Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
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Universidad de La Serena
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Laboratorio Bioquímica General
Ingeniería en Alimentos
Alumna: Natalia Vargas Guzmán
Profesora: Carla Maturana Valdivia
I Semestre 2013
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La concentración de sustrato determina la actividad enzimática
medida como la velocidad de la catálisis enzimática. Si la
concentración de la enzima se mantiene saturada, la
producción de producto será a una velocidad máxima.
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Gráfica Michaelis-Menten: Ecuación Michaelis-Menten:
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Gráfica Lineweaver-Burk:
Ecuación Lineweaver-Burk:
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Gráfica Eadie-Hofstee:
Ecuación Eadie-Hofstee:
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Gráfica Hanes-Woolf:
Ecuación Hanes-Woolf:
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Velocidad de reacción
enzimática
Inhibidores
Irreversible Reversible
Competitiva
No competitiva
Acompetitiva
Activadores
La forma de representar la
inhibición gráficamente es con la doble reciproca
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En la inhibición competitiva, el inhibidor
compite con el sustrato por el sitio activo.
Km Aument
a
Vmax Constant
e
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En la inhibición no competitiva el inhibidor
se une a la enzima en otro lado, no es su
sitio activo
Km
Vmax
Constant
e
Disminuy
e
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En la inhibición acompetitiva el inhibidor se
une al complejo enzima-sustrato ya
conformado.
Cambio
proporcional en Km
y Vmax
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Objetivos:
- Estudiar la influencia de la concentración de sustrato en
la velocidad de una reacción enzimática.
- Calcular la constante de Michaelis-Menten.
Fundamento: Determinar de la actividad enzimática de
una preparación de β-fructofuranosidasa en presencia
de diferentes concentraciones de sacarosa como
sustrato.
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Materiales:• 8 tubos de ensayo
• Pipeta
• Baño termorregulador a 27°C
• Espectrofotómetro
• 8 Cubetas de espectrofotómetro
Reactivos:• Solución Glucosa-Fructosa 0,01M
• Soluciones de sacarosa (distintas concentraciones)
• Reactivo DNS (inhibe o detiene la act. Enzimática)
• Buffer acetato
• Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un producto 5 moles/min.
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Procedimientos:
1. Disponer serie de 6 tubos de ensayo con concentración creciente de
sacarosa.
2. Luego agregar :
- 1,5 mL Buffer acetato
- 0,5 mL solución enzima 1/2000.
3. Equilibrar a 27°C por 3 minutos (Agregar sacarosa 1 mL).
4. Dejar en baño a 27°C por 40 minutos.
5. Agregar 2 mL de DNS, enfriar.
6. Agregar 15 mL de Agua destilada
7. Medir absorbancia (540nm).
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Resultados y ConclusionesPara calcular la concentración de glucosa usaremos la ecuación de la
recta obtenida por la curva de calibración:
y = 0,183x - 0,0085r² = 0,9992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Ab
sorb
an
cia
a 5
40
nm
Concentración Glucosa (mM)
Curva de calibración Glucosa-Fructosa por el Método DNS
Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183
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Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183
Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa.
Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada
tubo:
C1 x V1 = C2 x V2
Concentración del tubo 1:
0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL
C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción
Para calcular la velocidad de la reacción:
V= [glucosa] tiempo de reacción: 40
minutos
tiempo reacción
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Tabla: Valores obtenidos
Tubo[sacarosa]
M
Absorbanci
a
[Sacarosa
en reacción]
M
[Glucosa] Velocidad de
reacción
(M/min)
1 0,45 2,950,15 16,1 0,40
2 0,3 3,07 0,1 16,8 0,42
3 0,2 3,010,066 16,49 0,41
4 0,1 2,04 0,033 11,2 0,28
5 0,05 1,420,0166 7,8 0,19
6 0,03 1,14 0,01 6,27 0,15
P 0,45 0,570,15 3,17 0,079
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[sacarosa] MVelocidad de reacción
(M/min)
0,45 0,40
0,3 0,42
0,2 0,41
0,1 0,28
0,05 0,19
0,03 0,15
Tabla datos gráfico Michaelis-Menten
Vmax
Km= Vmax
2
Vmax = 0,21
(M/min)
2
Km = 0,02 M
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0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
Ve
loci
dad
(M/m
in)
Concentración sacarosa (M)
Grafico Michaelis-Menten: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la
-fructofuranosidasa
Km
Vmax
Vmax2
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y = 0,0484x + 2,0082R² = 0,9818
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120
1/v
(M
/min
)
1/[S] (M)
Grafico Lineweaver-Burk: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la
-fructofuranosidasa
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1/s 1/v
6,67 2,5
10 2,38
15,15 2,44
30,30 3,57
60,24 5,26
100 6,67
Tabla datos gráfico Lineweaver-Burk
y = 0,0484x + 2,0082
1 = 2,0082 (M/min)
Vmax
Km = 0,0484
Vmax
Vmax = 0,4979 (M/min)
1 = 41,49 (M)
Km
Km = 0,0241 (M)
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v/s v2,67 0,44,2 0,42
6,21 0,418,48 0,28
11,45 0,1915 0,15
Tabla datos gráfico Eadie-Hofstee:
y = -0,0245x + 0,5043
Km = 0,0245 (M) Vmax = 0,5043 (M/min)
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Grafico Vmax (M/min) Km (M)
Michaelis-Menten 0,42 0,02
Lineweaver-Burk 0,49 0,024
Eadie-Hofstee 0,50 0,024
Observamos que los resultados obtenidos son
muy similares, gracias a los diferentes gráficos
podemos calcular la actividad enzimática y su
valores de Km y Vmax.
A mi parecer el gráfico mas eficiente es el de
Lineweaver-Burk ya que la actividad enzimática representada de forma lineal facilita los cálculos.
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Objetivos:
- Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la
velocidad de una reacción enzimática.
Fundamento: Determinar la velocidad de la hidrólisis de
sacarosa a diferentes concentraciones por la β-
fructofuranosidasa en presencia de una concentración
constante de yodo acetato.
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Materiales:
• 14 tubos de ensayo
• Pipeta
Reactivos:
• Yodo acetato 0,001M
• Solución de Glucosa - Fructosa 0,01M
• Solución de sacarosa a diferentes concentraciones
• Reactivo DNS (inhibe o detiene la actividad enzimática)
• Buffer acetato pH=4,7 0,05 M
• Solución extracto β-fructofuranosidasa
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Procedimientos:
Luego agregar:
- 1 mL Buffer acetato
Equilibrar a 27°C por 3 minutos.
Agregar 0,5 mL solución enzima 1/250.
Dejar en baño a 27°C por 5 minutos.
Agregar 2 mL de DNS a 100°C por 5 minutos (enfriar).
Agregar 15 mL de Agua destilada
Medir absorbancia (540nm).
Con inhibidor
Sin inhibidor
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Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085
[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183
Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa.
Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada
tubo:
C1 x V1 = C2 x V2
Concentración del tubo 1:
0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL
C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción
Para calcular la velocidad de la reacción:
V= [glucosa] tiempo de reacción: 40
minutos
tiempo reacción
Resultados y Conclusiones
Haremos los mismos procedimientos pero ahora calcularemos velocidad con y sin inhibidor
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Tabla valores
obtenidosSIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR
Tub
o
[sa
ca
ros
a]
M [Sacaros
a en
reacción
] M
Abs
[Glucosa
]
M
Velocida
d
(M/min)
Abs
[Glucos
a]
M
Velocida
d
(M/min)
10,45 0,15 2,46 13,51 2,70 2,95 9,85 1,97
20,3 0,1 2,05 11,25 2,25 3,07 8,10 1,62
3 0,2 0,066 1,67 9,19 1,83 3,01 6,88 1,37
40,1 0,033 0,87 4,77 0,95 2,04 4,67 0,93
5 0,05 0,0166 0,56 3,10 0,62 1,42 3,12 0,62
60,03 0,01 0,45 2,48 0,49 1,14 2,30 0,46
![Page 30: Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)](https://reader031.fdocuments.ec/reader031/viewer/2022012304/559d15461a28abdf018b478c/html5/thumbnails/30.jpg)
[Sacarosa] M Velocidad C.I.
M/min
0,15 1,97
0,1 1,62
0,066 1,37
0,033 0,93
0,0166 0,62
0,01 0,46
[Sacarosa] M Velocidad S.I.
M/min
0,15 2,70
0,1 2,25
0,066 1,83
0,033 0,95
0,0166 0,62
0,01 0,49
Tablas para gráfico Michaelis-Menten
![Page 31: Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)](https://reader031.fdocuments.ec/reader031/viewer/2022012304/559d15461a28abdf018b478c/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)](https://reader031.fdocuments.ec/reader031/viewer/2022012304/559d15461a28abdf018b478c/html5/thumbnails/32.jpg)
CON INHIBIDORSIN INHIBIDOR
Vmax = 2,7 (M/min)
Vmax = 1,35 (M/min)
2
Km = 0,04 (M)
Vmax = 1,97 (M/min)
Vmax = 0,985 (M/min)
2
Km = 0,028 (M)
Vmax = Km
2
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1/[S] M 1/v S.I.
(M/min)
6,67 0,507
10 0,617
16,67 0,729
33,33 1,075
62,5 1,613
100 2,174
1/[S] M 1/v C.I.
(M/min)
6,67 0,370
10 0,444
16,67 0,546
33,33 1,052
62,5 1,612
100 2,040
Tablas para gráfico Lineweaver-Burk
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![Page 35: Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)](https://reader031.fdocuments.ec/reader031/viewer/2022012304/559d15461a28abdf018b478c/html5/thumbnails/35.jpg)
SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR
Km = 0,0186
Vmax
1 = 0,3016 (M/min)
Vmax
1 x 1 = 1
Vmax 0,0186 Km
1 = 16,21 (M)
Km
Km = 0,0178
Vmax
1 = 0,4385 (M/min)
Vmax
1 x 1 = 1
Vmax 0,0178 Km
1 = 24,63 (M)
Km
![Page 36: Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)](https://reader031.fdocuments.ec/reader031/viewer/2022012304/559d15461a28abdf018b478c/html5/thumbnails/36.jpg)
Gráfico Michaelis-Menten:
Vmax (M/min) Km (M)
Sin inhibidor 2,70 0,040
Con inhibidor 1,97 0,028
Observamos que en presencia del Inhibidor yodo
acetato , la Vmax y Km disminuye. Estamos en
presencia de un inhibidor acompetitivo ya que el
resultado es un cambio proporcional en la Vmax y Km
Gráfico Lineweaver-Burk:
Vmax (M/min) Km (M)
Sin inhibidor 3,32 0,061
Con inhibidor 2,28 0,040