Además, se demostró que embriones de pez cebra

knock-out para MyD88 albergaban entre 100 a 1000 veces más bacterias que embriones del tipo

silvestre cuando son inyectados con la bacteria patógena Salmonella enterica, revelando el papel

de MyD88 en respuesta inmunológico de los peces (Van der Sar et al., 2006).

84

5.2. Inactivación de la cepa IBM-40 de P. salmonis

La inactivación se realizó por calor, intentando alterar lo menos posible la estructura

externa de la bacteria, ya que antecedentes previos de inactivación de P. salmonis LF-89 con

formaldehído no generaba respuesta vía TLR. Se creyó que las proteínas bacterianas quedaban

ocultas en la membrana y menos accesibles a unirse a los receptores (Salazar, 2010). Por el

contrario, hay antecedentes de respuesta de TLR frente a infección con P. salmonis inactivada a

100°C, donde la expresión de los receptores aumenta drásticamente, lo que puede deberse a que

la bacteria pierde completamente su estructura dejando las proteínas libres a unirse a los

receptores; algo similar a estimular con proteínas totales de P. salmonis.

Con los antecedentes previos, en esta tesis se realizó una gradiente de inactivación de la

cepa IBM-40 a distintas temperaturas: 30; 37,5; 45; 52,5; 60 y 67,5°C durante 10 minutos, luego

se incubaron a 18°C durante 17 h, pasado este tiempo se midió por turbidimetría la exisencia de

crecimiento bacteriano, evaluando la diferencia de OD a 600nm de las muestras justo antes y

después de la inactivación. Además, se realizó tinción de Gram a cada muestra para observar y

comparar la estructura respecto al control.

En la Figura 8 se observa que a partir de los 45°C el crecimiento bacteriano se inhibe por

completo. Además, la estructura de la bacteria se observa intacta según la tinción de Gram. Se

escogió 45°C por ser la temperatura más baja a la cual se inhibe por completo el crecimiento,

intentando de esta forma alterar lo menos posible la estructura de la bacteria, para así eliminar las

dudas respecto a los resultados obtenidos con otras inactivaciones. Sin embargo, hay que tener en

cuenta que la inactivación con formaldehido realizada por Salazar se realizó en la cepa LF-89, y

en el caso de la inactivación con calor a 100°C se desconoce la cepa, por lo que los resultados de

cinéticas no son comparables entre sí. Por lo tanto, la intención es solo buscar una mejor forma de

85

inactivación de P. salmonis para obtener resultados más certeros respectos al rol de los TLR en el

reconocimiento de IBM-40.

5.3. Clonamiento de TLR2

El receptor TLR2 forma un heterodímero con TLR1 en mamíferos, en conjunto reconocen

distintos PAMPs de bacterias Gram negativas y Gram positivas (Kumar et al., 2009). Recientemente,

varios estudios han informado de las posibles funciones de TLR1 y TLR2 en peces. Hasta el

momento, TLR1 y TLR2 se han reportado en pez globo (Oshiumi et al., 2003), pez cebra (Jault et al.,

2004; Meijer et al., 2004 ), lenguado japonés (Hirono et al., 2004 ) y bagre de canal (Baoprasertkul et

al., 2007).Además, TLR1 se ha informado en Tetraodon nigroviridis (Wu et al., 2008) y trucha arco

iris (Palti et al., 2010b). Es de gran interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos y así

poder comprender de una mejor manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos.

En O. mykiss, hasta el momento del inicio de la tesis, no se encontraba secuenciado el mRNA

de TLR2, por lo que fue seleccionado para ser clonado y secuenciados. Todas las secuencias

aminoacídicas obtenidas, las que fueron deducidas de la secuencia nucleotídica del clonamiento de

cada receptor, no presentan las regiones y dominios característicos de los TLR.: LRRs, LRRCT y TIR

(Akira et al., 2006), importante en desencadenar la cascada de señalización en respuesta a algún

patógeno. En conjunto todas estas características encontradas, en las secuencias aminoacídicas

deducidas, nos dice que no corresponderían a TLR2. Esto se podría deber a la poca cercanía

filogenética de la trucha arcoíris con las especies de peces usadas como molde para generar

partidores. Además, en la actualidad se dispone de la secuencia de este receptor pudiendo

comprobarse la baja homología de secuencia entre las especies, razón por la cual no fue posible

obtener la secuencia del receptor en el transcurso de esta tesis.

86

5.4. Cinéticas de expresión

La investigación de la interacción de diversas formas de exposición de P. salmonis con

los TLR en peces puede abrir puertas y estrategias terapéuticas para la profilaxis humana y

animal. Los TLR se han descrito como receptores de adyuvantes (Seya et al., 2006), por lo que

incorporar ligandos a TLR de manera preferente en una solución farmacológica, permitiría una

mejora en vacunas en desarrollo contra P. salmonis.

Adicionalmente, el entendimiento de la función de los TLR en peces y sus especificidades

de patógenos puede guiar al desarrollo de mejores inmunoestimulantes para el uso en acuicultura

comercial, así como agonistas para el control y prevención de enfermedades (Randon-Barragan,

2009).

5.4.1. Evaluación de Cinéticas por receptor

La expresión de los TLR no es estática, sino más bien modulada en respuesta a patógenos,

a una variedad de citoquinas o estrés ambiental (Akira et al., 2006). El estudio de las cinéticas de

expresión se basó principalmente en la infección causada por Piscirickettsia salmonis en cultivo

primario de riñón anterior de O. mykiss.

P. salmonis al ser una bacteria gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas,

lipoproteínas, peptidoglicano (Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano y también se ha

descrito que posee la proteína flagelina (Wilhelm et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs

pueden ser reconocidos por distintos TLR. Además, hay que tener en cuenta que los TLR trabajan

en conjunto en el reconocimiento de un patógeno, debido a que un patógeno puede presentar más

87

de un PAMPs que permita su reconocimiento, por lo tanto las células pueden reconocer el

patógeno por varios TLR simultáneamente (Underhill et al., 2002).

Además de estudiar la infección con P. salmonis, se analizó el efecto inmuno-modulador

descrito para PRL (Balm 1997; Harris et al., 2000) sobre los TLR, y poder evaluar el

comportamiento de los distintos marcadores en estudio y aportar de esta manera al conocimiento

de los ligandos reconocidos por los TLRs de trucha.

En el desarrollo de la tesis se realizaron 5 cinéticas de expresión. Las cinéticas realizadas

utilizaron como elemento de infección a: IBM-40 viva, LF-89 viva, IBM-40 inactivada por calor,

proteínas totales de IBM-40 e infección con IBM-40 previa inmunoestimulación de 2 horas con

PRL. En todas las cinéticas se evaluó: la expresión de TLR1, TLR22, TLR9, MyD88 y IL-1β por

RT-qPCR. La idea de estudiar IL-1β y MyD88 es para poder visualizar como es el

comportamiento de la cascada de señalización en respuesta al reconocimiento de los distintos

PAMPs por sus correspondientes TLR. MyD88 es una de las cinco proteínas adaptadoras al

dominio TIR, y es utilizada por todos los TLR menos TLR3. Al activarse desencadena una

cascada de señalización que finaliza con la activación del factor de transcripción NF-ƙB (Kumar

et al., 2009), el cual dentro de los genes que activa se encuentra IL-1β. Esta interleuquina es el

mediador central de la respuesta inmune y respuesta inflamatoria, e inicia una variedad de

funciones, como activación de macrófagos y expresión de otras citoquinas (Bjornsdottir et al.,

2009). Además se agregó la evaluación de TLR9, receptor de endosoma que reconoce CpG DNA

no metilado, característico en el genoma de las bacterias (Akira et al., 2006).

88

5.4.1.1. Cinéticas de expresión de TLR1

TLR1 en peces, se ha descrito como su ligando Triacil-lipopéptidos, por lo que es de

esperar que TLR1 logre reconocer ambas cepas de P. salmonis en estudio. En la cinética de

expresión con IBM-40 viva, se observó un aumento en la expresión en todos los tiempos

estudiados, teniendo un pico máximo de 47 veces a las 12 h para luego disminuir la expresión a

30 veces a las 24 h. Lo que indicaría que, efectivamente la cepa IBM-40 de P. salmonis posee

ligando para este receptor.

En la cinética de expresión con LF-89 no se observan cambios significativos en la razón

de expresión respecto a los controles. Lo que podría indicar que la cepa tipo de P. salmonis,

aislada originalmente en 1989, no posee ligando para el receptor TLR1 indicando una diferencia

fundamental con la cepa patógena IBM-40.

En la cinética con IBM-40 inactivada por calor, al igual que en la cinética con la cepa no

patógena, LF-89, se observan pequeños cambios no significativos en la expresión de TLR1 en

todos los tiempos en estudio. Resultados que concuerdan con los obtenidos en la tesis de Carolina

Salazar en 2011, donde se midió la expresión de estos TLR en la línea celular SHK-1 de S. salar

frente a P. salmonis LF-89 inactivada con formaldehido, en ese momento se pensó que la bacteria

inactivada era incapaz de estimular la expresión de TLR debido a que la metodología de la

inactivación ocultó el ligando y éste ya no era accesible al receptor. Sin embargo, en esta tesis la

inactivación fue por calor y procurando mantener la estructura de la bacteria, lo cual fue

observado por tinción de Gram.

En la cinética de expresión con Proteínas totales de IBM-40. Se observa una disminución

progresiva en la expresión, desde un valor máximo a muy corto tiempo, 1.242 veces de aumento

89

a las 3 h, alcanzando una mínima de 117 a las 24 h. Lo cual sugiere el uso de proteínas totales de

IBM-40 para estimular en forma rápida y muy efectivo el sistema inmune de peces, vía TLRs.

La expresión del receptor TLR1 a las 3 horas fue prácticamente la misma frente a IBM-40

que frente a PRL (6,1 y 5,9 veces de aumento de expresión respecto al control). Sin embargo, la

expresión frente a IBM-40 se mantuvo en ascenso en los 3 siguientes tiempos en estudio;

mientras que, la expresión de TLR1 frente a PRL fue disminuyendo hasta alcanzar niveles

basales a las 24 h. La expresión frente a IBM-40, previa inmunoestimulación con PRL no sufrió

cambios respecto al control (Figura 20 A).

5.4.1.2. Cinéticas de expresión de TLR22

TLR22 es un receptor específico de peces, en humanos se encuentra como pseudogen

(Rebl et al., 2010). Se ha reportado, en pez cebra, que existe una modulación positiva de la

expresión de TLR22 frente a patógenos acuáticos como Aeromona salmonicida y Mycobaterium

marinum (Rebl et al., 2010). Además en lenguado japonés, peptidoglicano y dsRNA inducen un

aumento de la expresión de TLR22 (Rebl et al., 2007; Matsuo et al., 2008). Por estas razones se

piensa que TLR22 reconoce diversos ligandos de patógenos acuáticos, ya sean virus o bacteria.

En la cinética con IBM-40 viva, TLR22 presenta un aumento en todos los tiempos

estudiados, llegando a 82 veces a las 12 horas para luego disminuir a

15,8 a las 24 h. Se puede concluir que, al igual que TLR1, TLR22 reconoce algún ligando

presente en la cepa IBM-40 que aún no ha sido identificado.

Las cinéticas con Proteínas totales de IBM-40, se ve un máximo de 3.453,9 a las 3 h, para

luego disminuir bruscamente a 804 a las 6 h. Este resultado concuerda con el obtenido para

90

TLR1, lo que sugiere que proteínas totales de IBM-40 son un rápido y efectivo método para

estimular los TLRs.

Las cinéticas expresión frente a infección con IBM-40 y estimulación con prolactina,

muestran que la expresión del receptor a las 3 horas fue levemente superior frente a únicamente a

PRL que a IBM-40. En las horas siguientes, la expresión frente a IBM-40 se mantuvo en ascenso;

en cambio, frente a PRL fue disminuyendo hasta alcanzar niveles basales. La expresión de

TLR22 frente a P. salmonis cepa IBM-40, previa inmunoestimulación con PRL no sufrió

cambios respecto al control a nivel de transcrito.

Tanto para LF-89 como para IBM-40 inactivada no se encontró variaciones significativas

en la expresión del receptor.

5.4.1.3. Cinéticas de expresión de TLR9

TLR9 se encuentra en endosomas dentro de la célula y reconoce como ligando CpG-DNA

no metilado, los motivos CpG no metilados son abundantes en el genoma bacteriano (Akira et al.,

2006). En la cinética con IBM-40 viva, existe un aumento en las últimas 3 horas post-infección,

con respecto al control. Este comportamiento puede deberse a que la bacteria en las primeras

horas es fagocitada, donde las condiciones ácidas y reductoras degradan la doble hebra de DNA

en múltiples motivos de CpG que subsecuentemente interactúa con TLR9 (Akira et al., 2006).

También se ha reportado en lenguado japonés que TLR9 aumenta su expresión después de una

infección con Edwardsiella tarda, bacteria Gram negativa y en pez cebra también aumenta su

expresión frente a una infección con Mycobacterium marinum (Rebl et al., 2010).

91

En la cinética con IBM-40 viva se ve un aumento progresivo en la expresión alcanzando

un máximo de 180,8 veces de expresión respecto al control a las 24 horas post infección. Esto se

debe a que CpG no metilados de P. salmonis cepa IBM-40 son reconocido por TLR9.

En la cinética con proteínas totales de IBM-40, se ve un aumento progresivo en la

expresión, con una leve pendiente en los primeros tiempos evaluados, hasta lograr 1.151 veces de

aumento a las 24 h, el doble que a las 12 h. Esto se explica porque la metodología utilizada para

la extracción de proteínas totales, en ningún momento se trató con DNAsa por lo que el genoma

parcialmente degradado de la bacteria quedó en la solución, por lo tanto secuencias CpG no

metiladas quedaron accesibles; ya que, se ha reportado que existe una inducción de la expresión

de TLR9 en leucocitos de salmón del Atlántico después del desafío con CpG (Skajaeveland et al.,

2008).

Tanto para LF-89, IBM-40 inactivada como para PRL y PRL + IBM-40, no se encontró

variaciones significativas en la expresión de TLR9.

5.4.1.4. Cinéticas de expresión de MyD88

MyD88 es una de las cinco proteínas adaptadoras que se encuentran a cargo de

desencadenar la respuesta inmune una vez que TLR ha reconocido su ligando (O´neill et al.,

2007).

En la cinética de expresión frente a infección con IBM-40 viva, se observa aumento en la

expresión solo en los 3 últimos tiempos analizados, con máximo a las 12 h de 36,8. El hecho de

que no se observe un aumento a las 3 h, se puede deber al hecho que primero se debe generar una

respuesta en la expresión de los TLR para que posteriormente se active la expresión de la

proteína adaptadora MyD88 y se desencadene una cascada de señales.

92

En la cinética de proteínas totales de IBM-40 se observa aumento en la expresión en los

primeros 2 tiempos para luego disminuir en la segunda mitad de la cinética. En este caso, a

diferencia de la cinética con IBM-40 viva, el aumento en la expresión de MyD88 se da desde el

primer tiempo en estudio, alcanzando 105 ya a las 3 horas post infección valor que triplica al

máximo alcanzado en la infección con IBM-40 y en un tiempo mucho más corto (36,8 a las 12 h,

máxima para IBM-40 viva). Los cambios más rápidos y más elevados en a expresión de

MyD88se pueden explicar con los aumentos en la expresión de los TLR frente al mismo

estímulo, en los cuales los TLR1 y TLR22 alcanzaron sus máximos niveles de expresión ya a las

3 h. Estos datos confirman que lo que se sugiere previamente, que proteínas totales de IBM-40

son un rápido y efectivo método para estimular los TLRs.

En el caso de la infección con IBM-40 previa inmunoestimulación con PRL no se ven

grandes variaciones en la expresión alcanzando un valor máximo de 8,5 a las 3 h y mínimo de 4,9

a las 6 h.

Tanto para P. salmonis LF-89 viva, PRL e IBM-40 inactivada no se encontró variaciones

significativas en la expresión de MyD88.

5.4.1.5. Cinéticas de expresión de IL-1β

IL-1β es una citoquina de respuesta inflamatoria, la que se encuentra descrita en especies

salmonídeas (Ingerslev et al., 2010). IL-1β, además de ser modulada por PRL, es el mediador

central de la respuesta inmune e inflamatoria, iniciando la activación de macrófagos y expresión

de otras citoquinas (Bjornsdottir et al., 2009).

En la cinética de infección con la cepa IBM-40 viva, se ve un aumento de expresión en

todos los tiempos en estudio, con un máximo a las 24 h de 536,2 veces por sobre el control.

93

Como se observó en la cinética, existe la activación de los tres TLR analizados y de MyD88,

estos receptores desencadenan una cascada de señalización que finaliza con la activación de

distintas citoquinas, entre ellas IL-1β, lo cual explica el aumento en la expresión de esta

citoquina.

En la cinética con LF-89 no se observó variaciones significativas en la expresión de

ninguno de los TLR estudiados, lo mismo ocurrió para MyD88, sin embargo, si se observó un

aumento en la expresión de IL-1β en los 4 tiempos en estudio. Se ve un perfil de expresión

particular, con un máximo de expresión a las 3 h de 48,4, para luego disminuir a 18,9 y luego

aumentar progresivamente a 20,7 y 27. Debido a que LF-89 no es capaz de estimular la expresión

de TLR ni de MyD88, se sospecha que LF-89 logra un rápido aumento en la expresión de IL-1β a

través de los TLR ya expresados en la célula, sin mediar la transcripción de nuevos receptores.

En la cinética de expresión con IBM-40 inactivada, se observa un aumento significativo

en la expresión solo a los dos últimos tiempos, alcanzando un máximo de 65,4 veces por sobre el

control a las 24 h. Es decir, se observa una estimulación tardía de la expresión, lo mismo que

observó Salazar en su tesis en 2011, donde la inactivación de la bacteria fue con formaldehido

que probablemente generó un ocultamiento o alteró el patrón de los ligandos a los TLR,

generando un aumento en la expresión de IL-1β a las 24h de 1,8 veces respecto al control a

tiempo cero. Por otro lado, la cepa empleada por Salazar, fue la cepa de referencia LF-89, que

tiene una probada menor patogenicidad y virulencia respecto a cepas de campo y especialmente

respecto a la cepa IBM-40. Adicionalmente, en este caso la inactivación fue por calor a 45°C, lo

que sumado a las diferencias intrínsecas entre las cepas, puede explicar la diferencia de resultado.

Es también posible especular que, la inactivación por calor de la cepa IBM-40 no genera

ocultamiento de los ligandos, o dado que esta cepa es mucho más patógena que la LF-89, el

94

número de PAMPs que posee esta cepa es mayor, hace que la inactivación por calor no altere el

que puedan ser reconocidos por los TLR correspondientes, explicando de esta forma que la

expresión de IL-1β frente a IBM-40 inactivada sea mayor a LF-89 incluso viva, con valores de

65,4 versus 48,4 respectivamente.

En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, se ve un aumento de expresión por

sobre 200 en los primeros dos tiempos, luego baja la expresión hasta 36,3 a las 24 h. Esto debido

a que los ligandos se encuentran más “libres” y expuestos para poder interactuar con sus

respectivos TLR y se ejerce una respuesta inmune mayor y mucho más rápida, alcanzando un

máximo de expresión de 272 veces por sobre el control. Este dato es importante para una posible

creación de vacunas contra P. salmonis.

Por último el dato más significativo, en la cinética con PRL se observa un aumento

significativo prácticamente en todos los tiempos estudiados y bajo los tres estímulos: IBM-40,

PRL y PRL + IBM-40. En los primeros dos tiempos en estudio, la expresión frente a IBM-40

previa estimulación de 2 horas con PRL fue 10 veces superior respecto a la expresión frente a

únicamente PRL, luego a las 12 horas la diferencia se hace mayor llegando a 200 veces,

alcanzando un valor de 3.270 para PRL + IBM-40. A las 24 h en estudio la diferencia se estrecha

a 177, eso sí alcanzando valores muy elevados de 154 ante estimulación con PRL y 27.290 frente

a PRL + IBM-40. Con estos datos se puede concluir que, el rol inmunoestimulador de prolactina

potencia el aumento en la expresión de IL-1β frente a IBM-40, obteniéndose un efecto sinérgico.

95

5.4.2. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección

5.4.2.1. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con IBM-40 viva

En general se observa una estimulación de la expresión de todos los transcritos

estudiados. Lo que podría concluir que los TLR poseen la capacidad de reconocer y responder

frente a IBM-40, contradiciendo con el hecho de que P. salmonis puede vivir y replicarse dentro

de la célula del hospedero, por lo tanto podría evadir la respuesta inmune contra ella (McCarthy

et al., 2008).

En particular existe aumento en la expresión de TLR1 y TLR22 ya a las 3 h post

infección, alcanzando un máximo a las 12 h y en particular un gran aumento en la expresión del

TLR de endosoma (TLR9) a partir de las 6 h post infección con un máximo a las 24 h de más de

180 veces respecto al control. La modulación de la expresión diferencial de los TLR estudiados

se apoya con el hecho de que las células del sistema inmune usan múltiples TLR para detectar

varias características de un patógeno simultáneamente (Underhill et al., 2002), productos

microbiales pueden también inducir otros TLR más de los específicos para su propio

reconocimiento (Randon-Barragan, 2009). Además, IBM-40 viva logra estimular la expresión de

MyD88 e IL-1β, con valores muy elevados para todos los genes en estudio. Por lo tanto, se puede

concluir que IBM-40 posee ligandos que son reconocidos por los 3 TLR en estudio y que logra

desencadenar una respuesta inmune que finaliza con el aumento de la IL en estudio 6 h después

de infectar con la cepa patógena de P. salmonis. Sin embargo, esta respuesta no es suficiente para

frenar la replicación de la bacteria dentro de las células, ya que se sabe que a los 3 días post

infección se puede observar claramente al microscopio el efecto citopático. Es decir, si bien los

TLR están involucrados en la respuesta frente a IBM-40 viva, se necesita lograr una forma

96

efectiva de frenar la replicación de P. salmonis, para lograr evitar la sintomatología clínica del

SRS y las consecuentes pérdidas económicas, para ello se evaluaron otras formas de exposición

de P. salmonis.

5.4.2.2. Evaluación de la cinética de expresión frente a infección con la cepa LF-89 viva

En general no se observa una modulación de la expresión de los distintos TLR estudiados,

lo mismo ocurre con MyD88. Con estos datos, se puede concluir que LF-89 no posee ligandos

reconocidos por los TLR en estudio, sin embargo, LF-89 si es capaz de estimular la expresión de

IL-1β. El hecho que LF-89 si module positivamente la expresión de la IL en estudio, sugiere dos

posibles explicaciones, la primera es que no posee ligandos para los TLR en estudio, pero si para

otros TLR existentes en trucha. La segunda, y más factible explicación, es que el aumento en la

expresión de IL-1β sea desencadena por los TLR estudiados ya presentes en la célula sin mediar

transcripción de nuevos TLR y MyD88. Sugiriendo que LF-89 posee un menor número de

PAMPs comparada con IBM-40, lo que confirma los resultados bioinformáticos del número de

islas de patogenicidad obtenidos en la tesis en curso de Lagos, F.A.

5.4.2.3. Evaluación de la cinética de expresión de TLR frente a infección con la cepa IBM-

40 inactivada por calor

En general no se observa una modulación en la expresión de los receptores en estudio, con

lo cual se podría pensar que esta forma de inactivación no es buena para generar una respuesta

inmune, al menos vía TLR. Sin embargo, se observa una leve modulación positiva de la

expresión de MyD88, con un máximo de expresión de a las 3 horas cercano a 3 veces de aumento

97

respecto al control. En el caso de IL-1β, se observa un aumento significativo en la expresión solo

a los dos últimos tiempos. Es decir, se observa una estimulación tardía de la expresión, cercana a

las 60 veces de expresión. En este caso, la inactivación fue por calor a 45°C, lo que sumado a las

diferencias intrínsecas entre las cepas LF-89 e IBM-40, puede explicar la diferencia de resultado

respecto a la tesis de Salazar en 2011. Es también posible especular que, la inactivación por calor

de la cepa IBM-40 no altere el que puedan ser reconocidos por los TLR correspondientes,

explicando de esta forma que la expresión de IL-1β frente a IBM-40 inactivada sea mayor a LF-

89 viva, esto dado a que la cepa IBM-40 es mucho más patógena que LF-89, y el número de

PAMPs que posee la cepa patógena es mayor incluso inactivada.

El hecho que IBM-40 inactivada module positivamente la expresión de la IL-1β, sin

mediar modulación de los TLR estudiados, sugiere que el aumento en la expresión de la citoquina

es desencadenada por los TLR ya presentes en la célula sin mediar transcripción de nuevos

receptores.

5.4.2.4. Evaluación de la cinética de expresión frente a estimulación con proteínas totales de

IBM-40

En general, se ve un aumento de la expresión de todos los marcadores evaluados y a muy

corto tiempo y con valores muy elevados. Al observar este resultado se podría concluir que esta

forma de exposición de IBM-40 podría ayudar en la creación de un adyuvante efectivo contra P.

salmonis, ya que se ven activados al menos tres TLR, lo que sería importante en activar y

modular una respuesta adaptativa en el hospedero (Seya et al., 2006). Esta forma de exposición

de la bacteria lograría que los ligandos estén más libres de puedan interactuar con sus

98

correspondientes TLR y desencadenar una respuesta inmune adecuada, ya que proteínas totales

de la cepa IBM-40 son un rápido y muy efectivo método para estimular la expresión TLRs.

5.4.2.5. Evaluación de expresión de TLR en la cinética con prolactina e infección con IBM-

40 viva previa estimulación con PRL

En general, no se observa aumento en la expresión de los receptores en estudio para el

caso de infección con IBM-40 viva en cultivo primario previamente estimulado con PRL. Frente

a estimulación con PRL, sin posterior infección con P. salmonis, se observa un leve aumento en

la expresión solo en las primeras horas post estimulación para los receptores de membrana, TLR1

y TLR22. En el caso del receptor de endosoma, TLR9, solo se ve aumentada su expresión frente

a estimulación con IBM-40, sin responder a PRL. Con estos datos se podría pensar que prolactina

inhibe la respuesta inmune, al menos vía TLR.

Sin embargo, se observa una leve modulación positiva de la expresión de MyD88, tanto

para PRL como para infección con IBM-40 en cultivo primario estimulado con PRL. Además, se

observa una muy marcada estimulación en la expresión de IL-1β, especialmente a los dos últimos

tiempos de la cinética, donde la expresión frente a infección con IBM-40 sumada a la expresión

frente a estimulación con PRL es mucho menor a la obtenida al combinar ambos estímulos. Es

decir, se observa una estimulación sinérgica que alcanza valores de más de 27 mil veces respecto

al control sin infectar ni estimular a las 24 horas.

Olavarría y colaboradores en 2010, mostró las primeras evidencias que conectan PRL con

un proceso inmunológico: el estallido respiratorio y la expresión de citoquinas proinflamatorias

mediadas por la vías de señalización Jak/Stat y NF-kB. Los autores encontraron que PRL, en

peces teleósteos, regula la respuesta inmune por un entrecruzamiento en las vías de señalización

99

Jak/Stat y NF-kB. Además, se confirma la diafonía entre las vías de señalización de los TLR y el

receptor de PRL, sugiriendo como ésta puede conducir a la activación sinérgica de las actividades

pro-inflamatorias de macrófagos o, en su defecto, a la inhibición de estas actividades. Con estos

antecedentes, se puede explicar el hecho que la estimulación previa con prolactina y posterior

infección con IBM-40 viva aumente la expresión de IL-1β sin mediar estimulación de la

expresión de TLR, dado que la estimulación con PRL provoca un aumento de la expresión de la

citoquina en estudio vía receptor de prolactina para así generar una activación de respuesta

inmune adquirida. Una vez que se produce la infección, dos horas después de la estimulación con

PRL, la célula ya se encuentra expresando IL-1β vía receptor de PRL, entonces se produce el

efecto sinérgico de ambos estímulos amentando la expresión de IL, además, mediante los

receptores TLR ya presentes en la membrana, como se esquematiza en la figura 22. Estos

resultados abren el camino para futuros experimentos destinados a lograr entender de mejor

manera el papel exacto desempeñado por PRL en la resolución de las enfermedades infecciosas

en los peces.

5.4.2.6 Evaluación de expresión en la cinética infectada con IBM-40 respecto a infectada

con LF-89

En general, se observa una mayor expresión de los marcadores evaluados en los últimos 3

tiempos frente a la cepa patógena IBM-40 respecto a la cepa LF-89. Lo cual sugiere que la cepa

de campo, IBM-40, posee un mayor número de PAMPs reconocidos por TLR que logran activar

la respuesta inmune de una forma mucha más potente. Por lo tanto, la cepa IBM-40 podría ser

mucho más efectiva en la creación de una vacuna contra P. salmonis, ya que se ven activados en

gran medida al menos tres TLR.

100

Figura 22: Esquema representativo del entrecruzamiento en las vías de señalización de

TLR y receptor de Prolactina. Activación de TLR en respuesta a P. salmonis y receptor de

prolactina en respuesta a PRL. Se muestra las moléculas importantes en la cascada de señales de

cada vía, manteniendo una vía común a partir de la activación de NF-ƙB. Además, se representa

la prevalencia de la estimulación de la expresión de IL-1β vía receptor de PRL, obteniendo un

efecto sinérgico cuando se unen ambos estímulos, estimulación con PRL y posterior infección

con P. salmonis.

101

Es importante recordar que este estudio se realizó en cultivo primario, por lo tanto las

interacciones entre distintos tipos celulares y compuestos humorales son posibles. Sin embargo,

es necesario el estudio en el organismo (in vivo) para comprobar que el comportamiento de los

TLR concuerda con el estudio realizado in vitro. Además, es necesario un análisis a nivel

proteico y se podrían agregar más factores para poder comprender el comportamiento del sistema

inmune más global frente a la infección con P. salmonis.

Basándose en los resultados obtenidos, podemos concluir que:

Se expresa RNA mensajero de TLR1, TLR22 y MyD88 en bazo, músculo, corazón,

branquias, intestino, riñón, cerebro e hígado de trucha.

P. salmonis cepa IBM-40, induce la expresión de mRNA de los receptores TLR1, TLR22,

TLR9, además de MyD88 e IL-1β, en cultivo primario de riñón anterior de trucha arcoris.

P. salmonis cepa LF-89, induce la expresión de mRNA de IL-1β sin mediar un aumento

en la expresión de mensajeros de TLR1, TLR22, TLR9 y MyD88 en cultivo primario de

riñón anterior de trucha arcoris.

Proteínas totales de la cepa IBM-40, podría ser una certera forma de exposición de P.

salmonis para una posible vacuna contra ella.

La estimulación previa con prolactina y posterior infección con IBM-40 viva, aumenta la

expresión de IL-1β en forma sinérgica, sin mediar estimulación de la expresión de TLR

en cultivo primario.

102

6. REFERENCIAS

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