BLOQUE A

RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

EN PARASITOLOGÍA

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INTRODUCCIÓN

El laboratorio de microbiología clínica desempeña un papel importante en el diagnóstico y control de las enferme-dades infecciosas. En este manual nos vamos a centrar en el diagnóstico de las enfermedades causadas por parásitos.

Las enfermedades parasitarias se encuentran distribuidas a nivel mundial con mayor o menor prevalencia en función de la distribución geográfica de las especies de parásitos responsables de las mismas. En los países desarrollados la incidencia de las parasitosis ha ido aumentando principalmente a causa del mayor número de viajes internacionales y otros fenómenos como la inmigración. Por esto, todos los laboratorios clínicos deberían contar con personal cualificado para el diagnóstico de estas enfermedades ya que, en mayor o menor medida dependiendo del área de población que atiendan, van a tener que enfrentarse al diagnóstico de este tipo de infecciones.

El objetivo del estudio parasitológico de una muestra clínica es el de proporcionar información sobre la presencia o ausencia de patógenos, o de sus productos, que pudieran participar en la enfermedad de un paciente.

El conocimiento de la microbiología clínica exige cono-cer no tan solo las diferentes clases de patógenos existentes, sino también las infecciones que pueden estar asociadas a determinadas exposiciones de riesgo.

1. RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS EN PARASITOLOGÍA

Fernando Cobo Martínez, José Serrano Sánchez y Mª Dolores Enciso Rivilla

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Medicina tropical y parasitología. enferMedades infecciosas iMportadas

Los microorganismos con relevancia clínica que se deben identificar e informar varían según el origen. En este manual nos vamos a central en el diagnóstico de los parásitos intes-tinales y extraintestinales.

El proceso diagnóstico microbiológico es secuencial. Comienza por un problema clínico o epidemiológico que hace necesaria la demanda de una o varias pruebas, toma y transporte adecuado de las muestras a investigar, información de los datos demográficos y clínicos del paciente, recepción en el laboratorio, procesamiento, análisis e interpretación de los resultados y un informe final que, una vez recibido en el punto de origen de la petición, ayudará a tomar decisiones clínico-epidemiológicas.

La información que el laboratorio de microbiología puede proporcionar al responsable del paciente dependerá, en gran medida, de que la muestra sea adecuada, de su calidad, modo de transporte y de la información clínica que la acompañe. Por ello es importante conocer que muestras son las adecuadas para descartar una parasitosis ante un determinado cuadro clínico. El clínico debe estar informado de qué técnicas diag-nósticas realiza su laboratorio de forma sistemática, y cuales solo cuando se solicitan expresamente. Existen muchos tipos de análisis de laboratorio para diagnosticar las enfermedades parasitarias. Cada tipo de análisis seleccionado dependerá de los signos y la sintomatología del paciente, que hará que el clínico se decante por cada uno de ellos.

En este manual se recoge el procesamiento de muestras de heces así como las distintas técnicas que se pueden llevar a cabo en extensiones sanguíneas para la búsqueda de parásitos. Los laboratorios de microbiología diagnóstica de los países desarrollados siguen dependiendo en gran medida del examen microscópico de las muestras, método de limitada sensibilidad y muy dependiente de la experiencia del microscopista.

MUESTRAS FECALES

El estudio de las muestras fecales nos permite detectar la presencia de protozoos y larvas o huevos de helmintos. Para obtener un buen resultados en un examen parasitológico se deben tener en cuenta diferentes aspectos, como por ejemplo:

Recolección, tRanspoRte y pRocesamiento de muestRas en paRasitología

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• El empleo de técnicas adecuadas según el parásito del que se sospeche.

• La recogida de la muestra debe hacer durante tres días diferentes debido a que la eliminación de huevos o larvas no es constante, por lo que con el estudio de una sola muestra podríamos obtener un diagnóstico equivocado.

• Un correcto transporte de la muestra (está indicado reco-ger las muestras de heces en material de plástico, nunca en material absorbente como puede ser el papel).

• Las muestras se deben procesar con rapidez.• Se debe realizar un estudio macroscópico de la muestra,

ya que a veces se pueden observar estructuras visibles a simple vista, como por ejemplo las proglótides de las tenias, gusanos adultos de Enterobius vermicularis o de Ascaris lumbricoides.

• La observación al microscopio debe ser ordenada y sis-temática.

• Se debe tener en cuenta la consistencia de la muestra (si es diarreica o no) y escoger la parte de la misma que sea más adecuada para el estudio.

• La experiencia del observador en una parte muy impor-tante en el estudio parasitológico ya que en las muestras fecales existen numerosas partículas, llamadas artefac-tos, que pueden ser confundidas con huevos o larvas de parásito. A continuación describiremos las técnicas de laboratorio más utilizadas en el estudio de los parásitos en heces, centrándonos en el estudio microscópico de la muestra.

Como hemos comentado al inicio de este libro, tratamos de reunir la información necesaria para llevar a cabo el análisis parasitológico en pequeños laboratorios, es decir, de realizar una introducción al análisis parasitológico. Por este motivo no vamos a profundizar en aquellas técnicas que requieren material especial (microscopios de fluorescencia, centrífugas especiales, etc.) ya que este tipo de análisis se suelen realizar en los laboratorios de referencia, sino que vamos a describir las técnicas de diagnóstico más comunes mediante las cuales podemos confirmar una sospecha clínica.

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Estudio microscópico de la muestra Existen diferentes métodos de estudio en el análisis de

heces, algunos de los cuales incluyen colorantes especiales.Examen en frescoEste tipo de examen se utiliza para la observación de las

formas móviles de los protozoos intestinales, lo que conocemos como trofozoitos. En este estudio es muy importante realizar el procesamiento lo más rápidamente posible desde la obtención de la muestra ya que de otra manera la muestra se seca y los trofozoitos perderían la movilidad. El tiempo recomendado para llevar cabo un análisis satisfactorio se estima entre 20 y 30 minutos tras su emisión. También es importante rechazar aquellas muestras que hayan sido mantenidas o guardadas en nevera. Para realizar el examen en fresco de la muestra es aconsejable tener en cuenta la consistencia de las heces, por lo que diferenciaremos entre heces de consistencia líquida o diarreica y heces de consistencia normal.

• Heces de consistencia líquida o diarreica. Para el estudio de las heces diarreicas debemos colocar un gota de la muestra entre un porta y un cubreobjetos y observarla al microscopio utilizando el objetivo de 40X.Las estructuras que observaremos son, principalmente formas móviles: - Trofozoitos de Amebas - Trofozoitos Giardias - Trofozoitos de Balantidium - Sangre y pus

• Heces de consistencia normal. Cuando la consistencia de las heces es normal, debemos mezclar una pequeña can-tidad de heces con una gota de suero fisiológico sobre un portaobjetos. Con una varilla debemos homogeneizar la mezcla lo máximo posible. La observación al micros-copio tenemos que hacerla con el objetivo de 10X y con el de 40X. Con el objetivo de 10X podremos visualizar huevos y larvas de Helmintos. Con el objetivo de 40X, y si además añadimos una gota de Lugol, observaremos: - Quistes de Amebas - Quistes de Giardias - Quistes de Balantidium - Levaduras - Isospora y otros

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Técnicas de concentración de hecesEste tipo de técnicas se aplicarán cuando el número de

parásitos presentes en la muestra pueda ser limitado, ya que su objetivo es aumentar la sensibilidad de análisis parasitoló-gico Entre las diferentes técnicas de concentración de heces existentes vamos a mencionar la Técnica de Ritchie, el Método de Allen and Ridley y la Técnica de Kato-Katz.

Técnica de Ritchie Está técnica también es conocida como técnica de formol

éter y su uso está estandarizado en la mayoría de los labo-ratorios de Parasitología. La técnica se basa en la separación de las heces en dos partes, conteniendo una de ellas los pa-rásitos presentes en la muestra y en la otra los restos fecales no útiles para nuestro estudio. Esta técnica está indicada para la investigación de huevos y larvas de helmintos, así como quistes de protozoos. La técnica consiste:

• En un mortero o en un tubo de boca ancha, tenemos que mezclar aproximadamente 1 gramo de heces (o una por-ción de muestra de 1 cm de diámetro) con 10 ml de For-mol al 10%. Con ayuda de una varilla debemos remover la mezcla hasta obtener una consistencia homogénea.

• Dejamos reposar la muestra durante 10-15 minutos. • A continuación, debemos colar la muestra con ayuda de

un embudo, al cual hemos colocado previamente una gasa extendida que nos ayude a filtrar, en un tubo de cen-trífuga.

• Centrifugar y eliminar el sobrenadante • Añadimos ahora 5 ml de alcohol tamponado a ph7 y agi-

tamos. • Añadimos 5 ml de solución de éter, tapamos rápidamente

y agitamos con fuerza durante 1 minuto (con precaución). • Destapamos el tubo y lo centrifugamos a 2000 rpm du-

rante 5 minutos.• Al finalizar este tiempo, decantamos el sobrenadante y

limpiamos las paredes superiores del tubo con un esco-billón para que los restos fecales que están adheridos no contaminen el sedimento.

• Para terminar, debemos observar al microscopio el sedi-mento obtenido tras la centrifugación. Para ello, lo dilui-

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mos con unas gotas de suero y lo examinamos al micros-copio a 10X en un principio, y posteriormente a 40X.

• Para optimizar la visualización al microscopio podemos añadir Lugol al portaobjetos en el que depositemos la muestra.

Método de Allen and RidleyEste método es muy parecido al anterior, de hecho los

tres primeros pasos son iguales. Una vez coladas las heces, se debe añadir 3 ml de éter etílico y una vez tapado el tubo, agitar vigorosamente. A continuación lo centrifugamos a 2000 rpm durante 5 minutos y después decantamos el sobrenadante. Para la observación al microscopio podemos diluir el sedimento con un par de gotas de suero fisiológico.

Técnica de Kato-Katz Esta técnica es adecuada para el estudio de helmintos

así como para clarificar un sedimento demasiado espeso. El material que necesitamos para llevar a cabo esta técnica es:

La solución de Kato, que está constituida de:• Glicerina (100 ml).• Agua destilada (100 ml). • Verde malaquita al 3% (1 ml).Papel celofán en trocitos de aproximadamente 2x4 cm. Estos trocitos se introducirán en un recipiente que contiene

la solución de Kato durante 24 horas antes de ser utilizados. Los pasos a seguir a continuación son:

• Realizar una extensión de la muestra de heces sobre un portaobjetos intentando que la extensión sea moderada-mente extensa.

• Colocar encima de la extensión un papelito impregnado de la solución de Kato y eliminar las burbujas de aire que se puedan generar.

• Dejamos la preparación bajo la acción de calor ligero (por ejemplo debajo de la luz de un flexo) durante 10 minutos.

• La observación al microscopio se realizará al cabo de 20-30 minutos y con el objetivo de 10x

Técnicas de concentración de heces por flotaciónMétodo de Willis (concentración por flotación de la muestra

fecal)

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Este método está recomendado para la investigación de protozoos y helmintos. La técnica consiste en:

• Extraer una muestra de heces de aproximadamente el tamaño de un garbanzo y colocarla en un tubo de boca estrecha

• Añadir una pequeña cantidad de solución de cloruro só-dico a saturación para disolver la muestra. Una vez di-suelta la muestra debemos llenar el recipiente hasta el borde con la misma solución.

• Colocamos un porta sobre el extremo del recipiente de tal forma que contacte con el líquido intentando no dejar burbujas de aire entre porta y líquido.

• A los 15-20 minutos, retiramos el porta y colocamos un cubre para poder observarlo al microscopio.

El principio de esta técnica se basa en que los huevos de helmintos tienen un peso específico menor que el de la solución saturada de cloruro sódico por lo que tienden a subir y pegarse en el portaobjetos.

Métodos de fijación de hecesMétodo MIF (Mertiolato/Yodo/Formol) Esta técnica es útil para f ijar formas vegetativas de

protozoos a la misma vez que se tiñen, lo que facilita la vi-sualización al microscopio. Los reactivos que utilizamos son dos, la solución de mertiolato/formol y la solución de yodo.

La solución de mertiolato/formol está compuesta por:• Glicerina (5 ml) - formol 37% (25 ml)• Tintura de mertiolato (200 ml)• Agua destilada (250 ml) La composición de la solución de yodo es: • Yodo (5 g)• Yoduro potásico (10 g)• Agua destilada (100 ml)La solución MIF se obtiene mezclando 9,40 ml de solución

de solución de mertiolato con 0,60 ml de solución de Yodo. Lo más cómodo es preparar tubitos de la solución MF que contengan 4,7 ml cada uno. Se deben conservar en oscuridad y el tiempo de estabilidad es de un mes aproximadamente. Con la solución de yodo hacemos lo mismo, preparamos tubitos que contengan 0,30 ml cada uno.

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• Mezclamos el contenido del tubito MF con el del tubito que contiene la solución de yodo.

• Con ayuda de una espátula extraemos una muestra de he-ces del tamaño aproximado de un garbanzo y lo introdu-cimos en un tubo que contenga la mezcla realizada en el paso 1.

• Homogeneizamos la muestra correctamente y lo agita-mos. Dejamos el tubo en reposo durante media hora antes de iniciar el estudio microscópico.

A continuación observaremos la mezcla al microscopio, y si existen protozoos en la muestra, los observaremos teñi-dos con una tonalidad verde-amarillenta intensa debido a la solución MIF

Método de formol Para realizar esta técnica necesitamos solución acuosa

de formol al 10%. Debemos preparar tubos individuales que contengan 5 ml de esta solución.

• Cogemos una muestra de heces de aproximadamente el tamaño de un garbanzo y lo introducimos dentro de uno de los tubos que contiene 5 ml de solución de formol.

• Homogeneizamos la muestra lo máximo posible. A partir de esta mezcla podemos realizar técnicas de con-

centración como las de formol-éter y tinciones permanentes.

MUESTRAS ENTÉRICAS NO FECALES

Algunos parásitos como Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis habitan el duodeno y yeyuno, por lo que pueden ser necesarias muestras de contenido duodenal para demostrar su presencia.

Puede prepararse un montaje húmedo con solución salina a partir del material aspirado.

El contenido duodenal también puede examinarse mediante la prueba de la cuerda. Consiste en una cápsula de gelatina con una cuerda de nailon enrollada. La cápsula es deglutida y el peristaltismo la lleva hasta el duodeno (4-6 horas). Tras ese tiempo se extrae la cuerda y el moco con bilis adherido se utiliza para preparar montajes húmedos y frotis teñidos.

La sospecha de oxiuriasis (Enterobius vermicularis) se detecta mejor con la cinta adhesiva de celulosa (técnica de Graham). Esta cinta se aplica, en su cara adhesiva, a los

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pliegues perianales del paciente. Las muestras recolectadas a primera hora de la mañana son las óptimas para detectar los huevos. Esta cinta se coloca con el lado adherente hacia abajo sobre un portaobjeto y se examina microscópicamente.

En algunos casos de infección por Entamoeba histolytica puede ser necesario el examen histológico de una biopsia de sigmoides, si los exámenes de la materia fecal son repetida-mente negativos.

MUESTRAS DE ESPUTO

A veces, los estadios larvares de uncinarias, A. lumbri-coides y S. stercoralis, o los huevos de P. westermani pueden detectarse en muestras de esputo. Suele ser suficiente con la observación de montajes directos con solución salina. Si el esputo es espeso o mucoide, puede añadirse una cantidad igual de N-acetil L-cisteína al 3% o hidróxido de sodio al 3% para fluidificar la muestra, mezclar durante 2-3 minutos y centrifugarla. Después, se prepara un montaje húmedo del sedimento para el examen microscópico. Si el examen de la muestra se demora debe añadirse formalina al 10% para conservar los huevos o las larvas de los helmintos.

ORINA Y OTROS LÍQUIDOS CORPORALES

Si la muestra es de gran volumen debe dejarse reposar durante 1 o 2 horas. Del sedimento se toman 50 ml para centrifugación; a partir del sedimento altamente concentra-do se puede realizar un montaje húmedo. Si se observan elementos que sugieran parasitismo, se examinarán con un preparado con yodo para visualizar las estructuras internas diagnósticas.

BIOPSIAS DE TEJIDOS Y ASPIRADOS

Las úlceras y nódulos cutáneos y los ganglios linfáticos pueden ser aspirados mediante una aguja fina o biopsiados.

Ante una leishmaniasis cutánea, se debe aspirar con aguja y jeringa por debajo del lecho ulceroso. Asimismo puede ob-tenerse material cutáneo para el diagnóstico de leishmaniasis subcutánea.

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Pueden estar indicadas biopsia de la mucosa rectal y vesi-cal cuando se sospecha esquistosomiasis intestinal o vesical.

La biopsia debe ser enviada al laboratorio sin formalina. Si va a haber demora en el procesamiento, las muestras deben colocarse en PVA como fijador. Si la muestra es blanda, debe rasparse una pequeña porción y colocarse en una gota de solución salina para el examen de un montaje húmedo. También deben prepararse frotis por impresión mediante la compresión de una superficie recién cortada del tejido contra la superficie de un portaobjeto y la colo-cación inmediata del portaobjeto en un fijador (solución de Schaudinn). Posteriormente se teñirán con diversas tinciones. La porción restante se debe enviar para examen histológico.

RASPADOS O BIOPSIA DE CÓRNEA

Son útiles para el diagnóstico de queratitis por Acan-thamoeba. Estos raspados se colocan en un portaobjeto y se fijan con alcohol metílico durante 3-5 minutos. Se ha sugerido que debe realizarse tinción mediante blanco de calcoflúor; se disuelve una solución de blanco de calcoflúor al 0,1% y azul de Evans al 0,1% en agua destilada. Se colocan unas pocas gotas de esta solución sobre el frotis fijado con metanol du-rante 5 minutos. Luego se inclina el portaobjeto y el líquido se vierte, colocando un cubreobjeto examinando la preparación al microscopio. Los quistes de amebas se visualizan de color verde manzana, no tiñéndose los trofozoítos.

MÚSCULO

Sirve para demostrar formas larvales de Trichinella spira-lis. Se realiza a partir de material obtenido mediante biopsia de músculo esquelético. Algunos autores sugieren tratar el material de biopsia con un líquido de digestión antes del examen (5 g de pepsina en 1.000 ml de agua destilada y 7 ml de HCl concentrado). El tejido se coloca en un frasco de boca ancha añadiendo 1 parte de tejido por 20 partes de líquido de digestión. La mezcla se mantiene durante 12-24 horas a 37 ºC. Tras este periodo se observan unas pocas gotas al microscopio. Si no se halla nada, se centrifugan 15 ml de la mezcla y se examina el sedimento.

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SANGRE

Los hemoparásitos, así como los vectores que los transmiten, producen enfermedades que están ampliamente distribuidas en toda la zona tropical. El aumento del turismo y la inmigración son fenómenos que actualmente están favoreciendo el aumento de este tipo de enfermedades en zonas no endémicas. En la investigación de parásitos en sangre, al igual que el caso de los parásitos en heces, es muy importante tener en cuenta la historia clínica, antecedentes epidemiológicos, periodo de incubación, periodicidad del parásito, etc., ya que toda esta información nos permitirá escoger la técnica más adecuada para llevar a cabo el estudio de manera favorable. Para el diagnós-tico de los parásitos en sangre existen técnicas inmunológicas basadas en la presencia de anticuerpos o sustancias derivadas del microorganismo, y técnicas parasitológicas que se basan en el estudio directo de la muestra y la demostración de la presencia del parásito en la misma. Estas últimas son las que desarrollaremos a continuación. Los parásitos que se pueden identificar en muestras de sangre son los Plasmodios, las Mi-crofilarias, las Leishmanias, las Babesias y los Tripanosomas. La investigación de este tipo de parásitos se puede llevar a cabo con el análisis en fresco de la muestra o mediante la realización de la gota gruesa con la posterior tinción, que nos facilitará la visualización al microscopio.

Para buscar formas extraeritrocitarias grandes, móviles de tripanosomas y microfilarias, se puede colocar una gota de sangre anticoagulada sobre un portaobjeto y cubrirse con un cubreobjeto y examinar en el microscopio.

El frotis de sangre anticoagulada para detectar plasmodios debe realizarse lo antes posible, pues una exposición prolon-gada al anticoagulante puede comprometer la tinción. Debe realizarse frotis mediante extensión y por el procedimiento de la gota gruesa; este último, tras punción en dedo y dejando que la sangre fluya libremente, debe continuarse de agitación durante 30 segundos para prevenir la formación de coágulos de fibrina. Posteriormente se deja que el frotis se seque al aire libre, y se procede a hemolisar la sangre mediante agua o con una solución con buffer. Luego se realiza la tinción.

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Deben tomarse al menos 3 muestras en días sucesivos, si las muestras iniciales son negativas para parásitos.

El frotis debe teñirse antes de 48 horas mediante tinción de Giemsa o de Wright. Deben examinarse al menos 300 campos con objetivo 100x.