1

TEMA 5: RESCATE DE EMBRIONES, OBTENCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE

PATÓGENOS Y AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

1. CULTIVO DE EMBRIONES. APLICACIONES PRÁCTICAS

El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento, in vitro, de un embrión,

con el fin de obtener una planta viable.

En este proceso, todos los nutrientes que forman parte del medio de cultivo son los

sustitutos del endospermo.

Tiene un doble interés científico:

- De tipo básico. Permite un estudio muy detallado de las diferentes etapas del

desarrollo y de los factores que en él están implicados.

- De tipo aplicado.

o Permite el desarrollo de embriones híbridos (interespecíficos e incluso

intergénicos) que de otro modo serían inviables y la germinación precoz, que

acorta la duración del ciclo vital de las plantas.

o y con ello la posibilidad de aumentar el número de generaciones en un

determinado tiempo, algo muy importante en los programas de mejora

vegetal.

Existen dos tipos de cultivo de embriones:

- Embriones maduros que se encuentran en semillas maduras. La finalidad de este

cultivo es:

1. Romper procesos de dormición que en muchos casos se deben a la acción de

las cubiertas.

2. Formar plantas completas directamente, sin recurrir a procesos de

enraizamiento.

3. Ser punto de partida de plantas que sean difíciles de enraizar.

Microinjertos.

4. Servir como patrón para el cultivo de meristemos, de cara a la obtención

de plantas libres de patógenos

Es un tipo de cultivo que presenta muy pocas dificultades.

Si acaso, existe la dificultad física de separarlos del resto de las estructuras de la

semilla.

2

- Embriones inmaduros. Se utiliza para impedir la muerte temprana del embrión

(aborto embrionario) que ocurre frecuentemente cuando se han llevado a cabo

procesos de hibridación interespecífica.

También para obtener semillas artificiales de híbridos que no producen semillas

viables.

Es un proceso muy difícil tanto desde el punto de vista de la manipulación (partimos

de estructuras mucho más pequeñas que el embrión maduro) como del cultivo.

Dentro de ellos podemos cultivar embriones, óvulos u ovarios.

Ilustración 1.Desarrollo del embrión desde las etapas más tempranas: preglobular y globular donde se

considera que el embrión es inmaduro. A partir del estado de corazón (que es la etapa más tardía) y ya

a partir de aquí se considera que el embrión se encuentra en la etapa embrionaria.

2. APLICACIONES DEL CULTIVO DE EMBRIONES

Obtención de híbridos a través de cruces interespecíficos (Es la más importante)

- En ocasiones puede ocurrir fertilización cruzada entre diferentes especies y se

forman embriones.

- Sin embargo, estos embriones a menudo presentan anormalidades durante el

proceso de desarrollo que conducen al aborto temprano.

3

- Cuando el embrión aborta en un estadio muy temprano es mejor cultivar el óvulo

completo en un medio base hasta que se desarrolle y de lugar a un fruto con

semillas híbridas.

- A veces es necesario formar callo a partir de embriones muy poco desarrollados y

luego regenerar planta a partir de estos callos, porque las células de estos callos ya

tienen la información genética que a nosotros nos interesa.

Producción de plantas haploides

- En algunos cruzamientos interespecíficos, en las primeras divisiones celulares que

se producen para formar el embrión, uno de los dos juegos de cromosomas se

pierde, y, como consecuencia, se forma un embrión haploide que sólo es viable si se

cultiva in vitro.

- Naturalmente, a partir de un embrión de este tipo lo que se regeneran son plantas

haploides.

- Un ejemplo es el del cruce entre dos especies del género Hordeum, al que

pertenece la cebada (vulgare). Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum. En este caso,

los cromosomas que se pierden son los de H. bulbosum y de aquí su interés (le da

más interés a Hordeum vulgare).

Acortamiento de los ciclos de mejora debido a la germinación precoz

- Si los embriones inmaduros se extraen tempranamente, antes de que se hayan

puesto en marcha los mecanismos de dormición y se cultivan in vitro, se puede

conseguir que germinen

- Con ello se consigue que el ciclo vital se acorte de modo muy llamativo.

o Ej en el girasol se ha conseguido reducir justo a la mitad (de 120-150 días a

60-75). Si cada 60 días se completa una generación, al cabo de un año se

pueden haber obtenido 6 generaciones. En este caso debemos coger los

embriones maduros después de 8-10 de haber sido polinizados.

Ensayos tempranos de viabilidad de semillas (No lo ha explicado)

Germinación de semillas de parásitos obligados y de orquídeas (No lo ha explicado)

4

Ilustración 2. Semillas de orquídea antes de germinar (el grupo de la izquierda) y en varios estadios de

germinación (a la derecha). La semilla está formada por un embrión no diferenciado en eje embrionario y

cotiledones y una cubierta que en un 96% es aire.

- Las semillas maduras de las orquídeas carecen de un embrión diferenciado. En su

lugar tienen una masa globosa y desorganizada de células. En estos casos, en lugar

de hablar de radícula, se usa el término de polo radicular y en lugar de hablar de

plúmula, se utiliza el término de polo plumular.

- Para que las semillas de las orquídeas germinen es necesaria la presencia en el

suelo de micorrizas (Hifas de determinados tipos de hongos que crecen en el suelo).

No se sabe con claridad qué compuestos son los que la orquídea recibe del hongo.

Lo que si se ha conseguido es cultivar in vitro muchas de estas semillas.

- Se ha conseguido es cultivar in vitro muchas de estas semillas. Con ello se ha

conseguido:

o Mejorar el índice de germinación. Como son muy pequeñas, y tienen muy

poca o ninguna reserva alimenticia

- Sólo una proporción muy baja logra germinar y desarrollar una

planta.

o La germinación y el desarrollo ocurren mucho más rápidamente y se acorta

la duración de los ciclos de mejora.

Ilustración 3. Embrión de orquídea.

5

- Las semillas de plantas que son parásitos obligados, como es el caso del jopo u

orobanque, carecen también de un embrión claramente formado.

- La germinación de estas semillas, exige la presencia de la planta parasitada.

o Sin embargo, mediante técnicas de cultivo in vitro se puede conseguir

que germinen en ausencia del hospedador.

Para ello, se adiciona al medio un extracto procedente de la

planta hospedadora.

Los compuestos que más comúnmente debe tomar el parásito de

la planta parasitada son hormonas como citoquininas o

giberelinas, compuestos fenólicos tales como escopoletina y

estrigol.

Servir de punto de partida para la obtención de callo

Los callos obtenidos a partir de embriones cigóticos tanto maduros como inmaduros

tienen un elevado potencial morfogenético, es decir, a partir de ese callo vamos a poder

producir cualquier tipo de órgano, cualquier tipo de planta de una forma bastante fácil.

3. FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE EL CULTIVO DE EMBRIONES

Medio de cultivo

o Los embriones maduros pueden crecer en medios bastante simples.

Por ejemplo, los de olivo crecen bien en un medio semejante al de

crecimiento pero sin hormonas (ni citoquininas ni auxinas) y con sólo 10 g de

sacarosa por litro.

o Los embriones inmaduros tienen, sin embargo, requerimientos más complejos y

además varían con el grado de inmadurez. Los medios MS y Gamborg B5 son los más

usados para el rescate de embriones. Los suplementos requeridos aparte, dependen

del estado de desarrollo del embrión.

o En unos casos es más favorable la presencia de NH4+ y en otros la de NO3

-.

o En la germinación de las semillas de orquídea es muy importante la presencia de Fe.

6

Ilustración 4. Imagen que muestra la importancia de la presencia de Fe en el medio de germinación y crecimiento

de las semillas de orquídea. A la izquierda sin Fe y a la derecha con 25 mg/l de EDTAFeNa.

Raghavan identificó 2 fases en el estadío del embrión:

o En la fase heterotrópica el embrión joven o proembrión depende del endospero para su

crecimiento y requiere medios complejos:

Aminoácidos, particularmente asparragina y glutamina como mínimo.

Varias vitaminas y extractos naturales como leche de coco o hidrolizado de

caseína.

La sacarosa no sólo se adiciona como fuente de carbono, sino también para

mantener un potencial de solutos óptimo. Se usan concentraciones de entre 8 –

12%. Pueden adicionarse o no otros azúcares junto a la sacarosa ya que éste es

el azúcar de elección en el rescate de embriones.

Con respecto a los reguladores del crecimiento, en estadíos muy jóvenes del

embrión se necesitan niveles moderados de auxinas y bajos de citoquininas y

elevada concentración de sacarosa. Tras dos semanas hay que cambiar el medio

porque los embriones dejan de crecer. La composición de este segundo medio

sería niveles bajos de sacarosa, moderados de citoquinina y bajos de auxina, es

decir, justo lo contrario.

o El segundo estado de desarrollo del embrión es la fase autotrófica, que usualmente

comienza en el estado de corazón tardío del embrión.

El embrión ya es capaz de sintetizar por sí mismo las sustancias que necesita

para su crecimiento tomando los nutrientes del medio que necesita para ello.

A partir de este estadío, se utilizará un medio de cultivo simple con un

porcentaje de sacarosa de un 2 – 3%.

7

Fuente de carbono y potencial de solutos del medio de cultivo (No lo ha explicado)

Extractos procedentes de plantas (No lo ha explicado)

Ilustración 5. Imagen que muestra la importancia de la presencia de peptona en el medio de germinación y

crecimiento de las semillas de orquídea. A la izquierda sin peptona y a la derecha con 2 g/l de esta sustancia

Temperatura y luz

o Los requerimientos de temperatura y luz varían según las especies en función de

los requerimientos de sus parentales. En general, los cultivos se inician a una

temperatura elevada, de entre 25 – 30ºC pero en especies que exhiben dormancia

es necesario un tratamiento previo con frío (vernalización).

o La oscuridad es necesaria en etapas iniciales para facilitar la germinación durante 1

o 2 semanas, después se pasa a la luz.

4. OBTENCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE PATÓGENOS

o La mayoría de las plantas cultivadas, sobre todo las que se han reproducido

vegetativamente, están infectadas de modo sistémico por uno o más patógenos

(hongos, virus, bacterias, etc).

o Es muy difícil, y a veces imposible, eliminar bacterias, hongos o virus internos

de las plantas. Se pueden controlar con antibióticos y fungicidas pero suelen

resultar tóxicos para las plantas.

o Por lo que respecta a los virus, existen productos que limitan su multiplicación

(antivirales), pero resultan excesivamente caros para su utilización comercial.

8

o El más eficaz hasta la fecha es la ribavirina (1- -D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-

3-carboxamida) que se comercializa con el nombre de virazol.

o A pesar de la dificultad, si se eliminan los patógenos los resultados pueden ser

muy llamativos:

o se han descrito incrementos de cosecha de hasta un 300% al sustituir

plantas infectadas por otras libres de patógenos.

o Otro gran interés de producir estas plantas libres de patógenos es el hecho de

que pueden exportarse de un país a otro (plantas certificadas).

5. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO

a) Termoterapia

o Consiste en aplicar altas temperaturas a los explantos contaminados. Así se

puede impedir o ralentizar la replicación de determinados virus, bacterias,

hongos… pero debe utilizarse una temperatura que permita la supervivencia

del explanto.

o Se debe seleccionar una temperatura y un tiempo de tratamiento

o Se suelen utilizar tªs entre 35-40ºC durante intervalos de unos minutos a

varias semanas.

i. Un extremo es el caso del virus de la patata X que necesita 2-3 meses

continuados de tratamientos a 35ºC.

o En ocasiones, cuando el tratamiento resulta muy agresivo para la planta es

conveniente alternar días de elevada temperatura con temperaturas normales.

o Se obtienen mejores resultados si a la vez se mantienen humedad e iluminación

elevadas en la cámara de cultivo.

¿A qué tipo de material se le aplica el tratamiento?

o Lo que se suele hacer es tomar un vástago o explanto de la planta infectada,

introducirlo in vitro.

o Este explanto lo llevamos a la cámara de cultivo y lo sometemos a termoterapia y

posteriormente se aíslan las yemas que hayan podido crecer y se cultivan en un

nuevo medio de cultivo.

o La desventaja que tiene esta técnica es que una pequeña proporción de plántulas no

sobreviven.

o La termoterapia se combina normalmente con otros tratamientos tales como cultivo

de meristemos y microinjerto.

9

b) Cultivo de meristemos

o En los meristemos o no hay virus o éstos están en muy bajas concentraciones. ¿Cuál

es la razón?

o Los virus se suelen mover en la planta a través del sistema vascular, y este

no está desarrollado en los meristemos.

o El movimiento del virus célula-célula, a través de plasmodesmos, es muy

lento. Por tanto, las nuevas células que se están originando por mitosis se

infectarán con dificultad. En algunos casos se duda incluso de que existan

estas conexiones a través de plasmodesmos en meristemos.

Ej.: En el caso del virus del mosaico del tabaco y del virus X de la

patata, se ha visto que estos virus avanzan 1-2 cm/hora a través del

tejido vascular y sin embargo, de 5-15 micras/hora a través de

plasmodesmos.

o La división celular es muy elevada en meristemos y por tanto la capacidad

de replicación del ADN se está utilizando en la división de células de la

planta en detrimento de la multiplicación de los virus.

o Los sistemas de inactivación vírica que existen en la planta están más

concentrados en las células meristemáticas.

En este sentido, se ha sugerido que las altas concentraciones de

citoquininas y auxinas desempeñarían este papel.

También de que los virus necesitan de algunos enzimas que no se

expresan en las células meristemáticas.

Ninguna de estas dos teorías se ha podido demostrar.

¿A qué nos referimos cuando hablamos de meristemos?

o Como lo normal es que se utilicen meristemos apicales de tallo, nos referiremos a

ellos. Hay que distinguir entre.

o Meristemo. El meristemo apical del tallo es la porción más distal del ápice

del tallo. Suelen medir aproximadamente 0.1 mm de diámetro y entre 0.25 y

0.30 mm de altura.

o Ápice meristemático. Si además del meristemo se toman entre 1 y 3

primordios foliares, tendremos un ápice meristemático. Este ápice mide

hasta 0.5 mm de altura.

o Ápice caulinar. Es la porción más distal del tallo y puede tener hasta 1 mm

de altura. Incluye el meristemo pero también muchos primordios foliares.

o Desde el punto de vista de la obtención de plantas libres de virus, lo mejor es

utilizar meristemos

o pero desde el punto de vista de la manipulación y de la capacidad de

regeneración, lo mejor son los ápices caulinares.

10

c) Microinjerto

o El microinjerto de ápices caulinares in vitro para la obtención de plantas de naranjo

libres de virus:

o Consiste en extraer el ápice caulinar de la variedad a injertar, constituido

por el meristemo apical, y primordios foliares y luego sembrarlo sobre la

superficie decapitada de epicotilo de un embrión de 2 semanas de edad.

o En muchas ocasiones es muy difícil conseguir que los tallos enraícen. Para evitar

este problema, lo que se puede hacer es injertar los meristemos sobre patrones

cultivados in vitro a partir de semilla.

o Esta técnica ha dado muy buenos resultados en cítricos

Ilustración 6. Microinjerto de ápices meristemáticos. (A) La flecha señala un ápice meristemático de Citrus sinensis

injertado sobre un patrón de 2 semanas de edad. (B) Corte del punto de unión entre el ápice meristemático y el

patrón 5 días después del injerto. Se observa la formación de callo en el punto de unión

d) Eliminación de virus a partir de callos y protoplastos

o Plantas de tabaco infectadas con MTV han perdido el virus a través de sucesivos

repicados.

o Dos pueden ser las razones de que esto ocurra:

o La replicación del virus no es tan rápida como la capacidad de multiplicación

de las células y por ello algunas no se infectan

o Algunas células adquieren resistencia al virus o simplemente se seleccionan

células que en el explanto inicial ya eran resistentes

o También se han conseguido plantas libres de virus a partir de protoplastos

obtenidos de plantas infectadas.

o La gran limitación que tiene cualquiera de estos dos métodos es que se produce

variación somaclonal en una alta proporción.

11

e) Quimioterapia

o Consiste en utilizar sustancias químicas para eliminar los patógenos.

o El uso de antivirales sería la resolución definitiva pero hasta ahora no se ha

encontrado ninguno que sea realmente efectivo.

o Algunas sustancias químicas disminuyen la replicación de los virus en las plantas

durante un tiempo, pero una vez que se suspende el tratamiento vuelven a crecer otra

vez los virus.

o Han sido evaluados varios métodos. El que mejores resultados ha dado ha sido el

virazol o ribavirina.

f) Electroterapia

o El método consiste en aplicar corriente eléctrica a las yemas vegetales por un período

de tiempo variable dependiendo de la planta que se trate.

o Ej.: Esta técnica se ha utilizado para eliminar el virus del mosaico del almendro y para

ello se sometieron los brotes a 500 voltios por tiempo variable.

o Los mejores resultados se obtuvieron cuando se pusieron 500 voltios durante 5

minutos y con 20 minutos parece que se eliminaron todos los virus.

o También se ha utilizado con la caña de azúcar, en el virus de la banana en estos casos

se ponen de 5-30 voltios por un período de 5 minutos.

o La eficiencia del tratamiento es aproximadamente del 3-70%, dependiendo de la planta.

g) Métodos combinados

Casi todos los protocolos que se utilizan son una combinación de las técnicas que acabamos

de comentar.

Formación de órganos adventicios seguida del cultivo de meristemos

Algunos órganos adventicios formados in vitro a partir de explantos procedentes

de ejemplares infectados carecen de virus.

Brotes adventicios formados a partir de hoja de tabaco, petunia, col o vid.

Posteriormente se toman los meristemos de esos órganos y se cultivan.

Qquimioterapia con cultivo de meristemos

Se introduce la planta en un medio de cultivo con virazol. Se aíslan los brotes que crecen y

se vuelven a cultivar en otro medio. Tiene un gran inconveniente y es que el virazol es muy

citotóxico tanto para el virus como para las células de la planta.

12

En patata se ha conseguido eliminar algunos virus cultivando segmentos nodales en

medio MS con ribavirina 0.8 mM en condiciones de 4 h de luz a 30º C y 4 h de

oscuridad a 31º C durante 28 días.

6. PRUEBAS PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE PATÓGENOS

Indexaje de cultivos (Actividad)

Pruebas inmunológicas para detectar patógenos (Actividad)

Bioensayos

o Consisten en la obtención de extractos procedentes de la planta problema y su

aplicación a plantas muy sensibles al virus en cuestión.

Si al cabo de un cierto tiempo la planta sensible muestra síntomas de

enfermedad, es que el extracto problema estaba infectado.

Para facilitar la penetración del virus, a la planta sensible al virus se le adiciona

algún abrasivo que pueda lesionar las paredes celulares

o Con este método sólo se puede certificar la ausencia de aquéllos virus de los que se

han efectuado pruebas específicas

o Eliminación de otros tipos de patógenos

o El cultivo de meristemos, aunque diseñado originalmente para la eliminación de virus,

se ha comprobado que es capaz de eliminar también bacterias, micoplasmas y hongos.

7. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

o Los protoplastos son células vegetales desprovistas de sus paredes celulares.

Representan un caso muy interesante a la hora de estudiar células vegetales

individuales ya que no tienen continuidad citoplasmática con las células vecinas.

o Los protoplastos pueden ser útiles para:

Estudios bioquímicos relacionados con mecanismos comunicación celular.

Siempre es el paso previo a la introducción de ADN foráneo en una

célula para producir híbridos interespecificos por fusión celular

o El factor más importante a la hora de conseguir buenos resultados es la

adecuada selección del tejido de partida

13

7.1 Aislamiento de protoplastos

El explanto inicial se incuba con mezclas de enzimas de tipo celulasa, pectinasa y

hemicelulasa de origen fúngico.

El medio que se vaya a utilizar para eliminar la pared celular debe ser hipertónico por

dos razones:

Es el único medio de garantizar que no es hipotónico pues en su caso, entraría agua

a la célula y terminarían por estallar.

La hipertonicidad hace que la célula se plasmolice y así se rompan las conexiones

entre células a través de plasmodesmos.

Se suele utilizar soluciones de glucosa, fructosa, galactosa, manitol o

sorbitol (azúcares o alcoholes derivados de los azúcares).

A veces se utilizan sales para disminuir el potencial hídrico del medio, como

Cl2Ca ya que el Ca contribuye a mantener la integridad de las membranas.

Veamos algunos de los aspectos de interés relacionados con el aislamiento de

protoplastos

7.2. Digestión enzimática de las paredes celulares

o Dos son los enzimas que deben estar siempre presentes: celulasas y pectinasas.

Las primeras porque degradan la pared celulósica primaria.

y las segundas porque destruyen la lámina media que separa las paredes

celulares de las células vecinas (constituida por pectina y de aspecto

gelatinoso).

o Algunos tejidos requieren además la presencia de hemicelulosas. Aunque las

enzimas que se venden comercialmente están purificadas, contienen

contaminaciones de proteasas y nucleasas que pueden ser de utilidad para la

digestión de proteínas de la pared celular.

o La digestión de las paredes se lleva a cabo bajo agitación suave.

Para efectuarla, los enzimas se disuelven en el medio de cultivo. En

casos especiales, y con mezclas enzimáticas específicas, el

procedimiento puede durar tan sólo 30 minutos.

14

¿Cuáles son los factores más importantes del medio?

o Dos factores muy importantes para conseguir la división celular son los iones Ca++ y

los niveles de nitrógeno amoniacal.

o El Ca++ tiene efecto positivo sobre el cultivo. Su concentración a valores

elevados comprendidos entre 14 y 40 mM:

Promueve la división celular

Favorece la sincronización del ciclo celular

Disminuye los procesos de agregación

Reduce el oscurecimiento de los protoplastos durante los primeros

estadios del cultivo.

o El nitrógeno amoniacal normalmente se diluye a la mitad o a ¼.

aunque es esencial para promover la división celular, tiene efecto

negativo sobre los protoplastos.

o Así pues una vez que los protoplastos han regenerado la pared celular y comienzan

a dividirse, se deben restablecer los niveles habituales de Ca y nitrógeno amoniacal

¿Cuáles son los factores más importantes del medio?

Casi siempre se necesitan auxinas y citoquininas.

En ocasiones es necesaria la adición de PVP u otros antioxidantes

La presencia de un compuesto que mantenga bajo el potencial hídrico del medio es

esencial para el cultivo de los protoplastos.

Un factor muy importante es la densidad de siembra. Lo normal es cultivar entre

104 y 105 protoplastos/ml

Si lo que se pretende es seguir el desarrollo de células individuales que hayan sido

transformadas, se deben cultivar a densidades muy bajas: de entre 100 y 500

protoplastos/ml.

8. MANIPULACIÓN GENÉTICA DE PROTOPLASTOS

a) Fusión de protoplastos

o Los protoplastos viables normalmente regeneran las paredes celulares, pero

mientras tienen sus membranas plasmáticas desnudas se pueden fusionar.

o Como resultado de la fusión de protoplastos se forman células que tienen dos o

más núcleos.

Si los que se fusionan proceden de diferentes líneas parentales se

denominan heterocariones,

15

si se han originado a partir de células genéticamente idénticas reciben

el nombre de homocariones.

Una vez que se ha producido la fusión de los núcleos podemos hablar de

híbridos

o La fusión de protoplastos permite que en la nueva célula haya orgánulos

citoplasmáticos de ambos parentales (a diferencia de la reproducción sexual).

o Los genomas mitocondriales se pueden recombinar pero los genomas

cloroplastidiales normalmente no lo hacen

o La fusión de protoplastos es un fenómeno que en ocasiones ocurre de modo

espontáneo, sobre todo cuando los protoplastos proceden de células que se

encontraban en división activa.

o La fusión inducida se lleva a cabo mediante procedimientos químicos o

eléctricos.

o En ambos casos la membrana plasmática se desestabiliza de modo

temporal, lo que da como resultado la formación de poros.

o Las moléculas lipídicas orientadas al azar en los poros se alinean y

forman puentes de membrana entre los protoplastos adyacentes, con la

consiguiente unión de los citoplasmas de dichos protoplastos

16

Fusión de protoplastos. Fusión química.

Para inducir la fusión de protoplastos se necesita una sustancia que la facilite: estas

sustancias reciben el nombre de fusógenos. Tienen que ocurrir tres fenómenos:

1. Aglutinación. Los protoplastos se disponen muy cerca unos de otros. Para ello es

necesario que se neutralicen las cargas negativas superficiales de las membranas

plasmáticas. Esto se puede conseguir con:

o pH elevado e iones Ca++. Por ejemplo, una alta concentración de

Cl2Ca · 2H2O elimina por completo las cargas negativas de la superficie de

los protoplastos.

o Mediante tratamiento con polietilénglicol. El PEG es un polímero de alto

PM. Su carga, levemente negativa, le permite establecer enlaces por

puentes de hidrógeno con moléculas de agua, proteínas, carbohidratos, etc

y sirve de puente de unión entre protoplastos que se encuentren próximos.

o Además, PEG puede unirse a cationes (de Ca u otros) y estos cationes a su

vez sirven de puente de unión entre cargas negativas de proteínas o

fosfolípidos de protoplastos vecinos.

o El empleo de PEG da lugar a la producción de una gran cantidad de

heterocariones binucleados debido a que el número de protoplastos que se

fusionan es de sólo 2 ó 3 frente a la gran cantidad que se suelen unir

cuando se emplean iones Ca++. La concentración que se suele emplear es 15 -

45% de PEG durante 15 a 30 min. Pasado el tiempo de tratamiento, los

protoplastos se lavan para quitar el PEG con medio de cultivo.

o Otros posibles fusógenos son: N03Na, N03K, PEG + DMSO

(Dimetilsulfóxido), alcohol polivinilico, sulfato de dextrano, policationes

tales como poli-L-lisina, etc…

2. Fusión localizada de las membranas plasmáticas.

o Lo que da lugar a la formación de puentes citoplasmáticos entre los

protoplastos.

o Cuando se lavan los protoplastos y se elimina PEG y/o los cationes, las

cargas positivas y negativas de los protoplastos pueden interaccionar entre

si y facilitar la unión entre ellos.

o Sea cual sea el fusógeno empleado, las bajas temperaturas (15 ºC) mejoran

los resultados en la etapa de aglutinación. Sin embargo, para la etapa de

fusión son mejores las altas temperaturas, entre 30 y 37 ºC.

o En la práctica, todo el procedimiento se lleva a cabo a 24 ºC.

17

3. Fusión completa de las membranas plasmáticas.

o Los puentes citoplasmáticos se expanden hasta dar homocariones o

heterocariones esféricos y se cierran los puentes citoplasmáticos que

constituyen el protoplasto.

La fusión química presenta algunos inconvenientes tales como:

o Los fusógenos son tóxicos para algunos protoplastos.

Por ejemplo, el PEG produce destrucción de mitocondrias

o Normalmente se fusionan más de dos células, produciendo agregación múltiple.

o El fusógeno se debe eliminar antes del cultivo y esto es complicado.

o Con la fusión química se suele obtener sólo un 1% de fusión celular frente al

20% o más que se consigue con otros métodos como la electrofusión

Fusión de protoplastos. Electrofusión. (Actividad)

9. RESULTADOS DE LA FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

o Mientras que con los métodos de ingeniería genética se transfiere uno o muy

pocos genes, la fusión de protoplastos permite transferir una gran cantidad de

genes desde una célula donadora hasta otra receptora.

o Esto es de gran interés agronómico ya que cantidad y calidad de la cosecha, o

resistencia al estrés están codificados por un gran número de genes. De

manera que la mejora genética de este aspecto sólo va a poderse llevar a cabo

mediante fusión de protoplastos.

Híbridos simétricos:

o Son aquéllas plantas híbridas en las que están presentes, de modo completo, los

dos genomas nucleares de las células parentales. Ocurre en muy pocos casos

pero en ocasiones, particularmente con Solanum tuberosum, se ha conseguido.

18

Híbridos asimétricos:

o Son aquéllos híbridos en los que está presente, de modo completo, uno de los

dos genomas parentales mientras que el otro sólo está en parte.

o Suelen ser más interesantes que los híbridos simétricos, ya que estos suelen

llevar junto con los genes deseables, algunos de nulo interés o incluso

perjudiciales.

o Los cromosomas que se mantienen completos son los del parental que tiene un

ciclo celular más breve.

o Un método para conseguir híbridos asimétricos consiste en aplicar radiaciones

X a los protoplastos de las células donadoras.

Este tratamiento fragmenta los cromosomas, por lo que terminan por

eliminarse. Sin embargo, alguno de los fragmentos se pueden integrar en

el genoma de la célula receptora y modificarla.

Híbridos:

o Son aquéllos en los que los genomas nucleares parentales de ambos están de modo muy

desequilibrado. La mayoría de los genes proceden de uno de ellos pero hay genes

extranucleares (cloroplastidial y mitocondrial) de ambos parentales

o En la fusión celular de los gametos sexuales para formar un cigoto, todos los

cloroplastos y las mitocondrias proceden del gameto femenino.

o Los cíbridos y los híbridos asimétricos son los productos más interesantes de la fusión

de protoplastos. Hay que recordar que muchos fenómenos tales como resistencia a

herbicidas y esterilidad masculina se deben a genes extranucleares.

Los principales métodos para la obtención de cíbridos son los siguientes:

o Fusión de un protoplasto normal con otro al que se le haya eliminado el núcleo

(citoplasto).

19

o Fusión de un protoplasto normal con otro que contenga un núcleo inviable. El

tratamiento con rayos X parece que no afecta a los genomas extranucleares

probablemente porque hay una gran cantidad de copias de estos en cada célula.

o Eliminación de uno de los núcleos tras la formación del heterocarión

o Eliminación selectiva de uno de los juegos de cromosomas en un estadio posterior

10. INCONVENIENTES DE LA FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

Como inconvenientes más claros citaremos los tres siguientes:

o Los productos que se obtienen de la fusión de protoplastos son a menudo estériles,

producen plantas con malformaciones o son inestables, es decir la descendencia que

producen no es híbrida.

o No siempre es fácil disponer de métodos eficaces que permitan la selección de los

híbridos.

o Los procedimientos de producción y cultivo de protoplastos conducen a una elevada

inestabilidad genética, de modo que es posible que el protoplasto que se fusione no sea

exactamente igual que la célula parental.