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1 EXPRESIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL 4 EN CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS ASOCIADAS A COMPLICACIONES DEL EMBARAZO JERSSON LUIS GRANADOS CUAO 15861015 UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA 2018
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EXPRESIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL 4 EN CÉLULAS DECIDUALES
ESTROMALES HUMANAS ASOCIADAS A COMPLICACIONES DEL
EMBARAZO
JERSSON LUIS GRANADOS CUAO
15861015
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
BUCARAMANGA
2018
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EXPRESIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL 4 EN CÉLULAS DECIDUALES
ESTROMALES HUMANAS ASOCIADAS A COMPLICACIONES DEL
EMBARAZO
JERSSON LUIS GRANADOS CUAO
15861015
Proyecto de grado presentado como parte de los requisitos para la
obtención del título de Magíster en Investigación en Enfermedades
Infecciosas
PhD. Osmany Blanco Muñoz
Tutor
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
BUCARAMANGA
2018
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ACTA DE SUSTENTACIÓN
4
“Dedico esté trabajo a mi familia, quienes han estado a mi lado apoyándome
en escalar este sueño”.
5
AGRADECIMIENTOS
Primeramente a DIOS, quien permitió el regreso a esta ciudad, con puertas
abiertas y nuevas oportunidades.
A mi familia por su apoyo y comprensión, animándome hacia un mejor futuro
y a no desfallecer en esta labor.
A la Dra Osmany Blanco por su tutoría, confianza y dedicación,
enriqueciendo mí andar.
A la Dra Sara Torres por su asesoría y apoyo.
Al cuerpo docente de la Maestría, por sus enseñanzas y aportes a mi vida
profesional.
A todas las entidades participantes que de una u otra manera permitieron la
ejecución de este proyecto.
De manera especial al Dr. Juan Carlos Uribe Caputti, por sus consejos y
asesorías; al Dr. Pedro Silva (Cl. Chicamocha); a la Dra. Malka Wadnipar
(HUS); a las jefes de enfermería Marta Piedad Perez (HLN) y Cristina Isabel
Martinez (UIMIST), por colaborarme con las muestras. Muchas gracias.
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Comparación de placenta de parto normal con placenta de pre-
eclampsia. ..................................................................................................... 20
Figura 2. Disfunción endotelial materna, señalización del VEGF y función del
sFlt-1. ............................................................................................................ 28
Figura 3. Defectos en arterias espirales en la pre-eclampsia.. ..................... 30
Figura 4. Estructura lateral del complejo TLR-4-MD-2-LPS por cristalografía.
...................................................................................................................... 33
Figura 5. Vías de señalización mediadas por TLR4.. .................................... 34
Figura 6. Células DSC en cultivo celular.. ..................................................... 59
Figura 7. Gate FS vs SS de las DSC control. ............................................... 60
Figura 8. DSC cultivadas de control y PE, no expresaron CD45 y CD62p. .. 61
Figura 9. Fenotipo antigénico de las DSC cultivadas control y PE.. ............. 62
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1,5% ARN de las DSC cultivadas.
...................................................................................................................... 63
Figura 11. Curva de amplificación prueba eficiencia de primers.. ................. 64
Figura 12. Curva de amplificación RT-PCR en tiempo real para los ARNm
TLR4 y B-actina ............................................................................................ 65
Figura 13. Determinación de la eficiencia de la RT-PCR en tiempo real para
ARNm TLR4.................................................................................................. 67
Figura 14. Determinación de la eficiencia de la PCR en tiempo real para el
ARNm B-actina ............................................................................................. 68
Figura 15. Análisis de la expresión génica del TLR4 por RT-PCR en tiempo
real a partir de DSC control y DSC PE.. ....................................................... 69
Figura 16. Secreción de IL-6 por DSC en cultivo. ......................................... 70
Figura 17. Secreción de IL-10 por DSC en cultivo. ....................................... 71
7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Fenotipo antigénico de células deciduales estromales en cultivo. .. 18
Tabla 2. Variables analizadas condición clínica de las maternas. ................ 58
Tabla 3. Cuantificación y pureza del ARN extraído a partir de células DSC
cultivadas ...................................................................................................... 63
Tabla 4. Resultados de Ct de la RT-PCR en tiempo real para ARNm TLR4 y
B-actina de DSC control y PE. ...................................................................... 65
Tabla 5. Eficiencia reacción RT-PCR en tiempo real para el ARNm TLR4 ... 66
Tabla 6. Eficiencia reacción RT-PCR en tiempo real para el ARNm B-actina
...................................................................................................................... 67
Tabla 7. Comparación de Ct ARNm B-actina vs ARNm TLR4. ..................... 69
Tabla 8. Secreción de IL-6 e IL-10 por células DSC cultivadas control y PE. 70
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LISTA DE ABREVIATURAS
AP-1: Proteína Activadora 1 (Factor de transcripción)
BAFF: Factor de Activación de Células B
cAMP: Adenosina monofosfato cíclico
CD: Cúmulo de Diferenciación
CPA: Células Presentadoras de Antígenos
DAMP: Patrones Moleculares Asociados a Daño
DSC: Células Deciduales Estromales
ECM: Matriz extracelular
EnSC: Células Estromales Endometriales
HLA-DR: Antígeno Leucocitario Humano DR
HLA-G: Antígeno Leucocitario Humano G
HMG-B1: Proteína de alta movilidad del grupo 1
IFN-α: Interferon alfa
IFN-β: Interferón beta
IFN-γ: Interferón gamma
IKK: Complejo quinasa central
IL: Interleuquina
IRAK: Proteínas quinasas asociadas a interleucina-1
IRF3: Factor Regulador del Interferón 3
Iκβα: Inhibidor alfa de NF-κβ
LBP: Proteína de unión a LPS
LCA: Antígeno Leucocitario Común
LDL: Lipoproteína de Baja Densidad
LPS: Lipopolisacaridos
LRR: Repeticiones Ricas en Leucina
MAPK: Proteínas Quinasas Activadas por Mitógenos
MD-2: Proteína de Diferenciación Mieloide 2
MEC: Matriz extracelular
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MSC: Células Madre Mesenquimales
MyD88: Proteína de Diferenciación Mieloide 88
NF-κβ: Factor Nuclear κβ
NK: Células Natural Killers
PAMP: Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
PE: Pre-eclampsia
PG: Peptidoglicano
PIGF: Factor de crecimiento placentario
PRR: Receptores de Reconocimiento de Patrones
PVSC: Parto vaginal sin complicaciones (control)
RCF: Restricción del crecimiento fetal
RNS: Especies reactivas del Nitrógeno
ROS: Especies reactivas del Oxígeno
SARM: Proteína que contiene el motivo estéril alfa y armadillo (proteína
de señalización del adaptador).
sENG: Endoglina soluble
sFlt-1: Tirosina quinasa – 1 soluble
TAK1: Quinasa 1 activadora del Factor de Crecimiento Transformante
TIR: Receptor de Interleucina 1/Toll
TIRAP: Proteína Adaptadora con Domino TIR
TLR: Receptor Tipo Toll
TLR4: Receptor Tipo Toll – 4
TNF-α: Factor de Necrosis Tumoral - alfa
TRAF-6: Receptor Asociado al Factor de Necrosis Tumoral alfa 6
TRAM: Molécula Asociada a Receptor Tipo Toll
TRIF: Adaptador Inductor de Interferón β/TIR
α-SMA: Actina de musculo liso alfa
VEGF: Factor de crecimiento del endotelio vascular
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TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 14
1. PARTICIPANTES EN EL DESARROLLO DEL EMBARAZO .................... 15
1.1 CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES ........................................... 15
1.1.1 Fenotipo antigénico de las DSC .................................................... 16
1.2 INTERFASE MATERNO-FETAL ......................................................... 19
1.3 COMPLICACIONES DEL EMBARAZO ............................................... 22
1.4 PRE-ECLAMPSIA ................................................................................ 24
1.5 ESTRUCTURA Y SEÑALIZACIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL – 4 31
1.5.1. Expresión de TLR4 en placentas asociadas a patologías del
embarazo ............................................................................................... 35
1.6 CITOQUINAS EN EL EMBARAZO ...................................................... 38
1.7 INFECCIÓNES DURANTE EL EMBARAZO ....................................... 41
1.7.1 Enfermedad periodontal y complicaciones del embarazo ............ 44
1.7.2 Infección urinaria y pre-eclampsia ................................................ 47
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 50
2.1 OBJETIVO GENERAL ......................................................................... 50
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 50
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 51
3.1 DEFINICIÓN DE SUJETOS DE ESTUDIO .......................................... 51
3.1.1 Aspectos éticos del proyecto ......................................................... 51
3.1.2 Criterios de inclusión ..................................................................... 52
3.1.3 Criterios de exclusión ................................................................... 52
3.1.4 Obtención de las muestras ............................................................ 52
3.2 CULTIVO CELULAR ............................................................................ 53
3.2.1 Obtención, purificación y cultivo de las DSC ................................. 53
3.2.2 Recolección de sobrenadantes ..................................................... 54
3.3 CITOMETRÍA DE FLUJO .................................................................... 54
3.3.1 Análisis del fenotipo antigénico de las DSC .................................. 54
11
3.4 ENSAYO RT-PCR EN TIEMPO REAL ................................................ 55
3.4.1 Preparación del cultivo de DSC ..................................................... 55
3.4.2 Extracción de ARN total ................................................................ 55
3.4.3 RT-PCR en tiempo real ................................................................. 56
3.5 PRUEBA DE ELISA ............................................................................. 57
3.5.1 Detección de citoquinas ................................................................ 57
3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................... 57
4. RESULTADOS .......................................................................................... 58
4.1 CONDICIÓN CLÍNICA DE LAS PARTICIPANTES .............................. 58
4.2 CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA DE LAS DSC .............................. 59
4.2.1 Aislamiento de DSC obtenidas de placentas ................................. 59
4.2.2. Fenotipo antigénico de DSC cultivadas ........................................ 60
4.3 EXPRESIÓN GÉNICA DEL TLR4 POR LAS DSC .............................. 62
4.3.1 Extracción e integridad del ARN .................................................... 62
4.3.2 Eficiencia de primers ..................................................................... 63
4.3.3 Expresión del TLR4 ....................................................................... 64
4.4 SECRECIÓN DE CITOQUINAS .......................................................... 70
4.4.1 Secreción de IL-6 por las células DSC en cultivo, control y PE ..... 70
4.4.2 Secreción de IL-10 por las células DSC en cultivo, control y PE ... 71
5. DISCUSIÓN .............................................................................................. 72
6. CONCLUSIONES ..................................................................................... 85
7. REFERENCIAS ........................................................................................ 86
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RESUMEN
TITULO: EXPRESIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL 4 EN CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES HUMANAS ASOCIADAS A COMPLICACIONES DEL EMBARAZO AUTOR: JERSSON LUIS GRANADOS CUAO PALABRAS CLAVE: Células deciduales estromales, DSC, TLR4, pre-eclampsia, citoquinas.
DESCRIPCIÓN La Pre-eclampsia (PE) es una enfermedad multisistémica sin causa conocida que afecta entre el 5-7% de mujeres embarazadas, siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad materno-fetal en todo el mundo. La asociación entre infección e inflamación es considerada la causa principal de complicaciones como la PE, con aumento de citoquinas favoreciendo la disfunción endotelial en placenta. Las células deciduales estromales (DSC) constituyen el principal componente celular de la decidua y protegen al feto frente a bacterias Gram negativas y señales de peligro que emanan de inflamación severa con o sin infección. A través de la expresión del receptor tipo Toll 4 (TLR4) las DSC regulan la respuesta inmune innata durante la infección. El objetivo fue analizar el comportamiento inmunomodulador in vitro de las DSC a partir de PE. Materiales y métodos: estudio analítico de casos y controles. Las DSC fueron aisladas y cultivadas a partir de tejido placentario, de pacientes con parto vaginal sin complicaciones (control, n=6) y parto por cesárea con pre-eclampsia (PE, n=6). La caracterización fenotípica de las DSC se efectuó mediante análisis por citometría de flujo. La expresión del ARN mensajero del TLR4 se cuantificó por RT-PCR en tiempo real. Finalmente, la determinación de citoquinas se realizó por medio de ELISA a partir de sobrenadantes de cultivos celulares. Resultados: la expresión de antígenos característicos fue similar en las DSC estudiadas (CD10, CD29, CD44, CD73 y CD90). La expresión génica del TLR4, no presentó diferencia significativa (p=0,136). Las DSC control secretaron mayor cantidad de IL-6 (media=3631,7pg/mL) en comparación con las de PE (760pg/mL). La secreción de IL-10 presento diferencia significativa (control=4pg/mL, PE11,2pg/mL). Conclusiones: las DSC control y PE no presentaron diferencias significativas en la expresión del TLR4, se sugiere un papel protector a nivel placentario.
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ABSTRACT
TITLE: EXPRESSION OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4 IN HUMAN DECIDUAL
STROMAL CELLS ASSOCIATED WITH PREGNANCY COMPLICATIONS
AUTHOR: JERSSON LUIS GRANADOS CUAO
KEYWORDS: Decidual Stromal Cells, DSC, TLR4, pre-eclampsia, cytokines.
DESCRIPTIÓN
Pre-eclampsia (PE) is a multisystemic disease with no known cause that affects 5-7% of pregnant women, being one of the main causes of maternal-fetal morbidity and mortality worldwide. The association between infection and inflammation is considered the main cause of complications such as PE, with increased cytokines favoring endothelial dysfunction in the placenta. Decidual stromal cells (DSC) constitute the main cellular component of the decidua and protect the fetus against Gram-negative bacteria and warning signs that emanate from severe inflammation with or without infection. Through the expression of Toll-like receptor 4 (TLR4), DSCs regulate the innate immune response during infection. The objective was to analyze the in vitro immunomodulatory behavior of DSCs from PE. Materials and methods: analytical case and control study. The DSCs were isolated and cultured from placental tissue, from patients with uncomplicated vaginal delivery (control, n = 6) and cesarean delivery with pre-eclampsia (PE, n = 6). The phenotypic characterization of the DSC was carried out by means of flow cytometry analysis. The expression of the TLR4 messenger RNA was quantified by RT-PCR in real time. Finally, the determination of cytokines was performed by means of ELISA from supernatants of cell cultures. Results: the expression of characteristic antigens was similar in the DSC studied (CD10, CD29, CD44, CD73 and CD90). Gene expression of TLR4 did not present a significant difference (p = 0.136). Control DSCs secreted a higher amount of IL-6 (mean = 3631.7pg / mL) compared to PE (760pg / mL). The secretion of IL-10 showed significant difference (control = 4pg / mL, PE11.2pg / mL). Conclusions: control DSC and PE did not present significant differences in the expression of the TLR4; a protective role at the placental level is suggested.
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INTRODUCCIÓN
La decidua es el tejido materno que se encuentra en íntimo contacto con la
parte fetal durante el embarazo (Ramathal, Bagchi, Taylor, & Bagchi, 2010),
en ella se desencadenan mecanismos de tolerancia para el caso de
embarazo normal o de activación inmunitaria frente al trofoblasto en aborto
espontaneo y pre-eclampsia. Este tejido ampliamente estudiado, está
compuesto por diversas células de tipo inmunológico donde las más
abundantes son las células deciduales estromales (DSC) (Zhang et al.,
2014). Las DSC ejercen diversas funciones inmunitarias que sugieren
representan un papel relevante en las relaciones fisiológicas y patológicas
entre la madre y el feto.
La pre-eclampsia (PE) es considerada la enfermedad hipertensiva del
embarazo, se caracteriza por ser de etiología multifactorial sin causa
conocida (Hutcheon, Lisonkova, & Joseph, 2011; Itami-Sordo, Jiménez-Nieto,
& de Haro, 2013; Lopez, Llamas, & Sanchez, 2015). Esta enfermedad se
asocia a mecanismos que incluyen remodelación defectuosa de la arteria
espiral, disfunción endotelial, estado anti-angiogénico, estrés oxidativo,
respuesta inflamatoria exagerada intravascular y una respuesta inmune Th1
exacerbada (Conde-Agudelo, Villar, & Lindheimer, 2008; DiGiulio et al., 2010;
Kar, 2014).
La inmunidad innata juega un papel fundamental durante el embarazo por
medio de los receptores tipo Toll (TLR), a través del reconocimiento de
diversas moléculas, siendo expresados por células inmunes y no inmunes
(Akira, Uematsu, & Takeuchi, 2006; Krikun et al., 2007). El TLR-4 reconoce
principalmente lipopolisacaridos (LPS) de bacterias Gram negativas,
resultando la producción de citoquinas pro-inflamatorias, por lo que se ha
sugerido estar implicado no sólo en la infección, sino también en las
condiciones de no infección relacionadas con el embarazo. Se ha estudiado
la expresión y localización de TLRs en placentas de embarazos normales y
de algunas complicaciones, sin definirse realmente que células se
encuentran expresando TLR-4 en estas situaciones (Krikun et al., 2007;
Schatz et al., 2012). Es necesario determinar la expresión del receptor TLR-4
en DSC de pacientes con pre-eclampsia y analizar el papel que cumplen a
través de la secreción de citoquinas, con el fin de elucidar aspectos
relacionados con la fisiopatología de esta enfermedad.
15
1. PARTICIPANTES EN EL DESARROLLO DEL EMBARAZO
1.1 CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES
Las células deciduales estromales (DSC) son un tipo de célula presente en la
placenta de los mamíferos durante el embarazo, este tipo particular de
células proviene de la proliferación y diferenciación (decidualización) de un
precursor de células del estroma que se localizan en el endometrio no
gestante (células endometriales estromales – EnSC) (Richards, Brar, Frank,
Hartman, & Jikihara, 1995). Las DSC ejercen diversas funciones
inmunológicas que incluyen la protección del feto frente al ataque de
bacterias Gram negativas y de sustancias de peligro que emanan de la
inflamación severa con o sin infección, esto gracias a la expresión de TLR4
(Schatz et al., 2012b). Así mismo las DSC se han descrito como células
presentadoras de antígenos (Olivares, Montes, Oliver, Galindo, & Ruiz, 1997)
y células fagocitarias (Ruiz, Montes, Abadía-Molina, & Olivares, 1997). Estas
investigaciones han contribuido a determinar que las DSC presentan un
papel relevante en las relaciones fisiológicas y patológicas entre la madre y
el feto, siendo un factor importante en el mantenimiento de las primeras
etapas de la gestación (Iwabe et al., 2000; M. Montes et al., 1995; Nasu et
al., 1999).
Estas células presentan un gran número de ribosomas, cuerpos residuales,
lisosomas, mitocondrias y microfilamentos, y acumulan gran cantidad de
glucógeno y lípidos en el citoplasma (C Oliver, Montes, Galindo, Ruiz, &
Olivares, 1999). Por otro lado se ha demostrado que participan en la
remodelación de la matriz extracelular (ECM) produciendo colágeno IV,
fibronectina, laminina y actina de musculo liso alfa (α-SMA) (Saleh, Otti,
Fiala, Pollheimer, & Knöfler, 2011). Se ha demostrado que las DSC de
16
mujeres con embarazos a término expresan diferentes receptores tipo toll
(TLRs) como TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6, además de responder al estímulo
con lipopolisacaridos (LPS) y peptidoglicano (PG), demostrando su
participación en la inmunidad innata a través de la producción de citoquinas
en respuesta a ligandos bacterianos (Canavan & Simhan, 2007).
La decidua es el tejido materno que se encuentra en íntimo contacto con la
parte fetal durante el embarazo (Ramathal, Bagchi, Taylor, & Bagchi, 2010),
en donde las DSC constituyen el principal componente celular (Erlebacher,
2013) con funciones en la regulación de la invasión del trofoblasto, la
modulación de las reacciones inmunes e inflamatorias y el control de la
remodelación tisular del endometrio (Gellersen & Brosens, 2014). Por estas
razones las DSC exhiben un papel fundamental de gran impacto en la
receptividad del endometrio, influyendo en la implantación y el desarrollo del
embarazo.
1.1.1 Fenotipo antigénico de las DSC
Las DSC en cultivo exhiben antígenos asociados a diferentes tipos de células
hematopoyéticas como son el CD1a, CD11b, CD13, CD16, CD20, entre otros
(Lysiak & Lala, 1992), siendo negativas para marcadores de linaje como
CD3, CD14, CD19 y CD45, este último una tirosín fosfatasa conocida como
antígeno leucocitario común (leukocyte common antigen – LCA) que está
presente en todas las células humanas de origen hematopoyético, con
excepción de eritrocitos, plaquetas y sus precursores celulares (Montes et al.,
1996). Las DSC forman poblaciones de células adherentes uniformes que
expresan antígenos CD10, CD29, CD73 y α-SM actina, por lo que se asocian
a células madres mesenquimales (MSC) (Dimitrov et al., 2010). Un número
17
de moléculas sugeridas como marcadores de las DSC se describen en la
Tabla 1.
En los seres humanos las DSC están relacionadas con precursores
estromales de médula ósea (García-Pacheco, Oliver, Kimatrai, Blanco, &
Olivares, 2001), la expresión de antígenos CD10 y CD13, peptidasas
expresadas por células mielomonocíticas apoyan esta consideración (Montes
et al., 1996). Así mismo, su morfología y fenotipo son similares a
miofibroblastos, estas son semejantes a células de musculo liso con gran
capacidad contráctil (Kimatrai, Oliver, Abadía-Molina, García-Pacheco, &
Olivares, 2003; Ramos Abraham, Becerrir Berrocal, Cisneros Lira, & Montaño
Ramirez, 2004) .
Las DSC expresan niveles bajos pero significativos de HLA-G, este inhibe la
actividad citotóxica de las células Natural Killers (NK) contra el trofoblasto y el
deterioro fisiológico (por apoptosis) de DSC. Esta expresión puede ser
modulada por hormonas como la progesterona in vivo e in vitro
(decidualización), y por citoquinas anti-inflamatorias como la IL-10, y pro-
inflamatorias como el IFN-γ, demostrándose que promueven el desarrollo de
un embarazo normal (Osmany Blanco et al., 2008).
Las DSC regulan la respuesta inmunológica en la decidua protegiendo de la
apoptosis a las células NK y linfocitos T (O Blanco, Leno-Duran, Morales,
Olivares, & Ruiz-Ruiz, 2009), siendo capaces de conducir a un embarazo
exitoso. La producción del Factor de activación de células-B (BAFF) por las
DSC, puede estar implicado en la inducción de la respuesta Th2 (Langat,
Wheaton, Platt, Sifers, & Hunt, 2008), considerada la respuesta
inmunológica asociada al embarazo normal (Saito, 2010), así como a la
inhibición de la apoptosis de células T y células NK en la decidua, donde casi
no existen células B (O Blanco et al., 2009; Muñoz-Fernández et al., 2012).
18
Las DSC poseen propiedades similares a células madre mesenquimales y
cumplen con los criterios mínimos para definirlas como MSC multipotentes.
Su capacidad de diferenciarse a varios linajes (osteoblastos, adipocitos y
condroblastos), emigración, proliferación y contractilidad, además de su
amplia expresión de moléculas que están implicadas en muchas funciones
celulares (citoquinas, factores de crecimiento y moléculas inmunes),
demuestran la gran influencia que pueden ejercer en el microambiente donde
se encuentren (Dominici et al., 2006). En consecuencia las DSC son un
candidato con gran potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades
humanas asociadas a inflamación y estrés oxidativo (cánceres, trastornos
inmunitarios, enfermedades hepáticas y cardiovasculares) (Abomaray et al.,
2016).
Tabla 1. Fenotipo antigénico de células deciduales estromales en cultivo.
Antígenos Citometría de flujo Antígenos Citometría de flujo
Linaje Hematopoyético Células Madre Mesenquimales
CD45 - CD10 +++
Linaje de Células T CD29 +++
CD1a ++ CD34 -/+
CD3 - CD54 +++
CD7 - CD71 +++
Linaje Células B CD73 +++
CD20 ++ CD90 +++
CD21 ++ CD106 +/-
CD22 - Otros
CD24 + CD31 -
Linaje Natural Killers CD44 +++
CD56 - CD46 -/+
19
Linaje Mielomonocítico CD55 +++
CD11b ++ CD59 +
CD13 -/+ CD105 +
CD14 - CD142 -/+
CD15 - CD166 +
CD16 - HLA-DR -
CD33 - HLA-G +
CD36 ++ BAFF +++
Células Presentadoras de Antígeno Filamentos Intermedios
CD80 ++ α-SM actina +++
CD86 ++ Vimentina +++
Células Foliculares Dendríticas Citoqueratina -
CD21 ++
CD23 ++
CD35 +
1.2 INTERFASE MATERNO-FETAL
Es el lugar de tolerancia activa hacia el embrión en donde se relacionan el
trofoblasto placentario, la parte materna que contiene células (DSC) y
leucocitos maternos (dNK, macrófagos), resultando una zona en donde se
promueve el equilibrio y la tolerancia inmunológica durante el embarazo. La
mucosa uterina cumple una función importante en la implantación del
embrión, presentando un proceso de reacción del tejido en el cual se
especializa y se denomina decidualización, el cual se presenta para apoyar
el desarrollo y la función de la placenta (Erlebacher, 2013; PrabhuDas et al.,
2015). La placenta constituye una barrera física e inmunológica contra la
invasión de agentes infecciosos, proponiéndose como un componente del
embarazo específico del sistema inmune innato (Fazeli, Bruce, & Anumba,
20
2005; Holmlund et al., 2002; Young, Lyddon, Jorgenson, & Misfeldt, 2004).
Este tejido está compuesto por dos áreas, una fetal conformada
principalmente por el corion frondoso y una materna compuesta por la
decidua basal (Vázquez-Rodríguez et al., 2011). A nivel de la placenta se
encuentran diferentes tipos de células linfocíticas, identificándose
principalmente NK, macrófagos (CD14+), linfocitos T CD3+ en diferentes
porcentajes. También se encuentran células dendríticas (DC) y células T
reguladoras (Treg) (Hanssens, Salzet, & Vinatier, 2013). En placentas de
embarazos normales se describe una baja expresión de TLR4 en
comparación de placentas pre-eclámpticas. Sin embargo, en las placentas
pre-eclámpticas se observa un incremento en la densidad del estroma
velloso y del número de nodos sincitiales (Figura 1) (Pineda, Verdin-Terán,
Camacho, & Moreno-Fierros, 2011).
Figura 1. Comparación de placenta de parto normal con placenta de
pre-eclampsia. A: placenta parto normal, B: placenta parto pre-eclampsia,
flechas rojas: incremento de nodos sincicitial, flechas verdes: densidad de
estroma velloso. Adaptada de Pineda et al., 2011.
Las células NK expresan diferentes propiedades genotípicas, fenotípicas y
funcionales, ubicadas alrededor de las glándulas endometriales y de arterias
espirales, estudios comparativos de expresión de genes entre pNK
21
(placenta), eNK (endometriales) y dNK (deciduales), demuestran que las dNK
son células diferentes, ya que expresan específicamente algunos genes y
sobre expresan otros (CD56bright CD16neg CD160neg) con actividad de
protección propia en decidua a pesar que los trofoblastos expresan
aloantígenos paternos en su superficie, incluidas moléculas polimórficas
como HLA-C (Hanssens et al., 2013; Hod, Cerdeira, & Karumanchi, 2015).
Las DC sintetizan Factor de Crecimiento Transformante – Beta 1 (TGF-β1),
este se encarga de inhibir las células citotóxicas y promover el desarrollo de
las células Treg. Las DC interactúan con el antígeno HLA-G expresado por
las células trofoblásticas, haciéndolas tolerantes por medio de la fijación de la
galectina 1 (Gal-1) y mediante la secreción de la IL-27, que también induce la
aparición de las células Treg (Hanssens et al., 2013). Así mismo, participan
en la regulación del equilibrio Th1/Th2 orientando la respuesta hacia la vía
Th2 por medio de la secreción de quimiocina CCL1, que atrae las células
Th2 y las células Treg. En presencia de estradiol las DC invierten la balanza
IL-10/IL-12 predominando la IL-10 creando un ambiente de citoquinas tipo
Th2.
Los macrófagos en su papel como células presentadoras de antígeno,
participan en la eliminación de organismos patógenos, limpieza de células en
apoptosis y formación de nuevos vasos sanguíneos, proceso conocido como
angiogénesis, expresando una gran flexibilidad fenotípica y funcional que es
determinada por el microambiente el cual varia durante el embarazo, lo que
hace que adapten su funcionamiento en cada etapa. En el embarazo normal
los macrófagos deciduales son del tipo M2 con propiedades
inmunosupresoras en un ambiente de citoquinas Th2 (IL-4, IL-10 e IL13); en
patologías como la pre-eclampsia, la cual se encuentra asociada a una
respuesta Th1 exacerbada, se presenta estimulación por LPS, TNFα e INFγ,
lo que orienta a los macrófagos a la vía M1 produciendo radicales libres y
22
monóxido de nitrógeno (NO) para neutralizar los microorganismos, elevando
también la producción de TNFα, IL-1β, IL-8 e IL-12 (Hanssens et al., 2013;
Itami-Sordo, Jiménez-Nieto, & de Haro, 2013).
1.3 COMPLICACIONES DEL EMBARAZO
El desarrollo del embarazo normal requiere la vasculogénesis y la
angiogénesis en el compartimiento fetal, pero también angiogénesis en el
compartimiento materno. Para una implantación exitosa del trofoblasto se
requiere de varios factores angiogénicos, como el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF) el cual estimula la capacidad vascular induciendo
la formación y crecimiento de vasos sanguíneos. La circulación materna
también debe sufrir cambios dramáticos para un embarazo exitoso,
incluyendo el desarrollo de las arterias espirales uteroplacentarias para
aumentar la entrega de sangre hacia el espacio intervelloso. En trastornos
del embarazo diversos autores coinciden en un aumento de la vasodilatación
de estas arterias, debido a que no se cumple con la remodelación y
transformación requerida de las arterias espirales para asegurar la entrega
adecuada de nutrientes y oxígeno, para mantener el embarazo a término.
Una característica única de la biología del embarazo es que el trofoblasto
extravelloso invade la decidua y miometrio, el cual también juega un papel
importante en la remodelación de la circulación materna y probablemente
aporta en la dirección del diálogo inmunológico que ocurre en la interfase
materno-fetal. De estos procesos depende una buena concepción del
embarazo normal, siendo esenciales para evitar complicaciones. El fracaso
de la transformación fisiológica de las arterias espirales ha sido estudiado
usando biopsias de placentas en varios síndromes obstétricos, observándose
fallo de la transformación fisiológica en mujeres que han presentado abortos
espontáneos, parto prematuro, rotura temprana de membranas y
23
desprendimiento prematuro de la placenta. Contrario a lo que se creía,
lesiones en la transformación fisiológica no se limitan a la pre-eclampsia (PE)
y restricción del crecimiento intrauterino. Los trastornos de la placentación
profunda están presentes en una amplia gama de complicaciones del
embarazo que implican la transformación de las arterias espirales (Romero,
Kusanovic, Chaiworapongsa, & Hassan, 2011), donde también las DSC
desempeñan un papel fundamental en el desarrollo y equilibrio del ambiente
materno.
Las complicaciones del embarazo presentan una base común en su
desarrollo establecido por una angiogénesis inadecuada o transformación
fisiológica incorrecta de las arterias espirales conduciendo a la isquemia en
la placenta y el útero, produciendo lesiones que se han considerado como
resultado de la hipoperfusión materna de la placenta (trastorno de la
placentación) (Erlebacher, 2013; Vargas, Acosta, & Moreno, 2012). La
evidencia experimental muestra las consecuencias que indica disminución de
suministro de sangre que puede llevar a la muerte fetal, restricción del
crecimiento fetal, PE y parto prematuro. Un estado anti-angiogénico
inadecuado ha sido indicado en las complicaciones del embarazo, así como
cambios en las concentraciones de factores angiogénicos y anti-
angiogénicos, muestran que pueden ser la causa de estas complicaciones.
El aumento de las concentraciones maternas de factores como la tirosina
quinasa – 1 soluble (sflt-1), endoglina soluble (sEng), que son anti-
angiogénicos poderosos han sido reportados en mujeres con PE y en casos
con muerte fetal (Chaiworapongsa et al., 2010).
Una investigación en ratas reveló que la infección es uno de los principales
factores ambientales que conducen a parto prematuro (Garcia-Verdugo et al.,
2007). Un estudio en modelo murino demostró que el TLR4 desempeña un
papel fundamental en el parto prematuro inducido por inflamación, el modelo
24
fue establecido por aplicación de inyecciones intraperitoneales de LPS con y
sin bloqueo de TLR4. Posteriormente calcularon la incidencia de parto
prematuro estableciendo que cuando se produce el bloqueo de TLR4,
disminuyó significativamente el parto prematuro inducido y la muerte fetal.
Sin embargo, a pesar de una creciente asociación entre la inflamación y
parto prematuro, los mecanismos subyacentes que explican el desarrollo de
este y de complicaciones del embarazo después de la infección son poco
entendidos (Li, Kang, & Lei, 2010).
1.4 PRE-ECLAMPSIA
La pre-eclampsia (PE) es un trastorno multisistémico del embarazo, que se
caracteriza por la presencia de hipertensión después de 20 semanas de
gestación (TA > 140/90 mmHg) y antes del inicio del parto, con presencia de
proteinuria (≥ 30 mg/dL en orina al azar ó 300 mg/orina 24 horas) y cualquier
complicación polisistémica. También se considera este trastorno si después
del parto no desaparecen todas estas anomalías antes de la sexta semana
(Bounds, Newell-Rogers, & Mitchell, 2015; Lopez, Llamas, & Sanchez, 2015;
Steegers, von Dadelszen, Duvekot, & Pijnenborg, 2010; Uzan, Carbonnel,
Piconne, Asmar, & Ayoubi, 2011). La PE afecta al 5-8% de todos los
embarazos, suele manifestarse con inicio precoz (<34 semanas) o tardío
(≥34 semanas), siendo la principal causa de partos prematuros. Hasta el
presente no se conoce ninguna cura aparte del parto, causando una
morbilidad y mortalidad perinatal significativa secundaria a la prematuridad
iatrogénica (Kell & Kenny, 2016).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ubica a Colombia dentro de los
países con alta mortalidad materna por PE, enfermedad que a nivel mundial
es considerada como la principal causa de morbilidad y mortalidad materno-
25
fetal (Erlebacher, 2013; Vargas et al., 2012). En nuestro país es considerada
un problema de salud pública de alto costo, donde trastornos hipertensivos
del embarazo se estima representan un 35% de todas las muertes
(BUITRAGO et al., 2013; Lopez et al., 2015). En general, entre el 10% y el
15% de las muertes maternas se asocian directamente con pre-eclampsia y
eclampsia (Duley, 2009). Mujeres con antecedentes maternos presentan un
riesgo de 2 a 5 veces mayor para el desarrollo de PE. Dependiendo de la
etnicidad, la incidencia de pre-eclampsia oscila entre 3% y 7% en nulíparas
sanas y entre 1% y 3% en multíparas (Uzan et al., 2011).
En gestantes con PE se observa un mayor riesgo de desarrollar enfermedad
cardiovascular luego del parto. Estudios realizados a mujeres que cursan con
PE, en análisis de laboratorio se encontró que tuvieron un elevado recuento
de leucocitos e incremento en citoquinas de tipo inflamatorio. Por el contrario,
las citoquinas reguladoras estaban disminuidas. Esto implica fuertemente al
sistema inmunológico materno como un contribuyente principal a la
patogénesis en la PE. Sin embargo, no está claro si la activación excesiva
del sistema inmunológico materno inicia el desarrollo de PE o participa en
una etapa posterior a la PE (Bounds et al., 2015).
La PE sigue siendo una de las enfermedades que representa mayor interés
debido a su alta complejidad y la gran cantidad de interrogantes que aún
rondan su fisiopatología y etiopatogenia. En la actualidad se acepta que la
PE surge de una interacción interrumpida entre la placenta y el útero materno
que causa la disfunción de las células endoteliales. El embarazo normal se
caracteriza por una respuesta inflamatoria sistémica de bajo grado y cambios
metabólicos específicos, además la inmunidad de tipo Th1 está inhibida,
predominando la inmunidad de tipo Th2. Todas las características del
embarazo normal se exageran en PE (Sacks, Studena, Sargent, & Redman,
1998), al igual que otros aspectos de la enfermedad, tampoco se sabe por
qué ocurre la inflamación excesiva (Al-Ofi, Coffelt, & Anumba, 2014).
26
La fisiopatología de la PE implica placentación aberrante y un aumento de la
inflamación que se asocia al nivel sistémico. En este sentido la PE es más
probable cuando el nivel de carga inflamatoria sistémica inherente en el
embarazo, en sí excede la capacidad materna para compensar este estrés
adicional. Las enfermedades infecciosas aumentan la carga inflamatoria
sistémica. Dado que la infección urinaria representa una fuente común de
inflamación durante el embarazo, se determinó que la presencia de ITU en el
embarazo, particularmente en el tercer trimestre, está fuertemente asociada
con la PE. Esta asociación apoya la hipótesis de que el riesgo de PE se ve
reforzado por un aumento de la carga inflamatoria materna (Easter et al.,
2016).
La expresión y la función de los TLRs en la interfase materno-fetal pueden
desempeñar un papel importante en la placentación normal, donde las
“señales de peligro” son reconocidas por los trofoblastos a través del TLR4.
Estos pueden desempeñar un papel clave aportando al medio local
citoquinas pro-inflamatorias que conducen al desarrollo de PE. Estudios in
vitro demostraron que el TNF-α y los LPS de bacterias Gram negativas
aumentan la expresión del TLR4 en células de trofoblastos, de este modo la
respuesta de las células trofoblasticas frente a productos bacterianos y
"señales de peligro" es mejor. Por tanto este mecanismo patogénico se
vincula a la activación del sistema inmune innato a través del TLR4,
aportando en el desarrollo de la PE (Y. M. Kim et al., 2005).
Estudios epidemiológicos han establecido un mayor riesgo de PE en
pacientes con infecciones por patógenos específicos, sugiriendo que los
productos bacterianos o virales pueden causar y contribuir a una respuesta
inflamatoria hiperactiva. Sin embargo, muchos pacientes con PE no
presentan características clínicas de infección, lo que indica que los factores
27
endógenos pueden causar y contribuir a las características inflamatorias de
la enfermedad (Al-Ofi et al., 2014). De igual manera, se ha establecido un
incremento en el riesgo de PE en pacientes con infecciones por patógenos
no específicos (Minassian, Thomas, Williams, Campbell, & Smeeth, 2013).
Los niveles en circulación de fibrinógeno se incrementan durante el
embarazo normal, aunque es mayor en pacientes con PE, lo que induce una
mayor expresión de citoquinas inflamatorias por parte de monocitos de
mujeres con PE. Estos datos sugieren que este ligando endógeno del TLR4
puede tener un papel importante en el sostenimiento de la respuesta
inflamatoria exagerada en pacientes con PE (Al-Ofi et al., 2014). Alteraciones
de los factores angiogénicos circulantes indican que juegan un papel en la
patogenia de la PE. Factores como el VEGF y el PlGF, además de las
proteínas anti-angiogénicas, como la endoglina soluble (sEng) y la tirosina
quinasa 1 soluble (sFlt-1) se encargan de regular estrechamente la
angiogénesis, también son esenciales para el mantenimiento de las
condiciones saludables de los vasos sanguíneos. La síntesis y la acción de
estos factores y sus receptores en el lecho uterino y la placenta son
esenciales para el desarrollo placentario normal y el embarazo. En la PE, se
encuentran aumentados los niveles de sFlt-1 y sEng, donde el sFlt-1 se une
al VEGF y al PlGF en circulación y en tejidos, impidiendo interactuar con sus
receptores de membrana en el endotelio vascular (Figura 2) (Hod et al.,
2015).
En las últimas décadas, investigaciones han llevado al desarrollo de un
modelo etiológico en el que se perciben dos etapas para la PE, la primera
consiste en la remodelación inadecuada de las arterias espirales maternas
que podría ocurrir en la gestación temprana dando como resultado un
desarrollo placentario deficiente (isquemia/reperfusión y estrés oxidativo)
(Genc et al., 2011); la segunda etapa se presenta como consecuencia de la
28
primera, lo que conlleva a una disfunción de las células endoteliales
vasculares maternas y manifestaciones maternas de la enfermedad
(Redman, Sargent, & Staff, 2014).
Figura 2.Disfunción endotelial materna, señalización del VEGF y función
del sFlt-1. La evidencia existente indica que el VEGF y el PIGF, son
necesarios para el mantenimiento del endotelio de tejidos en condiciones
sanas, incluyendo la placenta y el riñón. Durante el embarazo normal, la
placenta produce concentraciones moderadas de VEGF, PIFG y sFlt-1. En la
pre-eclampsia, se evidencia un exceso de sFlt-1 placentario, este se une al
VEGF y al PIGF circulantes, bloqueando su interacción con los receptores de
la superficie celular endotelial lo que conduce a la disfunción endotelial.
Modificado de (Karumanchi, Maynard, Stillman, Epstein, & Sukhatme, 2005).
Sobre este modelo existen muchas inconsistencias clínicas, debido a que
existe asociación entre la mala placentación y la PE. Sin embargo, no es
específica. En este sentido la mala placentación y la restricción del
crecimiento fetal (RCF) se presentan con frecuencia sin signos maternos de
PE. Por otra parte, RCF no es una característica consistente de PE (Xu
Xiong, Demianczuk, Saunders, Wang, & Fraser, 2002).
El sistema inmune innato materno ejerce funciones protectoras y efectoras
durante el desarrollo del embarazo. Como protector, las células inmunes
innatas presentes como macrófagos, células dendríticas, células asesinas
naturales (NK), neutrófilos y células T γ δ, son reguladas positivamente
29
durante el embarazo para proteger a la madre de patógenos, mientras que
su sistema inmune adaptativo es moderado para no provocar una respuesta
inmune específica hacia el feto. En su papel efector, las células inmunes
innatas son importantes en la implantación de blastocistos, placentación,
invasión del trofoblasto, remodelación de la arteria espiral, la regulación y
reparación celular de los tejidos implicados en estos procesos, sin dejar de
lado la tolerancia hacia el feto. Sin embargo, células de la inmunidad innata
pueden cambiar de un fenotipo tolerogénico-anti inflamatorio a un fenotipo
citotóxico-pro inflamatorio, al detectar patógenos o señales de peligro
endógeno tales como ARN, ADN, proteínas de choque térmico, ácido úrico,
factor de necrosis tumoral, etc., mediante la expresión de receptores de
reconocimiento de patrones (PRRs) altamente conservados, estableciendo
un estrés oxidativo por medio de la liberación de especies reactivas de
oxígeno / nitrógeno (ROS / RNS), produciendo inflamación por la liberación
de citoquinas pro-inflamatorias y activación de células T y B. Todo este
panorama conlleva a la isquemia placentaria por una angiogénesis reducida
y por aumento de la vasoconstricción, en un intento de causar muerte celular,
fibrosis y rechazo del feto (figura 3) (Bounds et al., 2015; Hod et al., 2015).
La activación del sistema inmune en respuesta a infecciones durante el
embarazo, puede generar el excesivo estado pro inflamatorio-oxidativo que
afecta la vasculatura, la placenta y los riñones. Las infecciones subclínicas
crónicas constituyen una causa probable de inflamación en las mujeres que
desarrollan PE. Sin embargo, el tratamiento temprano de las infecciones
vaginales y urinarias reduce la incidencia del desarrollo de PE (López-
Jaramillo, Herrera, Arenas-Mantilla, Jáuregui, & Mendoza, 2008).
Células inmunes y no inmunes presentes en la unidad útero-placentaria
expresan TLRs. La activación de estos TLRs conduce a una respuesta
inmune rápida para la eliminación del patógeno seguida por la activación
30
adaptativa del sistema inmune. La expresión de TLR4 se incrementa en
placentas de mujeres con PE en comparación con mujeres normotensas (L.
Zhang & Yang, 2012).
Una asociación significativa entre la infección bacteriana y la PE, sugiere que
la inflamación debida a infección subclínica crónica en lugar de la infección
aguda o reinfección se asocia con el desarrollo de la PE (López-Jaramillo et
al., 2008). A nivel experimental sobre roedores ha sido desarrollada la PE
mediante el uso de LPS/endotoxina administrada a ratas embarazadas y
ratones, induciendo características de PE al promover una inflamación
excesiva (Ding, Yang, Han, & Yu, 2014).
Figura 3. Defectos en arterias espirales en la pre-eclampsia. Los
citotrofoblastos no pueden invadir el miometrio, ya que los cambios
fisiológicos de las arterias espirales se restringen a la decidua. De una
adecuada perfusión de los vasos materno dependen el intercambio de
31
oxígeno, nutrientes y productos de desecho entre el feto y la madre. En el
desarrollo normal de la placenta, los citotrofoblastos (origen fetal) invaden las
arterias maternas, estimulando la transformación de vasos con diámetro
estrecho a vasos de amplio calibre, sin resistencia, capaces de proporcionar
una perfusión placentaria adecuada para el sostenimiento del feto en
crecimiento. En condiciones normales de la invasión vascular se
desencadena el proceso conocido como “pseudovasculogénesis”, que
consiste en la diferenciación de los citotrofoblastos de un fenotipo epitelial al
fenotipo endotelial. En pre-eclampsia los citotrofoblastos no se diferencial al
fenotipo endotelial invasivo, reflejándose una invasión poco profunda, con
reducido diámetro y resistencia, por parte de las arterias espirales lo que
conduce a la isquemia placentaria. Modificado de (Karumanchi et al., 2005).
1.5 ESTRUCTURA Y SEÑALIZACIÓN DEL RECEPTOR TIPO TOLL – 4
El receptor tipo toll – 4 (TLR4) pertenece a la principal familia de receptores
de reconocimiento de patrones (PRRs), compartiendo con todos los
miembros de esta familia el reconocimiento de diferentes componentes
microbianos conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMPs). Los PAMPs son moléculas esenciales altamente conservadas para
la supervivencia de los microorganismos los cuales no se alteran, en caso de
presentarse alguna alteración representaría amenazas para la vida del
patógeno. La expresión de los PRRs es constitutiva en las células del
huésped, por lo que pueden detectar los patógenos independiente de la
etapa del ciclo de vida en que se encuentren, estos son codificados en línea
germinal, no clonal y expresados en todas las células de un tipo específico e
independiente de memoria inmunológica (Akira, Uematsu, & Takeuchi, 2006).
Los PRRs no sólo reconocen PAMPs exógenos derivados de
microorganismos patógenos y no patógenos, si no también reconocen
moléculas endógenas liberadas por estrés celular, lesión de tejido o células
muertas del huésped, conocidas como patrones moleculares asociados a
daño (DAMPs) (Essakalli et al., 2009).
32
El TLR4 es una proteína compuesta por un dominio extracelular en forma de
herradura, rico en leucinas que presentan cambios de cualquier aminoácido
cada 24 a 29 repeticiones de leucinas (LRR) (H. M. Kim et al., 2007), también
presentan un dominio citoplasmático de señalización homóloga al receptor
de IL-1, conocido como dominio TIR (receptor toll de interleuquina 1)
(Pandey, Kawai, & Akira, 2015; F. Xie, Hu, et al., 2010). El dominio TIR
contiene proteínas que incluyen no sólo los receptores, sino también MyD88,
TRIF, TIRAP, TRAM y SARM, que son proteínas de señalización del
adaptador involucradas en la dimerización del receptor y en cambios
conformacionales como resultado del reclutamiento de las moléculas
adaptadoras (Kenny & O’Neill, 2008; Watters, Kenny, & O'Neill, 2007).
El dominio extracelular está involucrado en el reconocimiento de ligandos e
induce la dimerización del dominio intracelular TIR activando las vías de
señalización. La inducción de respuestas inflamatorias por LPS se logra
mediante la coordinación y acción secuencial de cuatro principales proteínas:
1) la proteína de unión a LPS (LBP), 2) el antígeno de diferenciación 14
(CD14), 3) proteína de diferenciación mieloide (MD-2) y 4) el receptor tipo
Toll-4 (TLR4). Este proceso se inicia con el reconocimiento y unión de la LBP
a los agregados de LPS (lípido A), presentes en forma de micelas o
vesículas de membrana y termina con la formación de 2 complejos activados
(TLR4-MD-2-LPS) (Figura 4). Este complejo tiene un papel fundamental en la
iniciación de la cascada inflamatoria (Peri & Piazza, 2012).
La activación de TLR4 se da a través de una vía de señalización intracelular
común con el reclutamiento de la proteína adaptadora de señalización
intracelular, factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88), que conduce a una
posterior cascada de señalización por medio de quinasas, desencadenando
la activación de la vía del factor nuclear κβ (NF-κβ). Como resultado se
33
genera la respuesta inflamatoria con la producción y secreción de citoquinas
(IL-1, IL-6 y TNF-α). (Amirchaghmaghi et al., 2013; Kang & Lee, 2011; Koga,
Izumi, Mor, Fujii, & Osuga, 2014; Nijland, Hofland, & van Strijp, 2014; Pandey
et al., 2015).
Figura 4. Estructura lateral del complejo TLR-4-MD-2-LPS por
cristalografía. El componente lípido A de LPS se observa de color rojo y el
núcleo interno de carbohidratos de color rosa. Adaptada de Park B. S., 2009.
El reclutamiento por MyD88 activa una serie de proteínas quinasas
asociadas al receptor de IL-1 (IRAKs), IRAK4, IRAK2 e IRAK1, para formar el
"Myddosoma", que interactúa con el receptor del factor asociado al factor de
necrosis tumoral alfa 6 (TRAF6) (Lin, Lo, & Wu, 2010). La proteína TRAF6
activa el complejo cinasa activador del factor de crecimiento transformante-β
(TAK1), seguidamente se produce la fosforilación de quinasas de los
inhibidores κβ (IKKs) y MAP quinasa (MAPK). El complejo IKK (IKK-α / IKK-β)
y el modulador esencial κβ (NEMO) catalizan la fosforilación de la proteína
inhibidora de NF-kB (Iκβ α), que se somete a la degradación por el
proteosoma para liberar el NF-kβ. Una vez activo se trasloca al núcleo e
induce la expresión de genes pro-inflamatorios (Kawai & Akira, 2010) (Figura
5).
34
Diversos estudios han descubierto varios reguladores críticos para la
señalización TLRs que difieren en su localización celular y modo de acción
(Qian & Cao, 2013). Moléculas de membrana como CD14 y CD36, modulan
la señalización TLRs. El CD14, es una proteína glicofosfatidilinositol, actúa
como un co-receptor para LPS junto con TLR4 y MD2. CD36 es una proteína
de la familia de receptores scavenger clase B y actúa como un correceptor
para la lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL) (Pandey et al., 2015).
Figura 5.Vías de señalización mediadas por TLR4. Los LPS libres se unen
a LBP, MD-2 se une al complejo formado LPS-LBP, el TLR4 reconoce y
forma complejos de dimerización LPS-MD-2-TLR4 para activar las cascadas
de señalización dependientes de MyD88 y TRIF. MyD88 recluta los
35
adaptadores formando un complejo con IRAK4, IRAK1, IRAK2, y TRAF6.
TRAF6 cataliza la formación de cadenas de poliubiquitina ligado a K-63 (Ub)
sobre sí mismo generando una cadena no conjugada. El complejo TAK1
activado, a continuación inicia la cascada de señalización sobre el complejo
IKK y MAP quinasas simultáneamente, catalizando el Iκβ por fosforilación
que libera al factor de transcripción NF-κB permitiendo su translocación al
núcleo y la activación de AP-1. NF-κβ y AP-1 controlan las respuestas
inflamatorias mediante la inducción de citoquinas pro-inflamatorias tales
como IL-6 y TNF-α. TLR4 también envía señales a través de la vía
dependiente de TRIF con la ayuda del adaptador TRAM posterior a la
translocación del endosoma. TRIF recluta TRAF3, que activa TANK kinase 1
(TBK1) e IKKi para fosforilar IRF3 y activarlo, este último se dimeriza y se
trasloca al núcleo para iniciar la transcripción de los genes del interferón tipo
I, dando lugar a la producción de IFN-α / β. Adaptado de Pandey S., 2015.
1.5.1. Expresión de TLR4 en placentas asociadas a patologías del
embarazo
El sistema inmune innato es la primera línea de defensa inmunológica con
capacidad de distinguir entre lo propio y extraño. Durante el embarazo el feto
es considerado semialogénico debido a que tiene una parte paterna esto
implica que el sistema inmunológico de la madre debe crear un
microambiente adecuado durante el embarazo, así como en la eliminación de
infecciones (bacterias, virus, etc.) y la tolerancia a lo propio no infeccioso (la
placenta y el feto) (Koga et al., 2014).
La señalización del TLR4 tiene un papel importante en la respuesta a la
infección bacteriana y a ligandos inflamatorios a través de la inducción de
IFN-γ. La expresión de TLR4 junto con IFN-γ en la parte fetal y materna de la
placenta, indica que las infecciones virales o bacterianas podrían estar
contribuyendo en la etiología de enfermedades durante el embarazo como la
PE. Varios estudios muestran que la principal fuente de IL-6 y TNF-α en un
ambiente sano de una placenta de tercer trimestre es la parte fetal, mientras
36
que en pacientes con PE, las partes maternas expresan más TNF-α. Al
parecer distintas partes de la placenta exhiben un papel diferente en la
inducción de la condición inflamatoria dentro de la placenta, lo que sugiere
que las funciones difieren en placentas sanas y en placentas de mujeres con
pre-eclampsia (PE) (Dabagh-Gorjani, Anvari, Zolghadri, Kamali-Sarvestani, &
Gharesi-Fard, 2014b; Schatz et al., 2012b).
Las DSC forman parte fundamental de la interfase materno-fetal y se ha
demostrado que expresan diferentes TLRs, también secretan citoquinas
inflamatorias que activan el sistema inmunológico de la madre (Ramathal et
al., 2010; Y.-y. Zhang et al., 2014). A pesar de los hallazgos encontrados en
cuanto la expresión de los TLRs en las DSC pocos estudios han demostrado
la expresión del TLR4 en DSC (Graciela Krikun, Charles J Lockwood, et al.,
2007), sin embargo no se descarta que la infección bacteriana estimula el
TLR4 en las DSC durante el embarazo, induciendo la producción de
citoquinas (IL-6 y TNF-α) (Mori, Bogdan, Balassa, Csabai, & Szekeres-
Bartho, 2016), al respecto se ha reportado que la estimulación por LPS
induce la secreción de IL-6 e IL-8 por parte de las células de endometrio
humano (Krikun et al., 2012).
El nivel de expresión relativamente alto de TLR4 en células deciduales de
primer y tercer trimestre, comparado con el segundo trimestre, podría reflejar
el entorno inflamatorio que se exhibe en la interfase materno-fetal en el
principio y final del embarazo, este aumento de la expresión de TLR4 puede
haber evolucionado como un mecanismo de protección relacionada con el
embarazo contra microorganismos específicos y otros relacionados con la
inflamación (Schatz et al., 2012b).
En experimentos in vitro las DSC al ser estimuladas con LPS, presentan un
fenotipo pro-inflamatorio en el que secretan las citoquinas pro-inflamatorias
IL-6, IL-8 e IL-1 y la quimiocina CCL-5 (Romieu-Mourez et al., 2009), como
37
respuesta a la activación y proliferación durante el daño temprano del tejido y
la invasión de patógenos. La estimulación del TLR4 en DSC, ya sea derivada
de PAMPs o DAMPs, generan un entorno inflamatorio para el reclutamiento y
la activación de las células inmunes (Miyake, 2007).
Por el contrario, la respuesta Th2 podría presentarse en adaptación por la
baja regulación de las respuestas inmunológicas con el fin de limitar el daño
inflamatorio a los tejidos y permitir la reconstrucción y mejora de la matriz
extracelular (MEC) (Glenn & Whartenby, 2014). La expresión del TLR4 en
diferentes tipos de patologías del embarazo, sugiere el aporte no sólo en la
infección sino también en las condiciones de no infección.
Holmlund y colaboradores en el año 2002, publicaron la identificación del
TLR2 y TLR4 en explantes de placenta y se comprobó que cuando incubaron
ligandos bacterianos, zymosan y lipopolisacaridos, con explantes de
placenta, observaron que la IL-6 e IL-8 se incrementaron resultando un poco
ambiguos determinar el tipo de células que realmente reaccionan frente a los
ligandos (Holmlund et al., 2002). La comprensión de la función inmunológica
de estas células en los individuos normales, así como en pacientes con
complicaciones del embarazo pueden proporcionar una mayor comprensión
de los mecanismos implicados (Canavan & Simhan, 2007).
La expresión de TLR4 se ha demostrado en células presentadoras de
antígenos (CPA), pero también se encuentran expresados por células
deciduales de primer trimestre (Graciela Krikun, CJ Lockwood, et al., 2007),
células Hofbauer, citotrofoblastos vellosos y trofoblastos, pero no en
sincitiotrofoblastos, lo que indica el papel de la placenta como una barrera
para proteger al feto de moléculas infecciosas (Abrahams et al., 2004; Beijar,
Mallard, & Powell, 2006; Kumazaki, Nakayama, Yanagihara, Suehara, &
Wada, 2004).
38
La evaluación de la expresión de los TLRs realizada por Abrahams y
colaboradores en membranas fetales luego de la exposición a diversas
bacterias como Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum, Porphyromonas
gingivalis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Streptococcus del
grupo B y Escherichia coli, asociadas con infecciones genitourinarias y
orales, así como complicaciones en el embarazo demuestran que para cada
bacteria los efectos en patrones de expresión de los TLRs son diferentes, lo
que sugiere especificidad en los mecanismos frente a la infección asociada a
complicaciones del embarazo (Abrahams et al., 2013).
Al analizar la presencia del TLR2 y TLR4 en placentas a término de
embarazo normal mediante técnicas inmunohistoquímicas, así como en
placentas de mujeres con corioamnionitis y pre-eclampsia, se encontró que el
TLR4 fue altamente expresado en placentas de pacientes con pre-eclampsia
en comparación con otros grupos estudiados. Es importante determinar si los
cambios histopatológicos se deben en parte al aumento de la expresión de
los TLRs, lo que puede agravar el daño a través de la inflamación y contribuir
así al desarrollo de la pre-eclampsia, o si la pre-eclampsia misma se
desarrolla primero y conduce al aumento en la expresión de los TLRs. Los
receptores TLRs presentes en la placenta pueden estar entonces ligados a
la patogenia de la pre-eclampsia a través de procesos infecciosos o
inflamatorios. Es posible que, bajo cualquiera de estas circunstancias, la
placenta pueda producir un incremento en la expresión de diversos
receptores de tipo Toll (Pineda et al., 2011).
1.6 CITOQUINAS EN EL EMBARAZO
Durante el proceso gestacional el conjunto de citoquinas se mantienen en un
delicado equilibrio, el cual ejerce un importante papel en la
inmunomodulación. El proceso de cambio en los niveles de citoquinas es un
39
indicador de la reacción adaptativa del cuerpo en mujeres embarazadas,
donde cambios inmunológicos se asocian con la gravedad de
complicaciones particulares en el proceso gestacional (Daneva, Hadži-Lega,
& Stefanovic, 2016).
En la PE existe un aumento de la respuesta inflamatoria sistémica en
comparación con el embarazo normal (Mihu, Razvan, Malutan, & Mihaela,
2015). Se ha demostrado que las células deciduales en el embarazo tienen
función inmunológica debido a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y
anti-inflamatorias, además de la expresión de los receptores tipo Toll (TLR).
El aumento en la producción de citoquinas pro-inflamatorias se ha asociado a
procesos relevantes en la fisiopatología de la PE como la disfunción
endotelial, aumento de la apopotosis celular y disminución de la
angiogénesis (Vitoratos, Economou, Iavazzo, Panoulis, & Creatsas, 2010).
La IL-6 es una citoquina pleiotrópica que regula reacciones de fase aguda,
por su multifuncionalidad puede desempeñar una actividad central en la
defensa del huésped infiriendo en mecanismos de contracción y relajación de
vasos sistémicos en el embarazo, igualmente con gran actividad en la
mediación del aumento de resistencia vascular asociada con hipertensión en
el embarazo (Orshal & Khalil, 2004). La clasificación como Th1 o Th2 de la
IL-6 se mantiene en controversia, ya que puede exhibir ambas características
en función de la cantidad, fuente celular y etapa gestacional estudiada. Lo
considerado hasta hoy es que la IL-6 desplaza la respuesta Th1 hacia Th2
(Diehl & Rincón, 2002).
Leucocitos, las DSC, trofoblastos, células epiteliales y células endoteliales
maternas producen IL-6, después de estímulos por el TNF-α en eventos
como la infección materna, isquemia placentaria y reducción del flujo
40
sanguíneo uterino (LaMarca, Brewer, & Wallace, 2011; Luppi & DeLoia,
2006; Takacs, Green, Nikaeo, & Kauma, 2003).
La producción de enzimas tipo metaloproteinasas, responsables de la
digestión de la matriz extracelular se ve regulada por la IL-6 para promover la
implantación, seguido de una respuesta anti-inflamatoria y angiogénica,
necesaria para la vascularización placentaria. Por otro lado al final del
embarazo posiblemente está involucrada en el proceso pro-inflamatorio del
trabajo pre-parto (Gutierrez, Junovich, Dubinsky, Pasqualini, & Gentile,
2008). Los niveles de IL-6 en suero son significativamente mayores en las
mujeres con PE en comparación con parto normal (Gupta & Chari, 2015;
Kronborg et al., 2011; Udenze, Amadi, Awolola, & Makwe, 2015; C. Xie, Yao,
Liu, & Xiong, 2011).
La IL-10 se encuentra disminuida en mujeres con PE (LaMarca et al., 2011),
esta tiene un papel vital en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica
funcionando como un potente protector frente a la disfunción vascular.
Además de ser un potente inmunosupresor ayuda como modulador del
estrés en el retículo endoplasmatico contribuyendo a la supervivencia del feto
alogénico (Cheng & Sharma, 2015), por esto se considera una molécula
crítica para un resultado exitoso del embarazo (Plevyak et al., 2002;
Surendra Sharma et al., 2010; Thaxton, Romero, & Sharma, 2009).
La IL-10 es producida por células del sistema inmune innato incluyendo
macrófagos, monocitos, células NK, células dendríticas, neutrófilos,
eosinófilos y mastocitos, también células del sistema inmune adaptativo, tipo
Th1, Th2, Th17, células T reguladoras (Treg), células T CD8 + y células B.
Adicionalmente, células no inmunes producen IL-10, dentro de estas se
encuentran células tumorales y queratinocitos (Saraiva & O'garra, 2010).
41
La expresión de IL-10 en la placenta normal muestra altos niveles durante el
primer y segundo trimestre en comparación con el tercer trimestre y antes del
trabajo de parto disminuye (Hanna et al., 2000). La disminución de IL-10 en
placenta se asocia a complicaciones del embarazo como el parto prematuro,
aborto espontáneo y PE. Algunos estudios sugieren que la deficiencia de IL-
10 puede generar la inducción de factores anti-angiogénicos vasoactivos y
contribuir a una mala placentación, también se muestra una baja producción
en suero y tejido placentario de mujeres con PE (Kalantar et al., 2013;
Peraçoli et al., 2013; Pinheiro et al., 2013; Thaxton et al., 2013).
1.7 INFECCIÓNES DURANTE EL EMBARAZO
Las infecciones aumentan el riesgo de resultados adversos en el embarazo,
manteniéndose latente un componente infeccioso como causa del desarrollo
de complicaciones como el parto prematuro, bajo peso al nacer y pre-
eclampsia (PE). Infecciones como la enfermedad periodontal aumentan el
riesgo de PE en un 76%, así mismo la infección del tracto urinario (ITU) en
un 57%, la cual representa una de las infecciones maternas más comunes
durante el embarazo (Conde-Agudelo, Villar, & Lindheimer, 2008).
Componentes bacterianos como los lipopolisacaridos (LPS) son altamente
inflamatorios produciendo cambios sobre la respuesta inmune innata y
adaptativa, agravando problemas inflamatorios que favorecen el desarrollo
de resultados adversos del embarazo, donde mecanismos que subyacen
esta interacción no son bien conocidos. La inmunidad innata interactúa con
vías pro-inflamatorias a través del TLR4 contribuyendo al desarrollo de la PE
(F. Xie, Turvey, Williams, Mor, & Von Dadelszen, 2010).
La infección intrauterina subclínica ha sido implicada como un importante
factor etiológico en la patogénesis de la enfermedad materno-fetal, y además
42
está implicada en nacimientos prematuros (Hillier et al., 1993). En la mayoría
de efectos adversos durante el embarazo se encuentran aumentadas las
citoquinas pro-inflamatorias. Estos hallazgos apoyan la hipótesis que la
infección es una de las causas de parto prematuro, que opera a través de un
mecanismo que implica la inducción de la producción de citoquinas (Dudley,
Edwin, Dangerfield, Jackson, & Trautman, 1997). La infección durante el
embarazo puede estar implicada en la etiología de la PE. Mujeres que
adquieren una infección urinaria durante el embarazo, pero no las que
presentan infección respiratoria, tienen un mayor riesgo de PE. Un
mecanismo que se suma a la infección puede ser el aumento de la respuesta
inflamatoria sistémica materna, resultando en una inflamación exagerada y la
disfunción endotelial vascular antes del inicio clínico de la PE (Minassian et
al., 2013).
La infección conduce la respuesta inmune materna a una respuesta pro-
inflamatoria patógena, con producción de citoquinas inflamatorias y
productos tóxicos. Una actividad elevada de la caspasa 1, además del
incremento en la concentración de IL-1b se ha observado en las infecciones
del embarazo (Abrahams, 2011), lo que sugiere que el desencadenamiento
de la respuesta inflamatoria en la placenta puede deberse a la activación a
través del TLR4, contribuyendo a resultados adversos del embarazo dada su
expresión constitutiva. La secreción de IL-1b se aumenta significativamente
frente al tiempo de exposición a LPS bacterianos (Pontillo et al., 2012).
Debido a que las pacientes con PE no suelen presentar características
clínicas de enfermedad infecciosa, la producción de citoquinas aumentada
por parte de monocitos a través de la señalización del TLR4, puede ser el
resultado de la actividad endógena de ligandos del TLR4 en lugar de la
presencia de productos bacterianos. Estos ligandos endógenos pueden
incluir proteínas de choque de térmico, heparan sulfato, proteoglicano,
43
fibrinógeno, fibronectina, hialuronato de matriz extracelular y el grupo de
proteínas de alta movilidad 1 (HMGB1), que son liberados de células
dañadas (Erridge, 2010). Algunos autores sugieren que una infección puede
inducir la translocación del TLR4, con el fin de disminuir la señalización
durante la infección temprana (Ma et al., 2006). La localización en la placenta
del TLR4, así como los cambios durante la gestación normal, son temas
críticos en la comprensión del papel de estos en la defensa de la unidad
materno-fetal durante la infección materna (Beijar et al., 2006).
La colonización de la placenta con bacterias puede no ser exclusiva de
pacientes con evidencia de infección, como sucede en el parto prematuro
(Prince, Antony, Chu, & Aagaard, 2014). En 2013, Stout y colaboradores
demostraron por medio de evidencia morfológica macroscópica la presencia
de bacterias intracelulares Gram-negativas alojadas en la placa basal de
muestras de placenta sin evidencia clínica o histológica de corioamnionitis,
por lo tanto la placa basal materna es una posible fuente de colonización
intrauterina (Stout et al., 2013). Resultados de un estudio indican que la
placenta alberga un microbioma único y escaso, pero rico metabólicamente.
El microbioma placentario se compone en su mayor parte de microbiota
comensal no patógena de los filos Firmicutes, Tenericutes, Proteobacteria,
Bacteroidetes y Fusobacteria (Aagaard et al., 2014). Tradicionalmente, se ha
pensado que el desarrollo humano ocurre dentro de un ambiente "estéril". Sin
embargo, recientes investigaciones han mostrado ricos y diversos microbios
en placentas de embarazos clínicamente saludables (Aagaard et al., 2014;
Stout et al., 2013).
La placenta podría no ser estéril, incluso en ausencia de infección clínica, por
lo que se propone la propagación hematógena como mecanismo adicional
para la colonización e infección de la placenta (Prince et al., 2014). La
caracterización reciente del microbioma placentario y su asociación con el
44
microbioma oral desafía la teoría del parto prematuro resultante de la
infección ascendente del tracto genital inferior. Las similitudes entre el
microbioma bucal y placentario pueden indicar que el microbioma placentario
se establece mediante una diseminación hematógena (Fox & Eichelberger,
2015).
El efecto de alteraciones puede terminar en el rechazo del feto, así como
también, la alteración de la composición del microbioma de la madre. Los
hallazgos implican una etiología pro-inflamatoria, pero no está claro si esto
puede atribuirse a un perfil de taxones individuales o de microbiomas
placentarios. Estos cambios en el sistema inmunológico gravídico dentro del
micro-ambiente placentario deben encontrar un delicado equilibrio entre la
prevención del rechazo fetal y la susceptibilidad a la disbiosis y la
consiguiente inflamación. (Prince et al., 2014).
El sistema inmunológico en mujeres embarazadas tiene dos jugadores
claves que alertan al huésped para combatir la infección, el óxido nítrico (ON)
y el receptor TLR4. Entre sus múltiples funciones, un papel clave del ON es
proporcionar señales para relajar el útero (permitiendo un ambiente de
reposo para el feto), y destruir o restringir patógenos invasivos (Nowicki,
Sledzinska, Samet, & Nowicki, 2011).
1.7.1 Enfermedad periodontal y complicaciones del embarazo
Los tejidos infectados en mujeres con periodontitis actúan como depósitos de
bacterias y sus productos logran diseminarse a la unidad feto-placentaria, de
esta manera pueden activar las vías de señalización inflamatoria no solo
induciendo el parto prematuro, sino también llegando a producir restricción
del crecimiento intrauterino y conducir a la pre-eclampsia (PE) (Zi, Longo,
45
Bueno-Silva, & Mayer, 2015). La enfermedad periodontal se inicia por el
crecimiento excesivo de bacterias en su mayoría Gram negativas anaerobias
que crecen en sitios sub-gingivales. La respuesta del huésped frente a
patógenos, causa inflamación persistente y daño de los tejidos que soportan
los dientes, dando lugar a manifestaciones clínicas de la enfermedad
periodontal (Parihar et al., 2015).
La evidencia actual ha demostrado que un grupo específico de bacterias
Gram negativas anaerobias que incluyen microorganismos claves como:
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia,
Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia y
Porphyromonas gingivalis, implicados en la producción de periodontitis se
encuentra asociada con resultados adversos del embarazo, los cuales
incluyen el parto prematuro, abortos espontáneos, bajo peso al nacer y pre-
eclampsia (Parthiban & Mahendra, 2015; Van Winkelhoff, Loos, Van Der
Reijden, & Van Der Velden, 2002).
La enfermedad periodontal es iniciada por microorganismos orales, pero se
cree que la degradación periodontal severa está mediada por la respuesta
inflamatoria del huésped, la cual puede no estar limitada al área periodontal.
La enfermedad periodontal también se asocia con inflamación de bajo grado,
por lo que se ha propuesto que episodios diarios de bacteriemia y
diseminación de endotoxinas bacterianas del foco periodontal pueden inducir
activación sistémica de la respuesta inflamatoria (Wei, Chen, Yu, & Wu,
2013). Mecanismos bacterianos implicados en el parto pre-termino con bajo
peso al nacer incluyen citoquinas, exotoxinas y endotoxinas, que estimulan la
síntesis de prostaglandinas e inician la quimiotaxis, activación e infiltración de
neutrófilos, llegando a la síntesis y liberación de metaloproteasas, las cuales
alteran el colágeno en el cuello uterino. Las prostaglandinas inician
46
contracciones uterinas mientras que las metaloproteasas atacan con fuerza
las membranas corioamnióticas, llegando a la ruptura (Parihar et al., 2015).
En los últimos años se ha asociado la enfermedad periodontal como un
factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades sistémicas y
complicaciones del embarazo tales como la PE (Sgolastra, Petrucci,
Severino, Gatto, & Monaco, 2013), parto prematuro y bajo peso al nacer,
afectando entre un 20% y 50% de las mujeres embarazadas (X Xiong,
Buekens, Fraser, Beck, & Offenbacher, 2006). En Colombia un estudio indicó
que la presencia de los microorganismos Porphyromonas gingivalis,
Tannerella forsythensis y Eikenella corrodens, se asocia significativamente
con la PE (Contreras et al., 2006).
La posible asociación ha sido explicada por el proceso infeccioso periodontal
que resulta en un aumento de mediadores inflamatorios. Siendo así, se
podría inferir que el control de la condición periodontal ayudaría a disminuir la
incidencia y frecuencia de complicaciones del embarazo. Sin embargo, a
pesar que la enfermedad periodontal es frecuente en mujeres con PE, el
tratamiento periodontal mejora los parámetros clínicos periodontales, pero no
reduce la tasa de parto prematuro o el bajo peso al nacer (Contreras et al.,
2010). Boggess y colaboradores han sugerido que las mujeres con
enfermedad periodontal activa durante el embarazo, pueden presentar
translocación transitoria de patógenos orales a la unidad útero-placentaria, lo
que provoca inflamación y estrés oxidativo en el embarazo, finalmente
produciendo daño placentario y las manifestaciones clínicas de la PE
(Boggess et al., 2003).
Algunos estudios han mostrado que las mujeres embarazadas con PE tienen
mayor riesgo de parto prematuro si la enfermedad periodontal está presente
durante el embarazo o progresa durante el mismo (Pattanashetti, Nagathan,
47
& Rao, 2013). Una investigación independiente aisló bacterias de la cavidad
oral de varios individuos y posteriormente utilizó esta mezcla para infectar
ratones grávidos. Los resultados mostraron que la placenta fue colonizada
por las bacterias orales (Fardini, Chung, Dumm, Joshi, & Han, 2010).
Ratones infectados con bacterias Gram-negativas como Campylobacter
rectus, sola y en combinación con Porphyromonas gingivalis, mostró que los
ratones infectados presentaron disminución en la fecundidad y aumento de
los índices de resorción, además, presentaron inflamación junto con un
aumento en la expresión del receptor TLR4 en la placenta (Arce et al., 2009).
Las infecciones hematógenas tienen la capacidad de colonizar e infectar la
placenta, lo que proporciona apoyo a la noción de que el nacimiento
prematuro podría ser causado por infecciones que no se originan en la
cavidad vaginal (Prince et al., 2014).
1.7.2 Infección urinaria y pre-eclampsia
Las infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las complicaciones
médicas más comunes del embarazo, se caracterizan por la presencia de un
número significativo de bacterias (≥104 UFC/ml) en el tracto urinario, que
incluyen infecciones del tracto urinario inferior (uretritis y cistitis) y el tracto
urinario superior (pielonefritis). Debido a los cambios fisiológicos normales
inducidos por la gestación, las mujeres embarazadas son especialmente
susceptibles a esta infección, lo que puede resultar en enfermedades
urológicas y cambios en la función renal que son amenazas graves tanto
para la madre como para el feto (Sheffield & Cunningham, 2005).
Mujeres con ITU en el embarazo tienen un mayor riesgo de desarrollar PE
severa (Izadi et al., 2016). Las infecciones apoyan la hipótesis de que el
riesgo de PE se ve reforzado por un aumento de la carga inflamatoria
48
materna, la cual es suficiente para estimular una presentación clínica de PE
(Smaill & Vazquez, 2015), la cual se incrementa si la ITU se diagnostica en el
tercer trimestre, así como en los casos tempranos de PE (<34
semanas).(Easter et al., 2016).
El sistema óxido nítrico (ON) funciona en su nivel más alto en el huésped
embarazado, por lo tanto, si el huésped desarrolla una infección benigna del
tracto urogenital, el ON puede muy probablemente eliminar eficazmente este
patógeno. Ahora, en el caso de un proceso inflamatorio grave de un órgano
específico y de un patógeno virulento/invasivo tal como E. coli, el ON puede
ser menos eficaz. El TLR4 contribuye a la eliminación de la infección, pero en
mujeres embarazadas una respuesta inflamatoria agresiva puede ser
perjudicial para el feto y conducir a un parto prematuro. La señalización
inflamatoria por TLR4 es ejecutada por monocitos y macrófagos que infiltran
la unidad feto-placentaria. Un estudio preliminar en pacientes embarazadas
sugirió que la respuesta a través del TLR4 en mujeres embarazadas
disminuye. Evaluaron la respuesta a la infección por E. coli en ratones TLR4
negativos. Los resultados se asemejaron a la sensibilidad aumentada a la
infección observada en animales experimentales embarazados, lo que
sugiere que la reducción del TLR4 durante el embarazo puede tener un
impacto importante en el riesgo de ITU. Además, se muestra que en un
entorno en el que dos sistemas protectores claves tienen una capacidad
limitada y disminuida para ejecutar sus funciones, apareciendo un tercer
factor elevado, el CD55 que favorece un aumento en E. coli, quien encuentra
un nicho de oportunidad para establecer infecciones crónicas y subclínicas
(Nowicki et al., 2011).
El parto en si representa un proceso inflamatorio, donde la interrupción del
delicado equilibrio de citoquinas por LPS bacterianos u otros factores que
aumentan la producción de interleucinas inflamatorias en la interfase
49
materno-fetal, ocasiona una respuesta inmune de las células, con secreción
de diferentes cantidades de interleucinas y activando mecanismos que
desencadenan complicaciones del embarazo (Li et al., 2010; Vega-Sanchez
et al., 2010). Existe un buen número de estudios en modelos animales in vivo
que han demostrado el papel de la infección por bacterias en la inducción de
parto prematuro a través de la estimulación del TLR4 (Elovitz, Wang, Chien,
Rychlik, & Phillippe, 2003). En efecto consideramos que el TLR4 es un
mediador importante en las complicaciones del embarazo, por estas razones
queremos aportar en la comprensión del problema por medio de la
determinación de la expresión del TLR4 en las DSC de diferentes partos y la
producción de citoquinas anti-inflamatorias y pro-inflamatorias.
La respuesta inmune innata a nivel placentario es influenciada por las DSC a
través de la expresión de receptores tipo Toll y la secreción de citoquinas,
influenciando el microambiente en la interfase materno-fetal como resultado
de su papel importante en el mantenimiento del equilibrio de las relaciones
fisiológicas en el desarrollo del embarazo. Sin embargo, no se descarta
alguna relación con estados patológicos en el embarazo favoreciendo el
estado inflamatorio, a través de la expresión del receptor TLR4 y la secreción
de citoquinas. Sobre este asunto, muchos estudios han determinado la
expresión del TLR4 a partir de tejido de placentas, comparando la expresión
en condiciones normales del embarazo con diversas complicaciones del
embarazo incluso la pre-eclampsia, manifestando una mayor expresión del
TLR4 en placentas pre-eclámpticas, sin diferenciar que tipo de células
pueden estar aportando en esta condición. Por esta razón es importante
establecer la participación de las DSC a través de la expresión del TLR4 en
diferentes contextos del embarazo. Así mismo, es relevante analizar el papel
que puedan estar desempeñando a través de la secreción de citoquinas,
dadas sus funciones en el microambiente placentario.
50
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
El objetivo general del presente proyecto es analizar el comportamiento
inmunomodulador in vitro de las células deciduales estromales DSC en la
enfermedad hipertensiva del embarazo pre-eclampsia.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecer el fenotipo antigénico de DSC provenientes de mujeres con
embarazo a término que presentaron parto vaginal sin complicaciones y
DSC de mujeres con diagnóstico de pre-eclampsia con parto por cesárea.
Comparar la expresión génica del receptor TLR4 en DSC procedentes de
mujeres con embarazo a término que presentaron parto vaginal sin
complicaciones frente a DSC de mujeres con diagnóstico de pre-eclampsia
con parto por cesárea.
Estudiar la secreción de IL-6 e IL-10 por las DSC derivadas de placentas a
término de parto vaginal sin complicaciones y placentas con pre-eclampsia
de parto por cesárea.
51
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 DEFINICIÓN DE SUJETOS DE ESTUDIO
El presente trabajo es un estudio de tipo analítico de casos y controles. Se
tuvieron en cuenta maternas con embarazos a término y desarrollo normal del
trabajo de parto, sin ningún tipo de intervención médica (sin complicaciones).
Asimismo, maternas con diagnóstico de pre-eclampsia que tuvieron parto por
cesárea. Las participantes en el proyecto fueron abordadas antes del parto en
diferentes instituciones de salud de la ciudad de Bucaramanga, como el Hospital
Local del Norte HLN y Unidad Inmediata Materno Infantil Santa Teresita UIMIST,
para la recolección de placentas de parto vaginal sin complicaciones (control);
también en el Hospital Universitario de Santander HUS y Clínica Chicamocha,
donde se recolectaron placentas de pacientes con diagnóstico de pre-eclampsia
(PE), las cuales donaron las placentas aceptando voluntariamente su
participación, previa firma del consentimiento informado. Las muestras se
recogieron durante todo el año 2016.
3.1.1 Aspectos éticos del proyecto
En este proyecto no se llevó a cabo ningún tipo de ensayo clínico, seguimiento o
estudio continuado con las muestras de las participantes. Se emitió el
consentimiento informado siguiendo las normas científicas técnicas y
administrativas para la investigación en salud contempladas en la Resolución 8430
de 1993 del Ministerio de Salud, donde el estudio se clásica bajo la categoría de
investigación con riesgos mínimos. El consentimiento informado fue aprobado por
el Comité de Ética en Investigación (CEI) de la Universidad de Santander UDES
(Anexos 1 y 2).
La confidencialidad de las pacientes estuvo totalmente garantizada, ya que la
información requerida fue estrictamente ligada a su condición. Se les asignó un
52
código confidencial a cada una de las muestras, que sirvió para su identificación
en todos los experimentos que se realizaron.
3.1.2 Criterios de inclusión
Se tuvieron en cuenta para la aceptación en el estudio los siguientes parámetros:
mujeres gestantes entre 15 y 38 años, que tuvieron trabajo de parto normal sin
complicaciones y mujeres diagnosticadas con pre-eclampsia leve o no severa
(después de las 20 semanas de embrazo con signos de proteinuria (≥ 3 mg orina
al azar o ≥ 300mg/24hr) e hipertensión arterial (TA ≥ 140/90 mmHg). Las
participantes no debían presentar enfermedades de base como diabetes,
hipertensión, enfermedad cardiaca u obesidad.
3.1.3 Criterios de exclusión
Las mujeres con antecedentes de endometriosis, que hayan tenido tratamiento
hormonal o infecciones vaginales (vaginosis por Gardnerella, vaginitis por
Candida, trichomoniasis) y que estuvieron con tratamiento previo al parto (cremas
vaginales, óvulos, baños vaginales, etc) no se fueron tenidas en cuenta.
3.1.4 Obtención de las muestras
Las muestras de decidua basal se obtuvieron de placentas procedentes de
pacientes con embarazos a término (39,3 – 41 semanas de gestación) que
presentaron parto vaginal sin complicaciones – control, con edades entre los 15 y
36 años. Placentas de pacientes con parto por cesárea y diagnóstico de PE,
fueron adquiridas en el Hospital Universitario de Santander HUS y la Clínica
Chicamocha, de pacientes entre los 19 y 23 años, con embarazos entre 37 y 40
semanas de gestación.
53
3.2 CULTIVO CELULAR
3.2.1 Obtención, purificación y cultivo de las DSC
Las células deciduales estromales (DSC) se obtuvieron a partir de las placentas
recolectadas en las instituciones de salud participantes. La obtención de las DSC
se inició con una exploración visual de la placenta identificando la parte materna,
de donde se tomaron las muestras (decidua basal). Las muestras fueron
sumergidas en medio RPMI 1640 (Gibco, Ref: 21870076) y transportadas a 4oC al
Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas LIBB de la
Universidad de Santander UDES, para el procesamiento y manipulación bajo
medidas de bioseguridad en cabina de flujo laminar (LABCONCO Clase A2-
PURIFIER LOGIC +).
Las muestras inicialmente se disgregaron y se trataron con colagenasa tipo 1A
(16,5mg/mL, Sigma Aldirch, Ref: 2604). La suspensión de células deciduales fue
centrifugada sobre Ficoll-Hystopaque (Sigma Aldrich, Ref: 10771), obteniéndolas
de la interfase. Luego se lavaron y se sembraron en frasco de cultivo de 25 mL
con medio de cultivo Opti-MEM (Gibco, REF: 11058021) pobre en suero fetal (3-
5%). Inmediatamente se incubaron a 37oC en atmosfera húmeda al 5% de CO2.
Las células en suspensión fueron eliminadas al momento que se descartó el
sobrenadante. Las DSC son células adherentes las cuales se fijaron en el fondo
del frasco de cultivo y exhibieron morfología fibroblastica. El medio de cultivo Opti-
MEM se reemplazó cada 4 o 5 días. Las células alcanzaron una confluencia del
80% en aproximadamente 25 días, cubriendo toda la superficie del frasco de
cultivo. Los cultivos de DSC fueron observados a través del microscopio invertido
EVOS FL Cell Imaging System, life technologies (Anexo 3).
54
3.2.2 Recolección de sobrenadantes
Los sobrenadantes fueron recogidos a partir de los cultivos de DSC con un 80%
de confluencia en tubos falcon de 15 mL estériles, inmediatamente se rotularon y
almacenaron a -20oC para el análisis de las citoquinas.
3.3 CITOMETRÍA DE FLUJO
3.3.1 Análisis del fenotipo antigénico de las DSC
Para el análisis de la expresión de marcadores antigénicos de las DSC se
utilizaron anticuerpos monoclonales (mAb) conjugados con Isotiosianato de
Fluoresceína (FITC), Aloficocianina (APC) y Ficoeritrina (PE), obtenidos de la casa
comercial Bio-legend. Los controles isotipos utilizados fueron IgG1-FITC, IgG1-
APC e IgG1-PE. Los mAb conjugados fueron CD90-FITC, CD62p-FITC, CD29-
APC, CD10-PE, CD44-PE, CD45-PE y CD73-PE.
Las células DSC cultivadas fueron lavadas 3 veces con PBS 1X, luego se
despegaron del frasco de cultivo utilizando EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich, Ref:
E6758) durante 8 minutos a 37oC. Una vez separadas se recogieron las células y
se centrifugaron a 1.500 r.p.m por 5 minutos a 4oC. El sobrenadante se descartó y
se procedió a resuspender el botón celular a una concentración de 1.000.000
cél/mL. Para el análisis por citometría se realizó el marcaje de las DSC, en cada
tubo se agregaron 100μL de la suspensión celular junto a 10μL del anticuerpo
monoclonal correspondiente, atendiendo las recomendaciones de la casa
comercial. Luego se incubaron por un periodo de tiempo de 30 minutos en
oscuridad a 4oC. Posteriormente se centrifugaron con PBS 1X a 1.500 r.p.m por 5
minutos a 4oC, se descartó el sobrenadante y se resuspendieron las células en
400μL de PBS 1X y se mantuvieron a 4oC para el análisis en el citómetro de flujo
NAVIOS-Beckman Coulter (Hemocentro de Santander HUS). Los datos del
55
porcentaje de expresión de las DSC para cada marcador antigénico se obtuvieron
realizando el análisis correspondiente a través del Software Kalusa (Anexo 4).
3.4 ENSAYO RT-PCR EN TIEMPO REAL
3.4.1 Preparación del cultivo de DSC
El ARN se obtuvo a partir de los cultivos de DSC con una confluencia del 80%. Se
realizaron 3 lavados con PBS 1X (Gibco, Ref: 70011044) antes de aplicar tripsina
0,5% (Gibco, Ref:15400054) por 4 minutos a 37oC en incubadora de CO2. Se
verificó en microscopio invertido (EVOS FL Cell Imaging System, life technologies)
la disgregación de la totalidad de células, se realizó recuento celular en cámara de
Neubauer y se evaluó la viabilidad de las DSC a través del ensayo con azul de
tripán al 0.25% (Sigma-Aldrich) (90-92% células vivas). A partir de este recuento
se tomaron 1.000.000 cél./mL y se realizó un nuevo cultivo. Dentro de las 48 – 72
horas siguientes, nuevamente se disgregaron las células para realizar la
extracción del ARN a partir de un recuento celular de 1.850.000 cél/mL,
asegurando un crecimiento exponencial y una expresión adecuada.
3.4.2 Extracción de ARN total
Esta se realizó por medio del método de Trizol con el reactivo TRI-Reagent
(Ambion, Ref. AM9738), siguiendo las indicaciones del fabricante y conservando
las medidas de bioseguridad necesarias para el procesamiento y manipulación de
este material genético (Anexo 5). El ARN fue disuelto en agua libre de nucleasas,
se agregó RNase OUT inhibitor (Invitrogen, Ref. 10777019) y se evaluó la calidad
y concentración en el Nanodrop 2000 (Thermo scientific) para posteriormente
verificar la integridad a través del corrido electroforético en gel de Agarosa al 1,5%
y finalmente almacenarlo a - 80oC, hasta su procesamiento (Anexo 6).
56
3.4.3 RT-PCR en tiempo real
Una vez realizada la extracción del ARN y verificada la integridad del mismo, se
procedió a evaluar la eficiencia de los primers aplicando el protocolo establecido
para la prueba, para la B-actina como gen de referencia y TLR4 como gen blanco.
Ensayos previos con otros genes controles nos permitieron elegir el gen B-actina,
debido a que se obtuvo una mejor eficiencia en la expresión. La validación se
realizó a través de diluciones seriadas con ARN extraído de células DSC
cultivadas, determinando la temperatura optima de fusión para los primers B-
actina (Tm 61oC) y primers TLR4 (Tm 55oC). El tipo de reactivo utilizado en este
ensayo fueron sondas de hidrólisis TaqMan. Estas cuentan con sondas marcadas
con fluorocromo FAM (Fluoresceina) en su extremo 5´, las cuales hibridan en
medio de los primers. Al otro extremo (surco menor) de la sonda se encuentra un
Quencher (silenciador-MGB) que por su proximidad evita la emisión de
fluorescencia. Una vez que los primers y la sondas hibriden en la cadena molde de
ADN por la actividad 5´ nucleasa de la Taq Polimerasa, se liberan el fluorocromo y
el Quencher, permitiendo la emisión de fluorescencia. Este sistema tiene como
ventaja que es más específico dado que sus amplicones no superan las 150pb
aumentando la eficiencia de la reacción. Para normalizar la lectura de emisión de
fluorescencia se agrega el colorante ROX (conjugado de glicina de 5-carboxi-X-
rodamina, succinimidiléster). Seguidamente, se construyó una curva estándar con
el fin de evaluar el rendimiento del ensayo. Las muestras utilizadas como controles
de la expresión del TLR4 fueron ARN de neutrófilos humanos los cuales expresan
constitutivamente este receptor. Como control negativo se utilizó ARN a partir de
células HEK293tn, las cuales son una línea celular transformada y derivada de
preparaciones de riñón embriónico humano. Una vez validados los primers, se
procedió a realizar la RT-PCR en tiempo real en un solo paso a partir del ARN de
DSC de parto vaginal sin complicaciones (control) y de pre-eclampsia. Una vez se
obtuvieron los datos se analizaron aplicando en método comparativo de Ct,
teniendo en cuenta los valores de CT del ARNm TLR4 para cada muestra
57
comparándolos con los Ct del ARNm B-actina. Este análisis se procesó por medio
del modelo matemático propuesto por Pfaffl (Anexo 7).
3.5 PRUEBA DE ELISA
3.5.1 Detección de citoquinas
Se determinó la secreción de citoquinas por medio de kits de ELISA adquiridos de
la casa comercial Affymetrix e-Bioscience. La detección de las citoquinas se
realizó a partir de los sobrenadantes de los cultivos celulares. Para la
determinación de IL-6 se utilizó el Kit Human IL-6 Ready-SET-Go! con una
sensibilidad de 2 – 200 pg/mL. La IL-10 se analizó por medio del Kit Human IL-10
Ready-SET-Go! con una sensibilidad de 2 a 300 pg/mL. Las pruebas se llevaron a
cabo teniendo en cuenta las indicaciones dadas por el fabricante (Anexo 8). La
lectura de las citoquinas se realizó en el lector para ELISA Bio-Rad. Una vez
obtenidas las absorbancias de los patrones y las muestras, se procedió a realizar
la curva de calibración aplicando el modelo matemático de regresión lineal
mediante mínimos cuadrados para un mejor ajuste de los datos, obteniendo la
ecuación de la curva polinómica que nos permitió una mejor aproximación para
determinar las concentraciones.
3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la organización de los datos y el análisis, se utilizaron los programas EXCEL
y GraphPad Prism 6 respectivamente. Se evaluó la normalidad de los datos a
través de la prueba Skewness/Kurtosis test (SK test). Luego se aplicó la prueba de
U de Mann-Whitney, la cual se utilizó en los datos no normalizados a partir de las
medianas, y se consideró un valor significativo de p <0.05. Los datos de la RT-
PCR en tiempo real, fueron normalizados en relación al gen de referencias
utilizado (B-actina) y teniendo en cuenta el número de muestras (n=6), se aplicó la
prueba t de student. Las pruebas fueron aplicadas teniendo en cuenta que es un
estudio analítico de casos y controles, las cuales nos permitieron realizar las
comparaciones y establecer si existieron diferencias significativas.
58
4. RESULTADOS
4.1 CONDICIÓN CLÍNICA DE LAS PARTICIPANTES
Al realizar el análisis de los riesgos y variables en las maternas control y PE, se
encontró que las mujeres control no mostraron diferencias significativas en cuanto
a la edad, el número de embarazos, abortos y edad gestacional, en comparación
de las pacientes con PE. Por otro lado, se observó en las maternas control
diferencias significativas en el número de partos (media=1,5) cuando se
compararon con las de PE (media=0,0). Además, las mujeres con PE tuvieron
promedios de lecturas de presión arterial media (PAM) y proteinuria/24h, más
elevadas, que las mujeres control.
Tabla 2. Variables analizadas condición clínica de las maternas.
Factores de riesgo Control (n=6)
mediana (RIQ)
PE (n=6)
mediana (RIQ)
p valor
Edad (años) 22 (15.7-30.0) 19 (19.0-21.5) 0,5714
Embarazos 1.5 (1.0-2.2) 1.0 (1.0-1,0) 0,2000
Partos 1.5 (1.0-2.0) 0 (0.0-0.0) 0,0048**
Abortos 0 (0.0-0.2) 0 (0.0-0.0) 0,9999
Edad gestacional
(semanas) 39.8 (39.6-40.3) 38.5 (38.5-39.5) 0,4555
PAM(mmHg) 91.5 (89.2-93.2) 122.0 (110.5-
135.0) 0,0043**
Proteinuria/24 h (mg/24h) 82.0 (76.2-90) 475.0 (208.6-
557.3) 0,0043**
PE, parto por cesárea con pre-eclampsia; test de Mann-Whitney, con un valor
significativo para p<0,05; PAM, presión arterial media = (tensión arterial sistólica –
tensión arterial diastólica/3) + tensión arterial diastólica, valor de referencia 70-105
mmHg; Proteinuria definida ≥ 300mg/24 h.
59
4.2 CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA DE LAS DSC
4.2.1 Aislamiento de DSC obtenidas de placentas
Con el objeto de establecer el fenotipo antigénico in vitro de las DSC de muestras
de placentas a partir de pacientes control y PE, las células fueron aisladas,
disgregadas e incubadas con Colagenasa 1A, obteniéndose una suspensión
celular que fue sembrada en frascos de cultivos y mantenida en medio OptiMen
suplementado al 3% de Suero Fetal Bovino en atmosfera de CO2 al 5%. Al cabo
de 24 horas se logró observar en el frasco de cultivo una pequeña porción de
células de tipo fibroblasto adheridas al frasco (Figura 6), que fueron capaces de
expandirse formando colonias al cabo de 3 a 4 días. Las células fibroblásticas
cubrieron todo el frasco en forma de monocapa con una confluencia del 80% en
un promedio de tiempo de 25 días. Por otro lado, las células no adherentes fueron
eliminadas al momento de realizar el descarte de los sobrenadantes en los
cambios de medio de cultivo.
Figura 6.Células DSC en cultivo celular. Los cultivos de DSC control fueron
observados a través del microscopio invertido EVOS FL Cell Imaging System, life
technologies. (A) DSC a las 48 horas de obtenidas a partir de placenta, objetivo
40X. (B) Las DSC proliferaron hasta formar una| monocapa en todo el frasco de
cultivo, confluencia del 80%, objetivo 40X. (C) Las DSC se observaron en objetivo
10X, alcanzaron una confluencia del 80% en aproximadamente 25 días.
A B C
60
4.2.2. Fenotipo antigénico de DSC cultivadas
Luego que las DSC crecieron y formaron una monocapa de cultivo se tripsinizaron
para realizarle el análisis fenotípico mediante citometría de flujo. En el análisis se
observó una población de células homogéneas (Figura 7). Esta población de
células mostró que no existió contaminación por leucocitos y células endoteliales
(CD45 y CD62p negativas respectivamente. Figura 8). No obstante, todas las
células expresaron los marcadores antigénicos característicos de células madres
mesenquimales y deciduales (CD10, CD29, CD44, CD73 y CD90, Figura 9).
Figura 7. Gate FS vs SS de las DSC control. Tamaño (Forward Scatter-FS,
complejidad (Side Scatter-SS) Se tuvo en cuenta estas características de las DSC
con el fin de seleccionar una población homogénea para su posterior análisis.
61
Marcador antigénico Control PE
CD45
CD62p
Figura 8. DSC cultivadas de control y PE, no expresaron CD45 y CD62p.
Mediante citometría de flujo se analizó la expresión antigénica de los marcadores
CD45-PE antígeno leucocitario común y CD62p-FITC marcador antigénico para
células de endometrio, no hubo contaminación con este tipo de células.
Marcador antigénico Control PE
CD10
CD29
CD44
62
CD73
CD90
Figura 9. Fenotipo antigénico de las DSC cultivadas control y PE. Mediante
citometría de flujo se muestra una población homogénea caracterizada por la
expresión antigénica cercana al 100% de los marcadores característicos CD10-
PE, CD29-APC, CD44-PE, CD73-FITC y CD90-FITC.
4.3 EXPRESIÓN GÉNICA DEL TLR4 POR LAS DSC
4.3.1 Extracción e integridad del ARN
En relación a la expresión génica del receptor TLR4 en DSC control y PE, se
realizó la extracción del ARN por medio del método de Trizol siguiendo las
indicaciones del fabricante. Se obtuvo una buena concentración y calidad del
material genético (Tabla 3).
Luego, se procedió a verificar la integridad del ARN extraído, a través del corrido
electroforético (Figura 10). La electroforesis permitió diferenciar las subunidades
ribosomales 28s y 18s, en gel de agarosa al 1,5%, siendo esta la mejor
herramienta para evidenciar que el ARN no estuviera desnaturalizado y con un
buen indicador en la relación fluorescente entre las subunidades ribosomales 28s
y 18s (2:1), lo que favoreció la obtención de resultados representativos.
63
28s
18s
Tabla 3. Cuantificación y pureza del ARN extraído a partir de células DSC
cultivadas
Muestra
DSC – control DSC – Pre-eclampsia
Concentración
(ng/μl) A260/280
Concentración
(ng/μl) A260/280
1 180,7 1,8 363,1 2,0
2 296,3 2,0 211,9 2,0
3 177,5 2,1 368,0 2,1
4 192,7 2,1 301,5 2,1
5 259,7 2,1 254,0 2,0
6 351,8 2,1 333,3 2,1
Se evaluó la calidad y concentración del ARN en el NanoDrop 2000, obteniendo
muestras con una relación A260/280 en un rango óptimo.
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1,5% ARN de las DSC cultivadas.
Se observa el corrido de los fragmentos de las subunidades de ARN de mayor
tamaño en la parte superior (28s, flecha verde) y en la parte inferior (18s, flecha
naranja). Las muestras control fueron identificadas con la letra N, las
correspondientes a PE con la letra P.
4.3.2 Eficiencia de primers
Para realizar el cálculo de cambios relativos en la expresión génica del ARNm
TLR4 en las DSC a través de RT-PCR en tiempo real, se deben tener en cuenta
MP N1 N2 N3 N4 N5 N6 P1 P2 P3 P4 P5 P6
64
algunos parámetros para su validación, dentro de estos la eficiencia de los
primers, así como la verificación de la eficiencia de la PCR. Por lo tanto, se inició
con la evaluación de la eficiencia de los primers para el ARNm blanco (TLR4) y
para el ARNm de referencia (B-actina) (Figura 11).
A B
Figura 11. Curva de amplificación prueba eficiencia de primers. La imagen
corresponde a la amplificación presentada por las muestras de control positivo
ARN de Neutrófilos y control negativo ARN de células HEK293tn. (A) La expresión
del TLR4 corresponde a las líneas azules, los Neutrófilos (control positivo) Ct=20.
Las células HEK293tn (control negativo) Ct=38. (B) Muestra la expresión del
ARNm de referencia B-actina, por parte de los controles. La línea azul
corresponde a la expresión por parte de Neutrófilos y células HEK293tn Ct=20. La
línea roja en ambas imágenes al corresponder al colorante ROX.
4.3.3 Expresión del TLR4
Con el objeto de conocer la expresión génica del receptor TLR4 en DSC
procedentes de mujeres con parto natural como control y PE, el ensayo de
expresión contó con un montaje por duplicado de la RT-PCR en tiempo real de un
solo paso para los ARNm TLR4 y B-actina, así como la evaluación de la eficiencia
de la PCR en tiempo real. Se utilizaron primers que favorecieron la eficiencia de la
amplificación al generar pequeños amplicones (menos de 200pb), aumentando así
el rendimiento de la PCR en tiempo real. Esto facilitó el análisis al eliminar la
necesidad de utilizar curvas standard. El gen de referencia fue B-actina, del cual
se obtuvo una expresión similar en todas las muestras (media Ct=20), se tuvo en
cuenta las posibles variaciones por errores de pipeteo fueran mínimas. Esto
65
permitió realizar el análisis por cuantificación relativa a través de la aplicación del
método de Pfaffl, a partir de los resultados obtenidos del ciclo thershold (Ct) y
datos estadísticos (Figura 12, tabla 4).
Figura 12. Curva de amplificación RT-PCR en tiempo real para los ARNm
TLR4 y B-actina. La imagen corresponde a la amplificación presentada por las
muestras control y PE. Las líneas azules corresponden a la expresión del gen de
referencia B-actina Ct=20. Las líneas de color azul Ct=29 muestran la expresión
del TLR4. Las líneas rojas corresponder al colorante ROX.
Tabla 4. Resultados de Ct de la RT-PCR en tiempo real para ARNm TLR4 y B-
actina de DSC control y PE.
Muestra
TLR4 B-actina
∆Ct media DS CV
Ct-1 Ct-2
media
Ct Ct-1 Ct-2
media
Ct
N1 29,74 29,31 29,53 19,79 20,83 20,31 9,22 9,3
0,1
1%
N2 29,82 29,48 29,65 20,16 20,38 20,27 9,38
N3 29,21 29,97 29,59 20,08 20,32 20,20 9,39
N4 29,97 29,13 29,55 19,57 20,91 20,24 9,31
N5 29,51 29,84 29,67 20,03 21,08 20,55 9,12
N6 29,17 29,75 29,46 20,33 20,14 20,23 9,23
P1 29,61 29,89 29,75 20,30 20,63 20,46 9,29 9,5
0,3
3%
P2 30,16 29,54 29,85 20,98 20,39 20,68 9,17
66
P3 29,63 30,57 30,10 19,90 20,49 20,20 9,90
P4 29,69 29,90 29,79 20,71 20,14 20,42 9,37
P5 29,98 29,77 29,87 20,75 20,27 20,51 9,36
P6 30,72 30,12 30,42 20,88 20,51 20,69 9,73
N, muestras control; P, muestras de Pre-eclampsia; Ct, ciclo threshold (ciclo
umbral); ∆, delta; DS, desviación estándar; CV, coeficiente de variación.
En relación con el modelo matemático de Pfaffl (Pfaffl, 2001), se calculó la
eficiencia de las RT-PCR en tiempo real, teniendo en cuenta la pendiente de las
curvas. La eficiencia PCR en tiempo real (E) de un ciclo en la fase exponencial se
calculó a partir de la ecuación: E = 10 [-1 / pendiente], con 3 muestras de ARNm
obtenido de las células DSC cultivadas (diluciones seriadas), consiguiendo una
alta linealidad en el rendimiento del ensayo de la RT-PCR del ARNm TLR4, a la
cual se le determinó una temperatura optima de fusión para los primers (Tm 55oC),
datos con los que se construyó la curva estándar (Tabla 5, figura 13). Se obtuvo
una pendiente de –3,4085, con una eficiencia de reacción: 1,9651 (96%).
Tabla 5. Eficiencia reacción RT-PCR en tiempo real para el ARNm TLR4
Muestra Diluida Cantidad de ARNm
ln Cantidad de
DNA Ct
d1 5 1,609437912 30,900167
d2 2,5 0,916290732 31,737206
d3 1,25 0,223143551 32,952286
k -1,480290
d 33,21960
y = kx + d
Slope-pendiente (calc. for 10x dil.) -3,4085
Eficiencia PCR en tiempo real 1,9651
67
y = -1,48ln(x) + 33,22
R² = 0,9888
30
31
32
33
34
0 1 2 3 4 5 6
Ct
Cantidad de cDNA
Curva estandar ARNm TLR4
Figura 13. Determinación de la eficiencia de la RT-PCR en tiempo real para
ARNm TLR4. Se obtuvo una óptima linealidad de amplificación.
De igual manera, se determinó la eficiencia de la RT-PCR para el ARNm B-actina
a partir de una temperatura óptima de fusión para los primers (Tm 61oC) y se
realizó la construcción de la curva estándar (tabla 6, figura 14), obteniendo una
pendiente de -3,4697 y una eficiencia de reacción del: 1,9418 (94%).
Tabla 6. Eficiencia reacción RT-PCR en tiempo real para el ARNm B-actina
Muestra Diluida
Cantidad de
ARNm ln Cantidad de DNA Ct
d1 5 1,609437912 25,09350
d2 2,5 0,916290732 25,96230
d3 1,25 0,223143551 27,18245
k -1,506857
d 27,46014
y = kx + d
slope-pendiente (calc. for 10x dil.) -3,4697
Eficiencia RT-PCR en tiempo real 1,9418
68
y = -1,507ln(x) + 27,46
R² = 0,9907
24
25
26
27
28
0 1 2 3 4 5 6
Ct
Cantidad de cDNA
Curva estandar ARNm B-actina
Figura 14. Determinación de la eficiencia de la PCR en tiempo real para el
ARNm B-actina. Se obtuvo una óptima linealidad de amplificación.
En la RT-PCR en tiempo real se obtuvo una eficiencia de amplificación por ciclo
entre el 94% - 96% del ARNm. La cuantificación relativa del gen diana TLR4, se
evaluó en comparación con el gen de referencia B-actina, teniendo en cuenta los
parámetros en busca de los datos por medio de la aplicación del método
comparativo de Ct. La relación de expresión relativa (R) del TLR4 se calculó en
función de eficiencia (E) y la desviación de Ct de las muestras control frente al gen
de referencia, a partir de la siguiente ecuación:
(E TLT4)∆CP TLR4(CONTROL – TLR4)
ratio=
(E B-actina)∆CP B-actina(CONTROL – B-actina)
Finalmente se realizó el cálculo aplicando la formula anterior y el respectivo
análisis estadístico de los datos a través del t-test asumiendo un valor significativo
de p <0,05 (Tabla 7, figura 15).
69
Tabla 7. Comparación de Ct ARNm B-actina vs ARNm TLR4.
Muestra media
TLR4
media
B-actina
Delta
TLR4
Delta
B-actina E - TLR4 E - B-actina
Expresión
relativa media
N1 29,53 20,31 6,17 10,19 64,5926698 864,7327997 0,07
0,07
N2 29,65 20,27 6,05 10,23 59,56307062 887,9947922 0,07
N3 29,59 20,2 6,11 10,30 62,02691152 930,2191377 0,07
N4 29,55 20,24 6,15 10,26 63,72583617 905,8510324 0,07
N5 29,67 20,55 6,03 9,95 58,76373421 737,41338 0,08
N6 29,46 20,23 6,24 10,27 67,72050069 911,8825505 0,07
P1 29,75 20,46 5,95 10,04 55,67222959 782,798722 0,07
0,06
P2 29,85 20,68 5,85 9,82 52,03555013 676,4620421 0,08
P3 30,10 20,2 5,60 10,30 43,94950521 930,2191377 0,05
P4 29,79 20,42 5,91 10,08 54,18801331 803,8566233 0,07
P5 29,87 20,51 5,83 9,99 51,33723305 757,2503799 0,07
P6 30,42 20,69 5,28 9,81 35,40551411 671,9876796 0,05
E: eficiencia.
Figura 15. Análisis de la expresión génica del TLR4 por RT-PCR en tiempo
real a partir de DSC control y DSC PE. Se aplicó la prueba t de student,
considerando significativo un valor de p <0,05; ns: no significativo (p: 0,136).
Ex
pre
sió
n r
ela
tiv
a
TL
R4
No
rmal
Pre
-ecla
mp
sia
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
0 .0 8
0 .1 0
n s
70
Co
nc
en
tr
ac
ión
IL
-6
pg
/mL
Con
trol
PE
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
p = 0 ,0 0 2 2 * *
4.4 SECRECIÓN DE CITOQUINAS
4.4.1 Secreción de IL-6 por las células DSC en cultivo, control y PE
Una de las funciones de la IL-6 durante el embarazo se observa en el proceso pro-
inflamatorio del trabajo pre-parto (Gutierrez et al., 2008). Por lo tanto, se comprobó
si las DSC participan en este control a través de la secreción de esta citoquina. En
este estudio se realizó la medición de IL-6 en sobrenadantes de DSC cultivadas
obtenidas de parto vaginal sin complicaciones (control n=6) y pre-eclampsia (PE
n=6). Al comparar los grupos mediante el método de Kruskal-Wallis se observó
que existió diferencia estadística significativa (p=0,0022) (Tabla 8, figura 16).
Tabla 8. Secreción de IL-6 e IL-10 por células DSC cultivadas control y PE.
Citoquina DSC control (n=6)
mediana (RIQ)
DSC PE (n=6)
mediana (RIQ) p ≤ 0,05
IL-6(pg/mL) 3625 (3390-3930) 805 (615-877) 0,0022**
IL-10 (pg/mL) 4 (2.7-4.7) 10.5 (7.7-15.7) 0,0108*
Test de Mann-Whitney, valor significativo p<0,05.
Figura 16. Secreción de IL-6 por DSC en cultivo. Las DSC cultivadas control y
PE, secretan IL-6, se realizó la cuantificación por ELISA a partir de los
sobrenadantes de cultivos.
71
Co
nc
en
tr
ac
ión
IL
-1
0
pg
/mL
Con
trol
PE
0
5
1 0
1 5
2 0
p = 0 ,0 1 0 8 *
4.4.2 Secreción de IL-10 por las células DSC en cultivo, control y PE
Las células DSC en cultivo secretaron IL-10. Al realizar la comparación de los
grupos de células a través del método de Kruskal-Wallis se observó que existió
significancia estadística (p=0,0108) (Figura 17).
Figura 17. Secreción de IL-10 por DSC en cultivo. Las DSC cultivadas control y
PE, secretan IL-10, se realizó la cuantificación por ELISA a partir de los
sobrenadantes de cultivos.
72
5. DISCUSIÓN
La Pre-eclampsia (PE), considerada la enfermedad hipertensiva del
embarazo es un trastorno que se caracteriza por ser de origen multifactorial
sin causa conocida. Inicia con el defecto del desarrollo temprano de la
placenta desencadenando trastornos maternos y manifestaciones fetales.
Estos defectos se asocian a mecanismos que incluyen remodelación
defectuosa de la arteria espiral materna, disfunción endotelial, estado anti-
angiogénico, estrés oxidativo, respuesta inflamatoria intravascular
aumentada y una respuesta inmune Th1 exacerbada (Hod et al., 2015;
Hutcheon, Lisonkova, & Joseph, 2011; Itami-Sordo et al., 2013; Kar, 2014;
Lopez, Llamas, & Sanchez, 2015;(Kell & Kenny, 2016).
Las DSC son consideradas las principales moduladoras inmunitarias en la
placenta, debido a su capacidad para regular linfocitos y suprimir las
respuestas inmunitarias maternas (Vinketova, Mourdjeva, & Oreshkova,
2016). Se ha demostrado que las DSC ejercen un efecto inhibidor sobre las
células NK, suprimiendo su proliferación y citotoxicidad, a través de la
interacción bidireccional entre ambas células, necesaria para un
microambiente específico que modula las funciones celulares (Croxatto et al.,
2014). Las DSC modulan el proceso de maduración de las células
dendríticas por medio de la secreción de MIC-1 (citoquina inhibidora de
macrófagos-1) y el bloqueo de expresión de receptores CD25, CD83 y CD86
(Segerer et al., 2011). De igual manera en el embarazo las DSC cumplen
una función inmunológica a través de la producción de citoquinas pro-
inflamatorias y anti-inflamatorias, además de la expresión de los receptores
tipo Toll (Canavan & Simhan, 2007; Makhlouf & Simhan, 2006).
73
La alteración en la función de las células deciduales puede producir
complicaciones en el embarazo (Vinketova et al., 2016). La PE se asocia a
hemorragia decidual donde hay formación en exceso de trombina la cual se
une al factor tisular expresado por las DSC que junto al factor de la
coagulación circulante VIIa conlleva a un aumento de sFlt-1 (anti-
angiogénico) en la placenta (Lockwood et al., 2007). La producción
desregulada de quimioatrayentes por las DSC facilita la infiltración de
leucocitos (Huang et al., 2006), todas estas traen consigo alteraciones en la
invasión del trofoblasto extravelloso que está regulado por las DSC,
mostrando un papel importante en la patogénesis de la PE (Yeh, Chao, &
Huang, 2013).
En esta tesis de maestría conseguimos aislar una población de células
deciduales equivalentes a las descritas en otros estudios (Abomaray et al.,
2016; García-Pacheco et al., 2001), crecidas en un medio de cultivo pobre en
suero fetal para evitar que ciertos marcadores antigénicos desaparezcan.
Indicamos que las DSC están íntimamente relacionadas con las Células
Madre Mesenquimales (MSC) ya que presentan una morfología similar a
fibroblastos (Abomaray et al., 2016; García-Pacheco et al., 2001). Además,
se comprobó que las DSC obtenidas en este estudio presentan antígenos
característicos de MSC (Abomaray et al., 2016; Moll et al., 2015).
Se conoce que la placenta es un tejido compuesto por diferentes variedades
de células. Nosotros logramos aislar células DSC puras, y esto se evidenció
por la ausencia de la expresión del CD45 (leucocitos) y CD62p (células
endoteliales). Al respecto, faltarían más estudios para confirmarlo, el hecho
que las DSC en cultivo presenten una morfología de tipo fibroblasto y
además en presencia de progesterona secreten prolactina nos sugiere que
estamos cultivando DSC (datos no mostrados en esta tesis).
74
Los datos de este estudio concuerdan con los trabajos publicados por otros
autores en donde evidencian las características propias de las DSC, fenotipo
y morfología de acuerdo al sitio de la placenta de donde se obtienen
(Abomaray et al., 2016; Choi et al., 2017; Moll et al., 2015; Carmen Oliver,
Cowdrey, Abadıa-Molina, & Olivares, 1999). Resulta importante definir el sitio
de obtención de las células, así como el fenotipo ya que se obtiene mayor
relevancia al momento de analizar y comparar resultados, contribuyendo a
elucidar el papel a nivel placentario de las DSC en cuanto a complicaciones
del embarazo.
Algunos estudios muestran la expresión y localización de los TLRs en
placentas normales y placentas pre-eclámpticas. Sin embargo, no es claro si
el aumento en la expresión del TLR4 en el estroma placentario en pre-
eclampsia, se deba al gran número de células presentes o a la expresión
mostrada específicamente por las DSC (Schatz et al., 2012b). Uno de los
inconvenientes observados en algunos estudios relacionados a la expresión
del TLR4 es el aislamiento de DSC a partir de placentas, sin confirmación
fenotípica de las células analizadas (Dabagh-Gorjani, Anvari, Zolghadri,
Kamali-Sarvestani, & Gharesi-Fard, 2014a; Hayati, Mohamed, & Tan, 2010;
Pineda et al., 2011). Al respecto esta estudio conforma el fenotipo de las
DSC control y PE, lo que representa mayor consistencia a nuestros
resultados, ya que permite inferir de manera más concreta sobre la función
de las células, más aún cuando en el microambiente estudiado se presenta
la infiltración de diferentes células.
Un estudio en deciduas de primer y tercer trimestre, reveló la expresión de
los TLRs por parte de la DSC, sin mayor información en cuanto a la
caracterización fenotípica (G Krikun et al., 2007), lo que limita la consistencia
de los resultados. Asimismo, en otros estudios se ha confirmado en el tejido
de la decidua basal de primer, segundo y tercer trimestre del embarazo, la
75
expresión del TLR4. Para ello estudiaron cortes histológicos de decidua
sometidos a tinción por inmumohistoquímica, diferenciando la decidua por
medio de tinciones como: vimentina. En estos resultados informaron que las
DSC expresan más TLR4 en comparación con las células del trofoblasto,
sugiriendo a las DSC como objetivos primarios para bacterias Gram
negativas y señales de peligro relacionadas con la inflamación (Schatz et al.,
2012a).
El nivel de expresión de TLR4 en células deciduales de primer y tercer
trimestre, comparado con el segundo trimestre, podría reflejar el entorno
inflamatorio que se exhibe en la interfase materno-fetal al principio y final del
embarazo, este aumento de la expresión de TLR4 puede haber evolucionado
como un mecanismo de protección relacionada con el embarazo contra
microorganismos específicos y otros relacionados con la inflamación (Schatz
et al., 2012b).
Una asociación significativa entre la infección bacteriana y la PE, muestran
que la infección subclínica crónica, en lugar de la infección aguda o
reinfección, contribuye con el desarrollo de la PE (López-Jaramillo et al.,
2008). En diferentes tipos de patologías del embarazo la expresión del TLR4
sugiere el aporte no sólo en la infección sino también, en las condiciones de
no infección relacionadas. Resultados de un estudio basado en técnicas de
inmunohistoquímica en tejido placentario, concluyó que la expresión del
TLR4 en placentas a término, pre-termino, con y sin infección, comparando
las DSC y células amnióticas no presentaron diferencias estadísticamente
significativas (Hayati et al., 2010). De acuerdo con este autor, resulta de gran
importancia evaluar de manera individual cada tipo de célula presente en la
interfase materno-fetal y en distintas situaciones, lo que llevaría a vislumbrar
el panorama entorno a muchas de las reacciones adversas en el embarazo.
76
En relación varios estudios han trabajado en la identificación del TLR4 en
tejidos placentarios, observando también la producción de citoquinas. La
identificación del TLR2 y TLR4 en explantes de placenta mostró un aumento
en la producción de interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8 (IL-8), luego de la
incubación con ligandos bacterianos, zymosan y lipopolisacaridos (Holmlund
et al., 2002).
La participación del sistema de los TLRs en la exposición microbiana
materna, tiene efectos positivos sobre la salud fetal. Conrad y colaboradores,
mostraron que una administración de microorganismos no patógenos como
Acinetobacter iwoffii a ratones gestantes tiene un efecto protector sobre el
asma postnatal. No obstante, en ratones sin TLR2/3/4/7/9 el efecto protector
no se produjo (M. L. Conrad et al., 2009; Koga et al., 2014).
Los resultados obtenidos en este estudio en relación a la expresión génica
del TLR4, se sometieron a análisis comparativo entre las DSC control y DSC
obtenidas de PE, encontrándose ninguna diferencia estadística significativa.
Contrario al estudio realizado por Feryal Dabagh-Gorjani y colaboradores,
que encontraron un incremento del TLR4 en placentas de PE. (Dabagh-
Gorjani et al., 2014a). La diferencia con este trabajo fue que utilizaron tejido
de placentas como muestras. Al comparar estas evidencias, los resultados
de este trabajo en relación a la expresión del TLR4, contribuyen en el
esclarecimiento del verdadero aporte en la expresión de este receptor a nivel
de la placenta, específicamente en decidua basal.
Recientes investigaciones encontraron que la expresión del TLR4 se
incrementa en placentas de mujeres con PE en comparación con mujeres
normotensas (L. Zhang & Yang, 2012). Al comparar las evidencias obtenidas
con lo anteriormente descrito, se esclarece que las DSC no participan del
aumento en la expresión del TLR4 a nivel de placenta. No obstante, estos
77
resultados no descartan la posibilidad que puedan estar aportando al
desencadenamiento de la PE a través del TLR4. Además de aclarar la
expresión del TLR4 en estos contextos del embarazo, se describe la
importancia de discriminar y confirmar fenotípicamente el tipo de célula
analizada.
Un estudio en modelo murino muestra que el TLR4 desempeña un papel
fundamental en el parto prematuro inducido por el proceso inflamatorio, este
modelo de parto prematuro inducido fue establecido por aplicación de
inyecciones intraperitoneales de LPS con y sin bloqueo de TLR4. Luego del
cálculo de la incidencia de parto prematuro, establecieron que el bloqueo de
TLR4 disminuyó significativamente el parto prematuro inducido y la muerte
fetal (Li et al., 2010). Referente a este estudio se demuestra que la activación
del TLR4 juega un papel fundamental en el desarrollo de complicaciones del
embarazo.
La evaluación de la expresión de los TLRs realizada por Abrahams y
colaboradores, se efectuó en membranas fetales luego de la exposición a
diversas bacterias como Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum,
Porphyromonas gingivalis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis,
Streptococcus del grupo B y Escherichia coli, asociadas con infecciones
genitourinarias y orales, así como complicaciones en el embarazo,
demostrando que para cada bacteria los efectos en patrones de expresión de
los TLRs son diferentes, sugiriendo especificidad en los mecanismos frente a
la infección asociada a complicaciones del embarazo (Abrahams et al.,
2013). Resultaría interesante evaluar estas bacterias frente a las DSC de
diferentes contextos del embarazo y evaluar los posibles cambios que
puedan ser inducidos respecto a la expresión del TLR4.
78
Las DSC son parte fundamental durante el embarazo a través de la
expresión de los TLRs y la producción de citoquinas inflamatorias que
activan el sistema inmunológico de la madre (Ramathal et al., 2010; Y.-y.
Zhang et al., 2014). Al respecto se ha reportado que la estimulación por LPS
induce la secreción de IL-6 e IL-8 por parte de las células de endometrio
humano (Krikun et al., 2012). Sin embargo, no se descarta que la infección
bacteriana estimula el TLR4 en las células deciduales durante el embarazo,
induciendo la producción de citoquinas (IL-6, y TNF-α) (Mori, Bogdan,
Balassa, Csabai, & Szekeres-Bartho, 2016).
Así mismo, se ha indicado en la decidua de pacientes con PE, mayor
expresión de las proteínas de alta movilidad 1 (HMGB1), un ligando para
TLR4 (Holmlund et al., 2007). De estas evidencias se destaca la participación
del TLR4 en la patogénesis de la PE. Los resultados de este trabajo indican
que las DSC control y de PE, no presentan diferencias en la expresión
génica del TLR4, mostrando que la producción de ARNm es similar y que
podrían no estar involucradas directamente en la patogénesis de la PE. Sin
embargo, esto no significa que la expresión a nivel de membrana celular sea
la misma, dado que antes de expresarse el receptor pueda generarse alguna
modificación a nivel post-traduccional, siendo necesarios estudios
adicionales encaminados en este sentido.
El desenlace exitoso del embarazo depende en gran medida de la
comunicación entre las DSC y las células del trofoblasto estravelloso,
reflejadas en el éxito del implante y la placentación. Una inadecuada invasión
del trofoblasto así como una incorrecta remodelación de las arterias espirales
son las que se asocian a trastornos como la pre-eclampsia, lo que demuestra
una afectación en la comunicación entre las DSC y el trofoblasto (Shipra
Sharma, Godbole, & Modi, 2016). Las funciones de las DSC se encuentran
más enfocadas a la regulación del ambiente en la interfase materno-fetal, en
79
la que propende por la invasión del trofoblasto con movimiento direccional
hacia las arterias, a través de la producción de factores que influyen su
función (James-Allan, Whitley, Leslie, Wallace, & Cartwright, 2018; Shipra
Sharma et al., 2016).
Los niveles en circulación de fibrinógeno se incrementan durante el
embarazo normal, aunque es mayor en pacientes con PE, lo que induce una
mayor expresión de citoquinas pro-inflamatorias por parte de monocitos en
mujeres con PE (Al-Ofi et al., 2014). Este mecanismo sumado a la infección
resulta en el aumento de la respuesta inflamatoria sistémica materna
exagerada y disfunción del endotelio vascular promoviendo el inicio clínico de
la PE (Minassian et al., 2013).
A medida que avanza la morfogénesis placentaria, la IL-6 participa en el
control del equilibrio de propiedades adherentes e invasivas adquiridas por
los trofoblastos (Champion, Innes, Robson, Lash, & Bulmer, 2012). Sin
embargo, no se considera esencial para un embarazo exitoso. Ahora bien, es
probable que la IL-6 tenga una función moduladora durante el desarrollo
placentario y la implantación del embrión, ya que durante la gestación, la
bioactividad de la IL-6 parece estar finamente regulada. Estudios en tejido
decidual de rata revelan que la expresión del ligando de IL-6 y sus receptores
IL-6R y gp130, se suprimen por la prolactina y el estradiol (Deb et al., 1999),
por lo tanto, se deben considerar alteraciones de los ligandos de IL-6, sus
receptores y la sgp130 como inhibidor, en la relación con diversas
complicaciones del embarazo.
La IL-6 podría tener efectos beneficiosos y perjudiciales sobre los eventos
del embarazo temprano, que pueden estimular o inhibir diferentes vías de
señalización en conjunto con la armonía de factores como el INFγ y ligandos
del TLR4, que puedan influir en el equilibrio de la respuesta inflamatoria
80
(Sikorski, Czerwoniec, Bujnicki, Wesoly, & Bluyssen, 2011; Wolf, Rose-John,
& Garbers, 2014).
Los resultados de este trabajo demuestran que la pre-eclampsia está
asociada con una disminución de IL-6 por parte de las DSC de pacientes con
PE. Esta disminución está en concordancia con los hallazgos reflejados por
trabajos previos que muestran una disminución de IL-6 en el fluido amniótico
(Silver, Schwinzer, & McGregor, 1993) y placenta de pacientes con pre-
eclampsia (Kauma, Wang, & Walsh, 1995). Los resultados de ambos
estudios sugieren que la que la IL-6 encontrada en el fluido amniótico
proviene en gran parte de la placenta. Las DSC secretan en condiciones
fisiológicas del embarazo IL-6 y esta producción se encuentra regulada por
diversas citoquinas de tipo inflamatorio (Dudley DJ1, 1992; M. J. Montes et
al., 1995). El hecho que las DSC procedentes de parto vaginal sin
complicaciones secreten cuatro veces más IL-6 que las DSC obtenidas de
pre-eclampsia, podría deberse a la regulación de citoquinas de tipo
inflamatorio como la IL-1 y TNFα (Dudley DJ1, 1992) secretadas durante el
parto vaginal sin complicaciones (Taylor et al., 2013).
Al comparar los resultados de este trabajo con los de Silver et al (Silver et al.,
1993) y Kauma et al (Kauma et al., 1995) se pudo observar que la IL-6 se
encuentra disminuida en diferentes compartimientos de la placenta de
pacientes con pre-eclampsia y que las pacientes tuvieron fetos pequeños
para la edad gestacional (Silver et al., 1993). Otros autores también han
reportado niveles bajos de IL-6 en fluidos amnióticos de pre-eclampsia
(Opsjon, Austgulen, & Waage, 1995). No obstante, se ha reportado en
mujeres con pre-eclampsia que cursan con niveles elevados de IL-6 en suero
(K. P. Conrad, Miles, & Benyo, 1998; Kupferminc, Peaceman, Aderka,
Wallach, & Socol, 1996) considerado como un marcador de severidad (D
Mihu, 2010). La liberación de esta citoquina en suero puede ser por linfocitos
81
activados o por el endotelio materno, la cual se produce cuando se exponen
a estímulos como el TNF α (Pober & Cotran, 1990). Estos resultados indican
que la IL-6 presente en el suero de las pacientes con pre-eclampsia no se
deriva del líquido amniótico ni de las células DSC, pero surge la posibilidad
que el endotelio vascular pueda ser el responsable de este aumento. Faltan
más estudios para confirmar estos datos.
Una de las principales funciones de la IL-6 en el tejido materno es el control
de la invasión del torfoblasto extravellocitario. Estudios in vitro han
demostrado que la IL-6 estimula la migración de las células HTR-8/SV neo
(Graham et al., 1993; M. Jovanovic´, 2009). La deficiencia de IL-6 hace que
las células del citotrofoblasto no invada de forma adecuada a los vasos
uterinos generando en el segundo trimestre una disminución en la perfusión
útero placentaria, produciendo un aumento en la resistencia vascular
periférica y desencadenando los síntomas clínicos de la PE.
Estos resultados sugieren que las DSC contribuyen al reconocimiento y al
control de la invasión del trofoblasto, aportando al mantenimiento del
equilibrio en la interfase materno-fetal. Por tanto, se necesita más estudios
en cuanto al comportamiento de estas células en patologías del embarazo.
La IL-10 es una citoquina fundamental involucrada en la tolerancia inmune
materna para la supervivencia del feto alogénico. Es posible que las células
inmunitarias uterinas adquieran un fenotipo inflamatorio y produzcan
citoquinas inflamatorias en ausencia de esta. Las células T reguladoras
uterinas, las células NK y los macrófagos son los objetivos principales de
dicha desregulación (Cheng & Sharma, 2015). La secreción de IL-10 por las
DSC durante el tercer trimestre se disminuye para dar paso al proceso
natural del parto, propendiendo por el equilibrio en el ambiente materno.
82
Esta citoquina se considera compatible con el embarazo donde se encarga
del mantenimiento de la tolerancia inmune, ejerciendo un efecto anti-
inflamatorio a través de la inhibición de la producción de citoquinas pro-
inflamatorias, el bloqueo de la presentación de antígenos a través del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II y el bloqueo de
moléculas co-estimuladoras CD80 y CD86 (Cheng & Sharma, 2015).
También, se ha demostrado que la IL-10 no solamente ejerce como citoquina
anti-inflamatoria, sino que además tiene un papel protector en la disfunción
vascular (Hsu, Santner‐Nanan, Joung, Peek, & Nanan, 2014).
La placenta normal durante el transcurso del primer y segundo trimestre,
secreta altos niveles de IL-10. Sin embargo, para el tercer trimestre y antes
del parto disminuye su concentración en tejido de placenta (Hanna et al.,
2000). Lo reportado en la literatura referente a mujeres embarazadas con
PE, es una producción deficiente de IL-10 en la placenta a término y una
menor concentración en suero (Cristofalo et al., 2013). De igual manera,
algunos estudios han informado baja expresión de IL-10 en tejido de
placentas pre-eclámpticas en comparación con pacientes normotensas
(Peraçoli et al., 2013; Weel et al., 2016). Los resultados de este estudio
mostraron una secreción de disminuida de IL-10 por parte de las DSC control
en comparación con las DSC de PE. Teniendo en cuenta que las DSC
control fueron recolectadas en promedio a la semana 40 en donde el trabajo
de parto se desencadeno de manera natural y las correspondientes a PE
durante la semana 38 por cesárea, podría ser esta la explicación a los
niveles encontrados, lo cual se asemeja a lo reportado en otro estudio donde
utilizaron homogenizados placentarios (Weel et al., 2016).
Una expresión disminuida de IL-10 a nivel placentario genera la inducción de
factores anti-angiogénicos vasoactivos contribuyendo a una placentación
deficiente, siendo esta una condición asociada al parto prematuro, aborto
83
espontáneo y PE (Pinheiro et al., 2013; Thaxton et al., 2013, Kalantar et al.,
2013). En este sentido un embarazo exitoso exhibe una limitada inflamación
durante el implante y nuevamente aparece en el tiempo del parto (Surendra
Sharma, 2014). Estudios realizados a mujeres con PE, exhibieron en las
pruebas de laboratorio un elevado recuento de leucocitos e incremento de
citoquinas de tipo inflamatorio (Kurtoglu, Kokcu, Celik, Tosun, &
Malatyalioglu, 2015). Por el contrario, se observó que las citoquinas
reguladoras estaban disminuidas (Hennessy, Pilmore, Simmons, & Painter,
1999). Esto implica fuertemente al sistema inmunológico materno como un
contribuyente principal a la patogénesis de la PE. Sin embargo, no está claro
si la activación excesiva del sistema inmunológico materno inicia el desarrollo
de PE o participa en una etapa posterior a la PE (Bounds et al., 2015).
La PE es más probable cuando el nivel de carga inflamatoria sistémica
inherente en el embarazo, en sí excede la capacidad materna para
compensar el estrés adicional. De estos procesos depende una buena
concepción del embarazo normal, siendo esenciales para evitar
complicaciones. La disfunción en las interacciones entre trofoblastos y
células de origen materno, junto a la desregulación de la tolerancia inmune
materno-fetal, son altamente vinculadas a algunos fracasos del embarazo
tales como aborto involuntario, PE, restricción del crecimiento fetal, entre
otros (Du, Wang, & Li, 2014); los cuales presentan una base común en su
desarrollo, establecido en el fracaso de la transformación fisiológica de las
arterias espirales y en trastornos de la placentación, no limitados únicamente
a la PE (Erlebacher, 2013; Vargas et al., 2012). Contrario a lo que se creía,
lesiones en la transformación fisiológica no se limitan a la pre-eclampsia y
restricción del crecimiento intrauterino. Los trastornos de la placentación
profunda están presentes en una amplia gama de complicaciones del
embarazo que implican la transformación de las arterias espirales (Romero et
84
al., 2011), donde también las DSC desempeñan un papel fundamental en el
desarrollo y equilibrio materno.
Los resultados de este trabajo realizan un aporte no solo para PE sino
también para otras complicaciones del embarazo. Una de las limitaciones
encontradas en este estudio fue el número de muestras para cada grupo
estudiado, a pesar de esta condición se lograron obtener datos significativos
y demostrar la importancia en el análisis de la condición clínica de las
participantes para la recolección de los datos y las muestras, así como la
identificación y verificación fenotípica de las células estudiadas. Las DSC al
reconocer LPS de bacterias Gram negativas y ligandos endógenos a través
del TLR4, activan las señales que conducen a una respuesta inflamatoria.
Placentas pre-eclámpticas sobre expresan el TLR4, sin embargo, en este
aumento no participan las DSC ya que no presentaron diferencias
significativas entre las células control y de PE. En efecto las DSC revelaron
su papel protector y regulador del equilibrio placentario durante el embrazo.
En este sentido a nivel de la interfase materno-fetal, trofoblastos, células
endoteliales y leucocitos infiltrados al tejido placentario, estarían aportando
en gran medida al aumento en la expresión de este receptor. Es necesario
realizar más estudios orientados a la inmunidad innata materna
específicamente sobre el TLR4 e indagar sobre el papel que pueden estar
desempeñando las DSC en las diferentes complicaciones del embarazo.
85
6. CONCLUSIONES
1. Las células deciduales estromales (DSC) obtenidas de parto vaginal sin
complicaciones (control) y pre-eclampsia (PE), expresaron antígenos
característicos de células MSC.
2. Las DSC en cultivos obtenidos de parto vaginal sin complicaciones en
cuanto a su morfología y expresión de marcadores antigénicos son
equivalentes a las DSC de pre-eclampsia.
3. Las DSC de parto vaginal sin complicaciones (control) y pre-eclampsia
(PE), expresaron ARNm TLR4 y no mostraron diferencias significativas.
4. La secreción de IL-6 por las DSC provenientes de parto vaginal sin
complicaciones (control) secretaron mayor cantidad de IL-6 que las DSC de
PE.
5. La secreción de IL-10 por parte de las DSC de parto vaginal sin
complicaciones (control) fue menor que las DSC de PE.
86
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