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TEMA 9: TÉCNICAS DE TRANSFORMACIÓN MEDIANTE VIRUS

1. TRANSFORMACIÓN MEDIANTE VIRUS

o Una de las propiedades más destacadas de los virus es la de integrar sus genes

virales dentro del material genético de la célula infectada.

o Utilizan así la maquinaria celular de la planta para reproducir las partículas

virales.

o El avance en el conocimiento de la biología de los virus ha permitido el diseño de vectores que puedan transportar genes de interés hasta la planta y expresarlos

en la misma

o Los vectores virales hasta hoy día son usados como herramientas para

conseguir altos niveles de expresión de genes extraños en plantas, ya sea en

tejidos maduros, tejidos diferenciados, etc… y se han usado con distintas

aplicaciones:

i. Dichos genes, incluidos en el genoma viral, pueden servir para el

estudio de fenotipos de plantas mutantes.

ii. También para la producción de proteínas y péptidos extraños en

plantas, siendo una alternativa barata a los sistemas de producción

por fermentación (molecular pharming)

o Muchas investigaciones se han centrado en el desarrollo de virus RNA y DNA

como vectores para la expresión de genes en plantas

Los virus fitopatógenos son unos vectores atractivos por varios motivos:

Son capaces de introducir un gen extraño en células intactas. Dependiendo de la virulencia del virus, se puede conseguir una

transformación relativamente poco invasiva o no.

Relativamente, pueden producirse grandes cantidades de partículas virales en

células nfectadas, por lo que en principio es posible una producción alta de

proteína heteróloga.

Algunas infecciones son sistémicas, extendiéndose a otras células y tejidos.

Con una aplicación puntual del virus transgénico se puede conseguir la infección

de buena parte de la planta.

Una vez que se ha conseguido infectar una célula, la información genética del

virus se disemina por todas las células, dada la estrecha conexión entre las

células de una planta

o Pero hasta ahora no se ha descubierto ninguno que sea práctico de utilizar.

Entre las causas de que se utilicen poco para la transformación están:

Su elevada especificidad

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La naturaleza patogénica de los virus

El reducido tamaño de su genoma

La mayoría de los virus patógenos de vegetales tienen ARN como ácido

nucleico

El DNA vírico no se transmite de modo sexual a la progenie de las

plantas infectadas. Esto se debe a que no se integra en el genoma de la

célula y por tanto sólo tiene sentido utilizarlos para estudios de

expresión génica transitoria

Tipos de virus infectivos

o Las partículas de virus están compuestos por un genoma de ácido nucleico que

puede ser ADN o ARN, rodeado por una cápsida de naturaleza proteica también

llamada nucleocápsida.

o Presenta un enorme rango de morfologías desde forma de vara hasta partículas

isométricas y algunos presentan membranas que envuelven la nucleocápsida.

o El genoma de los virus codifica para proteínas de la cápsida, proteínas

relacionadas con la replicación, con el movimiento del virus incluso proteínas que

facilitan su extensión o capacidad infectiva. Algunos tienen pequeños

segmentos de RNA asociados llamados RNA satélite.

2. TRANSFORMACIÓN MEDIANTE VIRUS (II)

o Los genomas de virus fitopatógenos se han clonado en plásmidos bacterianos

tanto si son de DNA como si son de RNA, tras la previa y consiguiente

conversión a cDNA.

o Uno de los plásmidos usados para clonar virus es el plásmido Ti de

Agrobacterium tumefaciens.

o Dentro de estos plásmidos, los genomas del virus pueden manipularse e integrar

la secuencia del gen que se quiere expresar en el genoma de la célula vegetal

huésped.

o Las plantas huésped entonces son infectadas artificialmente.

o El genoma alterado del virus se replica y, al mismo tiempo, se expresan los

genes de la planta, entre los que se encuentra el gen ajeno manipulado inserto

en el genoma.

o Dependiendo de la construcción que se realice, la proteína heteróloga

sintetizada

puede quedar unida a alguna proteína viral.

o incorporarse a la célula vegetal a infectar.

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Virus mosaico de la coliflor

El más potente de los utilizados es el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) un virus

con DNA de doble cadena.

La partícula del virus es un icosaedro con un diámetro de 52 nm. Contiene una molécula

circular de ADN bicatenario de unas 8 kb, interrumpida por discontinuidades

localizadas en lugares específicos resultantes de su replicación por transcripción

inversa. Después de entrar en el huésped, el ADN viral es reparado, formando un molécula

altamente enrollada que se une a las histonas. Este ADN se traduce en una molécula

ARN 35S de longitud completa, terminalmente redundante, y en ARN 19S subgenómico.

El promotor del CaMV ARN 35S, bien conocido por su uso en ingeniería genética en

plantas, es muy potente.

El ARN 35S es particularmente complejo, conteniendo una secuencia lider de 600

nucleótidos con seis a ocho ORFs cortos.

Este 35S va seguido por siete ORFs perfectamente organizados que codifican las

proteínas virales.

ORF I Movimiento de proteínas ORF II Factor de transmisión en insectos ORF III ORF IV Proteína de la cápside ORF V Proteasa, transcriptasa inversa y RNaseH ORF VI

Activador translational / Proteína del cuerpo de inclusión ORF VII Desconocido

(dispensable)

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o Como principales desventajas tiene.

Un genoma muy pequeño (8 Kb) muy empaquetado en la cápside, por lo que

no es posible introducirle mucho ADN extra ya que no se puede eliminar

parte de su genoma (sólo se han encontrado dos genes no esenciales).

Su replicación es compleja y tiene una etapa intermedia a través de ARN

No obstante, contiene un promotor muy potente, el CaMV 35S RNA que se

utiliza para transformación de plantas, especialmente de dicotiledóneas.

Virus del mosaico del tacabo

o Otro virus interesante para usar como vector en la transformación de plantas es el

virus del mosaico del tabaco, TMV, un virus RNA con un promotor igualmente muy

potente.

o Este ha sido intensamente estudiado y su genoma codifica 5 ORFs de las que al menos

3 son proteínas no estructurales.

o Sin embargo produce bajos niveles de infectividad en las plantas en los distintos

tejidos. Sólo infecta al tabaco y otras Solanaceas.

o Produce decoloración de las hojas en forma de mosaico (de ahí su nombre)

o Su cápsida tiene 2130 moléculas de proteínas y una molécula de ARN genómico de 6 Kb

o La proteína de la cápsida tiene estructura helicoidal alrededor del ARN. Los

monómeros de proteína contienen 158 aminoácidos unidos en cuatro alfa-hélices

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o Win Brooothaers et al hicieron modificaciones en el proceso de infección del TMV. Los

autores introdujeron un sistema infiltrando plantas adultas enteras con una suspensión

diluída de Agrobacterium.

o Se utilizó para ello una técnica llamada agroinfiltración. Para ello se inserta TMV en el

T-DNA de Agrobacterium, y se usa a bajas concentraciones de inóculo para producir la

infección inicial.

o El T-DNA en este caso además de llevar el ADN extraño llevaría las proteínas del

virus necesarias para su replicación.

o Una vez dentro de la célula, el virus induce a la célula a la transcripción de su RNA y a

la formación de proteínas recombinantes en el citoplasma.

o El resultado: un vector viral mejorado y optimizado con capacidad de movimiento y

replicación célula a célula. Aumenta la eficacia y la simplicidad del proceso de

inoculación.

o Conseguimos una inoculación eficiente de todas las partes aéreas de la planta, usando

para ello Agrobacterium.

o Este proceso proporciona la base para una nueva forma de obtención de proteínas

recombinantes a escala industrial.

o Se facilitan dos cosas:

una mejor entrada del gen problema en la planta

y una mayor capacidad de replicación del gen

por medio del virus

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El virus X de la patata

o El virus X de la patata (PVX) es un virus RNA de cadena simple con una secuencia de

poli A en el extremo 3´que también ha sido usado con éxito como vector para la

expresión de genes foráneos en plantas.

o Para ello es totalmente necesaria la presencia de la proteína de la cápsida en la

construcción realizada, que hace posible el movimiento del virus célula a célula.

o Además se suele duplicar la presencia del promotor de manera que así la expresión es mayor

o Este virus presenta cinco largas ORFs, similares a las del virus TMV

Los vectores virales se han generado a partir de diversos virus.

o Cada vector tiene sus propias ventajas y desventajas particulares dependiendo de su

biología. Los más conocidos y utilizados hasta la fecha son el TMV o el virus de la

patata X (PVX).

o De hecho, los vectores derivados del TMV se están utilizando actualmente para

expresar cantidades comercialmente relevantes de proteínas de uso farmacéutico

o Estos sistemas de transfeccion virales permiten la superproducción de proteínas y de

metabolitos en cantidades que podrían ser mortales o deletéreas para la planta.

Por ejemplo, una sobreexpresión del gen que codifica para la fitoeno sintasa en

N. benthamiana condujo a un aumento diez veces mayor del phytoeno en las

plantas.

De forma parecida, la sobreexpresión de capsorubina sintasa, enzima que

existe en una especie de pimiento, condujo a la producción de capsanthina en N.

benthamiana, un carotenoide que no se encuentra normalmente en dicha especie.

o Esta capacidad de expresar fácilmente genes no-endógenos abre una amplia gama de

posibilidades

o Debido a su velocidad y flexibilidad de expresión de las proteínas, los vectores virales

son herramientas ideales para generar in vitro millares de mutantes o de genes

quiméricos, expresarlos y, finalmente, seleccionar mutantes de plantas con rasgos de

interés.

o Las bibliotecas de genes pueden reproducirse en virus fitopatógenos e individualmente

ser expresados sistemicamente a través de las plantas en un plazo de tiempo corto.

o Usando esta estrategia, se podrían crear actividades enzimáticas mejoradas en

plantas, tales como celulasas termoestables o ligninasas para facilitar la producción de

papel

o Los virus fitopatógenos han hecho muchas contribuciones significativas en la Biología

durante los últimos años:

han provisto a los investigadores de plantas de promotores funcionales muy

potentes,

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Son activos sistemas transitorios de expresión génica

y, lo más reciente e interesante, con inserciones críticas de tales virus en el

genoma de las plantas, se ha podido producir el silenciamiento

postranscripcional de genes o la sobreexpresión de los mismos

Estos vectores víricos tienen la capacidad de actuar sobre genes de la

planta para inducir su expresión o suprimirla

o Mientras que el mecanismo de sobreexpresión del gen se conoce

conceptualmente, sin embargo, los mecanismos para la inducción

del silenciamiento son menos entendidos.

3. INFECCIÓN DEL VIRUS EN LA PLANTA

• La mayoría de los virus son transmitidos a la planta por medio de vectores como

insectos, nematodos y hongos o a través de las semillas y el polen de las flores.

• El proceso de infección consiste en la entrada del virus completo en la planta a

través de orificios que el vector realiza en la misma para que penetre el virus.

o En algunos ejemplares de virus RNA se ha demostrado que al entrar en la

planta hospedadora eliminan la cápsida en un proceso conocido como

desemblaje contraslacional, en el cual, el RNA es rodeado por los ribosomas,

para evitar ser digerido por las nucleasas de la planta.

o Los genes de la planta codifican para el ácido nucleico del virus, que se

replica y produce las proteínas de patogenicidad. Posteriormente, este

genoma se empaqueta en forma de complejos de ribonucleoproteínas, que

infectan a la planta.

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Traslación y replicación en virus RNA de cadena positiva

• Los genomas de virus RNA de plantas son generalmente muy compactos,

• con genes separados por regiones intergénicas muy cortas,

• o sobrelapados unos a otros formando un genoma muy pequeño con

secuencias redundantes.

• Dicha naturaleza compacta de su genoma, con un mínimo número de

polipéptidos para los que codifica, significa que los virus necesitan de la

maquinaria de la planta para su replicación y movimiento.

• La mayoría de estos virus posee una cadena simple y positiva de RNA

• La replicación de los virus se produce en el citoplasma de la planta en donde

forman inclusiones, llamadas viroplasmas ancladas a la membrana

citoplasmática hacia dentro.

• Existe un problema fundamental en virus al usar la maquinaria eucariota de las

plantas.

– Sólo el primer cistrón 5´ en un mensaje policistrónico que constituye el

genoma viral, será trasladado, y el resto del mensaje, después del primer

codón stop no se leerá por parte de la maquinaria de la planta.

– Por este motivo los virus infectivos de plantas han desarrollado una serie

de estrategias para asegurarse de que todos sus genes se trasladan en la

replicación.

– Dicha estrategia consiste en que el primer cistrón trasladado es la replicasa del virus.

– Dicha replicasa será la responsable de la formación del los círculos

subgenómicos de cadenas RNA posteriores.

– Cada uno de esos RNA subgenómicos tienen su propia secuencia promotora

y terminadora para trasladar las proteínas funcionales del virus.

– Tales como son proteínas del movimiento y de la cápsida.

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Traslación y replicación en virus RNA de cadena positiva. Genomas segmentados

• Una segunda aproximación a la replicación y translación de los virus RNA es que

tienen un genoma segmentado.

• Miembros de la familia Bromoviridae, como el virus del mosaico de la calabaza,

tienen 3 tipos de RNA genómico, empaquetados en cápsidas individuales

compuestas por la misma subunidad proteica. En total codifican para 4 proteínas:

– RNA 1. Codifica para la metiltransferasa y para la helicasa.

– RNA2. Codifica para un dominio RdRp expresado en poca abundancia pero

imprescindible para promover la replicación y la supervivencia del virus.

Parece tener un papel en el silenciamiento post – transcripcional del virus.

– RNA3. Codifica para las proteínas de la cápsida.

• La tercera estrategia de los virus infectivos de plantas consiste en producir una

sola poliproteína a partir del RNA vírico que se traduce en la formación de

diferentes polipéptidos. Se preoduce en los géneros Potyviridae y Tymovirus

• Estos polipéptidos se anclan unos a otros inducidos por proteinasas codificadas por

el virus.

• Dichas enzimas proteinasas están situadas entre los dominios de la helicasa y

metiltransferasa del virus, de manera que se expresa obligatoriamente durante la

replicación.

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Virus RNA de cadena negativa

• Existen virus con cadenas RNA en antisentido (Bunyaviridae) que necesitan

fabricar las cadenas complementarias para codificar determinadas proteínas.

Afecta por ejemplo, al tomate.

• Sus genomas consisten esencialmente en tres partes o bloques:

– El Bloque I codifica la nucleocápsida y fosfoproteinas

– El Bloque II el desarrollo de las proteinas de membrana y proteinas del

movimiento del virus

– El Bloque III codifica para la replicasa

• La replicación inicial de los virus se produce cuando se detecta 10 a 20 copias del

virus con proteína del dominio viral RdRp.

Virus RNA de doble cadena

• Se agrupan en dos familias con dominios RdRp:

– Reoviridae, con genomas de un tamaño 26-28 Kb y 10-12 segmentos de su

genoma. Utilizan un mecanismo conservativo de su replicación que consiste

en que la doble cadena de RNA se desenrolla de forma transitoria sólo en la

parte final donde se produce el crecimiento de la nueva cadena RNA

complementaria

– Partiviridae con genomas más pequeños, de 3-4 Kb divididos en 2-3

segmentos con replicación de tipo semi-conservativa, que consiste en que la

doble cadena se divide en forma de horquilla para la síntesis de las

complementarias

• Son los llamados Geminivirus en su mayoría. Recientemente se han descubierto

otra familia de los Nanoviridae.

• Los Geminivirus poseen una o dos pequeñas cadenas de DNA simple (2,6-3 Kb)

emparejadas en dos partículas hermanas o gemelas.Su replicación se da en el

nucleo de plantas infectadas y el primer paso consiste en la conversión de la

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cadena DNA en doble usando enzimas de la planta las cuales no se conocen muy

bien (ni cuáles ni cómo).

• A continuación actuaría la replicasa viral, necesaria para la fase de enrollamiento

circular que da lugar a la producción de nuevas formas de virus de dsDNA y ssDNA.

Este proceso se inicia entre las 3ª y 8ª base de un locus invariante que existe en

todos los Geminivirus (TAATATTAC).

• Los Geminivirus nunca se replican en meristemos, sino siempre en células

diferenciadas de la planta. Esto ocurre a través de una interacción entre una

proteína viral Rep con otra proteína de la planta llamada RBR.

Virus DNA de cadena doble

• Se replican a través de la transcriptasa reversa Sus genomas (una 8Kb) están

formados por una cadena a (necesaria para la transcripción inicial) con una sola

discontinuidad en una región de 1-2 nucleótidos.

• La cadena opuesta posee 2-3 discontinuidades en las que las dos cadenas se

solapan entre sí.

• En la célula hospedadora el virus se mueve hasta el núcleo donde se abre la estructura de doble cadena y el DNA forma un minocromosoma superenrollado.

• A partir del mismo se producen dos transcritos de RNA:

– El 19S RNA, que se mueve hasta el citoplasma y se transforma en una

proteina transactivadora de 58 KDa

– 35S RNA Este transcrito es procesado de manera que conduce a la

formación de 6 conocidas proteínas encrgadas de xodificar para

estructuras imprescindibles para el virus

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4. LA SUPRESIÓN DE GENES EN PLANTAS USANDO LOS VECTORES VIRALES

• Aunque los vectores virales fueron diseñados originariamente para servir como

herramientas de sobreexpresión de genes, también tiene la capacidad de suprimir la

expresión de los mismos en plantas activando una secuencia específica para la

degradación del RNA conocida como silenciamiento posttranscripcional (PTGS).

• Se fabrican transgenes construidos bajo el control de promotores constitutivos fuertes.

• Como consecuencia, algunas plantas transgénicas generadas de esta manera, pero no

todas, exhibieron un fenotipo inusual en el cual, misteriosamente, la expresión tanto

del transgén como la del gen homólogo endógeno se silenció, es decir, se suprimió.

• Este fenómeno inesperado fue llamado cosupresión o silenciamiento génico (SGT).

Silenciamiento génico

• El término “silenciamiento génico” se utiliza habitualmente para describir el

“apagado” de un determinado gen, y es un mecanismo general que ocurre durante la

replicación de la expresión génica. A través de este mecanismo, la maquinaria

celular impide la expresión de un gen que debería estar “encendido” en

circunstancias normales.

• La expresión génica se puede regular tanto a nivel transcripción como post-

transcripcional.

• El silenciamiento génico es el resultado de la modificación de las histonas. Esta

modificación crea un ambiente de heterocromatina alrededor de un cierto gen, que

impide el acceso de la maquinaria transcripcional.

• El Silenciamiento Génico Post Transcripcional (en inglés, Post – Transcriptional

Gene Silencing o PTGS), en cambio, en un mecanismo que implica la degradación de

un determinado ARN mensajero.

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o La destrucción de este ARNm impide su normal traducción y

consecuentemente no se sintetiza la proteína correspondiente.

• Tanto el silenciamiento transcripcional como el post-transcripcional son

mecanismos que regulan la expresión de genes endógenos, pero además son

empleados por las plantas para protegerse de transposones y virus.

o Es por eso que se cree que el silenciamiento génico forma parte de un

sistema de defensa ancestral que resguarda a algunos organismos de la

invasión de AN infeccionsos.

• El PTGS es un mecanismo descrito en plantas y mediante el cual la maquinaria

celular desencadena la degradación de un ARNm. Se dice que esta degradación es

“específica de secuencia” ya que sólo serán degradadas las moléculas de ARNm que

contengan una secuencia particular, y no otros. Este fenómeno también se conoce

como ARN de interferencia o ARNi.

• El mecanismo se describió por primera vez en petunias transgénicas, en las que se

pretendía mejorar el color de las flores. Para eso se introdujeron copias

adicionales de un gen que codifica para una enzima clave para la producción de

pigmentos en los pétalos.

Silenciamiento post – transcripcional

• Algunos años más tarde un grupo de virólogos vegetales observó un fenómeno

similar. El objetivo de su trabajo era mejorar la resistencia de las plantas al ataque de ciertos virus.

o En ese tiempo ya se sabía que las plantas que fabricaban proteínas virales

eran más resistentes a la infección.

• Sin embargo, en este caso los virólogos observaron que las plantas que contenían

sólo un pequeño segmento del ARN viral, y que no codificaban para ninguna proteína,

eran igualmente resistentes.

• Concluyeron que el ARN viral producido a partir de transgenes también podía

proteger a la planta de nuevas infecciones virales, evitando la multiplicación y

propagación del virus en cuestión.

• Luego realizaron el experimento inverso: insertaron secuencias cortas de genes de

la planta en el genoma del virus.

• Infectaron plantas con el virus modificado y observaron que la expresión de ese

gen de la planta era suprimida. Este fenómeno se llamó “Silenciamiento Genómico

inducido por Virus”.

• A pesar de que el fenómeno de silenciamiento génico fue descrito por primera vez

hace más de 15 años, aún no se conoce con precisión su mecanismo molecular. Sin embargo, se ha avanzado mucho en estudios que lo describen parcialmente.

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• Utilizando análisis bioquímicos y genéticos se ha podido establecer un modelo que

describe cómo se produce el PTGS. En este modelo, el silenciamiento puede

dividirse en una etapa de inciación y en otra etapa efectora y de mantenimiento.

• La etapa de iniciación comienza con la presencia de un ARN de doble cadena. Este

dsRNA puede ser un intermediario de replicación de un virus, puede haber sido

inducido artificialmente o puede provenir de un transgen.

• Este dsARN es reconocido y digerido por la enzima Dicer, que posee dominios de

ARNasa tipo III (enzima que degrada moléculas de RNA), para formar moléculas

de ARN prequeños.

• En la etapa efectora, el siRNA se une a un complejo con actividad de nucleasa para

formar el compejo RISC (Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN). La

actividad helicasa de RISC separa las dos hebras del siRNA, y sólo una de ellas

permanece unida al compejo. Una vez que RISC está activado, tiene como blanco la

degradación de los ARNm homólogos a dichos siRNA.

Mecanismos de acción del silenciamiento postranscripcional

• Las plantas tienen una manera de detectar el RNA extraño que han acumulado a lo

largo de un tiempo. Después de la detección, la planta desencadena una respuesta

activa que lleva a su degradación.

• Se ha propuesto que la especificidad de PTGS es debido a la actividad de la RNA-

polimerasa

o En plantas, este enzima podría utilizar fragmentos cortos de RNAs

específico como plantillas para la producción de las moléculas

complementarias.

o Estos RNAS podían difundir a través del citoplasma, reconocer a su

secuencia complementaria y silenciarla.

o Entre los genes ahora sabidos para estar implicado en PTGS están el gen

RNasaD.

o Recientemente, se ha demostrado que los RNAs de doble cadena (dsRNAs)

son inductores potentes de PTGS.

Papeles biológicos de PTGS: PTGS y los virus

• PTGS se identificó por primera vez en plantas transgénicas. Es una barrera natural

desarrollada por las plantas para combatir la transgénesis en naturaleza.

• Por tanto, PTGS es una estrategia de defensa de la planta frente a virus pudiendo

tener muy probablemente papeles biológicos adicionales.

• En la ruta que se desarrolla en el núcleo y que se denomina silenciamiento génico

transcripcional (TGS, de las siglas en inglés “Transcriptional Gene Silencing”), los

pequeños fragmentos de ARN que se producen guían selectivamente la mutilación

del ADN y de las histonas, promoviendo la remodelación de la cromatina.

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• Las plantas detectan RNAs virales y, como mecanismo de defensa, inician una

respuesta para degradarlos selectivamente. Varias líneas de evidencia lo sugieren:

o Algunos virus expresan genes supresores del PTGS.

o Mediante respuestas muy similares al PTGS, las plantas se recuperan de

una infección viral en muchas ocasiones.

o Mutantes de arabidopsis en donde está interferido el PTGS en la planta,

son hipersusceptibles a la infeccion con algunos virus

o El RNA de doble cadena es un potente inductor de PTGS la mayor parte de

los virus de plantas son virus RNA que se replican con un intermediario de

RNA de doble cadena

• La habilidad de la señal PTGS de viajar en la planta a cortas (célula a célula) y

largas distancias (hoja a hoja), es un importante sistema de protección para evitar

el avance del virus en células no infectadas

Las conclusiones y el futuro prospecta

o Dado que PTGS parece ser una estrategia común en las plantas para el control de virus,

los virus tienen estrategias para contrarrestar esta defensa.

o La estrategia que un virus utiliza combatir la respuesta de PTGS afectará a su utilidad

como vector para transformación de plantas.

o Algunas de las estrategias del virus incluyen:

Evitar la detección evitando la activación de PTGS

Proteger secuencias de reconocimiento en el virus que desencadenen la señal

PTGS en plantas

Expresar genes que interfieren en los estados intermedios de señalización de

PTGS, para evitar que se produzca ese mecanismo protector en cadena

5. USO DE RNAs SATÉLITES.

o Se ha observado que algunas secuencias cortas de RNA pueden mejorar los

síntomas de la enfermedad causadas por virus de RNA.

Son secuencias de pequeño tamaño que se replican y encapsulan

normalmente,

que no tienen homología con el genoma principal

y que no se requieren para la propagación ni replicación del virus. o Son los denominados “RNAs satélites”.

o Su replicación y transmisión dependen de factores codificados por el genoma

vírico. Pueden conferir algún tipo de ventaja selectiva porque no se pierden ni

durante la proliferación ni por sección natural. La estrategia de protección

genética consiste en introducir copias en DNA del vector RNA satélite.

Parecen ser capaces de inhibir la aparición de síntomas.

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o En uno de los experimentos que demuestran lo anteriormente dicho

transformaron plantas de tabaco con RNA satélite de CMV (virus del mosaico

del pepino) bajo el control del promotor 35S rRNA del CaMV, usando el sistema

de Agrobacterium.

o Tanto las plantas transgénicas como las de control desarrollaron lesiones

cloróticas en las hojas en las que se produjo la infección.

Sin embargo, las plantas control desarrollaron síntomas de mosaico en

todas las hojas invadidas sistémicamente,

mientras que las transgénicas muestran los síntomas en las 2 o 3 hojas

invadidas pero no sistemicamente. En las posteriores no se producen

síntomas.

6. GEMINIVIRUS (No lo ha explicado)

o Desde que los virus DNA fueron caracterizados en plantas ha habido un interés

cada vez mayor en su potencial como vectores.

o Los Geminivirus son particularmente candidatos atractivos porque,

colectivamente, infectan una amplia gama de plantas, incluyendo las

monocotiledóneas y dicotiledóneas.

o Sus genomas tiene un tamaño de 2.7-3.0 Kb. Son virus de DNA circular,

pequeños y de cadena simple.

o Los miembros pueden ser divididos en dos subgrupos en base de la organización

del genoma.

Los vires africanos del mosaico de la mandioca (ACMV)

y el virus de oro del mosaico del tomate (TGMV) tienen genomas

bipartidos (DNAs A y B) y es típico de la mayoría de dicotiledóneas

infectadas.