CINÉTICA ENZIMÁTICA E

INHIBICION

Inhibición enzimática

Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Teniendo en cuenta que las reacciones químicas en la célula están catalizadas por enzimas, es fácil intuir el papel de muchos inhibidores enzimáticos que actúan como fármacos, antibióticos o conservantes; otros pueden ser tóxicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de prostaglandinas, implicadas en la producción del dolor.

INHIBICIÓN EN LAS REACCIONESENZIMÁTICAS

La inhibición enzimática es importante por variasrazones:

1.-Sirve como un mecanismo de control fundamental en los sistemas biológico permitiendo la regulación de los caminos metabólicos

2.-Muchos medicamentos actúan inhibiendo enzimas específicas en el cerebro o en los tejidos corporales

La comprensión del mecanismo de inhibición enzimática es, por tanto, esencial. Los propios inhibidores se usan frecuentemente como herramientas para el estudio del mecanismo de las propias enzimas.

FARMACOS E INHIBIDORES• DROGA USO TERAPAUTICO ENZ. AFECTADA INHIBID

Lovastatina Hipercolesterolemia HMGCo.Reductasa C

5-Fluoracil Cancer imidilato sintetasa I

Metrotexato Cancer Dihidrofolato reductasa C

Alopurinol Gota Xantino oxidasa I

Aspirina Antiinflamatorio Ciclo oxigenasa I

Captopril Hipertension arterial Enz.Convert.Angiotensina C

Continuación.....

• Capopril y Enalapril (agentes hipertensores). Compuestos sintéticos que inhiben a la Enzima Convertidora de la Angiotesina I.

• Alopurinol. Controla la gota, al reducir la síntesis del ácido úrico al inhibir a la Oxidasa de a Xantina.

NOMBRE ORIGEN MODO DE ACCION

ALOPURINOL (xantino) sintético Inhibe a la oxidasa

N.N- dimetilproparglilamina

sintético Inhibe a la mono amino oxidasa

Acido clavulánico sintético Inhibe a las β-lactamasas

Inhibidor:Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

1.- Irreversible, se enlaza permanentemente a la enzima con lo que la inhibición es completa. Los inhibidores reversibles se unen covalentemente a la enzima con lo cual resultan muy difíciles de eliminar.

2.- Reversible, se enlaza a la enzima pero no permanentemente con lo que la inhibición es transitoria. Los inhibidores reversibles se pueden eliminar normalmente mediante diálisis o cambios en el pH o en la disolución tampón. Hay tres formas principales de inhibición reversible:

(a) competitiva (competitive) (b) no competitiva (non-competitive) (c) anticompetitiva (uncompetitive)

Inhibición Enzimática

Inhibición

Irreversible Reversible

Competitiva No Competitiva

Acompetitiva

Clasificación de la Inhibición

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

E ES

EI

I

SE + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato.Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión con el S

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor: Ki =

[E] [I][EI]

Inhibición Competitiva

INHIBICIÓN COMPETITIVA

Un inhibidor competitivo normalmente es similar a la enzima en tamaño y forma con lo que compite por la enzima con el sustrato al unirse a la enzima por el mismo centro activo.

• La velocidad de reacción se reduce porque baja la proporción de moléculas unidas al substrato.

• Cuanto mas inhibidor hay presente, mas complejo EI se forma y menos producto se forma.

• Un ejemplo clásico de este tipo de inhibición es la del malonato sobre la succínico deshidrogenasa. Muchas veces el propio producto de la reacción actúa como inhibidor competitivo ya que es químicamente parecido a substrato y así se produce un típico mecanismo de feedback en el que el propio producto de la reacción regula la acción de la enzima

Succinato deshidrogenasa

Inhibidorescompetitivos

Inhibidores competitivoscomo ánalogos estructurales

del substrato

4-aminobencenosulfonamida

4-aminobenzoato

Ác. Fólico

Methotrexate

Timina

5-Bromouracilo

Análogos de base

Citidina

Citosina arabinósido

Análogos denucleósido

Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Susbtrato

Estado de transición

+ Productos

Análogo deestado de transición

Substrato

Estado detransición

Análogo deestado de transición

Aspartatotranscarbamilasa

Estado de transición

Análogo deestado de transición:

N-fosfonoacetil L-aspartato(PALA)

Angiotensinógeno

Angiotensina IDRVYIHPFHL

Angiotensina IIDRVYIHPF

HL

Renina

Enzima convertidorade Angiotensina, ECA

Hipotensión,hipovolemia,ortostatismo

Aumento de la presión arterial

+

Zn2+

+

Zn2+

Análogos de Estado de Transición: Captopril

Estado de transiciónde la ECA

Captopril

Inhibición Enzimática

1. Inhibición Competitiva

Inhibición Reversible

Lovastatina: HMG – CoA reductasa

Metanol: Alcohol Deshidrogenasa

Metotrexato: Dihidrofolato reductasa

Malonato: Succinato Deshidrogenasa

Cuando la enzima este saturada con sustrato, no

habrá inhibidor.

Vmax =Km: ↑Vmax: =

Se requiere mayor [S] para alcanzar Vmax/2

Km ↑

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

E ES

EI

I

SE + P

I

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

Inhibición no competitiva

• En este tipo de inhibición tanto el sustrato como el inhibidor se enlazan a la enzima pero en sitios activos diferentes. El enlace de I ejerce un efecto sobre el centro activo probablemente afectando a la estructura de la enzima que ya no funciona tan eficientemente. En consecuencia Vm se altera pero no se altera Km. El mecanismo general es:

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

• y la expresión matemática para el mecanismo MichaelIs-Menten para este tipo de inhibición es:

Inhibición Enzimática

2. Inhibición No Competitiva

Inhibición Reversible

Km: =Vmax: ↓

La unión del inhibidor altera el Kcat de la

enzima. Disminuye la [E] funcional

Vmax ↓

La unión del sustrato no es afectada por el inhibidor. Se requiere la misma [S] para

alcanzar la Vmax/2

Km =

Desoxiciclina: Colagenasa Plomo: Enzimas con grupos SH

• En este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centroactivo pero solo después de que el sustrato lo hayahecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. Deesta manera, aunque todo el sustrato esté saturando laenzima y toda la enzima esté como complejo ES, elinhibidor puede enlazarse produciendo un complejoinactivo ESI.

• Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y,por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima,disminuyendo Km. Sin embargo, el complejo ESI noconduce a productos y Vm disminuye.

INHIBICIÓN ANTICOMPETITIVA

E ESS

E + PI

ESI

InhibiciónAnticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Inhibición Enzimática

3. Inhibición Acompetitiva

El inhibidor se une a un sitio distinto al del sustrato. Se une solo al ES

Inhibición Reversible

No puede superarse la inhibición suministrando

más sustrato

Inhibición Irreversible- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente.

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por

una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Inhibición Irreversible

Nombre Origen Modo de acción

Cianuro Almendras amargas Reacciona con iones metálicos de enzimas (Fe, Zn, Cu), inhibe la citocromo oxidasa (complejo IV)

Diisopropilfluorofosfato (DFP)

Sintético Gas nerviosos

Inhibe enzimas con serina en el lugar activo, como la acetilcolinesterasa

Paratión Sintético (insecticida) Como el DFP, pero especialmente inhibidor de la acetilcolinesterasa de insectos

Antiinflamatorios no esteroideso (AINES)

Sintéticos y semi sintéticos

Inhiben la Ciclooxigenasa con afinidad variable.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes

Yodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2(c) Formadores de mercáptidos

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

DFP:diisopropilfluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases

Se unen covalentemente o destruyen un grupo del enzima que es esencial para su funcionamiento

• Diisopropilfluorofosfato: Acetilcolinesterasa, Quimotripsina

Inhibición Enzimática

Inhibición Irreversible

• Se trata de sustancias que reaccionan con algún grupo funcional importante para la catálisis, bloqueándolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interacción se produce a través del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarín, que inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, enzimas implicadas en la transmisión del impulso nervioso, al competir con sus sustrato la acetilcolina (un neurotransmisor) y su inhalación causa parálisis rápida de las funciones vitales.

Inhibidor IrreversibleFluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

Acetato + Colina

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

Inhibidores suicidas(Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

- Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos b-lactámicos.

b-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la b-lactamasa, el ácido clavulánico

b-Lactamasa

Esta moléculareacciona con la

serina activa de lab-lactamasa,

produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

Ejemplos de inhibidores suicidas, 2

- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral

Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

Noradrenalina

Dihidroxifenilglicol

Monoaminooxidasa

La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamentalpara la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

Flavina

Flavina modificada

N,N’ dimetilpropargilamina

(pargilina)

Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina

FIN