OBTENCIÓN DE CÉLULAS MESENQUIMALES DE SANGRE DE C ORDÓN UMBILICAL CRIOPRESERVADA CULTIVADAS CON LISADO DE P LASMA

RICO EN PLAQUETAS

MARCO ANTONIO BONILLA V. LUZ MABEL ÁVILA PORTILLO

DERLY FRANCO JENNIFFER AVILA ANGELA RIVEROS

JOSE VICENTE CARMONA PERTÚZ

UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA FACULTAD DE MEDICINA

HOSPITAL MILITAR CENTRAL 2015

TABLA DE CONTENIDO 1. RESUMEN 2. INTRODUCCIÓN 3. JUSTIFICACIÓN 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 5. OBJETIVOS 5.1OBJETIVO GENERAL 5.2 OBJETIVOS SECUNDARIOS 6. MARCO TEÓRICO 6.1 CELULAS MADRE ADULTAS Y CELULAS MADRE MESENQUIMALES (MSC) 6.2 SUPLEMENTOS PARA CULTIVO DE CELULAS MADRE 6.2.1Suero Bovino Fetal (SBF): ventajas y desventajas 6.2.2 Suplementos Libres de Proteína Animal 6.3 FACTORES DE CRECIMIENTO 6.3.1 Factor de crecimiento epitelial (EGF) / Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-Α) 6.3.2 PDGF (Factor de Crecimiento derivado de plaquetas) 6.3.3 Factor de crecimiento fibroblástico (FGF) 6.3.4 El factor de crecimiento transformante β (TGF-β) 6.3.5 Factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) 6.3.6 Factor Plaquetario 4 (PF - 4) 6.4 UTILIDAD CLÍNICA CELULAS MADRE MESENQUIMALES 6.5 SANGRE DE CORDON UMBILICAL (SCU) 6.6 BANCOS DE SANGRE DE CORDON UMBILICAL 6.7 CITOMETRÍA DE FLUJO 6.7.1. Realización de citometría de flujo 6.8 FENOTIPO 7. DISEÑO METODOLOGICO 7.1 MATERIALES Y MÉTODOS 7.1.1 Tipo de diseño 7.1.2 Población de estudio 7.1.3 Criterios de inclusión 7.1.4 Criterios de exclusión 7.2 VARIABLES 7.3 PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL 7.3.1 Equipos y materiales necesarios para la recolección 7.3.2 Pasos para la recolección de la muestra 7.4 PROCEDIMIENTO DE CONGELAMIENTO SCU 7.5 PREPARACIÓN DE LISADO DE PLASMA RICO EN PLAQUETAS (LPRP) 7.6 DESCONGELAMIENTO SCU 7.7 CULTIVO DE CÉLULAS 7.8 PROCEDIMIENTO DE DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICA 7.8.1preparación del medio de cultivo.

7.8.2 diferenciación osteogénica 7.8.3. disociación enzimática 7.8.4 separación de la capa de mononucleares 7.8.5 caracterización fenotípica 8. ANALISIS ESTADISTICO 9. RESULTADOS 10. DISCUSION 11. CONCLUSIONES 12. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

LISTA DE ABREVIATURA

MSCs Células madre mesenquimales MR Medicina Regenerativa SCU Sangre de cordón umbilical CM Células madre SBF Suero fetal bovino LPRP Lisado de plasma rico en plaquetas PRP Plasma rico en plaquetas FC Factores de crecimiento MAPC Células progenitoras multipotentes adultas CMF Citometría de flujo DMEM-LG Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco Bajo en Glucosa

LISTA DE TABLAS

Tabla No. 1. Medidas de tendencia central y de dispersión de las células obtenidas precongelamiento. Tabla No. 2. Medidas de tendencia central y de dispersión de las células obtenidas post descongelamiento. TABLA N° 3. Medidas de tendencia central y dispersión de la viabilidad de CN totales por crecimiento en cultivo de CMM. TABLA N° 4. Medidas de tendencia central y dispersión de la viabilidad precongelamiento por crecimiento en cultivo de CMM. TABLA N° 5. Medidas de tendencia central y dispersión de la viabilidad de CN totales postdescongelamiento por crecimiento en cultivo de CMM.

1. RESUMEN

TITULO OBTENCIÓN DE CÉLULAS MESENQUIMALES DE SANGRE DE C ORDÓN UMBILICAL CRIOPRESERVADA CULTIVADAS CON LISADO DE P LASMA RICO EN PLAQUETAS

Introducción: Las células madre mesenquimales (MSC) poseen gran potencial terapéutico, se han identificado MSC de diferentes fuentes, incluido la gelatina de wharton del cordon umbilical, existen brechas de conocimiento acerca de la obtencion de MSC de unidades de sangre de cordon (SCU), y la optimizacion del cultivo para la expansion de MSC a partir de UCB criopreservadas . El objetivo de este trabajo fue aislar y expandir MSC de SCU criopreservadas cultivadas con lisado de plasma rico en plaquetas.(LPRP) Materiales y métodos: Se realizó un estudio experimental de laboratorio. Se recolecto SCU de 21 maternas del servicio de ginecologia del Hospital Militar Central desde enero de 2013 a octubre de 2014 previa firma del consentimiento informado, se procesaron, congelaron (3 meses) y descongelaron , se verifico la viabilidad celular pre y pos congelamiento posterior al descongelamiento fueron cultivadas en medio DMEM LG suplementado con LPRP, se realizo citometria de flujo para CD34, CD45,CD73, CD90 y CD105 y se indujo diferenciación osteogénica a las celulas adherentes. Se aplicó un análisis estadístico de diferencia de medias para probar los determinantes del crecimiento. Resultados: Se recolectaron 21 muestras de sangre de cordón umbilical, obteniendo conteos de células nucleadas superiores a 200´000.000. La viabilidad promedio precongelamiento fue del 98,6% con D.E. 2,99. Con un descenso del 26,37% luego del descongelamiento. Se logró crecimiento de células madre mesenquimales en el 57,14%. En seis muestras se indujo diferenciación osteogénica, lográndose en el 100%. No hubo una diferencia significativa al comparar las medias del conteo de células nucleadas, la viabilidad precongelamiento y postdescongelamiento cuando hubo crecimiento de MSC o no.

Conclusiones: Este estudio encontro 57,14% de celulas adherentes provenientes de SCU criopreservadas, cultivadas con DMEM-LG+LPRP, las cuales fueron positivas para induccion osteogenica y fenotipo MSC.

2. INTRODUCCIÓN

El uso de MSC como alternativa terapéutica está siendo investigado en diferentes ensayos clínicos controlados en una gran variedad de enfermedades 1. Sus propiedades antinflamatorias, antifibroticas regenerativas y antimicrobianas las sitúan como un recurso biológico interesante, a pesar de que existen brechas de conocimiento aun en la comprensión de mecanismos de senalizacion, subpoblaciones y caracterizacion de las MSC, optimizacion de expansion para el efecto esperado, tipo de fuente a utilizar entre otras 2 . El suplemento más frecuentemente usado para el cultivo de células madre (CM) es el suero fetal bovino (SBF) que conlleva el riesgo de transmisión de patógenos conocidos y desconocidos, así como xenoimmunización contra antígenos bovinos 3,12. Dado lo anterior existe la necesidad de cultivar celulas con mayor seguridad y que no cumplan criterios de zoonosis, esta situacion ha estimulado el desarrollo de medios de cultivo sin sumplemento o la utilizacion de factores de crecimiento de origen plasmático con diferentes variantes metodológicas, específicamente el plasma rico en plaquetas (PRP). La introducción de este factor de crecimiento como alternativa para cultivo de MSC busca disminuir riesgos y aumentar la calidad de la célula obtenida. El desarrollo de estas plataformas de cultivo y la optimizacion de metodologias para expandir las celulas madre son necesarias para darle viabilidad a estas terapias en paises como el nuestro.6, 13

3. JUSTIFICACION

A nivel mundial, en los últimos años se han desarrollado avances en la aplicación de células madre como alternativa terapéutica ya que son capaces de regenerar tejidos deteriorados o lesionados como hueso, cartílago, tejido hepático o miocárdico, y modular reacciones inmunes en colagenopatías, esclerosis múltiple y trasplantes de médula ósea, entre otras. En esta área no solo se han demostrado grandes avances significativos, sino que también tiene un futuro prometedor en el campo clínico, social y científico. El suero fetal bovino (SBF) es utilizado frecuentemente como suplemento para la expansión de CMM, aunque se han planteado inquietudes acerca de sus reacciones, ya que se puede exponer a los pacientes a una posible zoonosis debido a que contiene proteínas animales que pueden ser no compatibles con el humano. Por otro lado, una alternativa es suplementar los medios de cultivo con derivados de la sangre de humano como el lisado de plasma rico en plaquetas (LPRP) para crear condiciones de cultivo que se asemejan más al ambiente. No obstante, se deben tener en cuenta precauciones para el uso del lisado, debido a que existe la posibilidad de desencadenar reacciones inmunológicas si no se tiene en cuenta la compatibilidad de los grupos sanguíneos de los donantes del suero y de los donantes de sangre de cordón umbilical. Con este estudio se quiere hacer una comparación en cuanto al potencial de diferenciación y fenotipo de CMM al ser cultivadas en medios suplementados con LPRP.

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las CMM pueden ser aisladas de diferentes fuentes, entre ellas la médula ósea, la sangre de cordón umbilical, tejido adiposo, páncreas, hígado, músculo esquelético, dermis, membrana sinovial y pulpa dental 2. Varias investigaciones publicadas han señalado la posibilidad de obtener también estas células de otras fuentes alternativas, como el líquido amniótico y la gelatina de Wharton del cordón umbilical. No obstante, los tejidos más empleados son la médula ósea, la sangre del cordón umbilical y el tejido adiposo51-52. Para que las CMM se puedan clasificar como tales, deben expresar los antígenos mesenquimales CD73, CD90 y CD105 y no tener antígenos hematopoyéticos como CD34, CD45, CD14 y CD11b. Además, se ha planteado que las CMM pueden expresar los antígenos CD13, CD29, CD44, CD116 y el receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) 52,54,55. Debido a la gran capacidad multipotencial, plasticidad y acciones de las CMM, resultan de gran interés para la aplicación clínica. Sus características permiten utilizarlas para modular reacciones inmunes en enfermedades autoinmunes y en el trasplante de médula ósea para regenerar tejidos destruidos o dañados, como sucede en enfermedades neurodegenerativas, la diabetes o en cardiopatías. Además, podrían ser utilizadas como vehículo terapéutico de genes como por ejemplo, en enfermedades monogénicas como la hemofilia54-55. El suero fetal bovino ha sido tradicionalmente usado como medio de crecimiento en el cultivo de CMM, sin embargo, éste tiene varias desventajas como son, la variabilidad de resultados entre muestras, potencial contaminación con patógenos animales conocidos y desconocidos así como el riesgo de xenoinmunizacón47. El medio de cultivo ideal, brindará factores de crecimiento, propiedades de adhesión, hormonas, proteínas, vitaminas y ácidos grasos fundamentales para el crecimiento celular pero sin los riesgos anteriormente descritos dados por el suero fetal bovino.13 Uno de los recientemente estudiados es el plasma rico en plaquetas, que al tratarse de un componente humano, disminuye el riesgo de reacciones alérgicas cruzadas y elimina el riesgo de zoonosis.36 Pero el reto más grande hoy día y que planteamos en este trabajo, después de obtener células mesenquimales provenientes de sangre de cordón umbilical, es lograr la diferenciación celular, en los distintos linajes usando el plasma rico en plaquetas (PRP) como medio de cultivo, como su nombre lo indica, posee una alta concentración de trombocitos, obtenido por centrifugación de la sangre a baja velocidad; su función está directamente ligada a la liberación de factores de crecimiento (FC) por parte de las plaquetas50.

Los FC liberados por las plaquetas, son capaces de estimular la actividad mitogénica de las células expuestas, así como su actividad angiogénica, entre otras propiedades de los mismos50. Por lo tanto, se espera con éste trabajo determinar la capacidad de expansión y diferenciación celular en un medio suplementado con PRP.

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL Aislar y expandir MSC de SCU criopreservadas cultivadas con lisado de plasma rico en plaquetas.(LPRP)

5.2 OBJETIVOS SECUNDARIOS

1. Comparar la viabilidad celular de las Unidades de sangre de cordon pre y pos congelamiento

2. Aislar celulas adherentes de sangre de cordon umbilical criopreservadas cultivadas con suplemento de LPRP

3. Caracterizar mediante fenotipo e induccion osteogenica las celulas adherentes

6. MARCO TEÓRICO 6.1 CELULAS MADRE ADULTAS Y CELULAS MADRE MESENQUI MALES (MSC) Las células madre mesenquimales son células pluripotentes y adultas con morfología fibroblastoide y plasticidad hacia diversos linajes celulares como condrocitos, osteocitos y adipocitos entre otros. Estas células pueden ser aisladas principalmente de médula ósea, sangre de cordón umbilical y tejido adiposo de donde se han logrado establecer cultivos que han permitido estudiar sus propiedades funcionales y fenotípicas. Aunque la información obtenida hasta la fecha no brinda un conocimiento completo, se espera que con el desarrollo de próximas investigaciones se aclaren diversos aspectos biológicos para implementar su uso en medicina regenerativa1. Las células madres adultas, también se conocen como células madre somáticas, están localizadas en muchos tejidos del cuerpo humano y son necesarias para restaurar la función normal a través de la reparación y regeneración de tejidos In vivo, por ejemplo, células satélites en tejido muscular. Ellas se encuentran en un estado de reposo hasta que son activadas por los mediadores de lesión o enfermedad2. Una de las poblaciones más estudiadas actualmente son las MSC, fueron caracterizadas entre los años 60`s y 70`s. Trabajos realizados por Friedenstein, donde las CMM fueron aisladas de la medula ósea, las describió como células adherentes de morfología fibroblastoide que son capaces de diferenciarse a células de origen mesodérmico como lo son los osteocitos, condreocitos y adipositos3.

Las CMM muestran varios antígenos de superficie comunes, como CD90 (Thy-1), CD166 (SB10/ALCAM), CD73 (SH3) y CD105 (SH2 y endoglina), y la carencia de expresión de antígenos hematopoyéticas (CD45, CD34) y endoteliales (como CD31) y los marcadores HLA-DR. Sin embargo, la heterogeneidad significativa en la morfología, la proliferación y en la diferenciación de las CMM también se han observado4.En el año 2006, la Sociedad Internacional de Terapia Celular o ISCT (International Society Celullar Therapy) propuso tres criterios principales para validar las células madres mesenquimales que son: 1. La adherencia en cultivo, 2. La expresión de antígenos CD73, CD90 y CD105 pero ausencia total de antígenos hematopoyéticos CD34 y CD45. Capacidad de diferenciación In vitro en osteoblastos, condrocitos, adipocitos bajo condiciones estándar de cultivo5. De acuerdo a lo propuesto por ISCT, se tiene en cuenta también que las CMM realicen procesos de autorenovación, es decir, que mientras la división celular una de las células hijas inicie programas de diferenciación celular, y que aparte de lo anterior tengan la capacidad de desarrollar plasticidad diferenciación hacia tejidos de capas embrionarias distintas al mesodermo, como lo son el ectodermo y el

endodermo; si no cumplen todas las características anteriores sería conveniente clasificarlas como progenitores tempranos y no como células madre.1 La principal fuente de aislamiento de CMM es la medula ósea, sin embargo se han aislado de tejido adiposo, páncreas, hígado, musculo esquelético, dermis membrana sinovial, hueso trabecular, sangre de cordón umbilical, tejido pulmonar, pulpa dental y ligamento periodontal1. Los tejidos más utilizados para la extracción de CMM, son medula ósea, sangre de cordón umbilical y tejido adiposo. En medula ósea el 0.003 % de células mononucleares son CMM y la literatura muestra un éxito de aislamiento del 100%, también se considera que las células obtenidas de esta fuente tienen una tasa de crecimiento que disminuye de acuerdo a la edad avanzada de los donantes6, además se logra una capacidad de diferenciación del 71.4%.7,8 En modelos experimentales se ha demostrado que las CMM son capaces de regenerar tejidos deteriorados o lesionados como hueso, cartílago, tejido hepático o miocárdico9,10, y son capaces de modular reacciones inmunes en colagenopatías, esclerosis múltiple y reacción injerto versus huesped11. 6.2 SUPLEMENTOS PARA CULTIVO DE CELULAS MADRE 6.2.1 Suero Bovino Fetal (SBF): ventajas y desventajas.

El uso común de SBF en cultivos de Células Madre (CM) como fuente de factores de crecimiento conlleva el riesgo de transmisión de patógenos conocidos y desconocidos, así como xeno-immunización contra antígenos bovinos. La situación ideal sería evitar la utilización de SBF durante la manipulación de células madre humanas. Hasta el momento la propagación óptima de CM cultivadas (CMC) ha sido estrictamente dependiente del uso en cultivo de SFB como suplemento. Se ha propuesto como alternativa el uso de suero humano del grupo AB al 20% como suplemento, con el fin de reducir el número de antígenos bovinos encontrados en cultivo y así mejorar la terapia con este tipo de células35.

Aunque las MSC propias no son altamente inmunogénicas; cuando son expandidas en SBF, probablemente van a generar respuestas inmunes en algunos pacientes en la primera administración, además la mayoría de los pacientes responden negativamente si se repite la administración de células y pueden presentar reacciones anafilácticas; lo anterior se ha observado en varios pacientes que recibieron repetidas administraciones de linfocitos o células dendríticas cultivadas en SBF35. En un ensayo clínico para el tratamiento de osteogénesis imperfecta, se identificó un paciente que desarrolló anticuerpos contra las proteínas de SBF después del tratamiento con CMC; este paciente no presentó éxito ante el injerto ni crecimiento celular35.

Varios análisis han revelado que una inyección única de 100 millones CMC que crecen en condiciones normales (SBF al 20%) llevaría con ella de 7 - 30 mg de proteínas séricas de bovino. La administración repetida de CMC contaminadas con proteínas de SFB tiene una alta probabilidad de causar rechazo inmunológico de las células inyectadas y también puede conducir a complicaciones graves, como reacciones autoinmunes contra sus propias células Stem35. Durante las últimas décadas, los múltiples efectos inmunomoduladores del SBF han sido demostrados, incluyendo la activación de células NK, inducción del complejo mayor de histocompatibilidad sin restricción, citotoxicidad mediada por células, inducción de la secreción de linfoquinas, y activación policlonal de células B. Es probable que muchos, si no todos, estos efectos pueden haber desempeñado un papel en la generación de respuestas en estos pacientes35. En 1991, Reisser, Michell y cols, describen la absorción de los componentes de suero fetal bovino en células cancerígenas de colon de ratas que modificaron la respuesta inmune de esas células cuando se inyecta en ratones sinérgicos. Del mismo modo, la detección de anticuerpos de SBF por inmunodifusión en pacientes, después de infusiones con cultivos de linfocitos sugiere que los procedimientos de lavado antes de la infusión son insuficientes para eliminar las proteínas extrañas de SBF en los linfocitos. También existe la posibilidad de la sensibilización de los pacientes con SBF en vez de limitarse a una actividad pasiva actúa como vehículo para el ingreso de antígenos extraños35. Anticuerpos y neo-antígenos son expresados en las líneas celulares humanas cultivadas con SBF, esto se ha demostrado en el suero de aproximadamente 50% de individuos normales. Si estos anticuerpos de SBF se encuentran en los pacientes, el título es demasiado bajo para la detección por inmunodifusión luego de las infusiones. La presencia de los síntomas clínicos empeora la reacción con la administración reiterada de las células lo que sugiere un efecto de uno o más componentes del SBF con la repetición de la exposición. Sin embargo, no se puede descartar el título de anticuerpos en una anamnesis de modo natural, y los niveles de sensibilización con la ingesta de productos bovinos35. Aunque la calidad del SBF ha influido en la producción a gran escala de las MSC al tiempo que mantiene su linaje y capacidad de diferenciación, otros parámetros y condiciones de cultivo como la concentración de glucosa, la densidad celular de siembra entre otras características afectan el resultado final35. Debido a los problemas que representa el uso de SBF como sustrato en medio de cultivo los investigadores han tratado de encontrar herramientas para el control de la calidad SBF aunque hasta el momento son relativamente primitivas y costosas dada la complejidad de la muestra y la gran cantidad de SBF utilizado por cultivo. Desde 1975, se ha demostrado un alto grado de variabilidad del suero entre los proveedores de las casas comerciales que producen el suero35.

Además, un reciente estudio de la evolución en el tiempo de los componentes del SBF, reveló que la cantidad de las proteínas estructurales de la matriz extracelular (que son las indicadoras del crecimiento celular) aumentó con el tiempo, y los componentes suministrados por el SBF (como los relacionados con la nutrición y propagación de las células relacionadas con las proteínas) disminuyó en el tiempo. Esa variabilidad no sólo obliga a la mayoría de los laboratorios a producir su propio SBF de uso continuo y a utilizar lotes preseleccionados, sino que además se hace difícil comparar los datos recibidos por los diferentes investigadores ya que todos elaboran sus productos en condiciones diferentes35. Finalmente, el SBF contiene altas concentraciones de fetuina-A, una glucoproteína con un amplio espectro biológico que influye sobre el crecimiento celular y la diferenciación, afectando proteinas clave que participan en la regulación del proceso de diferenciación en las MSC35. 6.2.2 Suplementos Libres de Proteína Animal.

En teoría, el uso de los derivados de la sangre humana puede eliminar o reducir el riesgo de efectos secundarios de los productos de origen animal. Diferentes consideraciones indican que no debemos excluir la posibilidad de utilizar igualmente suero humano o plasma debido a la evidente participación de la coagulación y vías fibrinolíticas. De hecho, la necesidad de usar MSC como fuente de los tejidos para terapia celular en medicina regenerativa conlleva a su creación y propagación, según los requisitos de calidad expuestos por las GPM (Good Manufacturing Practice), evitando los cultivos con sustancias animales con el fin de excluir el riesgo de infecciones e inmunogenicidad (Bull World Health Organ, 1997), y, por último, la obtención de células y tejidos que son genéticamente y epigenéticamente normales35.

En particular, se ha demostrado que las MSC que crecen con derivados de suero humano mantienen todas las características de las células Stem sin alterarlas en cultivos prolongados, manteniéndolas en números ilimitados e indiferenciados con capacidad proliferativa y mantenimiento del cariotipo normal35.

Por lo que se refiere a MSC, ha habido mucha controversia sobre lo que constituye un suplemento adecuado. Además del plasma humano, en el que se han identificado los varios factores que pueden ser importantes para la diferenciación de células Stem (por ejemplo, hormona de crecimiento y la insulina), varios estudios han centrado la atención en el uso de suero autólogo. Al respecto, varios documentos demuestran que el suero o plasma autólogo preserva la capacidad de diferenciación, e induce la proliferación de MSCS derivadas de médula ósea, lo que podría mejorar la terapias genéticas35. Varios estudios demuestran que las MSC cultivadas en los medios de suplementado con lisado de plasma rico en plaquetas (LPRP) muestran una

vigorosa capacidad de proliferación, eficiencia clonogénica, actividad inmunosupresora, y capacidad de diferenciarse hacia osteocitos, condrocitos, y adipocitos. De particular interés es la reciente evidencia que el suero heterólogo AB de humanos, proporciona significativamente mayores efectos proliferativos sobre el tejido adiposo, mantiene la diferenciación y la capacidad de expresión de marcadores en toda el cultivo a largo plazo35.

6.3 Factores de crecimiento del plasma rico en plaquetas 6.3.1 Factor de crecimiento epitelial (EGF) / Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-Α). Entre sus acciones biológicas podemos destacar efectos mitogénicos y quimiotácticos en fibroblastos y células epiteliales. También induce la migración celular y se ha demostrado que tiene un efecto dosis-dependiente. Además induce la formación rápida dentaria. Thesle (1987) demostró la presencia de receptores de EGF en los tejidos apicales de dientes en erupción. Otra importante función del EGF es su papel en la estimulación de la formación del tejido de granulación, así como su capacidad para inhibir la liberación de ácido por la mucosa gástrica. Aunque el EGF no aumenta la síntesis de RNA mensajero para proteínas de la matriz extracelular como el colágeno, los trabajos recientes apuntan a que lo hace por medio de un mecanismo indirecto, atrayendo fibroblastos por quimiotaxis, y estos a su vez sintetizan colágeno produciéndose un aumento del colágeno total17. 6.3.2 Factor de Crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). El PDGF tiene un papel importante en la embriogénesis, en particular en el desarrollo del riñón, vasos sanguíneos, pulmones y sistema nervioso central. En estos órganos, el PDGF es importante para las células derivadas del tejido conectivo, entre ellas los pericitos, los fibroblastos alveolares, las células mesangiales del riñón y las células glía. También el PDGF tiene un papel importante en la curación de heridas en el adulto, ya que estimula la mitogénesis y quimiotaxis de los fibroblastos y células musculares lisas. También estimula la quimiotaxis de los neutrófilos y los macrófagos18. 6.3.3 Factor de crecimiento fibroblástico (FGF). La familia de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) constituye uno de los grupos más importantes de factores de crecimiento que actúan por vía paracrina durante el desarrollo. Son responsables de determinar la diferenciación de ciertas células a mesodermo, de la producción de vasos sanguíneos, del crecimiento de los miembros, y del crecimiento y diferenciación de numeroso tipos celulares19.

6.3.4. El factor de crecimiento transformante β (TGF-β). Es una familia de proteínas que incluye al TGF-β, activinas y a la proteína morfogénica de hueso (BMP, por sus siglas en inglés), citocinas que son secretadas y se relacionan estructuralmente en diferentes especies de metazoarios. Los miembros de la familia del TGF-β regulan diferentes funciones celulares como proliferación, apoptosis, diferenciación, migración, y tienen un papel clave en el desarrollo del organismo. El TGF-β está implicado en varias patologías humanas, incluyendo desórdenes autoinmunes y vasculares, así como enfermedades fibróticas y cáncer. La activación del receptor del TGF-β propicia su fosforilación en residuos de serina/treonina y dispara la fosforilación de proteínas efectoras intracelulares (smad), que una vez activas se translocan al núcleo para inducir la transcripción de genes blanco, y así regular procesos y funciones celulares20. 6.3.5 Factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1). Es un polipéptido sintetizado en órganos de importancia reproductiva como el hipotálamo, ovario y útero, además de la placenta, corazón, pulmón, riñón, hígado, páncreas, bazo, intestino delgado, intestino grueso, cerebro, médula ósea e hipófisis. Los principales tejidos diana afectados en combinación con la hormona del crecimiento son los músculos, cartílagos, huesos, hígado, riñones, nervios, piel, ovarios y pulmones22. 6.3.6 Factor Plaquetario 4 (PF - 4). Un complejo de factor proteoglicano-plaquetario de alto peso molecular que es liberado de las plaquetas sanguíneas mediante la trombina. El mismo actúa como mediador de la capacidad neutralizante de la heparina en la sangre y desempeña un papel en la agregación plaquetaria. Sometido a alta fuerza iónica (1=0.75), el complejo se disocia en el compuesto activo (peso molecular 29.000) y el transportador del proteoglicano (4-sulfato de condroitina, peso molecular 350.000). La molécula existe en la forma de dímero y está constituida por 8 moles de factor plaquetario 4 y 2 moles de proteoglicano23. 6.4 UTILIDAD CLÍNICA CELULAS MADRE MESENQUIMALES Desde 1994, se han realizado protocolos estratégicos en ingeniería de tejidos para lograr diferenciar In situ de MSC en cartílago; en estos procedimientos se combinan éstas células con matrices biológicas activas y factores de crecimiento que inducen a la formación de condrocitos logrando grandes avances9, aunque una de las principales aplicaciones de MSC, consiste en la reparación del hueso demostrado In vivo en ratones y en caninos con defecto cráneofaciales y con defectos de huesos largos mediante la administración directa con matrices como hidroxiapatito/fosfato tricálcico (HA/TPC)24, 25. En cuanto a la reparación del miocardio, se ha postulado diferentes efectos de las CMM sobre el tejido cardiaco tales como la diferenciación local de éstas células en

cardiomiocitos, liberación de factores solubles paracrinos que promuevan la proliferación de células residentes de tejido y/o la fusión de las MSC con células cardiacas. El modelo más utilizado para llevar a cabo esta aplicación es el corazón porcino donde se ha observado una reducción importante del tamaño del tejido lesionado, neovascularización y reducción de los niveles de apoptosis18-25. Defectos congénitos en el músculo esquelético como distrofia muscular y otras miopatías pueden ser teóricamente restaurados con un trasplante de MSC que mejoran la estructura y funcionamiento del músculo. Las MSC obtenidas de la membrana sinovial han mostrado un potencial In vivo un potencial miogénico en el modelo de ratón mdx con distrofia muscular de Duchenne25. Además de las propiedades regenerativas de las MSC, también tiene la capacidad de afectar el funcionamiento del sistema inmune. Estudios muestran que las MSC pueden inhibir la proliferación de linfocitos inducida por aloantígenos, mitogénos como fitohemaglutinina y concavalina A16-18, así como la activación a través de anticuerpos anti CD3 Y CD28. Durante la activación de células dendríticas, las MSC pueden inhibir la expresión de moléculas involucradas en la presentación de antígenos como CD1a, CD40, CD80, CD86 y HLA – DR.1 El uso de células madre adultas en la aplicación clínica, está siendo investigado debido a sus restricciones y problemas éticos alrededor del uso de células madre embrionarias1-4. Las células madre mesenquimales (MSC) son apropiadas para el uso en aplicación clínica, se adhieren bien al plástico, proliferan y se diferencian muy bien In vitro, y tienen propiedades adecuadas para el trasplante: propiedades de baja inmunogenicidad y alta inmunosupresión, debido a una disminución o ausencia del marcador de superficie celular HLA-clase II26, 27. Se ha demostrado actualmente que tienen un potencial para el mejoramiento de tratamientos, cardiovasculares, neurológicos y trastornos musculo – esqueléticos para diferenciarse en cardiomiocitos y células vasculares, neuronas y como células gliales, condreocitos, respectivamente18-24. Sin embargo, como se encuentran en cantidades muy bajas en el tejido adulto es necesario hacer expansión in vitro para alcanzar el número deseado antes de su uso en la aplicación clínica6. Aún se debe desarrollar una comprensión clara de cómo optimizar la expansión de MSC de manera eficiente, ya que muchos documentos han informado de las discrepancias en los resultados como la influencia de la edad y género del donante, la densidad de siembra puede afectar el ritmo de la proliferación celular.26

Debido a que las células madre tienen el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de célula en el organismo, existe la esperanza que ellas lleven al diseño de tratamientos para enfermedades como el mal de Parkinson, Alzheimer, insuficiencia cardiaca, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, lesiones de la médula espinal, así como el diseño de tejidos nuevos, tales como la piel8-17. Además el entendimiento de los diferentes y múltiples factores que regulan la autoreplicación de estas células podría llevar al entendimiento de muchas formas de cáncer1. La aplicación clínica de las células y el trasplante de sus progenitores comenzó cuando la humanidad se expuso a radiaciones letales producidas por el advenimiento de la era nuclear en 1945. En esa época se experimentó en ratones el efecto de esa radiación, demostrándose que el trasplante de médula ósea proveía a los ratones de una nueva fuente de tejido hematopoyético, el cual se presentaba disminuido debido a las radiaciones2-4. En 1961 Till y McCulloch demostraron la existencia de precursores hematopoyéticos y propusieron que estas células tenían la habilidad de autorenovarse y de generar varias líneas de tejidos. Aunque estos experimentos develaron la existencia de las células madre, no fue posible obtener su aislamiento.27 El problema con el potencial de estas células es controlar su crecimiento y diferenciación. Si estudios recientes han mostrado que estas células son capaces de expresar MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) en humanos, aunque en niveles más bajos a la norma producida por una célula diferenciada. A pesar de esto el potencial de expresar el MHC podría ser evitado diseñado genéticamente a estas células2-5. El rechazo también podría ser evitado usando trasplantes autólogos, provenientes de células madre del organismo2-3. Las células madre MAPC (células progenitoras multipotentes adultas) podrían ser una fuente de células madre para trasplantes autólogos. Estas células pueden diferenciarse en células hematopoyéticas y de varios tejidos in vivo y pueden ser seleccionadas de la médula ósea propia del paciente a ser tratado. Usando este tipo de células no sería necesario transformar células madre embrionarias para evitar la producción de MHC y el subsiguiente rechazo.27

6.5 SANGRE DE CORDON UMBILICAL (SCU) La sangre de cordón umbilical es una fuente de células precursoras hematopoyéticas para ser usadas en trasplantes. La creación de bancos de sangre de cordón umbilical (SCU), generó la posibilidad de almacenar unidades de SCU para trasplantes posteriores. Los bancos de SCU, se han convertido en una nueva tendencia obstétrica15,17,18. Actualmente se conoce que en la SCU se pueden identificar diferentes tipos de células madre adultas entre estas las CMM. Se ha demostrado que las células estromales son necesarias para el mantenimiento y expansión de células madre hematopoyéticas derivadas de la médula ósea de adultos y de la sangre del cordón umbilical. Estas células, además de dar apoyo a la hematopoyesis pueden diferenciarse en osteoblastos, condroblastos, adipoblastos y mioblastos. Por otra parte, se ha señalado la posibilidad de diferenciación de células estromales derivadas de la médula ósea en células con marcadores asociados con las neuronas, como es la nestina. Estas observaciones abren posibilidades para su empleo en diferentes enfermedades neurológicasy amplían el potencial terapéutico que estas células podrían tener en la medicina regenerativa.17,18,28 Varios grupos afirman haber conseguido diferenciar MSC a células derivadas del neuroectodermo, basándose en la adquisición de ciertos marcadores de origen neuronal por parte de dichas células cuando son sometidas a sistemas de cultivo específicos. Sin embargo, los autores no llegan a demostrar que estas células adquieran características funcionales similares a neuronas o células de la glía. A pesar de su probada multipotencialidad mesodérmica y de su habilidad para diferenciarse a neuroectodermo, las MSC no se diferencian a tejido derivado del endodermo y, por lo tanto, no se pueden considerar células madre pluripotenciales. Las MSC constituyen un modelo muy útil en aplicaciones clínicas para un número de enfermedades, tanto en terapia regenerativa como en terapia génica.29 6.6 Bancos de sangre de cordón umbilical. Desde el primer trasplante de sangre de cordón que se realizó en Europa en 1988, un gran número de bancos de sangre de cordón fueron establecidos para facilitar los trasplantes de sangre de cordón. Durante años el número de unidades recolectadas en Europa se ha incrementado a aproximadamente 190.000 en el año 2011. El trasplante de sangre de cordón es un campo de rápido crecimiento con un incremento de los indicadores en todo el mundo30.

Los resultados reportados por Eurocord reflejan un sorprendente incremento rápido en la actividad. Por ejemplo, Asian Pacific Blood y Marrow Transplantation Group reportaron 937 trasplantes de sangre de cordón en el año 2008 solamente. En Estados Unidos, más del 40% delos trasplantes pediátricos relacionados son proporcionados por sangre de cordón31. Además de los bancos públicos, un gran número de bancos privados también se han establecido. En este escenario, el costo del almacenamiento es cobrado al donante de la sangre de cordón umbilical, por lo tanto, los bancos privados tienden a tener una estructura sólida que es generalmente con ánimo de lucro. Estos bancos tienen como objetivo el almacenamiento de sangre de cordón para uso autólogo. Pero en contraste con sangre de cordón umbilical para el trasplante alogénico de células madre30-31. En el momento, en el mundo hay almacenadas más de 400.000 unidades de sangre de cordón umbilical en 50 bancos públicos y más de 600000 en bancos privados, según los datos más recientes (Haematologica 94; 536-541, 2009), se estima que para poder atender debidamente a las necesidades clínicas que pudieran surgir, se necesitarían alrededor de 50.000 unidades de sangre de cordón umbilical para una población de 60 millones de habitantes. Un aspecto muy importante para mejorar la eficacia clínica de los bancos de sangre de cordón umbilical es, no solamente aumentar el número de unidades almacenadas, sino también mejorar la calidad de las mismas; si se logra esto, parece ser que el número óptimo de unidades de sangre de cordón umbilical podría ser de alrededor de 9 por 100.000 habitantes.30

La criopreservación tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de determinadas reacciones bioquímicas y el frío prolonga el tiempo biológico puesto que enlentece estas reacciones. Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interacción célula-célula inherente en las células y tejidos a criopreservar.31 Se considera que a recolección óptima de sangre de cordón debe realizarse en un embarazo a término, es decir de 38 a 42 semanas. Los bebés nacidos antes de la semana 37 se consideran prematuros y se enfrentan a riesgos variados de morbilidad e incluso de mortalidad, después de la semana 42 se consideran pos maduros32.

Los bebés a término, al nacer pesan entre 2700 y 4200 gramos, miden aproximadamente 50 centímetros y su perímetro cefálico es de unos 35 centímetros (estos valores no son absolutos y existe una lógica variación entre bebés por lo que hay que tomarlos como referencia pero no como ley estricta) 33. 6.7. CITOMETRÍA DE FLUJO Citometría es un término genérico que se aplica a cualquier tecnología que se usa para la medición, recuento, comparación u otra caracterización de células. La citometría de flujo es una tecnología de rápido crecimiento y desarrollo que permite examinar muchas propiedades de un gran número de células en poco tiempo34. La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de laser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros están relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma, así como con su capacidad antigénica (inmunofenotipo)25. 6.7.1. Realización de citometría de flujo Se hace en 3 etapas independientes:

1. Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

2. Fase de citometría de flujo: involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.

3. Fase de análisis: análisis de los datos recolectados. La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila de líquido que contiene las células. A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots"36.

6.8 Fenotipo. La molécula CD73 ó 5'ectonucleotidasa se considera un marcador de linaje para las MSC y se cree que esté relacionada con mecanismos de adhesión celular, ya que se ha encontrado co-expresada con moléculas tipo a2 integrinas, lo que ha caracterizado al CD73 como un mediador de adhesión celular en MSC.37,38 Las MSC aisladas de la médula ósea, también expresan la molécula CD90 ó Thy-1, una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas y cuyo principal ligando es el CD45;39,40 se expresa entre el 10-40 % de las células CD34+ y en mayor proporción en el tejido conectivo. En células del estroma medular este antígeno es un marcador de precursores mesenquimales tempranos que pueden diferenciarse en osteoblastos. La molécula CD105, también conocida como endoglina, es una glicoproteína que forma parte del complejo del receptor del factor transformante de crecimiento-beta ó TGF-β, y se expresa en monocitos activados, macrófagos activados, precursores eritroides, fibroblastos, células foliculares dendríticas, melanocitos, células cardíacas, células vasculares de músculo liso y células endoteliales.41 Esta molécula interviene en la regulación de distintos componentes de la matriz extracelular, como fibronectina y colágeno, razón por la cual se cree que está relacionada con procesos de angiogénesis y reparación vascular41,42 y se sugiere que su expresión en MSC humanas es determinante en la generación de cardiomiocitos18.

7. DISEÑO METODOLOGICO 7.1 MATERIALES Y MÉTODOS 7.1.1 TIPO DE DISEÑO. Se realizó un estudio experimental tipo ensayo de laboratorio. 7.1.2 POBLACION DE ESTUDIO · Universo: células madre mesenquimales obtenidas del cordón umbilical de mujeres entre 18 a 35 años de edad en estado de gravidez no complicada de más de 38 semanas de gestación. · Muestra: células madre mesenquimales obtenidas de sangre de cordón umbilical, luego de la sección del cordón, en mujeres entre 18 a 35 años de edad en estado de gravidez no complicada, de más de 38 semanas de gestación a quienes se les atendió el parto en el servicio de obstetricia del Hospital Militar central, previa autorización. 7.1.3 CRITERIOS DE INCLUSIÓN

1. Pacientes mayores de 18 años y menores de 35 años, de cualquier raza o condición socioeconómica con gestación de más de 38 semanas, que asisten al servicio de Ginecobstetricia del Hospital Militar Central con previa firma del consentimiento informado.

2. Ausencia de antecedentes patológicos de la gestante, tales como eclampsia, embarazos ectópicos, defectos estructurales del útero, abortos o embarazos de alto riesgo según clasificación del Ginecoobstetra, diabetes gestacional, entre otras.

3. Pacientes que garanticen un seguimiento mínimo durante el cual se recolecte la información considerada en el protocolo (antecedentes, evaluación del ginecoobstetra, entre otros.)

4. Recuento de células nucleadas mayor a 400 millones en las muestras recolectadas

5. La muestra debía ser de mínimo 40 mL de sangre. 6. El tiempo entre la recolección y el procesamiento inicial debía ser menor de

36 horas.

7.1.4. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

1. Pacientes con resultados “reactivos” o positivos para enfermedades infecciosas (HIV, Hepatitis, etc.), y/o antecedentes de enfermedades relacionadas con la gestación o enfermedades congénitas en embarazos previos o en el actual.

2. Voluntad expresa de la no-participación en el estudio.

3. Pacientes con enfermedades discapacitantes a nivel cognitivo, motor, sensitivo o psiquiatrico que les impida entender o colaborar con la recolección de información referente a este protocolo.

4. Volumen insuficiente de la muestra, menor a 40 ml o cantidad menor a 400 millones de células.

7.2 VARIABLES

5. Variables de nivel de razón: Células nucleadas totales, CD34+ precongelamiento, viabilidad precongelamiento, viabilidad postcongelamiento

6. Variables de nivel nominal: Crecimiento de Celula adherente, Diferenciación osteogénica, citometría de flujo

7.3 PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION DE MUESTRAS DE SAN GRE DE CORDÓN UMBILICAL 7.3.1 Equipos y materiales necesarios para la recol ección : compresas estériles, agujas para venojet, camisa para venojet, bolsa de recolección de 450 mL de capacidad y 63 ml de CPDA-1., alcohol iodado, guantes estériles. 7.3.2 Pasos para la recolección de la muestra:

1. Previa autorización del Neonatólogo, seccionado el cordón umbilical y separado al recién nacido se limpió el cordón con alcohol iodado para evitar contaminar la recolección con sangre materna.

2. Desinfección del sitio de punción en la vena umbilical (cercano al extremo fetal).

3. Con técnica antiséptica y bajo condiciones asépticas, se retiró el capuchón plástico del venojet, haciéndolo girar sobre la camisa para la aguja.

4. Manteniendo tenso el cordón, se canalizó la vena umbilical en la zona desinfectada, insertando la aguja con su extremo aguzado en el sentido de la placenta y paralela al cordón.

5. Aseguramiento de la aguja. 6. Llenado de la bolsa de recolección por gravedad. 7. Una vez se produjo el alumbramiento, en los casos que se detuvo el flujo de

sangre, se exprimió gentilmente la placenta. 8. En los casos en que no se alcanzó el llenado completo de la bolsa de

recolección, se repitió el procedimiento desde el primero al sexto paso en un nuevo sitio de punción del cordón más proximal a la placenta

9. Al completar el llenado, se retiró la aguja y se descartó la placenta y el cordón umbilical.

10. Traslado de las muestras en menos de 36 horas al Banco de células para su procesamiento.

7.4 PROCEDIMIENTO DE CONGELAMIENTO SCU

La muestra es transportada al laboratorio de procesamiento dentro de las primeras 36 horas a una temperatura de 4 a 8°C. Se calcula el volumen de sangre que contiene la bolsa y el recuento inicial de células nucleadas. Se realiza un proceso de reducción de volumen por método manual, mediante la centrifugación y separación de los componentes sanguíneos en un sistema cerrado de bolsas que garantiza la esterilidad, obteniendo un volumen de muestra concentrada de 20 ml en bolsa de congelamiento, eliminando la porción de plasma y una parte de los glóbulos rojos.

La unidad de sangre de cordón umbilical se lleva a una temperatura de 4°C. Se agrega una solución de congelamiento compuesta por dos crioprotectores, uno interno y otro externo: DMSO/Dextran 40 al 10%. Posteriormente se realiza el congelamiento automatizado en cámara de congelamiento automatizada ThermoScientific donde baja la temperatura de la muestra gradualmente desde 4°C hasta -120°C, 1°C cada minuto. Finalmente la muestra es almacenada en nitrógeno líquido durante 3 meses a menos de -155°C.

7.5 PREPARACIÓN DE LISADO DE PLASMA RICO EN PLAQUET AS (LPRP)

Las bolsas de Plasma Rico en Plaquetas fueron donadas por el Banco de Sangre del Hospital Militar Central, estas bolsas cumplieron con el sello nacional de calidad. Después de mantener las bolsas a temperatura ambiente y agitación continua por 72 horas las bolsas fueron llevadas al Banco de Células Stem de Colombia en nevera de icopor a temperatura ambiente, donde se expusieron a temperaturas de -40 °C, 37°C, se separó el plasma en un tubo falcon de 50 mL y se centrifugó a 1800 revoluciones por 15 minutos, se recolectó el sobrenadante y se pasó por filtros estériles con membrana de 0.20 µm, se refrigeró el producto a - 30°C. 7.6 DESCONGELAMIENTO SCU

Después del tiempo de almacenamiento, las muestras fueron descongeladas mediante choque térmico en baño maría a 37°C por dos minutos hasta la descongelación de la unidad de sangre. Para la remoción del crioprotector, inmediatamente después de ser descongelada, cada unidad fue diluida en una solución que contiene 5% de albúmina humana (HSA), 10% de HAEMACELL, 1% de ACDA en buffer fosfato salino (PBS). Para obtener las células nucleadas se llevaron a centrifugación y las células sedimentadas fueron resuspendidas en solución de lavado con 5% de HSA y PBS. Se realizó recuento y viabilidad celular en cámara de neubauer con azul de tripán.

7.7 CULTIVO DE CÉLULAS

Las células obtenidas fueron cultivadas en cajas de cultivo T-25 (25 cm2, Falcon) o cajas de 6 pozos de 9 cm2, con medio de cultivo DMEM-LG suplementado con 10% de LPRP, 1% de antibiótico (Pen/Strep 100X), a una densidad de 1x106 CN/cm2. Se incubaron a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 durante 24 horas, y tiempo después se realizó el primer cambio de medio. Posteriormente el medio fue cambiado cada 3 días hasta alcanzar confluencia del 90%. La morfología, adherencia y proliferación celular se comprobaron mediante microscopio invertido.

7.8. PROCEDIMIENTO DE DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICA

7.8.1 Preparación del medio de cultivo. El medio fue preparado fresco semanalmente. Para las CMM humanas en tercer pase se prepararon 20 mL (3 pozos x 3 cambios/semana x 1x 2 mL/9.6 cm2 pozo). Se pipeteó en un tubo estéril cónico de 50 mL y se almacenó estéril a 4°C:

7.8.2 Diferenciación osteogénica

1. Se le realizó inducción de diferenciación osteogénica únicamente a los cultivos de células madre mesenquimales que sí crecieron en el medio de cultivo y tenían un recuento celular mayor a 600.000 células.

2. Se sembró en una placa de 6 pocillos (9.6 cm2) a una concentración inicial de 1.104 células/cm2, con DMEM-LG y 10% de LPRP (2 mL/pozo).

3. Se incubó la placa a 37°C y 5%CO2. 4. Al día siguiente se cambió el medio de los 3 pozos superiores (1, 2,3) por

medio completo de diferenciación ósea sin B – glicerofosfato para comenzar el proceso de diferenciación. Los 3 pozos inferiore (4, 5, 6) o pozos control se mantuvieron sólo con medio DMEM-LG y 10% de LPRP hasta confluencia. Luego, solo con DMEM.

5. Se cambió el medio de todos los pozos cada 2-3 días.

6. A los 7 días aproximadamente, o cuando se observó confluencia en los pozos de diferenciación, se utilizó el medio completo de diferenciación ósea con B – glicerofosfato para comenzar la deposición de sales de calcio.

7. A las 3 semanas (aproximadamente) se realizaron las tinciones en los pozos control y los pozos de diferenciación. Von Kossa para la identificación de depósitos de calcio y Fosfatasa Alcalina (AP) para la demostración histoquímica de la actividad de esta enzima.

7.8.3 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA

La identificación de los marcadores de superficie se llevó a cabo en un citómetro de flujo BD FACS Canto II usando el Kit de Análisis de MSC Humanas (BD Stemflow™), y los anticuerpos monoclonales conjugados a flourocromos: CD90 FITC, CD105 PerCP-Cy™5.5 (Endoglina), CD73 APC.

8. ANALISIS ESTADISTICO

Los datos recolectados se ingresaron a hoja de cálculo de Excel. Por medio de Epi info 7.1.0.6 se realizó el análisis estadístico, obteniendo medidas de tendencia central y dispersión según el tipo de variable. Se realizó un análisis de diferencia de medias de las variables de razón, y con la prueba de Bartlett se verifico si las varianzas poblacionales eran iguales por lo que se procedió a realizar análisis de varianza (ANOVA). Si la prueba de Bartlett presentaba una p menor de 0,05, se usó el análisis no paramétrico de Mann – Whitney/Wilcoxon. Se usó la aplicación web www.openepi.com para calcular el intervalo de confianza de la media de cada variable 59.

9. RESULTADOS

Se recolectaron 21 muestras de sangre de cordón umbilical, estas fueron llevadas a conteo precongelamiento obteniendo conteos celulares superiores a 200´000.000 de células. (Ver Tabla No 1) Tabla No. 1. Medidas de tendencia central y de disp ersión de las células obtenidas precongelamiento.

PRECONGELAMIENTO

CN Totales Viabilidad

Media 562’809.523,80 98,68

DE 310’717.817,16 2,99

Rango mínimo

200’000.000,00 87,1

Rango máximo

1.572’000.000,00 100,00

De la tabla anterior se denota que la viabilidad promedio obtenida previa al congelamiento fue del 98,6% de las muestras tomadas, con una dispersión de 2,99. En 13 de las muestras cultivadas se logró 100% de células viables precongelamiento. Sin embargo de las 21 muestras que se realizó congelamiento y conteo satisfactorio celular, se denoto un descenso en la viabilidad postdescongelamiento (Ver Tabla No 2). Tabla No. 2. Medidas de tendencia central y de disp ersión de las células obtenidas post descongelamiento.

POST DESCONGELAMIENTO

Viabilidad

Media 72,31

DE 13,99

Rango mínimo 48,08

Rango máximo 97,86

Según los resultados obtenidos se demuestra un descenso del 26,37% en el promedio de la viabilidad de las células posterior al descongelamiento. Se logró crecimiento de células madre mesenquimales en el 57,14% de las muestras de sangre de cordón umbilical recolectadas (Ver Grafica No 1) posterior al descongelamiento.

Grafica No 1. Crecimiento de células madre mesenqui males posterior a descongelamiento.

En el 50% de las 12 muestras con presencia de células madre mesenquimales se indujo diferenciación osteogénica, por citometría de flujo se verificó el fenotipo, presentando en el 60% CD34-, CD45-, CD90+, CD73+, CD105+; en el 40% restante se presentó negatividad para CD105, con el resto de perfil idéntico al anterior. En el 100% de las muestras que se indujeron se logró la diferenciación osteogénica. Se realizaron análisis de diferencias de medias, buscando comprobar alguna relación entre los factores medidos en este estudio y el crecimiento o no de CMM en el medio de cultivo suplementado con LPRP (Ver tabla 3, 4, y 5). TABLA N° 3. Medidas de tendencia central y dispersi ón de la viabilidad de CN totales por crecimiento en cultivo de CMM.

Media DE Rango

SI 578´916.666,7 IC 95% (361´915.000 – 795´919.000)

383´559.277,9 200´000.000 – 1.572´000.000

NO 541´333.333,3 IC 95%

(413´702.000 – 668´964.000) 195´368.881,9

272´000.000 – 876´000.000

Al comparar las medias del conteo CN totales con el crecimiento de CMM, encontramos que no hubo una diferencia significativa en la diferencia de medias que fue de 37´583.333,4. Se realizó ANOVA, dando un resultado en el estadístico F 0,07 y valor p de 0,79. TABLA N° 4. Medidas de tendencia central y dispersi ón de la viabilidad precongelamiento por crecimiento en cultivo de CMM.

Media DE Rango

SI 25,3775 IC 95% (0,42–50,34)

44,1185 0,9697 - 100

NO 32,4057 IC 95% (1,54–

63,28) 47,2534

0,9545 - 100

Al comparar las medias de la viabilidad precongelamiento con el crecimiento de CMM, encontramos que no hubo una diferencia significativa en la diferencia de

medias que fue de – 7,0282. Se realizó ANOVA, dando un resultado en el estadístico F 0,12 y valor p de 0,73. TABLA N° 5. Medidas de tendencia central y dispersi ón de la viabilidad de CN totales postdescongelamiento por crecimiento en cultivo de CMM.

Media DE Rango

SI 74,04 IC 95% (65,28 - 82,8) 15,48 48,08 - 97,86

NO 71,59 IC 95% (63,4 – 79,8) 12,51 50 - 85,04

Al comparar las medias del porcentaje de viabilidad de las células entre las que si crecieron y las que no crecieron en el medio de cultivo, encontramos que no hubo una diferencia significativa. La diferencia entre las medias fue de 2,45. Se realizó ANOVA, dando un resultado en el estadístico F 0,1505 y valor p de 0,70.

Estas fotos se pueden incluir en resultados para demostrar el crecimiento de las células en cultivo:

Fig. Cultivo de CMM de SCU con DMEM-LG suplementado con LPRP (Magnificación 10X) . A) 3 días en medio de cultivo. B) Células después de 10 días de cultivo. C) Células después de 20 días de cultivo.

A

B

C

Para la diferenciación osteogénica evidenciada con las tinciones de Von Kossa y Fosfatasa Alcalina:

Fig. Diferenciación osteogénica . A) Tinción de Von Kossa para depósitos de calcio en MSC de SCU a las 5 semanas de inducción. B). Tinción de Von Kossa para MSC control. C) Tinción histoquímica de AP en MSC de SCU después de 5 semanas de inducción. F) Tinción histoquímica de AP para MSC control. Magnificación 10X en todas las imágenes.

A) B)

C) D)

10. DISCUSION

En este experimento in vitro usando el lisado de plasma rico en plaquetas como medio de cultivo para la expansión de células madre mesenquimales se centra en dos áreas principales, primero la optimización del proceso de diferenciación de células madre mesenquimales y segundo ampliación de los conocimientos sobre cómo LPRP modifica el comportamiento de las MSC 61 LPRP es una herramienta útil para ser incorporada en la ingeniería de tejidos, ya que actúa como un estimulador de la proliferación celular; actualmente en la literatura, solo tres estudios han mostrado el potencial de LPRP para inducir la migración MSC.62, 63,64 . Por lo tanto, la necesidad para aumentar nuestro conocimiento, e introducir modificaciones del procedimiento que puedan ayudar a controlar la migración, proliferación y diferenciación de estas células, para la utilización exitosa en diversas aplicaciones clínicas, y cuyas fuentes de obtención anteriores eran diferentes a la SCU64. Los cultivos celulares son una herramienta útil para diseñar modelos que ayuden a dilucidar los mecanismos moleculares, e identificar moléculas específicas que intervienen en el mismo. Del mismo modo, el aumento de porcentaje LPRP en los cultivos, no necesariamente aumenta la proliferación; una adición de 10% de LPRP parece ser lo óptimo para la diferenciación hacia células mesenquimales, el aumento de hasta un 30% de LPRP no aumenta la proliferación y siempre es menor, en comparación con FBS 65,66,67,68 .

Hasta la fecha, los sistemas de cultivo de MSC convencionales implican el uso de alrededor de 10% de FBS (suero fetal bovino) en medio de cultivo, pero recientemente hay un interés creciente para evitar su uso, debido al riesgo de reacciones inmunes xenogénicas provocada por antígenos del FBS 69,70. Además, se ha informado que el FBS puede estar implicado en la transmisión de priones, y su uso terapéutico no se recomienda por la legislación europea 71. Además, es complicado usar el FBS de una manera reproducible controlada, debido a su composición compleja, con eficacia variable. El plasma rico en plaquetas humano (PRP), en forma de lisados de plaquetas (HPL) o productos de la liberación, han surgido como posibles sustitutos de FBS debido a su carácter autólogo, características no inmunogénicos, y la composición fisiológica adecuada; en la actualidad los PPR se comercializan con fines de expansión celular, e incluso lisados resultantes de bolsas de plaquetas caducadas obtenidos de los bancos de sangre, parecen ser adecuados como sustitutos de FBS y proporcionar los mismos buenos resultados como recién aisladas PRP 72 .

La expansión de células se realiza actualmente en los laboratorios con FBS disponible comercialmente. Nuestro experimento sugiere que el LPRP facilita la proliferación y la diferenciación autónoma o inducida de células 73.

Con respecto a la sangre de cordón; en comparación con sus homólogos de otros orígenes tales como médula ósea, grasa, etc., las células madre derivadas de sangre de cordón umbilical tiene ventajas tales como: 1. un procedimiento de recogida no invasiva para uso autólogo o alogénico; 2 un menor riesgo de infección; 3 un bajo riesgo de teratoma; 4 multipotencialidad; y 5 baja inmunogenicidad con una buena capacidad inmunosupresora. 74.

11. CONCLUSIONES

1. Las MSC se pueden expandir en medios suplementados con LPRP que pueden sustituir totalmente al SBF. El LPRP es un suplemento importante para el uso clínico ya que se evitan aditivos derivados de animales, tampoco induce cambios fenotípicos, conservan su fenotipo en los marcadores de la membrana y la capacidad de diferenciarse.

2. Este trabajo demostró la presencia de células madre

mesenquimales en las unidades de sangre de cordón crio preservadas en un 60% de las muestras procesadas y analizadas.

3. Solamente el 28% de las muestras recolectadas fue apta para realizar inducción para diferenciación osteogénica luego del cultivo de CMM.

4. El crecimiento de MSC en medio de cultivo LPRP no se ve influenciado por el conteo de células nucleadas, ni la viabilidad pre o postcongelamiento.

5. Se espera que con estos resultados se hagan futuras investigaciones usando sangre de cordón umbilical aumentando el número de muestras actual y medio de cultivo enriquecido el lisado de plasma rico en plaquetas.

Se deben hacer estudios clínicos para determinar la aplicabilidad de estos resultados en humanos

12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Páez, D; Arévalo J; Rodríguez, V. Células madre mesenquimales:

características biológicas y aplicaciones clínicas. Nova - Publicación científica en ciencias biomédicas. 2007: 177-184.

2. Fossett E; Khan WS. Optimising human mesenchymal stem cell numbers for

clinical application: A literatura review. Stem Cells International. 2012, 158-163. Article ID 465259.

3. Friedenstein A. Stromal-hematopoietic interrelationships: Maximov's ideas and

modern models. Cell Ther Transplant. 2009: 124 – 135.

4. Bernar A, Biología de las células madre. Biotecnología Aplicada. 2012 9a edición. 142-234

5. Macías C.; Lázaro O. Características fenotípicas y funcionales de las células madre mesenquimales y endoteliales. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia. 2010; v.26 n.4

4. Beyer N, Da Silva L. Mesenchymal Stem Cells: Isolation in vitro expansion and

characterization. Hand Exp Pharmacol. 2006; 174:249 – 283. 5. Wexler S, Donaldson C, Adult bone marrow is a rich source of human

mesenchymal «stem» cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 2003;121: 368-374.

6. Wagner W, Wein F, Comparative characteristics of mesenchymal stem cells

from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. ExpHematol.2005; 33:1402-1416.

7. Krampera Ma, Pizzolo G, Aprili G, Franchini M. Mesenchymal stem cells for

bone, cartilage, tendon and skeletal repair. Bone. 2006;39: 678-683. 8. Kassem M, Kristiansen M, Abdallah B. Mesenchymal Stem Cells:Cell biology

and potential use in therapy. Basic ClinPharmacolToxicol.2004; 95:209-214. 9. Rasmusson I. Immune modulation by mesenchymal stem cells. ExpCell Res.

2006;312: 2169-2179 10. Nesrine A., Faouzi J., Zohra R. Phenotypical and functional characteristics of

mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem cell Research & Therapy. 2012, 3:6

. 11. Valka J, Mellorb D. R. The humane collection of fetal bovine serum and

possibilitiesfor serum-free cell and tissue culture. Toxicology in vitro, 2004. 18: 1–12.

12. Biological Industries. BIOLOGICAL INDUSTRIES. Technical Resources: Sterile

FoetalBovine (Calf) Serum. 2002. http://www.bioind.com/Media/Uploads/serum_info.pdf(acceso el 03-05-2007).

13. Jin H, Kyong S. Down Regulation CD105 is associated with multi lineaje

differentiation in human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. 2009. Biochemical and Biophysical Research Comunications. 381: 676-681

14. Sutton M, Bonfield T, Stem Cells: Innovations in clinical aplications. Hindawi publishing corporation.2014. Pag 1-9. 15. Lee M., Sang Young J.,Low immunogenicity of allogeneic human umbilical cord

blood derived mesenchymal stem cells in vitro and in vivo. Biochemical and Biophysical Research Comunications. 2014. 446: 983-989

. 16. Roura S, Gálves C, Umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells: New

therapeutic weapons for idiopatic dilated cardiomyopathy. Biochemical and Biophysical Research Comunications.2014. 177:809-818.

17. Gilbert, S. Specific Functions of Fibroblast Growth Factor Receptors.

Developmental Biology, 2000, Ed. Sinauer. Pag 1354-1415. 18. Gálvez F., Sandoval A., El factor de crecimiento transformante B como blanco

terapéutico. Salud Pública Mexicana. 2004; 46: 341-350. 19. Informe de la agencia española de medicamentos y productos sanitarios sobre

el uso del plasma rico en plaquetas.23/05/2013. Ministerio de Sanidad. España.

20. Ruiz J., Uribe L., Factor de crecimiento semejante a insulina tipo 1 (IGF-1) en

la reproducción de la hembra bovina. Vet. zootec. 2011 5(2): 68-81. 21. Lippi G, Favaloro EJ.,Recombinant platelet factor 4: a therapeutic, anti-

neoplastic chimera?. Semin Thromb Hemost. 2010 Jul;36(5):558-69 22. Mankani M., Kuznetsov S., In vivo bone formation by human bone marrow

stromal cells: effect of carrier particle size and shape. Biotechnol Bioeng. 2001;72: 96-107.

23. Tsuchida H, Hashimoto J, Engineered allogeneic mesenchymal stem cells

repair femoral segmental defect in rats. J Orthop Res. 2003; 21: 44-53.

24. Friedenstein, A., Chailakhjan R. The development of fibroblast colonies in

monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells, Cell and Tissue Kinetics, 1970. vol. 3, no. 4, pp. 393–403.

25. Blanc K. ,Ringden O., Immunobiology of human mesenchymal stem cells and

future use in hematopoietic stem cell transplantation, Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2005. vol. 11, no. 5, pp. 321–334, 2005.

26. Giraldo, J; Madero, J; Ávila, M; López, C; Las Células Madre. Revista

Colombiana de Obstetricia y Ginecología, 2003. vol. 54, 2: 87-96. 27. Hernández P., Dorticos E. , Medicina regenerativa. Células madre embrionarias

y adultas. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 2004, v.20 n.3.

28. Prat, I; Hernández, M.; Trends in cord blood banking. Blood Transfus 2012; 10:

95-100. 29. Primer encuentro Internacional de Latinoamérica sobre “Terapéuticas

Innovadores con células madre autólogas” [en línea]. 2012.9 de Julio. [fecha de acceso 13 diciembre 2014. URL disponible en: http://biocells.wordpress.com/.

30. Gary F.,Obstetricia de Williams. 22Ed. McGraw Hill/Interamericana de México.

2006.Pag 134-148. 31. González M, Obstetricia. Elsevier. 12 Ed. España. 2006. Pag. 448-502 32. Laguado J. Aplicaciones de la citometría de flujo en Microbiología, veterinaria y

agricultura. 2007. Rev.MVZ Córdoba 12(2): 1077-1095. 33. Miranda J., Valero L., Viabilidad del lisado de plasma rico en plaquetas como

suplemento para el cultivo de células madre de limbo corneoescleral. 2012. Pag 16-19

34. Bernardi M., Albiero E.,Production of human platelet lysate by use of ultrasound for ex vivo expansión of human bone marrow –derived mesenchymal stromal cells. Cytotherapy, 2013; 15: 920- 929.

35. Airas L, Niemelä J, Differential regulation and function of CD73, a Glycosyl-Phosphatidylinositol-linked 70-kD adhesion molecule, on lymphocytes and endothelial cells. J. Cell Biol 1997; 136:421-31.

36. Sträter N. Ecto- 5'-nucleotidase: Structure function relationships. Purinergic Signal 2006; 2:343-50.

37. Craig W, Kay R, Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells. J Exp Med1993;177: 1331-42

38. Barboni E, Rivero B, The glycophosphatidylinositol anchor affects the conformation of Thy-1 protein. J. Cell. Sci. 1995;108: 487- 97.

39. Cheifetz S, Bellon T. Endoglin is a component of the transforming growth factor-β receptor system in human endothelial cells. J BiolChem 1992; 67: 190- 210.

40. Fonsatti E, Maio M. Highlights on endoglin (CD105): From basic findings towards clinical applications in human cancer. J TranslMed 2004; 2:18-24.

41. Ben Anzouna N., Jenhani N., Phenotypical and functional characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem Cell Res Ther. 2012 Feb 14;3(1):6.

42. Gstraunthaler G.,Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Serum-free Cell Culture. ALTEX. 2003;20(4):275-81.

43. Leotot J, Coquelin L,Platelet lysate coating on scaffolds directly and indirectly

enhances cell migration, improving bone and blood vessel formation. Acta Biomater. 2013 May;9(5):6630-40.

44. Crespo-Diaz R, Behfar A., Platelet lysate consisting of a natural repair

proteome supports human mesenchymal stem cell proliferation and chromosomal stability. Cell Transplant. 2011; 20(6):797-811.

45. Trojahn Kolle SF, Oliveri RS., Pooled human platelet lysate versus fetal bovine

serum-investigating the proliferation rate, chromosome stability and angiogenic potential of human adipose tissue-derived stem cells intended for clinical use. Cytotherapy. 2013 Sep;15(9):1086-97.

48. Accidentalidad vial en Colombia. Información para el desarrollo de una cultura

vial. Fondo de Prevención Vial (2006). 49. Estrada C., Paz A.C., López L.E. Ingeniería de tejido óseo: consideraciones

básicas. Revista EIA. 2006. 5: 93-100. 50. Prósper F., Gaviria J., Herreros J.Trasplante celular y terapia regenerativa con

células. Anales del sistema sanitario de Navarra. 2006. 29: 219-234. 51. Pu L., Cui X., Fink B., Adipose aspirates as a source for human processed

lipoaspirated cells after optimal cryopreservation. Plastic and reconstructive Surgery, 2006. 117: 1845-1850.

52. Ringe J., Kaps C. Stem cells for regenerative medicine: advances in the

engineering of tissues and organs. Naturwissenschaften, 2002. 89: 338–351.

53. Bunnell B., Deng W., Potential application for mesenchymal stem cells in the treatment of cardiovascular diseases. Canadian journal of physiology and pharmacology, 2005. 83: 529-539.

54. Freshney R.I., Stacey G.N. Culture of specialized cells. Culture of human stem

cells. John Wiley & Sons, Inc, 2007. 369, Capítulo 5-7, 369. 55. Zuk P.A., Zhu M., Multilineage cells from human adipose tissue: implications

for cell-based therapies. Tissue Engineering, 2001. 7: 211-228. 56. Freshney I, "Culture of animal cells: A manual of basic technique", 4th edition,

John Wiley & Sons, 2000:589. 57. Molina N., Minvielle M., Células RK13: influencia de la concentración de

suero fetal bovino en el tiempo de duplicación, Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 2004. 38:477.

58. Fariñas N., Instituto Andaluz de Patología y Microbiología, España, 2006,

Diarreas víricas en ganado bovino, Eumedia Mundo Veterinario, núm. 188, URL: http://www.eumedia.es/user/articulo.php?id=85, consultado en noviembre de 2014.

59. Openepi.com [internet] Disponible en: www.openepi.com/Mean/CIMean.htm

Consultado 26/1/2015 60. Prins HJ, Rozemuller H, Bone forming capacity of mesenchymal stromal cells

when cultured in the presence of human platelet lysate as substitute for fetal bovine serum. Tissue En Part A. 2009 Dec; 15 (12) : 3741-51.

61. E. Rubio-Azpeitia et al., Partnership between platelet-rich plasma and

mesenchymal stem cells: in vitro experience. Muscles, Ligaments and Tendons Journal 2014; 4 (1): 52-62.

62. Sell SA, Wolfe PS, Ericksen JJ, Simpson DG, Bowlin GL. Incorporating platelet-rich plasma into electrospun scaffolds for tissue engineering applications. Tissue Eng Part A. 2011;17 (21-22):2723-2737

63. Moreira Teixeira LS, Leijten JC, Wennink JW, et al. The effect of platelet lysate

supplementation of a dextran-based hydrogel on cartilage formation. Biomaterials. 2012;33(14):3651-3661

64. Murphy MB, Blashki D, Buchanan RM, Yazdi IK, Ferrari M, Simmons PJ,

Tasciotti E. Adult and umbilical cord blood-derived platelet-rich plasma for

mesenchymal stem cell proliferation, chemotaxis, and cryo-preservation. Biomaterials. 2012;33(21):5308-5316.

65. WarnkePH, HumpeA,Strunk D, et al.Aclinically-feasible protocol for using

human platelet lysate and mesenchymal stem cells in regenerative therapies. J Craniomaxillofac Surg. 2013;41(2):153-161.

66. Schallmoser K, Strunk D. Generation of a pool of human platelet lysate and

efficient use in cell culture. Methods Mol Biol. 2013;946:349-362. 67. Flemming A, Schallmoser K, Strunk D, Stolk M, Volk HD, Seifert M.

Immunomodulative efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in human platelet lysate. J Clin Immunol. 2011;31(6):1143-1156

68. Lohmann M, Walenda G, Hemeda H, et al. Donor age of human platelet lysate

affects proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 2012;7(5):e37839.

69. Kocaoember A, Kern S, Klüter H, Bieback K. Human AB serum and thrombin-

activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 2007;25(5):1270-1278.

70. Lohmann M, Walenda G, Hemeda H, et al. Donor age of human platelet lysate

affects proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 2012;7(5):e37839

71. Doucet C,Ernou I,ZhangY, Llense JR,Begot L, HolyX, Lataillade JJ. Platelet

lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005;205(2):228-236

72. Jonsdottir-Buch SM, Lieder R, Sigurjonsson OE. Platelet lysates produced from

expired platelet concentrates supportgrowth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 2013;8(7):e68984.

73. Lacci KM, Dardik A (2010) Platelet-rich plasma: support for its use in wound

healing. Yale J Biol Med 83:1–9 74. Nagamura-Inoue T et al. Potential utility of umbilical cord-MSC. World J Stem

Cells 2014 April 26; 6(2): 195-202