Pedro Coila

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

•Cinética enzimática

•Medición de la Actividad Enzimática (AE)

•Factores que afectan la AE

•Inhibición enzimática

•Regulación enzimática

•Problemas

Estudia la velocidad de las reacciones enzimáticas y los factores que la afectan.

La Velocidad o Actividad Enzimática (AE) puede ser determinado midiendo la cantidad de S consumido (o P formado) en una unidad de tiempo bajo condiciones adecuadas de Tº y pH.

Cinética enzimática

En la práctica es muy difícil determinar la cantidad de enzima, ya que se encuentran en cantidades muy pequeñas y por que la mayoría se encuentran formando complejos. También pueden existir enzimas que no estén catalizando.

Por eso es más fácil determinar la AE ya que es directamente proporcional a su concentración.

La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de las siguientes formas:

Expresiones de Actividad Enzimática (AE)

Nomenclatura comúnUnidades Internacionales de AE (UI o U).- Son los micromoles de S transformado (o P formado) en un minuto (μmol/min).

Nomenclatura SI Katal (kat).- Son los moles de S transforma-do (o P formado) en un segundo (mol/s). Se pueden usar prefijos SI.

Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de 5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katales y microkatales.

Es el número de moléculas de S transformado por una sola molécula de enzima en un tiempo dado (min o s).

Actividad molecularACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)

Catalasa H2O2

Anihidrasa carbónica HCO3-

Acetilcolinesterasa Acetilcolina

40,000,000

400,000

140,000

b-Lactamasa Benzilpenicilina 2,000

Fumarasa Fumarato 800

Proteína RecA (ATPasa) ATP 0.4

Enzimas Sustrato kcat (s-1)

1. Temperatura

2. pH

3. Concentración de enzima

4. Tiempo de incubación

5. Inhibidores

6. Electrolitos y fuerza iónica

7. Sustancias químicas

8. Concentración de sustrato

Factores que afectan la AE

Numerosos factores influyen en la velocidad de las enzimas, entre ellas:

1. Efecto de la temperatura

0 10 20 30 40 50 60 70

Temperatura (ºC)

Velo

cid

ad d

e r

eacció

n

Tº óptima

Vmáx

Des

na

tura

liza

ció

n

de

la e

nzim

a

A medida que aumenta la Tº la AE también sube, pero solo hasta cierto grado, más allá de ese límite, la enzima se desnaturaliza.

Cada enzima tiene su propia Tº óptima, al cual tiene máxima AE.

Para la mayoría de enzimas de mamíferos la Tº óptima está entre 35 y 40ºC.

2. Efecto del pH

4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Velo

cid

ad d

e r

eacció

n

pH óptimo

Vmáx

Cada enzima tiene un pH óptimo, al cual tiene máxima actividad. Por debajo y encima de este pH la actividad declina.

Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas.

Algunas enzimas tienen un pH óptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 -7,5 de pH

¿Cómo afecta el pH?

Modifica la ionización de ciertos grupos del sitio activo, del S o de ambos.

3. Efecto de la [E]

0 10 20 30 40

Concentración de enzima (mM)

Velo

cid

ad d

e r

eacció

n

50

10

0

15

0

Bajo condiciones saturantes de S,

la velocidad de reacción, es

directamente proporcional a la

[E].

Problema: Si una enzima cataliza a una vo = 2,7 x 10-3 UI ¿Cuál será su velocidad si la [E] se triplica?

Luego, la recta declina debido a:

- Depleción del S

- Inhibición por el P

0 10 20 30 40

Tiempo (min)

Velo

cid

ad d

e r

eacció

n4. Efecto del tiempo de incubación

En los momentos iniciales, la AE es directamente proporcional al tiempo de incubación, pero solo hasta cierto límite.

Luego, la AE declina debido a:

- Agotamiento del S

- Desnaturalización de la E

- Inhibición por el propio P

VO α tiempo

5. Inhibidores enzimáticos

Los inhibidores son sustancias orgánicas o inorgánicas que unidos a la enzima disminuyen su AE.

6. Electrolitos y fuerza iónicaLos iones (p.e. cationes) muchas veces son requeridos en el sitio activo de la E.

La fuerza iónica de la solución en donde está la E influye en la AE (salting in y sallting out)

7. Sustancias químicas

La presencia de diversos químicos afectan la AE, sobre todo:

-Agentes quelantes y

-Agentes reductantes

8. Efecto de la [S]

En 1912, en la Universidad de Berlín, los investigadores que realizaron el primer estudio (cinético y matemático) del efecto de la [S] sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas, fueron:

Leonor Michaelis y MaudMenten

Ellos observaron que cuando se mantenía constante la [E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtenía una gráfica hiperbólica.

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Sustrato (μmol)

AE

(UI)

80

60

40

20

0

S

+

E

↓

P

EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN

Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S] (cinética de primer orden), luego va disminuyendo (cinètica de orden intermedio) hasta que la velocidad se hace constante, así haya fuerte [S] (cinética de orden cero).

Gráfica y ecuación matemática de la

hipérbola rectangular

Constante de

Michaelis-Menten

Gráfica y ecuación enzimática de la

hipérbola rectangular

Curva de Michaelis-Menten

Ecuación de

Michaelis-Menten

Velocidad máxima (Vmáx)

Es la máxima velocidad de una reacción enzimática.

En este momento, todas las enzimas están “trabajando” (no hay enzima disponible).

Si el Km es alto: menor velocidad

Si el Km es bajo: mayor velocidad

Constante de Michaelis-Menten (Km)

Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmáx.

Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S.

Todas las reacciones enzimáticas tienen su Km característico.

Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)

Problema: ¿Cuál es el S preferido para la hexokinasa, cuyos sustratos y Km se muestran en la siguiente tabla?

Sustrato Km (M)

Galactosa 1 x 10-1

Fructosa 1,6 x 10-3

Glucosa 8 x 10-6

Manosa 5 x 10-6

NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son próximos

a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de

forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer

grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

En todo estudio enzimático, los dos parámetros cinéticos

que deben ser determinados son: Vmáx y el Km.

La curva hiperbólica realmente nunca llega a contactar con la asíntota de la curva (que es el valor de la Vmáx).

Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmáx, tampoco se podrá determinar el verdadero valor de Km.

Pero en la práctica, estos

dos parámetros no

pueden ser

determinados, en forma

exacta, utilizando la

gráfica de Michaelis-

Menten, debido a:

El Ploteo de Lineweaver-Burk

El ploteo de Eddie-Hofstee

El ploteo de Hanes-Woolf

El ploteo de Eisenthal y Cornish

Programas computarizados

Métodos disponibles en:

Entonces, ¿Cómo poder determinar exactamente estos dos

parámetros enzimáticos (Km y Vmax)?

Frente al problema, muchos investigadores plantearon métodos matemáticos (conocidos como ploteos) para resolver este problema, entre ellos:

http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html

Ploteo de Lineweaver-Burk (1934)También conocido como el ploteo del doble recíproco.

El método consiste en aplicar el recíproco (inverso) a la ecuación de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]), obteniéndose una recta.

Ploteo del doble recíproco

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Doble recíprocoPloteo directo

1

Vmax

- 1

Km

1/2

Dato

s

No

1

2

3

4

0.25

0.50

1.0

2.0

0.42

0.72

0.80

0.92

Absorbance v (mmole/min)[S]

0.21

0.36

0.40

0.46

(1) El producto fue medido por espectrofotometría a 600 nm para 0.05 por mol

(2) El tiempo de reacción fue de 10 min

VelocidadSustrato Producto Doble recíproco

1/S 1/v

4

2

1

0.5

2.08

1.56

1.35

1.16

→

→

→

→

1.0

0.5

0

v

Plo

teo

Dire

cto

Do

ble

re

cíp

roco 2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Ejemplo de cinética enzimática y ploteo de Lineweaver-Burk

Los inhibidores son sustancias (orgánicas o inorgánicas) que al ser añadidos al medio donde está actuando una E determinan su menor AE.

Inhibición enzimática

El estudio de los inhibidores es importante por que proporciona información sobre: El mecanismo de catálisis enzimática La especificidad de la enzima La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo

Los inhibidores se unen a la enzima lo que ocasiona la pérdida parcial o total de la AE formando los complejos EI o ESI

Aplicaciones

Modo de acción de los inhibidores

Aplicaciones del estudio de inhibidores:

Muchos compuestos actúan inhibiendo ciertas reacciones enzimáticas; y, por lo tanto, de toda una vía metabólica. Entonces, tiene aplicación en:

Medicina.- Antiinflamatorios, analgésicos, antibióticos, interferones, anticancerígenos, etc

Agricultura.- Herbicidas, insecticidas, plaguicidas, etc.

Guerras biológicas.- Gases nerviosos, venenos, etc.

Industria alimentaria

Biotecnología, ect.

1. Inhibición Irreversible.- Al retirar del medio el inhibidor, la enzima no recupera su AE. Entonces, el inhibidor ha destruido algún grupo funcional necesario para la actividad catalítica de la E. A menudo la unión la EI es covalente. Ejemplos:

- Los organofosforados inhiben a la acetilcolinesterasa.

- Agentes alquilantes como el yodoacetato (se unen a –SH)

- La penicilina inhibe enzimas que sintetizan la pared bacteriana

- Los metales pesados (Pb, As, Hg) .

Tipos de Inhibición

2. Inhibición Reversible.- Si el inhibidor es retirado del medio (por diálisis u otros medios) en donde está actuando, la enzima recupera su AE. Entonces, se dice que la E se ha reactivado. La unión EI es laxa. Existen 3 subtipos:

-Competitiva

-No Competitiva

-Acompetitiva

Tipos de Inhibición

Inhibición reversible (Mecanismo)

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitiva No competitiva Acompetitiva

E

E

Diferente sitioCompiten porel sitio activoInhibidor

Sustrato

Esq

ue

ma

sE

cuac

íone

s y

Des

crip

cion

es

[I] sólo se une a [E] libre,

y compite con el [S];

incrementando la [S] se

revierte la Inhibición.

[I] se une a [E] libre o al

complejo [ES] ; aumentando

la [S] no se revierte la inhib.

[I] sólo se une al complejo

[ES], aumentando la [S] se

favorece la inhibición.

E + S → ES → E + P

+I

↓

EI

←

↑

E + S → ES → E + P

+ +I I

↓ ↓

EI+ S →EIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P

+I

↓

EIS

←

↑

E

I

S

Km

Inhibición enzimática (Ploteos)

I II Competitiva No competitiva Acompetitiva

Plo

teo

dir

ecto

Plo

teo

de

Lin

ew

ea

ve

r-B

urk

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

I I

Km [S], mM

Vmax

I

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax no cambiaKm aumenta

Vmax disminuyeKm no cambia Vmax y Km disminuyen

I

1/[S]1/Km

1/vo

1/Vmax

I

Dos líneasparalelas

I

Intersect en el eje X

1/vo

1/Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/Vmax

1/vo

Intersect en el eje Y

= Km’

Ejemplo de un inhibidor competitivo

-COOHH2N-

-SONH2H2N-

PrecursorAcidofólico

Acidotetrahidrofólico

Sulfanilamida

Acido para-aminobenzoico (PABA)

La bacteria requiere PABA para

la biosíntesis de ácido fólico

Las sulfas tienen similar

estructura con el PABA e

Inhiben el crecimiento de

la bacteria..

Domagk (1939)

Droga Uso terapéutico Enzima afectada Tipo de inhibidor

Lovastatina Hipercolesterolemia HMGCoA reductasa Competitiva

5-fluouracil Cáncer Timidilato sintetasa Irreversible

Metrotexate Cáncer Dihidrofolato reductasa Competitiva

Alopurinol Gota Xantino oxidasa Irreversible

Cumadin Anticoagulante Glutamil carboxilasa Competitiva

Aspirina Antiinflamatorio Ciclooxigenasa Irreversible

Captopril Hipertensión art. Enz.convert.angiotensina Competitiva

Ejemplo de algunos inhibidores

aplicados en medicina

El funcionamiento celular u orgánico requiere que todas las reacciones estén controlados, de modo que las vías metabólicas estén activas en ciertos momentos e inactivas en otros.

Regulación enzimática

Todas las enzimas pueden ser reguladas por factores como Tº, pH, [S], [E], cofactores, etc. Pero estos factores en el organismo animal son casi constantes, por lo que poco influyen en la regulación.

Existen otros mecanismos intracelulares que permiten la regulación de la velocidad de las reacciones enzimáticas

La regulación enzimática se refiere a la posibilidad que tienen las enzimas de variar la velocidad de las reacciones que catalizan al producirse determinados cambios en el medio.

Existen dos tipos de enzimas especializadas denominadas enzimas regulatorias (o moduladoras) que intervienen en la regulación del metabolismo y están ubicadas estratégicamente en las vías metabólicas:

1. Las enzimas alostéricas Regulación Alostérica

2. Las enzimas reguladas por unión covalente Regulación Covalente

Ubicación de las enzimas regulatorias

Generalmente, catalizan las primeras reacciones, permitiendo una regulación de una vía desde el inicio (principio de máxima economía)

Las enzimas alostéricas presentan 2 sitios de unión funcionalmente distintos y separados:

-Sitio activo.- Con actividad catalítica, sierve la unión con el S.

-Sitio alostérico o regulador.- Sin actividad catalítica, sirve para la unión con una molécula efectora (= efector, modulador o regulador) por enlaces no covalentes.

1. Regulación alostérica

1. Efectores negativos o inhibidores.- Disminuyen la AE

2. Efectores positivos o activadores.- Aumentan la AE

Tipos de efectores

Si la enzima posee:

-Un solo efector (+ ó -) = monovalente

-Dos o más efectores (+ ó -) cada uno con su sitio = polivalente

Características de las enzimas

alostéricas

1. Generalmente, son poliméricas Alto PM

2. No cumplen la clásica cinética micheliana.

3. Presentan 2 estados interconformacionalesinterconvertibles. Ambos están en equilibrio.

- R (relajado).- Es activo. Tiene alta afinidad por el S

- T (tenso).- Es inactivo. Baja afinidad por el S

4. Pueden ser homeotrópicas (si su propio S actúa como efector) o heterotrópicas (si el efector es una molécula distinta al S)

6. Son bastante inestables o lábiles

T

T

R

T

[S]

vo

Mecanismo y ejemplo de regulación alostérica

SS

R

R

SS

R

S

A

I

T[S]

vo

[S]

vo

(+)

(-) XX

X

R = Relajado

(activo)

T = Tenso

(inactivo)

Sitio alostérico

Homotrópico

(+)

Concertado

Heterotrópico

(+)

Secuencial

Heterotrópico

(-)

Concertado

Sitio alostérico

Cinética CooperaciónModelos

(-)

(+)

(+)

En la mayoría de los casos, las 2 formas de la enzima sólo se diferencia en la presencia de un grupo fosfato el cual se une covalentemente a la proteína. Entonces, las formas serían:

2. Regulación covalente

1. Forma fosfatada o forma a

2. Forma no fosfatada o forma b

Son enzimas que presentan 2 formas interconvertibles, con diferente composición, lo que origina cambios conformacionales en la molécula (estructura 3ria o 4ria).

Las kinasas: Son enzimas que agregan el grupo fosfato proveniente del ATP.

Las fosfatasas: Son las enzimas que retiran el grupo fosfato.

Las 2 formas difieren en su grado de actividad, siendo una muy activa y la otra poco activa. Algunas veces la forma a es la activa y en otros casos la forma b.

Regulación covalente (por fosforilación)

ConformationalChangeFosfatasa

(defosforilación)

P

Protein

OH

Active Inactive

Inactive Active

Glycogen phosphorylase b Glycogen phosphorylase a

Fischer, Kreb (1978)

Kinasa(fosforilación)