Reacción en cadena de la polimerasa

Biología Molecular, Bioquímica 2016

Ivana Kraiselburd

Clase PCR II

PCR: es una técnica para amplificar ácidos nucleicos in vitro,

que permite la obtención de grandes cantidades de un

fragmento específico de DNA a partir de un molde complejo

El ADN de interés es amplificado exponencialmente mediante

la síntesis enzimática dirigida por una DNA polimerasa

termoestable cebada por 2 oligonucleótidos cebadores (o

primers) y por el agregado de desoxirribonucleótidos

trifosfatos (dNTPs)

Etapas de cada ciclo de la PCRDesnaturalización: el ADN doble hebra se separa en dos hebras a altas temperaturas

(94-95ºC, durante 45 s-1 min). Depende del contenido de GC del molde y su longitud

Hibridación de los cebadores a la zona específica de cada una de las hebras por

complementariedad de bases. Temperaturas más bajas (55-65º C, durante 30 seg-

1min). T y t dependen de las características particulares de los cebadores utilizados

Elongación o extensión del cebador por la DNA polimerasa, la cual cataliza la

incorporación de desoxirribonucleótidos siguiendo la cadena molde en la dirección 5´-3´.

Esta etapa será realizada a la temperatura óptima de reacción de la ADN polimerasa

(72°C para la Taq polimerasa). Los tiempos dependerán de la prosesividad de la enzima

y de la longitud del fragmento a amplificar

Sensibilidad: cantidad mínima de DNA necesaria para que se

produzca la amplificación, es decir, para obtener un producto (banda en

gel). Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede ocurrir que

una muestra sea positiva pero sea dada como negativa porque no se

ha amplificado por no tener suficiente cantidad de DNA

Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto

amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la

que se unen al DNA molde. De esta forma, si los oligos tienen más de

un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto

amplificado

Eficiencia- rendimiento: se refiere a la amplificación máxima que se

puede obtener en un número determinado de ciclos

Fidelidad: se refiere a los errores que comete la DNA polimerasa

durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la

secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena

fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos

Conceptos de la PCR

Sensibilidad• N° de moléculas blanco presentes en la muestra• Complejidad de las secuencias blancoSensibilidad• Diseño del Primer• Enzima• Optimización de la Reacción• Concentración de Magnesio• Formulación del Buffer • Temperatura de AnilladoEspecificidad-Fidelidad• T° de anillado (compromiso)• Número de ciclos• Concentración de Magnesio• Concentración y balance de Nucleótidos dNTPs (10-50 M)• Elección de la Enzima• Concentración de Primers-cebadores suficientemente alta para la unión rápida al DNA blanco

Componentes esenciales de la PCR estándar

DNA polimerasa termoestable

Oligonucleótidos iniciadores (primers o cebadores)

Cationes divalentes: Mg2+ (MgCl2)

Buffer (para mantener el pH de la enzima)

DNA molde

Desoxirribonucleótidos trifosfatos dNTPs: se deben

utilizar soluciones equimoleculares de los

desoxirribonucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP

H2O de alta calidad (doble destilada estéril o MiliQ).

Cationes monovalentes

Co-Solventes: estabilizan la enzima, influencia la

procesividad y/o la Tm.

DNA polimerasas termoestables

Llevan a cabo la síntesis de DNA dependiente del molde

Diferentes orígenes:Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus

woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

Estabilidad: Taq 9 min a 97°C (40 min a 95 °C), Pwo >2 hr a

100°C

Procesividad: número promedio de nucleótidos añadidos a la

cadena de ADN que se sintetiza, antes de separarse de la

cadena molde

Fidelidad: frecuencia de incorporación de un nucleótido

equivocado (depende MgCl2, dNTPs, pH, daño térmico, etc).

Fidelidad: Taq baja; Pfu alta; Pfx alta

Actividad correctora (proofreading, exonucleasa 3’-5’) y/o

reparadora (exonucleasa 5’-3’)

Taq Stoffel Vent Pfu

Fuente Thermus

aquaticus

Taq truncada

sin exo 5´-3´

Thermococus

litoralis

Pirococus

furiosus

Peso

molecular

94 kDa 61 kDa ? 92kDa

Velocidad

Procesividad

75nt/s + 50nt/s + 80nt/s 60 nt/s

Vida ½ (95°C) 40 min 90 min 360 min + 2h

Exo 5´-3´ SI NO SI

Exo 3´-5´ NO NO SI SI

Mg2+ óptima 1,5 mM 3 mM 2 mM 1,5-2 mM

KCl óptima 50 mM 10 mM 10 mM 10 mM

Características de algunas DNA polimerasas

termoestables

Taq polimerasa

Aislada de Thermus aquaticus

Fidelidad baja

Tasa de error total para la Taq polimerasa: introducción de

errores de aproximadamente 1 cada 9.000 nucleótidos

No posee actividad 3´-5´ exonucleasa

Alta procesividad

Es muy importante determinar la concentración adecuada de la

taq polimerasa en la PCR (0.5 y 2.5 U por reacción)

Presenta actividad transferasa terminal en el extremo 3´

(agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo

hay una C). Pfu, Pwo y Tli generan extremos romos

DNA molde Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)

En general se utilizan cantidades que van desde 10 a 500 ng

dependiendo de la naturaleza de la secuencia a amplificar, ADN

genómico (1-100 ng) o plasmídico (2-10 ng), representación del gen

de interés en el genoma, etc

Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1µg de humano, 10

ng de levadura, 1 ng de bacteriano

DNA circular cerrado es levemente menos efectivo que el DNA lineal

Se puede amplificar a partir de una sola molécula de DNA molde,

pero las condiciones deben estar muy optimizadas

Debe estar completamente desnaturalizado (etapa previa)

Calidad del molde (integridad: no fragmentado en trozos más

pequeños de lo que queremos amplificar; proceso de extracción:

que la muestra no presente agentes que inhiban a la actividad de la

polimerasa como trazas de fenol o alcoholes o quelantes como EDTA

que reducen la concentración de iones de Mg en la solución)

Oligonucleótidos iniciadores (primers,

cebadores)

Dos oligonucleótidos cebadores simple hebra

complementarios a los extremos de la secuencia que se

desea amplificar

Presentan entre 18-25 nt de longitud

Se conoce su secuencia

Es el factor más importante para la eficiencia y la

especificidad del proceso

Deben estar presentes en exceso (1013= 30 ciclos, 1kb)

comparado con el DNA molde

Requieren de un cuidadoso diseño

Solución stock 10 µM, se usan 0,1-1 µM final en cantidad

equimolar de cada oligonucleótido

Diseño de cebadores

Manual o por programas de bioinformática

Complementarios a la secuencia deseada

Secuencia del oligo: contenido de GC entre 45-55%

Tamaño estándar: 18 a 25 nt

Extremos 3´ de los oligos quedan enfrentados y deben estar

bien apareados

Evitar formación de estructuras secundarias: dímeros,

autocomplementariedad (palíndromos o largos segmentos de

polipurinas y polimirimidinas) e intercomplementariedad

Agregado de linkers o sitios de restricción

Diseño de cebadores

Consideraciones sobre la Tmelting y Tannealing

Temperatura de melting o fusión es la temperatura a la que la mitad

de los oligos se encuentran hibridados y la mitad se encuentran

como simple hebra. A mayor contenido GC más alta Tm

Si los primers se encuentran mal apareados, la amplificación será

menos eficiente o puede no funcionar. Los cebadores con Tm más

altas pueden aparearse inespecíficamente a temperaturas más

bajas y el cebador con la Tm más baja puede no aparearse a

temperaturas más altas

Solamente se puede programar una temperatura en el termociclador

o equipo de PCR. Si los cebadores poseen diferentes Tm se elige

como Tannealing la más baja

Las temperaturas de melting de los oligonucleótidos pueden ser

estimadas usando la fórmula de Wallace:

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Ta = Tm- 4

(válida para oligos entre 18-25 bases de rango, sino se usan

fórmulas más complejas)

Reglas de diseño:

• Longitud= 18-25bp

• Contenido de GC entre 45-55%

• Ambos cebadores deben tener Tm similares (no mas de 5 ºC de

diferencia entre ambos)

• Evitar las secuencias repetidas. No deberían presentar

estructuras secundarias

Diseño de cebadores

Evitar secuencias repetidas

5´-NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´

5´-NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´

5´- NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´

3´-ATATNNNNNNNNNNNNNNN-5´

1. Caso de extremos 3´ repetidos

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´Dímero del primer

PCR

Evitar secuencias repetidas

5´-TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´

5´- TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´

3´-NNNNNNNNNNNNNNNATAT-5´

5´ 3´

3´ 5´

PCR

5´ 3´

3´ 5´No hay extensión

2. Caso de extremos 5´ repetidos

Evitar secuencias repetidas

5´-NNNNNNNNNNNNNNNGCATGC-3´

5´-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3´

5´-NNNNNNNNNNNNNNNGCA3´-CGT

3´ 5´

5´ 3´

PCR

5´ 3´

3´- Productos de PCR

no deseados

3. Caso de formación de horquillas

Temperatura y tiempo de anillado

Rango estándar: entre 50°C - 65°C, 10-120 s

Mejoras en la especificidad:

• Incrementar la temperatura de anillado (incrementos de 2°-5°C

son recomendados) puesto que reduce las posibilidades de

priming no específico y por lo tanto la formación de producto no

específico

• Reducir los tiempos de anillado. Durante el anillado, los primers

se hibridan rápidamente. Tiempos muy largos no mejoran

normalmente la producción y pueden producir un aumento en

el apareamiento inespecífico y así mayores cantidades de

productos no específicos

Estrategias para lograr una selectiva amplificación en los

primeros ciclos evitando el apareamiento inespecífico

Hot start disminuye la inespecificidad causada por el anillado y la

elongación a bajas T° (agregado de la enzima taq polimerasa o el

Mg2+ a altas T°). Exclusión de un reactivo (dNTPs, taq, Mg2+, primers)

de la mezcla de reacción hasta que la reacción llega a la temperatura

de desnaturalización del ciclo 94 °C

También puede ser con anti-Taq (inhibe la actividad de la Taq

polimerasa hasta la etapa de desnaturalización)

Touchdown PCR (TD-PCR). Es una modificación de la PCR en la

cual la temperatura de anillado inicial es mayor que la Tm óptima de

los primers y la Ta es gradualmente reducida en los subsiguientes

ciclos hasta que la Ta óptima es alcanzada. Una reducción gradual

de la temperatura hasta una temperatura más permisiva durante el

curso de los ciclos favorece la amplificación del fragmento deseado

Iones Mg2+

Cofactor requerido para las DNA polimerasas

Estabiliza el DNA de doble cadena y eleva la Tm, es importante para

controlar la especificidad de la reacción

Mg2+ bajo, apareamiento más estricto. Pero muy pocos iones Mg2+

producen un bajo rendimiento de producto de PCR

Mg2+ alto, aumenta el rendimiento de los productos pero favorece la

inespecificidad promoviendo la incorporación errónea

Exceso de Mg2+ reduce la fidelidad de las DNA polimerasas y puede

causar la generación de productos no deseados (en un gel aparecen

como una escalera)

Los dNTPs secuestran iones Mg2+ (un cambio importante en la

concentración de dNTPs en el buffer puede requerir el ajuste de la

concentración de Mg2+ en la mezcla de reacción)

EDTA en el molde puede afectar la concentración de Mg2+ libre. La

Taq polimerasa requiere Mg2+ libre para su actividad

Concentración de Magnesio

Se utiliza en una concentración entre 1 y 4 mM

La concentración de magnesio afecta los siguientes procesos:

hibridación de los cebadores, temperatura de desnaturalización,

especificidad del producto, formación de dímeros entre cebadores

y la actividad y fidelidad enzimática

Alto Mg2+: alto rendimiento; productos inespecíficos

Bajo Mg2+: bajo rendimiento; alta especificidad

Mejorar la especificidad: disminuir la concentración. Cuidado:

concentraciones inadecuadas de Mg2+ pueden dar lugar a un

más bajo rendimiento

Mejorar la eficiencia: aumentar la concentración. Cuidado:

exceso de Mg2+ tiende a causar reacciones no específicas

dNTPs Las concentraciones de los 4 desoxinucleótidos trifosfato (dATP,

dCTP, dTTP, dGTP) deben ser iguales de modo que ocurra la

incorporación exacta (si un dNTP está en una concentración más

alta que otro será incorporado preferencialmente)

Rango estándar de concentración: 20-200 µM

Las concentraciones de dNTPs utilizados en una reacción son

determinados por la afinidad de la enzima por el sustrato (la Km de la

enzima). Usar concentraciones mayores que la Km (Km para los

dNTPs 10-15 µM)

Se preparan soluciones stock (5-10mM) que contienen cantidades

equimoleculares de los dNTPs

La concentración de dNTPs óptima depende de:

Longitud del producto (200 µM puede alcanzar a sintetizar 12,5 µg DNA

de 400 bp)

MgCl2

Astringencia (exigencias impuestas por el sistema, rigurosidad)

dNTPs

Mejorar la eficiencia: para secuencias molde largas, incrementar la

cantidad de dNTPs

Mejorar la fidelidad: bajar la concentración dNTPs pero tener en

cuenta la concentración de Mg2+ que debe ser disminuida en una

proporción equimolar (cambio en su concentración afecta la

concentración de Mg2+ disponible ya que el Mg2+ forma un complejo

soluble con los dNTPs)

Mejorar la especificidad: reducir la concentración de dNTP pero

observar que la concentración de Mg2+ se debe bajar en una

proporción equimolar

Alto dNTPs baja fidelidad alto rendimiento

Bajo dNTPs alta fidelidad bajo rendimiento

Proporciona las condiciones de reacción, que son importantes para la

actividad de la enzima

Por lo general está formado por:

10 mM tris-HCl (pH=8.4)

50 mM KCl

1.5 mM MgCl2

Adyuvantes o aditivos: pueden ayudar en la práctica a aumentar la

especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El

dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10%

contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN.

También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12

(0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen

también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol,

formamida, albúmina sérica bovina (BSA), etc, aunque no son

imprescindibles

Agua de buena calidad (destilada, desionizada y estéril o agua

milliQ) para completar el volumen final de la reacción

Buffer de Reacción

Número de ciclos

Rango Estándar: 25-40 ciclos

Se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a

partir de DNA genómico de mamífero

Pocos ciclos: bajan el rendimiento

Muchos ciclos: aumentan la inespecificidad

Algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos

El efecto plateau favorece las amplificaciones inespecíficas por

lo que incrementar el n° de ciclos no incrementa la especificidad o

la eficiencia

Mayor a 40 ciclos: se aumenta cantidad y complejidad de los

productos no específicos.

Mejorar la especificidad: Reducir el número de ciclos

Ejemplo de un protocolo de PCR

COMPONENTE VOLUMEN (µL) CONCENTRACIÓN FINAL

Agua autoclavada y ultra filtrada (pH 7) 20,7

10X Buffer de PCR 2,5 1X

Mezcla dNTPs (25mM de cada nucleótido) 0,2 200 µM (cada nucleótido)

Mezcla de primers (25 pmoles/µL cada uno) 0,4 0,4 µM (cada primer)

Taq DNA polimerasa (10U/ µL) 0,2 2 U totales en 25 µL

Molde DNA genómico (100 ng/ µL) 1 100 ng totales en 25 µL

c.s.p. 25

2’ 95 oC

30x 30’’ 94 oC

30’’ 65 oC

2’ 72 oC

10’ 72 oC

Cebadores

Enzima,

longitud

producto

Molde

Detección y Análisis de los resultados

Línea 1: fragmento de PCR de aproximadamente 1850 pares de bases

de longitud. Línea 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800

bases de longitud. Línea 3: no hay producto formado, la PCR falló.

Línea 5: múltiples bandas son formadas a causa de que uno de los

primers se unió a diferentes regiones del molde de DNA.

PCR es una técnica muy sensible: evitar contaminaciones, ya que es

posible que cantidades traza de ADN contaminante sirvan de ADN molde

(producto no deseado, falsos positivos)

1. Contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores

2. Contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de

ADN diana de una muestra a otra

3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores

Normas que ayudan a evitar las contaminaciones:

• Zonas de trabajo exclusivas para PCR, dotadas de su propio material,

separadas de los pasos anteriores (extracción de ADN genómico, etc) y

posteriores (corrida electroforética de los productos)

• Uso de guantes por el manipulador

• Utilización de reactivos y tubos estériles

• Cuidado en pipeteo del ADN (evitarse la formación de aerosoles)

• Las mesas y estantes se lavados periódicamente con lavandina al 10 %,

seguida de etanol al 70 % y de ser posible tratadas con luz UV

• Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)

• Controles: negativo (todos los componentes de la reacción excepto el ADN

molde); positivo (material que se haya utilizado con éxito en PCR anteriores)

Consideraciones prácticas importantes

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Introducir sitios de restricción mediante PCRUno distinto en cada extremo: clonado direccional. Ventaja: no se puede ligar sobre sí

mismo y entra en la orientación correcta.

Hay dos formas de introducir sitios: 1) agregar el sitio en el 5’ del primer o 2) agregarlo

internamente introduciendo mismatch.

1) Introducir un sitio BamHI (GGATCC) en el 5’ del primer

Secuencia del gen: 5’ CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3’

Primer directo o forward:

5’ GCGGATCCCTTCTGCACACAACTG 3’ 24 nt Tm1= 48= Ta1= 44

Tm2= 76 Ta2=72

Tm1= sólo con la parte que hibrida inicialmente; Tm2= con el oligo completo

Anillado de la PCR: primeros 5-10 ciclos a 44º, siguientes a 72º

2) Interno: secuencia del gen: 5’ CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3’

GgA t cC

Primer directo: 5’ CTTCTGGATCCAACTGATG TTCAC 3’

Restar 4º por cada mismatch

Tm= 70 Ta= 70 – 12= 58º Hacer la PCR completa con esta temperatura

Sambrook & Russel - Molecular Cloning - Vol. 1, 2, 3 - 3rd edition

– Chapter 8, 8.1-8.126, c2000 CSHL Press

PCR: Clinical Diagnostics and Research, Rolfs, Schuller, Finckh

and Weber-Rolfs, Chapter 1: PCR Principles and Reaction

Components, Pag. 1-21, Springer-Verlag.

Bibliografía