DEDICATORIAIn Memoriam: Prof. SenénVilaró

RESUMEN

OBJETIVO: Valorar la efica-cia del implante de célulasmadre pluripotencialesadultas obtenidas a partir deaspirado medular (célulasnucleadas) y de tejido adi-poso (células mesenquima-les) en la rehabilitación fun-cional y estética del aparatoestomatognático de pacien-tes con insuficiencia óseamáxilo-mandibular.

DISEÑO: Ensayo clínicoaleatorio-controlado, en ungrupo constituido por 9pacientes con insuficienciaósea máxilo-mandibular.Los criterios de inclusión delos pacientes en este estu-dio, fueron adultos ambossexos tanto los de asigna-ción al grupo tratado concélulas obtenidas a partir de

aspirado medular como concélulas mesenquimales cul-tivadas a partir de lipoaspi-rados de tejido adiposo.

RESULTADOS: Los resulta-dos obtenidos evaluando elcrecimiento óseo han sidoaltamente satisfactorios en8/9 casos totales. Sólo 1caso de 9 se descartó porcontaminación. No se handistinguido diferencias des-tacables en la evolución delimplante celular en ambosgrupos objeto de estudio, yen todos los casos se consi-guió hueso cortical. Se haconseguido crecimiento dehueso vertical en los trata-mientos realizados concélulas progenitoras mesen-quimales, así como tambiénen los tratados con concen-trado de aspirado medular.

CONCLUSIONES: Elimplante de células madreadultas pluripotenciales esuna técnica que precisa deuna preparación meticulosa

y un control exhaustivo decada caso, pero que daresultados altamente positi-vos tanto si las célulasimplantadas son mesenqui-males como si se utilizaconcentrado medular, frentea las técnicas clásicas hastaahora utilizadas.

PALABRAS CLAVEOsteoinducción, osteogéni-co, células madre embriona-rias, células madre adultas,células mesenquimales, teji-do adiposo, médula ósea,células mononucleadas.

INTRODUCCIÓNEl problema que representala insuficiencia ósea maxilo-mandibular, que puedeimpedir o dificultar la reha-bilitación funcional y estéti-ca del aparato estomatogná-tico mediante implantes, esobjeto de estudio desdehace años. Las técnicas pararesolverlo han ido evolucio-nando e incorporando nue-vos elementos a lo largo del

tiempo. Actualmente, la téc-nica de elección es el trata-miento del defecto mediantela inserción de auto-injertoson-lay e in-lay, la cual escompleja y traumática y losresultados, como los de ladistracción ósea, dependenfundamentalmente de lahabilidad y preparación delcirujano. Sin embargo,muchos de los problemas deinsuficiencia ósea pueden,hoy día, resolverse con otrastécnicas más conservadoras.Los elementos de que se dis-pone podemos dividirlosbásicamente en 2 grupos.

El primer grupo de mate-riales, estaría formado porlas membranas que aíslan eldefecto y cuya función esimpedir el crecimiento delos tejidos blandos hacia suinterior, mientras que pre-servan o crean un espacioen donde pueda crecer elhueso. Sus componentespueden ser reabsorbibles ono reabsorbibles, rígidos ono, y todas ellas tienen ven-

Dr. Miguel Velilla LópezMÉDICO ESTOMATÓLOGO

SERVICIO DE ESTOMATOLOGÍA DE LA CLÍNICA HOSPITALARIA

ST. JOSEP DE VIC

Dr. Eduard Molina MascaróMÉDICO ESPECIALISTA EN CIRUGÍA MAXILO-FACIAL

CLÍNICA DEXEUS, BARCELONA

Dra. Adela Miralles MarínRESPONSABLE DEL BANCO DE TEJIDOS (BARCELONA) Dr. Juan García LópezDIRECTOR DEL CENTRO DE TEJIDOS Y TERAPIA CELULAR DEL

BANCO DE SANGRE Y TEJIDOS (BARCELONA)Dr. Manuel Reina del PozoPROF. TITULAR DEL DEP. DE BIOLOGÍA CELULAR DE LA

UNIVERSIDAD DE BARCELONA

Dra. Conxita de Castellarnau Castella INVESTIGADOR SENIOR, DEL DEP. DE BIOLOGÍA CELULAR DE LA

UNIVERSIDAD DE BARCELONA Y DE ADVANCELL

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Células madre adultas(mesenquimales y nucleadas).

Aplicación al campo de laregeneración ósea maxilar en

Implantología

tajas e inconvenientes,debiéndose utilizar la másadecuada a cada caso con-creto. A una membranadeberíamos pedirle, ademásde que evite el crecimientode los tejidos blandos haciael defecto, que sea inmuno-lógicamente compatible,barata, fácil de utilizar, quepermita un cubrimientototal por la mucosa y encíaadherida y que no sea posi-ble su exposición. Existeuna membrana que reúnetodas estas condiciones, queno es otra que el propioperiostio.

El segundo grupo demateriales, estaría formadopor los posibles rellenos deldefecto como son las matri-ces biocompatibles, las cua-les imitan al hueso y tienenpropiedades osteoconducto-ras de la regeneración ósea,lo que facilitará el andamia-je para las células y portanto el crecimiento delhueso. Recordemos que laestructura ósea está consti-tuida por una fase mineralde fosfato cálcico llamadohidroxiapatita (HA), el colá-geno y otros componentes.Por este motivo, las cerámi-cas de fosfato cálcico simila-res al HA son en principio,una de las opciones usadasdesde hace muchos años enimplantes dentales, ortope-dia y cirugía maxilofacial.Se han utilizado todo tipode materiales (1), peroactualmente la tendencia esutilizar principalmente elhueso bovino y otros mate-riales como el hueso decadáver, que al tener proteí-nas precursoras de hueso,podría inducir el crecimien-to de éste y presenta unabuena actividad osteocon-ductora e inductora del cre-cimiento óseo (2).

A este segundo grupopertenecería el materialosteogénico. Sólo el huesovivo lo es, y solamente el

hueso del propio pacientenos da la seguridad inmu-nológica necesaria.

En la actualidad, al dis-cutible efecto morfogenéti-co del hueso de cadáver, sele ha unido la utilización deconcentrados de plaquetas(3), reservorio de factoresde crecimiento y que se hademostrado clínicamenteque aumentan el metabolis-mo óseo, estimulan la rege-neración periodontal, y ace-lera la cicatrización.

Estos factores de creci-miento plaquetarios no sonespecíficos del hueso, sinoque aceleran la formaciónde cualquier tipo de tejido,y su incorporación al arse-nal terapéutico de la regene-ración tisular guiada, hahecho a ésta más predeciblepero no totalmente y sólo sehan conseguido aumentosóseos horizontales. Se preci-saría un nuevo factor añadi-do al substrato, que diera laseguridad de que será huesoy no otro tejido lo que cre-cerá en los defectos a tratar.Una posibilidad serían lascélulas precursoras del teji-do óseo, las cuales ya seincorporan al substrato pormedio del hueso molido delpropio paciente, pero suconcentración estimada de1/1.000.000 no nos asegurala predictibilidad del trata-miento.

Desde hace algunos añosse viene trabajando en laregeneración de tejidosmediante la implantación decélulas madre embrionarias.Durante la fase de mórulalas células embrionarias sontotipotenciales, esto es, cadauna de ellas puede diferen-ciarse en todas las célulasdel organismo y dar lugar aun ser completo. En el sép-timo día, en la fase de blas-tocito, se forma una cavidaden la masa celular que dalugar a dos partes, elembrioblasto del que se

diferenciarán las tres hojasembrionarias y el trofoblas-to que dará lugar a la pla-centa. Estas células embrio-blásticas son denominadasmultipotenciales y van adiferenciarse en las distintaslíneas de células pluripoten-ciales, que se multiplicarána su vez en las estirpes celu-lares para las que están pre-determinadas y que daránlugar a los distintos órganosen el embrión.

En la fase multipotencial,es en la que las célulasembrionarias son obtenidaspara su utilización. Sinembargo la obtención eimplantación de las célulasmadreembrionarias presen-ta una serie de problemasmorales, éticos e inmunoló-gicos que dificultan suincorporación a la clínica.

Algunas células pluripo-tenciales permanecen en losdistintos sistemas del adultocon la función de regenera-ción específica de la líneacelular a que pertenecen.

Recientemente los traba-jos de Verfaille (4) y Prosper(5) han demostrado que esposible la obtención y laextensión de células madreadultas, mesenquimales demédula ósea, y más recien-temente Zuk PA y cols.,2001, las obtienen del tejidoadiposo (6). Parece ser queestas células adultas inserta-das en un medio favorable,son capaces de sufrir unproceso denominado detransdiferenciación, siendoentonces capaces de generarcélulas de tejidos de hojasembrionarias diferentes a suorigen, esto es, que vuelvena ser multipotenciales. Estascélulas madre adultas nopresentan ninguno de losproblemas tanto éticoscomo inmunológicos quehacían tan difícil la utiliza-ción de las embrionarias,por obtenerse del propiopaciente. El doctor. del

Olmo ha aplicado esta téc-nica a problemas clínicosconcretos con gran éxito elaño 2003 (7). Recientemen-te, Rei Ogawa y cols., 2006,(8) han revisado el tema dela potencial utilización delas células madre obtenidaspor técnicas de liposuccióndel tejido adiposo en laregeneración del tejido óseoy en su vascularización.Nuestro grupo ha descritola existencia en las célulasdel tejido adiposo de unapoblación de células proge-nitoras estromales muy pri-mitivas capaces de producirendoteliales y en conse-cuencia de participar en elproceso de vascularización(Martinez-Estrada O.y cols.,2005) (8). Además, las célu-las mesenquimales del teji-do adiposo se ha descritoque expresan marcadoresque indican su potencialcapacidad de diferenciarse acélulas del tejido óseo y quees importante que las célu-las vayan acompañadas deuna matriz que les sirva desoporte para su anclaje yproliferación (revisado en 9y 11).

En base a lo anterior, elobjetivo de este estudio hasido valorar la eficacia delimplante de células madrepluripotenciales obtenidas apartir de tejido adiposo(células mesenquimales) yde aspirado medular (célu-las nucleadas) en la rehabi-litación funcional y estéticadel aparato estomatognáticode pacientes con insuficien-cia ósea máxilo-mandibular.Estas células se han utiliza-do mezcladas con unamatriz ósea y plasma rico enplaquetas (PRP) para pro-porcionar soporte y factoresde crecimiento osteocon-ductivos.

METODOLOGÍAPACIENTES. En este estudiose incluyeron un total de 9

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pacientes (6 varones y 3mujeres) de edades com-prendidas entre 45 y 65años. Los criterios de inclu-sión de los pacientes en esteestudio fueron la insuficien-cia maxilar en combinacióno no con la necesidad deelevación de senos para sutratamiento.

Los criterios de asigna-ción al grupo tratado concélulas nucleadas obtenidasa partir de aspirado medular(n = 7) o con células mesen-quimales (n = 3) obtenidasen cultivo de lipoaspiradosdel tejido adiposo, fueronúnicamente los expuestospara ambos grupos. La eva-luación clínica y radiológica(T.C. en todos los casos) fuerealizada en el periodo pre-y post-operatorio. La eva-luación clínica incluyó elseguimiento postoperatoriodurante 24-48 horas. Poste-riormente se realizó elseguimiento de formaambulatoria semanalmentedurante 8 semanas. La eva-luación por imágenes inclu-yó estudio radiológico altérmino de las 8 semanas yestudio citológico del tejidoóseo neoformado en loscasos que requirieron rein-tervención. Este estudio serealizó bajo la autorizaciónadministrativa de la Organi-zación Catalana de Tras-plantes (OCATT) y con elconsentimiento del ComitéÉtico del centro autorizadopor el propio OCATT parala obtención e implantaciónde células madre adultas(Clínica Hospitalaria St.Josep de Vic).

Técnica quirúrgica. Laobtención del aspiradomedular se realizó mediantepunción en cresta ilíaca,bajo sedación y anestesialocal; el lipoaspirado seobtuvo en las mismas con-diciones, de zona periumbi-lical mediante aspiraciónmanual con cánula hueca

aplicando técnica húmeda.El abordaje quirúrgico parael implante de las célulasmadre pluripotenciales fueincisión crestal y descargasverticales en todos loscasos, excepto en uno en elque se expuso la mandíbulaen su totalidad para coloca-ción de prótesis (10). Comoera de esperar, cuando lascélulas adquieren aparienciafibroblastoide, en cultivoexpresan marcadores (CDs)específicos de mesenquima-les (CD90; CD44; CD105;etc.) y son negativas paraalgunos marcadores hema-topoyéticos que sí se expre-san al inicio.

La obtención de célulasprogenitoras mesenquima-les de tejido adiposo se rea-lizó mediante lavados y tra-tamiento enzimático dellipoaspirado y posteriorpuesta en cultivo de las mis-mas según técnica originaldescrita por Zuk PA y cols.2001 (6), y posteriormenteutilizada por nosotros (10).A estas células se les ha lla-mado PLA (processed lipo-aspirate adipose cells), otambién ADAS (adipose-derived adult stem cells)(8). Estas células multipo-tenciales pueden diferenciar-se in vitro hasta adipocitos,osteoblastos, condrocitos (6,8) y, recientemente, a célulasendoteliales (10). Una vezpuesto a punto el procesopor el grupo de investiga-ción Celltec UB de la Uni-versidad de Barcelona, estatécnica se transfirió al Cen-tro de Tejidos y TerapiaCelular del Banco de Sangrey Tejidos de Barcelona, parasu aplicación a terapia celu-lar. La caracterización de lascélulas obtenidas en 3pacientes se realizó, al finaldel cultivo y antes de suimplantación, mediantecitometría de flujo y el usode alguno de los marcadoresespecificos antes menciona-

dos.El aspirado medular de 7

pacientes se procesó para elimplante mediante centrifu-gación a 3.500 rpm(1.506,50 g), durante 7minutos.

El Plasma Rico en Pla-quetas (PRP) se obtuvomediante la técnica habi-tual.

RESULTADOSLos casos clínicos globalesse presentan en la Tabla I amodo de resumen.

CASOS CLÍNICOS DE PACIEN-TES TRATADOS CON CÉLULAS

MESENQUIMALES DE TEJIDO

ADIPOSO

El volumen medio de tejidoadiposo obtenido en 3pacientes ha sido de 56,7 ±37,5 ml, a partir del cual alfinal del cultivo se han obte-nido 21,6 x 106 ± 6,2 célu-las para implante. Por cito-metria de flujo se encontróque de estas células un 94,6± 4,1 por ciento han sidoCD45-, un 92,4 ± 2,5 porciento han sido CD14-CD90+ y un 72,5 ± 12,9 porciento CD105 + CD166 +CD45-, lo cual nos estaríaindicando su origen mesen-quimal y su potencial osteo-génico.CASO I. Varón de 45 años deedad que presenta grandefecto horizontal y verticalen zona vestibular anterior,que compromete gravemen-te la estética de la restaura-ción (Figura 1). Bajo aneste-sia local y sedación, fuepracticada manualmenteliposucción periumbilical(Figura 2) con técnicahúmeda para la obtencióndel material adiposo, quefue inmediatamente trasla-dado al Banco de Tejidospara su procesado y puestaen cultivo (Figura 3). Sietedías más tarde, bajo aneste-sia local se realizó la inter-vención para la inserción de

los implantes y el rellenodel defecto mediante unamezcla de hueso bovino,PRP y las células mesenqui-males procedentes del culti-vo (Figura 4). Se interpusouna membrana de fibrinadel propio paciente, paraevitar la dispersión del relle-no, y mediante incisión delperiostio se liberó el colgajoque fue suturado sin ten-sión. Parte de las células seinfiltraron en el área desutura para una mejor cica-trización. A las 8 semanas elpaciente conservaba radio-lógicamente el injerto enaltura. El escáner demostróa los 90 días que el creci-miento óseo se había produ-cido tanto en sentido hori-zontal como en el vertical(Figura 5).

CASOS II Y III. Con lamisma técnica, se obtuvie-ron e implantaron célulasmesenquimales en otros dospacientes con atrofia mandi-bular severa, en uno de loscuales se utilizó como mate-rial de relleno y adhesivopara prótesis de mentón yángulo mandibular, conresultados satisfactorios(Figuras 6 y 7). Este pacien-te, que había sido interveni-do innumerables ocasiones,acumulaba fracasos. Seismeses después de la inter-vención el paciente conti-núa asintomático.

En el tercer caso se per-dió el injerto a causa de unainfección (Tabla I).

La técnica descritademuestra que la inserciónde células madre adultas(mesenquimales de tejidoadiposo autólogo) en maxi-lares induce el crecimientoóseo incluso vertical, ya queaunque en ninguno de loscasos pudo llevarse a cabola citología la evolución clí-nica y radiológica fue sufi-cientemente demostrativa.

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CASOS CLÍNICOS DE PACIEN-TES TRATADOS CON CÉLULAS

NUCLEADAS DE MÉDULA ÓSEA.CASO I. Paciente de 47 añosde edad, que presenta insu-ficiencia ósea muy grave enmaxilar superior que preci-saría de injerto de huesoprocedente de cresta ilíaca,con dudoso pronósticodado el escasísimo materialósea donde insertar el injer-to (Figura 8).

Se obtiene el aspiradomedular mediante punciónde hueso ilíaco (Figura 9).

Se prepara una cavidadmediante una membranasemirrígida, que se rellenacon una mezcla de huesobovino, que nos dará volu-men, PRP que aportará fac-tores de crecimiento, homo-genizará la mezcla y la haráfácil de manipular y el cen-tímetro cúbico superior delprecipitado celular, obteni-do mediante el centrifugadode 30 ml de la muestra delaspirado medular , dondeen razón de su densidad, seencontrarán las célulasmononucleadas (Figuras 10y 11). Tenemos pues elmaterial de relleno que bus-cábamos desde el principio:andamiaje biológico, impul-

so de crecimiento y célulasnucleadas como precursorespotenciales del crecimientoóseo. Estas células no hansido aún caracterizadas,pero cabe suponer que enesta fracción pueden existircélulas precursoras. Conesta idea las hemos obteni-do e implantado en elmismo acto quirúrgico, y alser del propio paciente, no

existen problemas ni éticosni inmunológicos. Además,con esta técnica no hemosabierto un segundo campoquirúrgico que siempreresulta traumático para elpaciente y es comprometidopara el profesional. En estecaso el T.C. demostró a los 3meses un crecimiento óseoextraordinario (figura 12).Los implantes fueron inser-

tados y cargados sin proble-ma.

CASO II. Mujer de 50 añosque presenta una reabsor-ción extrema en maxilarsuperior (figura 13). Se pro-puso injerto de cresta ilíacaque fue rechazado por lapaciente. Con la misma téc-nica que en el caso anteriorse procedió a la regenera-

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Figura 1

PACIENTES INSUFICIENCIA ELEVACIÓN PROCEDENCIA CULTIVO TIPO CELULAR CONTROL CONTROL RESULTADOS

MAXILAR DE SENOS CELULAR RADIOLÓGICO HISTOLÓGICO

1 Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales T.C. No +

2 Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales T.C. No +

3* Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales No No ¿?

4 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

5 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. Sí +

de médula ósea

6 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

7 Sí No Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

8 No Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

9 No Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula óseas

Tabla I. Principales características y resultados globales en los pacientes estudiados. (* el paciente 3 no se pudo considerar porque se infectó

ción ósea, en esta ocasiónsin la ayuda de la membra-na que hubiera impedido lasutura sin tensión. A lostres meses, el T.C. demos-tró un crecimiento óseosumamente satisfactorio(Figura 14), incluso com-parado con otro caso trata-do con injerto de cadera.En este caso la histologíadio el resultado de huesomedular. Los implantesfueron colocados y carga-dos sin incidencia.

Finalmente comparamoseste caso con otro distintotratado con injerto de cres-ta ilíaca (Figura 15).

El resto de casos fuerontratados y resueltos conidéntica técnica (Tabla I).

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Figura 2a, b, c y d

Figura 3. Proceso de obtención de mesenquimales: a) centrifugado, b) cultivo, c) mesenquimales, d) transporte al centro hospitalario

DISCUSIÓNLa técnica es novedosa, yaque no hemos encontradoen la literatura revisada nin-gún caso de aplicación decélulas madre adultas en laregeneración ósea maxilaren relación con la Implanto-logía, por lo que natural-mente la experiencia clínicaes escasa, pero ante losresultados obtenidos, sepodría expresar que unanueva y quizás prometedoraterapia celular en MedicinaRegenerativa, podría ser lautilización de las célulasmadre mesenquimales deorigen adiposo (más abun-dantes que en la médulaósea) del propio paciente,multiplicarlas in vitro utili-zando su propio suero comofactor de crecimiento y pos-teriormente transferirlas alpaciente de forma adecuadapara poder facilitar su dife-renciación.

Esta transferencia podríahacerse con las células solaso asociadas a algún tipo debiomaterial cerámico de losque ya se usan actualmente,pensando que estos podríafavorecer conjuntamente suanclaje y favorecer su oste-ointegración.

De acuerdo con distintosautores (8, 9) y por resulta-dos experimentales propios(10) creemos que estapodría ser técnica de elec-ción para resolver los defec-tos óseos más importantes ysobre todo el proceso devascularización, el cual esmuy necesario para quehaya formación de huesomedular.

Con esta intención a par-tir del tejido adiposo hemosobtenido un número muyelevado de células progeni-toras adultas, que expandi-das en cultivo presentan oexpresan marcadores reco-

nocidos como específicospara células mesenquimalescon capacidad de diferen-ciación específica a célulasdel hueso. En los casos estu-diados y que se han podidoseguir, esta técnica ha sidoclínicamente muy efectiva.Sin embargo, en la prácticadiaria resulta, por ahora,legalmente inalcanzablepara el práctico general ybastante costosa.

Sin embargo, los resulta-dos también positivos obte-nidos en 7 casos utilizandolas células nucleadas de unconcentrado medular sinpurificar, nos estaría indi-cando otro camino por elque quizás de forma no tantraumática y en el mismoacto quirúrgico, se podríanresolver casi la totalidad delos casos de insuficienciaósea periimplantaria, con laaportación de las pocascélulas madre hematopoyé-ticas presentes en dichosconcentrados de médulaósea medular. Nos encon-tramos, como se demuestraradiológica, clínica e histo-lógicamente (esto último enun caso), que las célulasexistentes son capaces detransdiferenciarse en célulasmadre precursoras de tejidoóseo. Si bien en estos casos

se consigue sólo hueso enforma de bloque cortical,este es suficiente para llevara cabo tratamientos implan-tológicos.

No desesperamos, sinembargo, de que aplicandoal aspirado medular técnicasmás refinadas de aislamien-to y extensión celular en elmismo acto quirúrgico, lle-garemos a conseguir unnúmero de células aportadosuperior y el “efecto rabo delagartija” deseado, esto es,la restitución íntegra de cor-tical y medular que busca-mos desde el principio.

CORRESPONDENCIADr. Miguel Velilla LópezTel. y fax: 93 883 37 24e-mail: miguelvelilla@tele-fonica.net

AGRADECIMIENTOSDra. Esther BellafontDña. M.ª Jesús FélixDra. Carmen RosDra. M.ª José GiménezProf. Montserrat PonsàD. Miguel Velilla BellafontDr. Julián LópezDr. Albert VallésDr. Josep M.ª FerrerDr. Juan Ángel ClaveroDr. Luís Massuet Dr. Luciano Rodríguez

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Figura 4a, b y c

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Figura 5a, b, c, d, e y f

Figura 6a y b

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Figura 7a, b, c y d

Figura 8a y b

Figura 9

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Figura 10a. Vertido en los tubos de centrifugado.10b. Obtención de la sangre para el P.R.P.10c. Material final de relleno

Figura 11a y 11b

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Figura 12a, b,c y d

Figura 13a, b y c

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Figura 14a, b, c y d

Figura 15a y b

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