CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICADiscusión

OBJETIVOS

Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos.

Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico.

Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y enriquecimiento).

LACTATO DESHIDROGENASA

DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD DE LOS EXTRACTOS DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS DE LA PURIFICACIÓN DE LA LDH DE MÚSCULO DE BOVINO

Después se grafican los datos para obtener las pendientes de las curvas

TIEMPO FRACCION 3 FRACCION 4 fpii Fpii2 FPA

dil 1:20 dil 1:20 conc conc conc

0.5 1.027 1.047 1.257 1.263 1.107

1 0.919 0.922 1.257 1.263 1.109

1.5 0.8 0.798 1.253 1.261 1.105

2 0.697 0.68 1.261 1.106

2.5 0.59 0.567 1.241 1.261 1.008

3 0.487 0.461 1.261 1.007

3.5 0.392 0.364 1.237 1.26 1.008

4 0.307 0.276 1.240 1.26 1.008

4.5 0.23 0.202 1.240 1.259 1.007

5 0.166 0.141 1.237 1.005

CÁLCULOS

mg proteína F3= 0.01812 mg (lo obtuve al considerar que había 7.25 /L en el concentrado (datos de determinación de proteína de mi extracto) al diluir 1:20 quedaron 0.3625 g/L, como añadí 50 L entonces la celda tenía 0.01812 mg)

ACTIVIDAD DE LDH DE LAS FRACCIONES 3 Y 4 DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DE AL ENZIMA

Fracción 3 (mol min-1mg-1)

Fracción 4 (mol min-1mg-1)

m 0.1946 0.2043

r2 0.99 0.99

Actividad 29.490499 33.293998

¿CÓMO CALCULAR EL FACTOR DE PURIFICACIÓN O LAS VECES DE PURIFICACIÓN?

Etapa Volumen (ml)

Actividad Total

(U)

ProteínaTotal (mg)

Act. Espec. (U/mg)

Cantidad (%)

Factor de Purificación

EC 500 3,000 15,000 0,2 100

SA 100 2,400 4,000 0,6 80 3,0

CII 45 1,440 500 2,9 48 14,5

FG 50 1,000 125 8.0 33 40,0

Cuando se purifica a una proteína es habitual usar una tabla con datos que nos indiquen si el proceso que se llevo a cabo fue efectivo. Cuando una proteína no pierde actividad biológica esta se sigue a través de medir esa actividad.

EC: Extracto crudo. SA: Precipitación con sulfato de amonio. CII: Cromatografía de intercambio iónico. FG: Filtración en gel.

TABLA DE PURIFICACIÓN DE LA LDH DE MÚSCULO ESQUELETO DE BOVINO (EQUIPO 6)

Fracción Proteína [µg /µL]

Volumen total de la fracción [µL]

Proteína total en la fracción [µg]

Rendimiento

1 13.72 30000 411600 100%

2 14.13 29000 282600 68.66%

3 15.55 2500 38875 9.44%

4 15.93 1000 15930 3.88%

FPA 1.474 900 1326.6 0.32%

FPB 1.364 900 1227.6 0.29%

PURIFICACIÓN DE LA LDH