BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y … · Los hongos fitopatógenos de las especies...

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MEDELLÍN

BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL

MEDIANTE EL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum acutatum

LUIS ALBERTO OVIEDO BERROCAL

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Química

Medellín, Colombia

2014

BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL

MEDIANTE EL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum acutatum

LUIS ALBERTO OVIEDO BERROCAL

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias-Química

Director:

Químico, M.Sc. Candidato a Ph.D. Diego Luis Durango Restrepo

Codirector:

Químico, M.Sc., Ph.D. Carlos Mario García Pajón

Línea de Investigación:

Productos Naturales

Grupo de Investigación:

Química de los Productos Naturales y los Alimentos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Química

Medellín, Colombia

2014

AGRADECIMIENTOS

Expreso mi más sincero agradecimiento a la Universidad Nacional de Colombia sede

Medellín, en especial al grupo de investigación Química de los Productos Naturales y los

Alimentos por permitirme hacer parte de él, a los laboratorios de Separaciones Químicas y

Productos Naturales por hacer posible la realización de este trabajo.

A DIEGO LUIS DURANGO RESTREPO, Químico, M.Sc., Candidato a Ph.D., por sus

enseñanzas, por el aporte de su conocimiento a la realización de este proyecto y por su

infinita paciencia, gracias por todo.

A CARLOS MARIO GARCIA PAJÓN, Químico, M.Sc., Ph.D., y a JESUS HUMBERTO GIL,

Químico, Ph.D., por sus valiosos aportes en mi formación como investigador.

A NANCY VANEGAS B. Química farmacéutica, laboratorista del grupo de Productos

Naturales, por sus valiosos aportes.

A MANUEL NUMPAQUE por su gran aporte a este proyecto, compañero mil gracias.

A los docentes de la escuela de química Angelina Hormaza, Cristina Valencia, Jorge

Correa, Tatiana Lobo, Benjamin Rojano, y Elizabeth Pabon por su colaboración.

Al Daniel Barragán (Director) y Ana Silvia Arboleda (Secretaria), del Área Curricular de

Ciencias Naturales por su colaboración.

A mis amigos, Mauricio Espitia, Gustavo Hernández, Carlos García, Fredys Sánchez,

Yeray Rodriguez, Samuel Vizcaíno y Leonardo Aleman por compartir como familia en

Medellín.

A mis compañeros de laboratorio, Natalí, Rodrigo Velasco, Rodrigo Pineda, Fredy Vélez,

Juan, Anderson, Diego Montenegro, Janio, Lina, Natalia, Lorena, Carlos Alberto, Jesús

David, Víctor, Jenny y Lina Cristina.

A mis compañeros de la Maestría Jhon Jairo, Edward, Efrain, Carlos Corrales, Saul y

Madeleine.

A mi familia:

A mis padres Ruby y luis, hermanos Luifer y Xiomi y abuela Graciela

A Teresa Ramos y Hugo Constain por ser incondicionales y un apoyo en momentos

difíciles de mi vida.

A Zury Constain por estar a mi lado y vencer juntos todos los obstáculos.

A DIOS por darme esperanza en los momentos difíciles de mi vida.

Dedicatoria

A mi abuelito Francisco Berrocal,

Porque me enseñaste a creer en mí. Fuiste mi primer profesor.

Te extraño y sé que desde el cielo te sientes orgulloso.

A Zury Constain por ser el amor de mi vida,

A mis padres Ruby y Luis, mis hermanos Luifer y Xiomi, y

Mi abuelita Graciela Por su amor incondicional y su

Constante apoyo siempre los llevo en mi corazón.

A mi segunda madre Teresa Ramos y

Segundo Padre Hugo Constain por haberme ofrecido

Su afecto y haberme apoyado cuando más lo necesite.

Resumen y abstract VI _______________________________________________________________________ __

Resumen

Los hongos fitopatógenos de las especies Colletotrichum acutatum y Botryodiplodia

theobromae, están asociados con las enfermedades de las plantas conocidas como

antracnosis y muerte negra, respectivamente. Desde el punto de vista económico, estos

hongos causan pérdidas elevadas al sector agrícola, las cuales se ven incrementadas por

la tendencia de los patógenos a causar daños en los frutos en el cultivo y durante los

procesos de pos-cosecha. El objetivo del presente trabajo fue investigar la actividad

antifúngica y el metabolismo de timol y carvacrol por C. acutatum y B. theobromae.

Inicialmente, se evaluó la toxicidad de cada uno los compuestos sobre los

microorganismos, empleando el método del “agar envenenado”. A partir de las curvas de

toxicidad, se demostró que ambos compuestos ejercen un control relativamente bueno

contra los hongos fitopatógenos; el crecimiento micelial de C. acutatum y B. theobromae

se inhibió significativamente a concentraciones mayores de 75 µg/mL para carvacrol y 50

µg/mL para timol, respectivamente. Tomando en cuenta la toxicidad de los compuestos

hacia los hongos, se seleccionaron para la biotransformación las concentraciones de timol

y carvacrol de 80 y 125 µg/mL respectivamente, las cuales inhibieron casi entre un 50 y

60 %. Los resultados de la biotransformación muestran que el timol y carvacrol fueron

metabolizados en baja proporción a varios compuestos, incluyendo timoquinona,

timohidroquinona, timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter, entre otros. A

partir de la estructura de los productos metabólicos se propuso una posible ruta

metabólica. Además, se sugiere que las modificaciones realizadas por los

microorganismos afectan los requerimientos estructurales a los cuales se les

responsabiliza de la actividad antimicrobiana y modo de acción del timol y el carvacrol.

Por último, se prepararon algunos compuestos estructuralmente relacionados con estos

monoterpenos fenólicos y se evaluó su actividad inhibitoria contra C. acutatum. Los

resultados muestran que los compuestos correspondientes con los de la

biotransformación, presentan un efecto fungiestático inferior al del timol y carvacrol.

Este comportamiento insinúa un posible mecanismo de detoxificación del timol y

Resumen y abstract VII _________________________________________________________________________

carvacrol por parte de ambos microorganismos. De otro lado, los derivados bromados y

nitrados de timol y carvacrol exhibieron efectos inhibitorios del crecimiento micelial de C.

acutatum mayores a los encontrados para los monoterpenos aromáticos precursores. En

general, la alta actividad antifúngica de timol y carvacrol contra C. acutatum y B.

theobromae y los niveles de transformación microbiana bajos, indican que ambos

compuestos podrían ser una alternativa a los fungicidas químicos tradicionales para el

control de los hongos fitopatogénicos, en la pre- y poscosecha de frutas y vegetales. De

otro lado, los metabolitos de defensa de las plantas podrían servir de plantillas

estructurales interesantes para el desarrollo de nuevos agentes para el control de

enfermedades en plantas importantes nutricional y comercialmente.

Palabras claves: Fungitoxicidad, Antracnosis, Muerte Negra, metabolismo, timoquinona.

Abstract

Phytopathogenic fungi Colletotrichum acutatum and Botryodiplodia theobromae are

associated with plant diseases known as Anthracnose and Black Death, respectively. From

the economic point of view, these fungi cause heavy losses to agriculture. The effects of

those diseases have increased because of the tendency of the pathogen to damage the

fruit during post-harvest processes. The aim of this study was to investigate the

antifungal activity and metabolism of thymol and carvacrol by C. acutatum and B.

theobromae. Initially, the toxicity of each compound against the plant pathogens using

the “poisoned agar technique” was evaluated. From toxicity curves, it was shown that

both compounds have a relatively good control against pathogenic fungi. The mycelial

growth of C. acutatum and B. theobromae was significantly inhibited at concentrations

higher than 75 µg/mL and 50 µg/mL. Taking in account the toxicity of both compounds

against fungi, thymol and carvacrol at 80 and 125 g/mL, respectively, were choice for

biotransformation processes. These levels were able to inhibit between 50 and 60% of

radial growth. Results from biotransformation showed that the pathogenic fungi

Resumen y abstract VIII _______________________________________________________________________ __

metabolized thymol and carvacrol in low proportion to several compounds, including

thymoquinone, thymohidroquinone, carvacryl- and thymyl acetate, and carvacryl- and

thymyl methyl ether, among others. From structure of metabolic products, a possible

biosynthetic pathway was proposed. Also, it was suggested that modifications carried out

by microorganisms affect the structural requirements which were associated with the

antifungal activity and action mode of thymol and carvacrol. Finally, some structurally

related compounds with these phenolic monoterpenes were prepared and their activity

against C. acutatum was evaluated. Results showed that, the compounds corresponding

to those from biotransformation, exhibited a higher fungistatic effect in comparison to

thymol and carvacrol. This behavior proposes a possible detoxification mechanism of

thymol and carvacrol by both microorganisms. On the other hand, brominated and

nitrated derivatives of thymol and carvacrol displayed inhibitory effects of mycelial

growth of C. acutatum higher than those found by the precursor aromatic monoterpenes.

Overall, the relatively high antifungal activity of thymol and carvacrol against C. acutatum

and B. theobromae and the low levels of microbial transformation indicate that both

compounds could be an alternative to traditional chemical fungicides for control of pre-

and postharvest phytopathogenic fungi on fruits or vegetables. Moreover, plant defense

metabolites could provide interesting structural templates for the development of new

agents for the control of plant diseases, in nutritional and commercially important crops.

Keywords: Fungitoxicity, Anthracnose, Black Death, metabolism, thymoquinone.

Contenido IX

_________________________________________________________________________

Contenido

Resumen ............................................................................................................................... VI

Abstract ................................................................................................................................ VII

Lista de figuras ....................................................................................................................... XI

Lista de tablas ...................................................................................................................... XIII

Abreviaturas ........................................................................................................................ XIV

Introducción ........................................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE .............................................................................. 4

1.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS Colletotrichum

acutatum Y Botryodiplodia theobromae .............................................................................. 4

1.1.1. Colletotrichum acutatum ........................................................................................ 4

1.1.2. Botryodiplodia theobromae .................................................................................... 5

1.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum

Y Botryodiplodia theobromae .............................................................................................. 8

1.2.1. C. acutatum ........................................................................................................... 8

1.2.2. B. theobromae ....................................................................................................... 9

1.3. CONTROL QUÍMICO DE LA ANTRACNOISIS Y LA MUERTE DESCENDENTE (Ó

PODREDUMBRE DE LOS FRUTOS) ........................................................................................ 10

1.4. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA EL CONTROL DE HONGOS FITOPATÓGENOS .................. 15

1.4.1. Productos naturales .............................................................................................. 16

1.4.2. Aceites esenciales ................................................................................................. 16

1.5. IMPORTANCIA DE TIMOL Y CARVACROL ....................................................................... 18

1.6. BIOTRANSFORMACIONES: GENERALIDADES Y APLICACIÓN PARA EL DISEÑO RACIONAL

DE FUNGICIDAS .................................................................................................................. 21

1.6.1. Aspectos generales de las biotransformaciones ..................................................... 21

1.6.2. Biotransformaciones de compuestos aromáticos sustituidos .................................. 22

1.6.3 Biotransformaciones con hongos fitopatógenos ...................................................... 25

1.6.3.1. Biotransformaciones con la especie Colletotrichum acutatum ............................. 25

1.6.3.2. Biotransformaciones con la especie Botryodiplodia theobromae ........................ 29

Contenido X

_______________________________________________________________________ __

1.6.4. Biotransformaciones para el diseño biosintético de fungicidas ............................... 31

2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 34

2.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 34

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 34

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL................................................................................................. 35

3.1. MATELIALES Y EQUIPOS ........................................................................................... 35

3.2. METODOLOGIA ............................................................................................................ 36

3.2.1. Mantenimiento de las Cepas C. acutatum y B. theobromae ................................... 36

3.2.3. Biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos C.

acutatum y B. theobromae. ............................................................................................ 38

3.2.4. Evaluación del avance de la biotransformación de los sustratos timol y carvacrol en

el curso del tiempo. ........................................................................................................ 39

3.2.5. Extracción y purificación de algunos de los metabolitos mayoritarios resultantes de

la biotransformación ...................................................................................................... 40

3.2.6. Identificación de los productos mayoritarios aislados de las biotransformaciones .. 42

3.2.7. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol y

evaluación de su actividad antifúngica contra los hongos C. acutatum y B. theobromae ... 42

4. DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................................... 44

4.3. ASPECTOS GENERALES ............................................................................................. 44

4.2. TOXICIDAD DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS C.

acutatum Y B. theobromae. ............................................................................................... 44

4.3. BIOTRANSFORMACIONES LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS

C. acutatum Y B. theobromae. ........................................................................................... 49

4.3.1 Extracción, aislamiento e identificación de productos ............................................. 49

4.3.3 Experimento curso en el tiempo ............................................................................. 65

4.3.4 Posible ruta metabólica .......................................................................................... 67

4.3.5. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol y

evaluación de la actividad antifúngica. ............................................................................ 70

5. Conclusiones y recomendaciones .................................................................................... 83

5.1 Conclusiones ................................................................................................................ 83

5.2. Recomendaciones ........................................................................................................ 84

6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 85

Figuras XI _________________________________________________________________________

Lista de figuras

Figura 1-1. Lesiones causadas por antracnosis. a) Guanábana, b) Fresa, c) Tomate de árbol d) Tallos de mora

e) Arándanos y f) Mangos [ (18), (19)]. .................................................................................................... 7

Figura 1-2. Lesiones causadas por la muerte negra. a) Coco no infectado e infectado, b) Anón, c) Maíz y d) y

e) Tallos de manzano f) banano (13) (27). ............................................................................................... 7

Figura 1-3. Transformación de metil 2-naftil metil ditiocarbamato por S. sclerotiorum (50). ......................... 14

Figura 1-4. Estructura química de timol (59), (60)]. ......................................................................................... 17

Figura 1-5. Estructura química de la carvona (61). .......................................................................................... 17

Figura 1-6. Estructura química del alcohol perílico (63). ................................................................................. 18

Figura 1-7. Estructura química del α-terpineol (62). ....................................................................................... 18

Figura 1-8. Estructura de carvacrol y timol indicando su fuente de origen (68). ............................................ 19

Figura 1-9. Glicosilación de Timol, carvacrol y eugenol por las células cultivadas de E perriniana. (72)......... 20

Figura 1-10. Biotransformación de los pterocarpanos (−)-maackiaina y (−)-medicarpina por Colletotrichum

spp (2). ................................................................................................................................................... 26

Figura 1-11. Biotransformación de isosteviol (5) por C. gloeosporioides (91). ................................................ 26

Figura 1-12. Biotransformación de (+)-α-Bulnesena (43) por G.cingulata (92). .............................................. 27

Figura 1-13. Biotransformación de widrol por C. gloeosporioides (93). .......................................................... 27

Figura 1-14. Biotransformación del 2-feniletanol con C. acutatum (94). ....................................................... 28

Figura 1-15. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (94). ...................................................... 28

Figura 1-16. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (83). ...................................................... 29

Figura 1-17. Biotransformación de 2- feniletanol con B.theobrome (96). ....................................................... 30

Figura 1-18. Biotransformación de acetofenona con B.theobrome (96). ........................................................ 30

Figura 1-19. Transformación de camalexin por Rhizoctonia solani (97). ........................................................ 32

Figura 1-20. Desintoxicación de las crucíferas fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin, y brassilexin

por el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum (98). ...................................................................... 33

Figura 3-1. C. acutatum conservado en PDA ................................................................................................... 36

Figura 3-2. Evaluación de la toxicidad de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B. theobromae

................................................................................................................................................................ 37

Figura 3-3. Inóculos de los hongos C. acutatum y B. theobromae (periodo de incubación). .......................... 38

Figura 3-4. Procesos de biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos

C. acutatum y B. theobromae. ............................................................................................................... 39

Figuras XII _______________________________________________________________________ __

Figura 3-5. Diagrama del proceso de extracción de los filtrados de los medios de cultivo. ............................ 41

Figura 4-1. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C.

acutatum ................................................................................................................................................ 45

Figura 4-2. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C. acutatum ................................ 46

Figura 4-3. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B.

theobromae. ........................................................................................................................................... 47

Figura 4-4. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B. theobromae. ......................... 48

Figura 4-5. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de carvacrol con C. acutatum después: 2

(i), 7 (ii), y 14 días (iii). ............................................................................................................................ 54

Figura 4-6. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de timol con B. theobromae después: 2

(i), 7 (ii), y 14 días (iii). ............................................................................................................................ 63

Figura 4-7. Evolución en el tiempo de la transformación microbiana de: carvacrol por B. theobromae (a) y C.

acutatum (b); y timol por B. theobromae (c) y C. acutatum (d). ............................................................ 67

Figura 4-8 Posible ruta metabólica de carvacrol (denotado como C) y timol (T) con C. acutatum y B.

theobromae ............................................................................................................................................ 68

Figura 4-9. Reacciones de metilación y acetilación de timol y carvacrol. ........................................................ 70

Figura 4-10 a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de

derivados del carvacrol y timol (productos metabólicos) b) Porcentaje de inhibición del crecimiento

radial de C. acutatum de derivados de timol y carvacrol (productos metabólicos)............................... 80

Figura 4-11. a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de

derivados bromados y nitrados del carvacrol y timol b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial

de C. acutatum de derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol. .............................................. 82

Tablas XIII _________________________________________________________________________

Lista de tablas

Tabla 1-1. Algunos fungicidas sintéticos comunes usados contra hongos fitopatógenos [ (46), (43)]. ........... 12

Tabla 1-2. Biotransformaciones de benzaldehido, ácido coumarico, ácido p-coumarico y ácido vanilico (82).

................................................................................................................................................................ 23

Tabla 4-1. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los

productos detectados en la biotransformación de carvacrol con C. acutatum. .................................... 50


productos detectados en la biotransformación de timol con C. acutatum. .......................................... 51

Tabla 4-3.Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los

productos detectados en la biotransformación de carvacrol con B. theobromae. ................................ 52


productos detectados en la biotransformación de timol con B. theobromae. ...................................... 53

Tabla 4-5. Espectro de masas y estructura de timohidroquinona. .................................................................. 55

Tabla 4-6. Espectro de masas y estructura de 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol. ................................. 56

Tabla 4-7. Espectro de masas y estructura de 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol. ................................ 56

Tabla 4-8. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de metil carvacril éter. .................................................. 57

Tabla 4-9. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de Timoquinona ............................................................ 57

Tabla 4-10. Espectro de masas, 1H RMN,

13C RMN y estructura de carvacril acetato. .................................... 59

Tabla 4-11. Espectro de masas y estructura de 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-fenol. ............................... 59


13C RMN y estructura de Timil metil eter. ...................................... 60

Tabla 4-13. Espectro de masas y estructura de 5 - (2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol. ............................. 61

Tabla 4-14. Espectro de masas y estructura de 2-hidroximetil-5-isopropil-fenol ........................................... 61

Tabla 4-15. Espectro de masas y estructura de 5-isopropenil-2-metil-fenol ................................................. 62

Tabla 4-16. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de timil acetato ........................................................... 62

Tabla 4-17. Espectros de masas y estructuras de 4-Hidroxi-3-isopropil-6-metil-ciclohex-2-enona y 4-Hidroxi-

6-isopropil-3-metil-ciclohex-2-enona ..................................................................................................... 64

Tabla 4-18. Espectro de masas de 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1 ,4-diol. .......................................... 65

Tabla 4-19. Espectro de 1H RMN y

13C RMN de timil acetato. ........................................................................ 71


13C RMN de carvacril acetato. ................................................................... 72


13C RMN de timil metil éter. ..................................................................... 73


13C RMN de carvacril metil éter. ............................................................... 74

Tabla 4-23. Espectro de 1H RMN de timoquinona. .......................................................................................... 75


13C RMN de 2,4-dibromo-6-isopropil-3-metil fenol. ................................. 76

Abreviaturas XIV

_______________________________________________________________________ __

Tabla 4-25. Espectro de 1H RMN de 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol ................................................... 76


13C RMN de 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol. .......................................... 78

Tabla 4-27. Espectro de 1H RMN de 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol. ............................................................ 78

Abreviaturas

C. acutatum Colletotrichum acutatum

B. theobromae Botryodiplodia theobromae

CG-EM Cromatografía de gases - Espectrometría de masas

13C RMN Resonancia magnética nuclear de Carbono

1H RMN Resonancia magnética nuclear de protón

ppm Partes por millón

U.E Unión Europea

LOX Lipoxigenasa oxidativa

HPL Hidroperóxi liasa

AE Aceites esenciales

CLAE Cromatografía liquida de alta eficiencia

CG Cromatografía de gases

CCF Cromatografía en capa fina

CC Cromatografía en columna

CCFP Cromatografía en capa fina preparativa

EM-IE Espectrometría de masas por ionización electrónica

δ (ppm) desplazamiento químico en unidades de δ

Hz Hertzios

J Constante de acoplamiento en Hertzios

AcOEt Acetato de etilo

AcOH Ácido acético

PDA Agar-Papa-Dextrosa

TR Tiempo de retención

Abreviaturas XV

_________________________________________________________________________

C Carvacrol

T Timol

equiv Equivalente-gramo

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

OMS Organización mundial de la salud

DDQ dicloro-diciano-quinona

Introducción 1 _________________________________________________________________________

Introducción

Los hongos fitopatógenos pertenecientes a los géneros Colletotrichum y Botryodiplodia

presentan una amplia distribución a nivel mundial. Estos microorganismos son

considerados como algunos de los más importantes en la agricultura, debido a la gran

diversidad de especies vegetales que pueden afectar y la magnitud de los daños que

ocasionan a las plantas. Los hongos del género Colletotrichum son los agentes causales de

la enfermedad de las plantas conocida como antracnosis; la especie C. acutatum, no

posee especificidad hacia familias particulares de plantas (es un hongo multihospedero) y

se ha encontrado patogenizando los cultivos de almendras dulces, aguacate, melocotón,

duraznos, arándanos, naranjas y cítricos en general, mangos, olivo, fresa, tomate de árbol

entre otros. Por su parte, la especie Botryodiplodia theobromae causa las enfermedades

conocidas normalmente con los nombres de muerte súbita, muerte basal o secamiento

de los cítricos, gomosis, cáncer negro y muerte negra, entre otros. Este hongo afecta los

cítricos, cacao, cacahuete, algodón, plátano, mango, maíz, cebolla, ajo, piña, coco, ñame,

aguacate, berenjena, té, melón, alcachofa, soya, patata dulce o batata, tabaco, arroz,

granadilla gigante, caña de azúcar, papaya, pera africana, zanahoria, guayaba común,

entre otros. En general, estos hongos fitopatógenos pueden afectar a la mayor parte de

la planta, incluyendo raíces, hojas, flores, ramas, brotes tiernos y retoños. Además, los

frutos pueden ser atacados tanto en pre- (especialmente frutos en formación y en

estados avanzados de desarrollo) como en postcosecha.

Tradicionalmente, el control de dichas enfermedades se ha llevado a cabo mediante la

aplicación de fungicidas químicos de síntesis. Sin embargo, debido al desarrollo de cepas

patogénicas más resistentes, muchos de estos productos químicos son cada vez menos

efectivos. Como consecuencia de lo anterior, se requiere para el control de las

enfermedades dosis más elevadas y aplicaciones más frecuentes del fungicida en el

campo, lo que incrementa notablemente los costos de producción y profundiza el

problema de residuos tóxicos (algunos de los cuales son reconocidos por sus efectos

carcinogénicos, teratogénicos, y con alta toxicidad aguda) en productos alimenticios.

Introducción 2

_______________________________________________________________________ __

Además, el uso de fungicidas de baja selectividad ha sido restringido para controlar el

deterioro poscosecha de frutos y hortalizas debido a sus posibles efectos adversos en la

salud humana. Además, se ha encontrado que algunos productos químicos presentan

efectos deletéreos para el medio ambiente y poseen largos periodos de degradación.

Todos estos factores han estimulado la necesidad de buscar productos alternativos

más seguros para el control eficaz de los hongos fitopatogénicos, entre los cuales se

destacan aquellos de origen natural y biológicamente activos, tales como los aceites

esenciales, extractos vegetales y/o sus constituyentes mayoritarios. Estos materiales

poseen una mayor aceptación y son reconocidos por los consumidores como de menor

peligrosidad para el medio ambiente y la salud humana que sus contrapartes sintéticas.

Una ventaja adicional que presentan los aceites esenciales y sus constituyentes volátiles

es su bioactividad en la fase de vapor; esta característica los hace atractivos como

posibles fumigantes para la protección de los productos almacenados.

Actualmente, se cree que la producción de aceites esenciales en las plantas es un

mecanismo para contrarrestar el ataque de patógenos y plagas; además, algunos de

estos materiales han demostrado poseer propiedades antimicrobianas y antifúngicas

valiosas para la industria. Así por ejemplo, los aceites esenciales de hierbas y especias

como el tomillo (Thymus vulgaris) y el oregano (Origanum syriacum) han sido

reconocidos por su actividad para inhibir múltiples hongos fitopatógenos, tales como C.

acutatum, Botrytis cinerea, Fusarium sp., y Aspergillus flavus, entre otros. La elevada

bioactividad de estos materiales ha sido asociada con la presencia de los constituyentes

timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol). Ambos compuestos

han exhibido propiedades antimicrobianas importantes y tienen gran utilidad en la

industria alimenticia, especialmente como conservantes naturales al evitar la

proliferación de hongos. Estos agentes causan alteraciones de la morfología de la hifa,

resultando en diámetros reducidos de la hifa y lisis de la pared hifal, cuando interactúan

con la membrana celular del patógeno. Sin embargo, la modificación química de estos

compuestos fenólicos a varios derivados éter y éster resulta en cambios importantes en

la actividad biológica de los micoorganismos. Además, se ha reportado que líneas de

Introducción 3 _________________________________________________________________________

Pseudomonas pueden degradar completamente el timol y parcialmente el carvacrol, lo

que puede limitar seriamente la aplicación de ambos compuestos como agentes para el

control de enfermedades en plantas.

De otro lado, los experimentos de biotransformación pueden proporcionar información

sobre los mecanismos de detoxificacion usados por los microorganismos fitopatogénicos

y dar un indicio de las modificaciones estructurales que se deben llevar a cabo sobre los

sustratos, si se pretende desarrollar agentes selectivos de control de hongos a partir de

sus estructuras. Por lo anterior, en el presente trabajo se evaluaron las propiedades

antifúngicas contra C. acutatum y B. theobromae del timol y carvacrol, junto con su

metabolismo. Adicionalmente, se prepararon algunos compuestos relacionados

estructuralmente con el timol y carvacrol, y se evaluó su actividad inhibitoria contra C.

acutatum.

Marco teórico y estado del arte 4

_________________________________________________________________________

1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

1.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS HONGOS

FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum Y Botryodiplodia

theobromae

1.1.1. Colletotrichum acutatum

El género Colletotrichum está constituido por hongos filamentosos imperfectos; estos

hongos pertenecen al reino Mycetae, division Eumycota, subdivisión Deuteromycotina,

clase Coelomycetes del orden Melanconiales (1). Las especies del género se encuentran

distribuidas ampliamente en todos los continentes y están implicadas en la enfermedad

de las plantas conocida con el nombre vulgar de antracnosis. Las especies del genero

Colletotrichum son consideradas como algunos de los mayores agentes patógenos en

poscosecha; sus daños incluyen los cereales, leguminosas, frutas y hortalizas entre otros.

La enfermedad incluye el marchitamiento, podredumbre y en estados avanzados puede

conducir a la muerte de la planta (2).

Colletotrichum acutatum es una especie que en la agricultura es responsable de pérdidas

económicas importantes en frutales de climas subtropicales y tropicales. La biología del

género es compleja y se desconocen muchos aspectos claves; esto es válido para C.

acutatum el cual es confundido en muchas ocasiones con otras especies como C

gloeosporioides; pero en la actualidad las clasificaciones han mejorado notablemente con

el uso de las técnicas de biología molecular que han posibilitado la distinción entre ambas

(3). La especie C. acutatum no posee especificidad hacia familias particulares de plantas y

se ha encontrado como patógeno en los cultivos de almendras dulces (Prunus dulcis) [ (4),

(5), (6)], aguacate (Persea americana L.) (7), melocotón y duraznos (Prunus persica L.)[

(5), (8)], arándanos (Vaccinium spp.) [ (9), (10)], naranja y cítricos en general (Citrus spp.)

5 ________________________________________________________________________

Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol

mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae

[ (11), (12)], mango (Mangifera indica L.)[ (13), (14)], olivo (Olea europea L.) (15), y fresa

(Fragaria spp. Duch.); [ (9), (16), (17)]. En los ataques puede afectar a la mayor parte de la

planta, incluyendo raíces, hojas, flores, ramas, brotes tiernos y retoños; es notable la

pérdida de frutos inmaduros y la defoliación que conduce a reducciones en la capacidad

fotosintética Figura 1-1 [ (18), (19)]. El sector frutícola se ve afectado cuando C. acutatum

ocasiona la pudrición de la corona y de la raíz, defoliación y caída prematura de flores, y

especialmente, pudrición de las frutas, tanto en los árboles como en todos los procesos

de poscosecha (3).

La antracnosis del fruto, ocasionada por el hongo filamentoso fitopatógeno C. acutatum,

es la enfermedad más importante del cultivo de tomate de árbol (Solanum betaceum L.,

syn: Cyphomandra betacea), por su amplia distribución y por las pérdidas económicas

que ocasiona [ (20), (21), (22)]. Específicamente el departamento de Antioquia es

actualmente uno los mayores productores de tomate de árbol en Colombia y la

antracnosis es la mayor limitante que se presenta en los cultivos comerciales y en las

pequeñas explotaciones domésticas.

1.1.2. Botryodiplodia theobromae

La especie B. theobromae pertenece al reino Mycetae, División Eumycota, Subdivisión

Deuteromycotina, Clase Coelomycetes, Orden Sphaeropsidales, Familia

Sphaeropsidaceae, género Lasiodiplodia (Pat.) Griffon & Maubl. (Botryodiplodia

theobromae Pat.) (23). En estado natural se encuentra en los estados imperfecto

(anamórfo) con el nombre de Botryodiplodia y perfecto (teleomórfo) Botryosphaeria.

Otros nombres son: Lasiodiplodia theobromae (anamórfo) (Pat.) Griffiths & Maubl,

Diplodia theobromae (Pat.) W. Novell, Diplodia natalensis Pole-Evans, Diplodia gossypina

Cooke, Diplodia cacaoicola Hen, Macrophomina vestita Prillinger & Delac, Lasiodiplodia

tubericola Ellis & Everh, y Diplodia tubericola (Ellis & Everh.) (24).


_________________________________________________________________________

Las enfermedades causadas por este hongo afectan un amplio número de plantas

cultivadas en diferentes áreas ecológicas y se conocen normalmente con los nombres de

muerte súbita, muerte basal o secamiento de los cítricos, gomosis, enfermedad

pedúncular, cáncer negro y muerte negra entre otras (25). Entre las especies afectadas se

encuentran los cítricos, cacao, cacahuete, algodón, plátano, mango, maíz, cebollas, ajo,

puerro, piña, pino colonial, coco, ñame, caucho, aguacate, berenjena, té, melón,

alcachofa, soja, patata dulce, tabaco, arroz, granadilla gigante, caña de azúcar, zahína,

vid, carambola, papaya, pera africana, zanahoria, guayaba común, etc [ (26); (24)]. En

general, la gran cantidad de especies de árboles frutales afectados por B. theobromae son

el resultado de un mal manejo agronómico del cultivo, ya sea por estrés hídrico o

deficiencias nutricionales, y por el descuido de las labores de poda que se realizan

durante la conducción del cultivo, resultando en daños como la muerte descendente de

las ramas que puede incluso llegar a matar la planta (13).

Las plantas afectadas por B. theobromae presentan la siguiente sintomatología: hojas

necróticas y de formas anormales, vástagos con cáncer, gomosis o resinosis y

podredumbre del corazón; en las raíces se observa una leve putrefacción de la corteza;

las flores, semillas y frutas presentan decoloración y lesiones con tonalidades marrón a

negro, Figura 1-2 (27). Además como resultado de la enfermedad, las ramas terminales

presentan secamiento y necrosis, en donde es posible observar muerte descendente así

como defoliación parcial y muerte del árbol. Por su parte en los frutos, la pudrición

pedúncular llega a causar la pérdida total, por lo que a pesar de que su incidencia es

menor a la de antracnosis, su severidad en frutos individuales es mayor (13). En hongo B.

theobromae ha sido considerado como un patógeno oportunista, que ocasiona grandes

daños en los procesos de poscosecha de frutas y verduras; las pérdidas económicas son

significativas en los frutos de mango, aguacate, papaya, guanábana, durazno y carambolo

entre otros frutos y hortalizas (13).

7 ________________________________________________________________________



Figura 1-2. Lesiones causadas por la muerte negra. a) Coco no infectado e infectado, b) Anón, c) Maíz y

d) y e) Tallos de manzano f) banano [ (13) (27)].

Anón, c) Maíz y d) y e) Tallos de manzano f) banano (13) (27).

Figura 1-1. Lesiones causadas por antracnosis. a) Guanábana, b) Fresa, c) Tomate de árbol d) Tallos de

mora e) Arándanos y f) Mangos [ (18), (19)].


_________________________________________________________________________

1.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LOS HONGOS

FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum Y Botryodiplodia

theobromae

1.2.1. C. acutatum

La mayor parte de las pérdidas económicas producidas por C. acutatum están asociadas

con el ataque sobre los frutos del huésped; esto en gran medida es debido a que el hongo

infecta la fruta verde en el campo, permaneciendo inactivo durante la cosecha. Luego

este se activa en la fruta madura infectando a las demás que estén alrededor durante el

almacenamiento. A nivel mundial, la antracnosis causada por el hongo C. acutatum

genera pérdidas agrícolas graves; por ejemplo, afecta los frutos de mango en la India,

Latinoamérica y el Caribe, dónde este cultivo es considerado de gran importancia

económica. Igualmente se ven afectados el plátano en Tennessee, Mississippi, Luisiana y

Alabama, y los cultivos de uvas en California, Indonesia, Brasil y Ecuador (28). En Brasil,

este hongo también es responsable de la caída prematura de los cítricos. Además, se ha

reportado la enfermedad en frutos de fresa (en este cultivo C. acutatum es el segundo

patógeno más importante después de Botrytis cinerea) en el Estado Mérida (Venezuela)

(29), y en Francia; donde la enfermedad ha causado más del 80% de las pérdidas en

cultivos de fresa no tratados con fungicidas, especialmente cultivos de floración

permanente. Los cultivos tratados con fungicidas para controlar B. cinerea han sufrido

mucho menos. Por su parte en Gran Bretaña, la detección de la enfermedad en fresa

hace obligatoria la quema de los cultivos y la fumigación del suelo. De otro lado en

Queensland (Australia), C. acutatum causa reducciones del 25 al 30% en el apio. Otros

cultivos más pequeños también pueden ser gravemente afectados, tales como las

anémonas e incluso las hojas del árbol akebia (Akebia trifoliata) en Saitama (Japón); una

plata trepadora de hoja caduca que crece salvaje en las montañas de Japón y es usada

como planta “bonsái” (30).

9 ________________________________________________________________________



En Colombia, los cultivos de tomate de árbol (Cyphomandra betacea), mora (Rubus

glaucus Benth), manzano (Malus domestica Borkh), mango (Mangifera indica), lima Tahití

y pasifloras son severamente afectados por la antracnosis, la cual puede llegar a

ocasionar pérdidas superiores al 50% (31). Los costos de control de la enfermedad en

tomate de árbol, planta cuyo fruto tiene una alta demanda a nivel nacional y además se

exporta a varios países del mundo, corresponden al 45% de los costos totales de

producción. A pesar del esfuerzo realizado por los productores, las pérdidas alcanzan

hasta un 50% o más, debido exclusivamente a la severidad e intensidad del problema;

esto sin tener en cuenta la contaminación ambiental, los daños ecológicos y los costos

socioeconómicos que ocasiona el uso indiscriminado de fungicidas de síntesis química

empleados para el control de la enfermedad y que redunda en el empleo (32).

Adicionalmente, se ha indicado que la enfermedad produce una disminución en el

período productivo de los árboles de tomate de árbol de 5 a 2 o 3 años, y cuando no se

aplican medidas de control las pérdidas son totales. Por su parte, en cultivos comerciales,

bajo condiciones de uso continuo de fungicidas, se estiman reducciones que oscilan entre

el 10 y 25% de los frutos cosechados.

Se ha reportado que en el altiplano norte de Antioquia estaban afectados más de 66000

árboles de tomate de árbol, calculándose reducciones en la zona, en un período de 6

meses, del orden de 360 millones de pesos. La antracnosis causada por C. acutatum en el

cultivo de mora ha alcanzado una incidencia promedio de 52.9%, en la zona cafetera, en

departamentos como Caldas, Quindío y Risaralda (18). En este cultivo, C. acutatum

produce lesiones y la muerte en las ramas.

1.2.2. B. theobromae

B. theobromae es un hongo cosmopolita que se presenta predominantemente en las

regiones tropicales y subtropicales. Adicionalmente, se ha reconocido como un patógeno

humano causante de keratomicosis y feohifomicosis y como un patógeno de plantas

asociado con más de 500 hospederos (33). Por ejemplo, este hongo se ha reportado


_________________________________________________________________________

como un patógeno del mango a nivel mundial, siendo el principal responsable del

decaimiento y la muerte descendente. Las enfermedades ocasionadas por este hongo en

mango se reportaron por primera vez en India, pero se han encontrado en otros países

de Asia, África y el continente Americano (34). De otro lado, B. theobromae está

considerado como uno de los organismos más vitales causante de diversas enfermedades

en Annona spp; se ha reportado en India, Brasil, Nigeria y EE.UU (Florida). En maíz, se ha

reportado la presencia de B. theobromae como patógeno en India, Nigeria, Pakistán y

Tailandia y, en menor grado, en el Continente Americano (35). Además, esta enfermedad

impacta negativamente la producción de cacao en los estados de Tabasco y Chiapas

(México) con aproximadamente 60,324 y 35,014 hectáreas respectivamente, causando

pérdidas del potencial productivo considerables que pueden llegar a ser del 30% o más

(36). En banano, papaya, mango y rambutan, B. theobromae causa la podredumbre de la

corona en Sri Lanka [ (37), (38)]. En Egipto, se ha reportado que B. theobromae causa la

pudrición de la raíz en remolacha azucarera (39), y la muerte regresiva en la vid (40), el

maíz (41), cítricos (39), y Annona spp (42). En Colombia, B. theobromae afecta especies

agrícolas y forestales importantes; en los departamentos de Antioquia, Caldas,

Cundinamarca, Magdalena y Valle del Cauca este hongo ataca los cultivos de aguacate y

mango tanto en precosecha como en poscosecha (43). Para el caso de los frutos de

mango, se ha reportado que la infección con el patógeno no permite que logren el

máximo climaterio (36).

1.3. CONTROL QUÍMICO DE LA ANTRACNOSIS Y LA MUERTE

DESCENDENTE (Ó PODREDUMBRE DE LOS FRUTOS)

Es necesario destacar que durante los últimos 50 años, la lucha contra las plagas en

Colombia se ha basado en gran medida en el uso intensivo y extensivo de plaguicidas de

cuestionados efectos sobre el hombre y el medio ambiente (43); además de estos efectos

indeseables hay sobrecostos adicionales de producción. El uso de productos químicos

11 ________________________________________________________________________



sintéticos es el principal método de control de podredumbres fúngicas de pre- y

poscosecha causadas por ambos microorganismos. No obstante algunos de los fungicidas

empleados actualmente poseen baja selectividad y pueden generar efectos deletéreos a

la salud humana y el medio ambiente. Así por ejemplo, los plaguicidas como el Folpet,

Maneb, Paraquat, Zineb, Benomil y Carbaril son considerados teratogénicos y alteran o

destruyen el material celular, bloqueando parcial o totalmente procesos enzimáticos que

afectan directamente al feto, es decir, son embriotóxicos y generarían abortos espontáneos

y en no pocos casos, malformaciones congénitas [ (43), (44)]. Cuando el plaguicida genera

cambios en el material genético del núcleo celular, de manera que puedan ser trasmitidos

en la división celular, puede dar origen a cáncer si el daño es a nivel de las células somáticas

o a malformaciones congénitas si el daño ocurre a nivel de las células gaméticas; éstos son

denominados mutagénicos como es el caso de bromuro de metilo, ziram, atrazina, captan,

folpet. Los efectos mutagénicos se manifestarían en futuras generaciones y el daño sería

irreversible. Como consecuencia de lo anterior, el uso de productos químicos para

controlar el deterioro de los productos alimenticios básicos en poscosecha está

restringido [ (44), (45)].

Para el control de la antracnosis (causada por C. acutatum), y la muerte descendente ó la

podredumbre de los frutos (causada por B. theobromae) se proponen tratamientos con

fungicidas sintéticos de baja selectividad como el benomyl, carbendazim y Maneb entre

otros [ (43), (46)]. A continuación se describen algunos de los efectos adversos a la salud

humana y el medio ambiente de algunos de los fungicidas empleados para el control de

los microorganismos fitopatogénicos mencionados Tabla 1-1.


_________________________________________________________________________

Tabla 1-1. Algunos fungicidas sintéticos comunes usados contra hongos fitopatógenos [ (46), (43)].

FUNGICIDAS SINTETICOS COMUNES

Benomyl

Nombre IUPAC: Metil 1-(butilcarbamoil)

bencimidazol-2-il carbamato

N

N

NH

O

O

NH

O

CH3

CH3

Una exposición intensa o continua (pero no

crónica) podría causar incapacidad temporal o

posibles lesiones residuales, a menos de que se

proporciones un rápido tratamiento médico. Su

toxicidad varía de alta a prácticamente nula para

peces. Es extremadamente tóxico para lombrices

de tierra, pero ligeramente tóxico para anfibios y

prácticamente no es tóxico para aves.

Carbendazim

Nombre IUPAC: Metil benzimidazol-2-il

carbamato

N

NH

NH

O

O

CH3

En el suelo presenta una movilidad moderada y

prácticamente no se volatiliza. En este medio es

biodegradado lentamente bajo condiciones

normales; sin embargo, su degradación biológica

puede incrementarse en suelos pre-tratados. El

Carbendazim presenta un potencial de

bioconcentración bajo en organismos acuáticos.

Maneb

Nombre IUPAC: Etilen-1,2 bistiocarbamato

de manganeso

S-

S-

S S

NH NH

Mn2+

Su potencial tóxico agudo es bajo, la reacción a

bebidas alcohólicas después de una absorción

elevada se caracteriza por, cefalea, sudoración,

sensación de calor, debilidad, congestión nasal,

dificultad respiratoria, opresión torácica,

taquicardia, palpitaciones e hipotensión. Las dosis

muy elevadas pueden resultar en choque,

convulsiones, depresión respiratoria y alteración

del estado de la conciencia.

13 ________________________________________________________________________



Otro factor que dificulta el control de las enfermedades fúngicas en cultivos importantes

lo representa el empleo de tratamientos dispendiosos a lo largo de la cosecha; por

ejemplo para el tratamiento del aguacate con antracnosis se realiza lo siguiente (43).

Dado que el hongo puede infectar la pepa de aguacate, esta se debe tratar con

hipoclorito de calcio (40%) (1,5 mL/l) durante 15 minutos, con posterior inmersión

durante igual período de tiempo en un producto a base Carboxin y Captan (Vitavax 300)

(2 a 6 g/L), a fin de prevenir posibles pudriciones o la manifestación del hongo en el

semillero o almácigo. En condiciones de campo, se deben realizar aspersiones al inicio de

la floración, hasta dos o tres semanas después del cuajamiento del fruto, con fungicidas a

base de Oxicloruro de Cobre (Oxiclor 35)(2 g/L), Hidróxido Cúprico (Kocide 101)(2 g/L),

Benomil (Benlate)(Bezil 50)(0,5 g/L), Metil Tiofanato (Topsin M 50)(1 mL/L), Carbendazim

(Derosal 500)(0,75 a 1,25 mL/L)(Bavistin 500)(0,5 mL/ L), Tiabendazol (Mertect 500)(1

mL/L), Procloraz (Mirage 45)(0,5 mL/L)(Sportak 45)(0,5 mL/L)(Octave 50)(0,5 g/L) o

Difenoconazol (Score 250)(0,5 mL/L).

Para evitar la aparición de poblaciones del patógeno resistentes a los fungicidas se deben

sumergir los frutos de aguacate después de la cosecha por tres minutos, en suspensiones

de fungicidas a base Benomil (Benlate)(Bezil 50)(0,5 g/L), Procloraz (Mirage 45)(0,5

mL/L)(Sportak 45)(0,5 mL/L)(Octave 50)(0,5 g/L) o Tiabendazol (Mertect 500)(1 mL/L),

que también reducen la incidencia de antracnosis en el almacenamiento. Además, los

cuartos de almacenamiento y las canastillas en las cuales se comercializa la fruta, se

deben desinfectar periódicamente con productos a base de hipoclorito de sodio al 2%

(43).

Una limitante importante en el uso de estos fungicidas comerciales es el rápido

desarrollo de tolerancia por parte de los microorganismos fitopatogénicos. Así, se ha

reportado que algunas especies del género Colletrotrichum poseen muchos hongos, una

capacidad extraordinaria de adaptación y variación [ (47), (5)]. En particular C. acutatum,

mostró ser intrínsecamente resistente al benomil y a otros fungicidas tipo bencimidazol


_________________________________________________________________________

(48). Además, también se reportó para Colletotrichum gloesporioides aislado de mango,

resistencia a benomil y tiabendazol (49), lo que ha conducido a un aumento en la

cantidad de estos compuestos que tiene que ser usada en los cultivos. Como

consecuencia de lo anterior, la presencia de residuos de fungicidas en los frutos y

productos procesados puede incrementarse, disminuyendo su calidad e impidiendo su

exportación a algunos mercados extranjeros (45).

Se ha establecido que el metabolismo dentro de la célula fúngica es uno de los

mecanismos que el patógeno usa para detoxificar un compuesto extraño, tal como un

fungicida. Un hongo con la habilidad para degradar rápidamente un fungicida puede

inactivar potencialmente éste antes de que pueda alcanzar su sitio de acción. En

particular, se ha demostrado que Sclerotinia sclerotiorum produce enzimas capaces de

detoxificar activamente carbamatos, a productos glicosilados que carecen de actividad

antifúngica Figura 1-3 (50).

Figura 1-3. Transformación de metil 2-naftil metil ditiocarbamato por S. sclerotiorum (50).

N

NHS

S

R

NH S

S

NH S

S

NH S

S

OO

OHOH

OH

OH

Carbamatos

Glicosilado

Adicionalmente, el hongo Leptosphaeria maculans detoxifica los ditiocarbamatos

principalmente vía oxidativa de la cadena lateral en el C3 del anillo indol (50).

Por lo anterior, se hace necesario el estudio sobre el metabolismo de sustancias con

aplicación potencial como antifúngicos, de cara a establecer la viabilidad real de su uso

para el control de un microorganismo específico. Es importante resaltar además, que en

nuestro país el uso de pesticidas, la mayoría costosos, ha dejado de ser una práctica

15 ________________________________________________________________________



rentable en el caso del mango, el tomate de árbol y el aguacate, debido al incremento

considerable en su precio comparado con el de los frutos importados, perdiendo

competitividad en el mercado. De esta manera, la gran capacidad de adaptación de los

patógenos a los plaguicidas de síntesis, la persistencia de estos compuestos en el suelo

durante largos periodos de tiempo y la incorporación de estos a la cadena alimentaria,

están haciendo disminuir la confianza en la utilización de pesticidas de síntesis

tradicionales y están motivando la aparición de nuevas técnicas y métodos de control

compatibles con el entorno ambiental (51). Lo anterior se suma a las restricciones

sanitarias impuestas por entidades internacionales como la EPA, FAO o la OMS a los

residuos de pesticidas en productos animales y vegetales. Lo anterior limita seriamente

las posibilidades comerciales de productos agrícolas para Colombia, ahora que se realizan

diferentes tratados de libre comercio con países como Estados Unidos, Japón, China, y la

Unión Europea.

1.4. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA EL CONTROL DE

HONGOS FITOPATÓGENOS

Los productos químicos sintéticos destinados a controlar enfermedades como la

antracnosis y muerte negra, han tenido un papel muy marcado en el incremento de la

producción agrícola. Sin embargo, el uso continuo e indiscriminado de agroquímicos con

baja especificidad ha generado diversos inconvenientes, tales como el incremento en los

costos de producción, el desarrollo de resistencia por parte de algunos microorganismos,

la presencia de residuos de pesticidas en los alimentos y, en consecuencia, los riesgos que

acarrean para la salud humana y el medio ambiente (20). Por estos motivos, desde las

últimas décadas del siglo XX se ha incrementado el interés en la búsqueda de alternativas

más seguras que permitan mitigar el impacto negativo de este tipo de productos. Una

estrategia que ha resultado satisfactoria para reducir la utilización de agroquímicos

costosos y potencialmente dañinos y peligrosos, ha sido el manejo integrado de plagas


_________________________________________________________________________

mejor conocido como MIP y dentro de esta opción, la utilización de sustancias de origen

natural, consideradas más seguras para la salud humana y el medio ambiente, y más

aceptadas por los consumidores (52).

1.4.1. Productos naturales

La búsqueda de compuestos bioactivos de origen vegetal contra los hongos ha sido

objeto de interés para encontrar productos ecológicamente seguros (53). El uso de

fungicidas en el control de enfermedades de las frutas por hongos está limitado

principalmente por las restricciones impuestas a su uso (54). Además, los fungicidas

sintéticos imponen una presión selectiva sobre las poblaciones de patógenos y pueden

resultar cepas resistentes a fungicidas (55), deben ser desarrolladas alternativas seguras

de manera viable, para ello compuestos volátiles de origen natural provenientes de las

plantas, son fundamentales constituyentes de sabor y fragancia además poseen cierta

actividad antifúngica (56). Algunos fungicidas orgánicos como ultra aceite fino Sunspray,

concentrado de Neem, y Rhapsody, se compararon con algunos de origen sintético, para

contrarestar la antracnosis en Alabama obteniéndose resultados similares (57). Los ácidos

grasos, los principales precursores de compuestos volátiles responsables del aroma de

plantas, se transforman en aldehídos, alcoholes, ácidos, y ésteres a través de la

degradación por la lipoxigenasa de soja oxidativa (LOX) y la vía hidroperóxido liasa (HPL).

Además de su papel en el aroma biosíntesis, tanto LOX y HPL puede tener relevancia

fisiológica debido a que sus productos tienen los antimicrobianos y antifúngicos que

están implicados en la respuesta de la planta herida (53).

1.4.2. Aceites esenciales

La aplicación de aceites esenciales (AE) es un método muy atractivo para controlar

enfermedades tanto en cosecha como en post-cosecha. Estos materiales son una mezcla

compleja de compuestos volátiles producidos en diferentes partes de las plantas, y han

sido reconocidos por poseer diversas funciones, incluyendo conferir la resistencia a

plagas y enfermedades; algunos AE, así como sus constituyentes, han demostrado poseer

propiedades antibacterianas y antifúngicas [ (58), (53)]. El AE de tomillo, Thymus vulgaris,

17 ________________________________________________________________________



presenta como componente mayoritario el timol Figura 1-4 y en algunas variedades su

composición puede alcanzar valores hasta del 80%. Tanto los AE obtenidos de las

especies de Thymus, como el timol, han sido reconocidos por su actividad antibacteriana

y antifúngica, razón por la cual se emplean industrialmente en la preparación de

desinfectantes de uso humano, enjuagues bucales y otros agentes antimicrobianos

utilizados a nivel doméstico [ (59), (60)].

Figura 1-4. Estructura química de timol (59), (60)].

OH

También el aceite esencial de Tagetes patual Linn. Fue evaluados para propiedades

fungicidas contra las cinco cepas Aspergillus niger, Penicillium feniculosa, Fusarium solani,

Rhizomucor sp., y Trichoderma viride. Las concentraciones de aceite, 1600 y 3200 ppm,

eran plenamente inhibidor, mientras que a concentraciones 10, 200, 400 y 800 ppm,

hubo una dosis dependiente, disminuir las tasas de crecimiento de hongos (61). La

carvona Figura 1-5 es uno de los componentes principales de los aceites esenciales de

plantas como Alcaravea (Carum carvi), Eneldo (Anethum graveolens) e Hierbabuena

(Mentha spicata). Cuando se compara con químicos tradicionales antibrote de papa

como isopropilfenilcarbamato y 3-isopropilclorofenilcarbamato, la carvona muestra igual

o mejor comportamiento durante el almacenamiento a largo plazo, manifestando

también actividad antifúngica contra Fusarium sulphureum, Phoma exigua y

Helminthosporium solana (62).

Figura 1-5. Estructura química de la carvona (61).

O


_________________________________________________________________________

El alcohol perílico Figura 1-6 es un monoterpeno con actividad antifúngica y potente

actividad anticancer y se encuentra en baja concentración en aceites esenciales de

Lavandula hybrida, Mentha piperita, Mentha spicata, Prunas sp., Carum carvi y Perilla

frutescens (63). Es un agente con baja toxicidad, propiedades terapéuticas y actividad

quimiopreventiva y/o quimioterapéutica contra una amplia variedad de cánceres.

Recientemente se ha estudiado su efecto como agente terapéutico en el tratamiento de

tumores de próstata (64), tumores de pulmón (65) y cáncer de mama (66).

Figura 1-6. Estructura química del alcohol perílico (63).

OH

El α-terpineol Figura 1-7 es el alcohol terpénico monocíclico cuyo aceite esencial es

obtenido a partir de muchos cítricos, comercialmente es importante, se ubica entre los

30 compuestos saborizantes con mayor demanda mundial. Ambos enantiómeros tienen

olor diferente, el R-(+)- α- terpineol tiene un aroma floral a lilas mientras que el S-(-)-

terpineol tiene un aroma a madera de coníferas. Es usado como perfume, repelente de

insectos, antifúngico, desinfectante, agente para flotación de metales y para fabricación

de copolímeros funcionales (62).

Figura 1-7. Estructura química del α-terpineol (62).

OH

1.5. IMPORTANCIA DE TIMOL Y CARVACROL

Timol y carvacrol son dos compuestos fenolicos que tienen potentes propiedades

19 ________________________________________________________________________



antimicrobianas naturales y son los principales componentes de los aceites esenciales de

tomillo y orégano, timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol)

son los componentes principales de los aceites esenciales de algunas Laminaceae

miembros como el orégano, el tomillo y ajedrea Figura 1-8. Se producen por estas especies

de plantas como un mecanismo de defensa química contra microorganismos

fitopatógenos. En consecuencia, presentan propiedades antimicrobianas y fungitóxicas

contra diversos patógenos de las plantas (67).

Figura 1-8. Estructura de carvacrol y timol indicando su fuente de origen (68).

OH

Timol Tomillo

OH

Carvacrol Orégano

Los aceites esenciales que contienen carvacrol y el timol que se conocen como

antibacterianos y antifúngicos naturales. Algunos investigadores están estudiando los

efectos antimicrobianos de los aceites esenciales y sus componentes activos (65). Timol y

carvacrol son eficaces contra E. coli (65), aunque carvacrol es más eficaz que el timol (69),

Con E. coli, carvacrol fue encontrado para ser completamente eficaz contra Penicillium

citrinum (70). El timol es significativamente eficaz contra Staphylococcus aureus (69).

Timol y carvacrol parece dañar las membranas de células bacterianas, así como entrar en

las bacterias y los procesos de cambio celular. Estos efectos pueden dar cuenta de sus

propiedades antibacterianas. Además, conociendo el mecanismo de detoxificacion de

hongos y bacterias sobre este tipo de compuestos mediante biotranformaciones se


_________________________________________________________________________

puede diseñar una estrategia que permita potencializar el uso de compuestos naturales [

(69), (71), (65)]. Un estudio de la evaluación de la fitotoxicidad y la actividad antifúngica

contra colletotrichum acutatum de los aceites esenciales de tomillo (thymus vulgaris),

limoncillo (cymbopogon citratus), y sus componentes mayoritarios, encontraron que Los

resultados demuestran que el timol a 125 mg/L y el citral a 300 mg/L inhiben el

crecimiento micelial completamente durante once días de incubación. La germinación de

las esporas se evita en un 100% con el AE de limoncillo a 350 y 400 mg/L, timol a 100 y

125 mg/L, y citral a 250 y 300 mg/L, después de un período de doce horas (20).

Por ejemplo el uso de las biotransformaciones de compuestos aroma de especias, tales

como timol, carvacrol, y eugenol mostrados en la Figura 1-9 (72), se investigaron mediante

las células en cultivo de plantas de Eucalyptus perriniana. Las células cultivadas de E.

perriniana son capaces de convertir estos compuestos de aroma de especias en los

glucósidos que se acumulan en las células, la Glicosilación permite la conversión de

compuestos orgánicos insolubles en agua e inestable en el los correspondientes solubles

en agua y estables para mejorar sus propiedades biológicas y farmacológicas. Desde el

punto de vista fisiológico, los glicósidos de timol, carvacrol, y eugenol, que están

compuestos de aroma de hierbas naturales y especias, pueden ser de interés

farmacológico, así como utilizable para los aditivos alimentarios y cosméticos (72).

Figura 1-9. Glicosilación de Timol, carvacrol y eugenol por las células cultivadas de E perriniana. (72).

OH

OH

O

OH

OO

OH

OHOH

OH

O

OO

OH

OHOH

OH

O

OH

O

OHOH

OH

O

OO

O

OH

OH

OH OHOH

OHOH

O

O

O

OH

OH

OH OHOH

OHOH

O

O

O

O

OH

OH

OH OHOH

OHOH

O

O

Timol

Carvacrol

Eugenol

21 ________________________________________________________________________



1.6. BIOTRANSFORMACIONES: GENERALIDADES Y

APLICACIÓN PARA EL DISEÑO RACIONAL DE FUNGICIDAS

1.6.1. Aspectos generales de las biotransformaciones

Los procesos de biotransformación se definen como aquellos en los cuales se emplean

sistemas biológicos para llevar a cabo transformaciones químicas de cualquier tipo. Estos

sistemas se denominan biocatalizadores y se caracterizan por ser enzimas o células

completas, ya sean de microorganismos naturales o recombinantes [ (73), (74)]. Las

biotransformaciones se encuentran enmarcadas dentro de los procesos biotecnológicos

que tienen una gran potencialidad para la industria química, especialmente en la

actualidad tiene la necesidad imperiosa de utilizar estrategias que sean de bajo costo,

eficientes y que no contaminen el medio ambiente; los productos obtenidos deben

satisfacer la demanda comercial de las industrias farmacéuticas, alimenticias, agrícolas,

entre otras (75).

En este tipo de procesos se utilizan las metodologías desarrolladas por diferentes campos

de la ciencia, incluyendo la biología, la genética y la química entre otras, que incluyen

diferentes sectores de la Ingeniería. Los procesos biotecnológicos en general son más

limpios y menos contaminantes, ya que son menos exigentes en consumos energéticos.

Los Hongos, las levaduras, las bacterias y otros organismos inferiores, se han utilizado

durante algún tiempo para la transformación de compuestos orgánicos; recientemente la

utilización de algunos microorganismos completos o sus sistemas enzimáticos para

realizar reacciones estereospecificas y estereoselectivas ha cobrado gran relevancia (24).

Los procesos de biotransformación se han estudiado extensivamente y son considerados

una dinámica importante, para modificar la estructura de los compuestos orgánicos de

bajo costo y obtener en el proceso productos con alto valor agregado especialmente


_________________________________________________________________________

aquellos que son difíciles de conseguir desde fuentes naturales o mediante estrategias

sintéticas.

Las biotransformaciones se caracterizan porque poseen alta versatilidad, eficiencia,

regioselectividad, quimioselectividad y enantioselectividad [ (76), (77)]. Un buen número

de reacciones pueden ser realizadas mediante la utilización de organismos completos o

sus partes, muchas se han logrado optimizar y son empleadas en la síntesis de moléculas

quirales ópticamente activas, que son de importancia en las industrias [ (78), (79), (80)].

En términos generales la producción de compuestos se realiza mediante procesos que

involucran catalizadores organometálicos especializados y procesos de protección-

desprotección de grupos funcionales que utilizan reactivos y catalizadores novedosos;

muy pocas de estas estrategias sintéticas son amigables con el medio ambiente, debido a

que la mayor parte de ellas generan subproductos tóxicos que son difíciles de eliminar y

no son reutilizables. Como una contraparte los procesos de biotransformación son

considerados como una tecnología económica y ecológicamente competitiva. Además

transcurre a presión atmosférica, temperatura ambiente o muy cercana a ella y no

requieren de la presencia de otros catalizadores diferentes. Las condiciones de reacción

bajo las que se llevan a cabo son consideradas suaves y muchas de ellas se distinguen por

poseer un sello verde (amigable con el entorno) (81).

1.6.2. Biotransformaciones de compuestos aromáticos sustituidos

Los compuestos aromáticos alquilsustituidos han sido empleados como sustratos en

diferentes procesos de biotransformación, con el objeto de obtener productos con valor

agregado a partir de sustratos económicos y disponibles comercialmente. La

biotransformación de compuestos ha permitido la obtención de moléculas pequeñas

mediante procesos económicos de bajo impacto ambiental, los cuales han sido utilizados

como precursores en la industria química, farmacéutica y para la obtención de sabores,

fragancias y cristales líquidos (82).

23 ________________________________________________________________________



La aplicación de estos procesos pretende aprovechar el alto grado de selectividad, e

incluso especificidad, que poseen los sistemas enzimáticos para la obtención de

materiales especializados. Se observa en la Tabla 1-2 (82), algunos ejemplos de

biotransformaciones en las que se obtienen compuestos de valor agregado.

Además los compuestos aromáticos sustituidos; en el contexto comercial los productos

obtenidos mediante transformaciones microbiológicas son considerados naturales y este

calificativo es un factor importante debido a que pueden ser modificados por vía

metabólica o enzimática sin perder dicha categoría, esto hace que esta tecnología

biológica se presente como una ruta importante para la producción a gran escala de

derivados de estas moléculas (83).

Tabla 1-2. Biotransformaciones de benzaldehido, ácido coumarico, ácido p-coumarico y ácido vanilico (82).

SUBSTRATO PRODUCTOS ORGANISMO REFERENCIA

Benzaldehido

O H

Fenilacetilcarbinol

OH

O

OH

O

Hongos

Rhizopus javanicus,

Rhizopus oryzae,

Aspergillus oryzae,

Aspergillus tamarii,

Neurospora crassa,

Polyporus

eucalyptorum,

Fusarium lateritium,

Fusarium sp., Monilia

sitophila,

Paecilomyces

lilacinus y Mucor rouxii

(84)


_________________________________________________________________________

Continuación tabla 2

SUBSTRATO PRODUCTOS ORGANISMO REFERENCIA

Ácido p-coumarico

O

OH

OH

Ácido cafeico

O

OH

OH

OH

Hongo

Pycnoporus

cinnabarinus

(85)

Ácido vanilico

OHO

OH

O

CH3

Metoxihidroquinona,

OH

OH

O

CH3

Alcohol vanilico,

OH

OH

O

CH3

Vainillina

HO

OH

O

CH3

Hongo

Phanerochaete

chrysosporium

(86)

Ácido pcoumarico

O

OH

OH

Ácido cafeico O

OH

OH

OH

Ácido phidroxibenzoico

OHO

OH

Ácido protocatecuico

OHO

OH

OH

Bacteria

Streptomyces

caeruleus

(87)

25 ________________________________________________________________________



1.6.3 Biotransformaciones con hongos fitopatógenos

Dentro de la literatura científica se encuentran publicados muchos trabajos de

biotransformación, desarrollados con hongos fitopatógenos que causan daños en cultivos

de importancia comercial; en algunos casos, los sustratos utilizados son compuestos

antifúngicos y en los estudios se pretende elucidar los mecanismos de detoxificacion

empleados por el patógeno, con el fin de esclarecer su dinámica enzimática y

fundamentados en ella desarrollar antimicóticos potencialmente más activos (88). Los

compuestos utilizados como sustratos tienen alguna similitud estructural con los

metabolitos producidos por el hongo; en muchos casos estos compuestos tienen

importancia económica y se pretende aumentar su producción por parte del organismo

(83). Algunos de los substratos empleados en biotransformaciones no tienen ninguna

relación con el patógeno y son evaluados por sus características estructurales con la

finalidad de modificarlos y obtener productos con mayor valor agregado [ (89), (90)].

1.6.3.1. Biotransformaciones con la especie Colletotrichum acutatum

Se reportan en la literatura científica muchos artículos de trabajos investigativos

relacionados con las biotransformaciones realizadas por este hongo fitopatógeno, se

citan muchos trabajos sobre biotransformaciones con el género Colletotrichum mas con

la especie Colletotrichum gloeosporioides (Glomerella cingulata) y muy pocos con

colletotrichum acutatum. Los pterocarpanos: (-)-maackiaina 1 y (-) – medicarpina 2,

realizan la función de fitoalexinas en las especies, se sometieron a ensayos de

detoxificación, utilizando 9 hongos fitopatógenos dentro de los cuales se incluyeron tres

especies de Colletotrichum: C. trifolii, C. dematium (f. truncatum) y C.destructivum. Las

tres especies hidroxilaron los compuestos 1 y 2 en posición C-6, para producir los

metabolitos 3 y 4. La especie C. trifolii, rompe el anillo de ambos sustratos, para producir

los isoflavonoles sophorol 5 y vestitona 6 Figura 1-10 (2). Lo que muestra un mecanismo de

detoxificacion.


_________________________________________________________________________

Figura 1-10. Biotransformación de los pterocarpanos (−)-maackiaina y (−)-medicarpina por Colletotrichum

spp (2).

O

O

OH

R1

R2

H

H

O

O

OH

R1

R2

H

OH

O

O

OH

OH

H

H

O

R1

R2

OH

OOH

OH

A B

CD

(1) R1- R2 = 0CH2-O

(2) R1= H R2=OCH3

(3) R1- R2 = 0CH2-O

(4) R1= H R2=OCH3

(9)

O

O R1

R2

OH

O

OHH

(5) R1- R2 = 0CH2-O

(6) R1= H R2=OCH3

(7) R1- R2 = 0CH2-O

(8) R1= H R2=OCH3

El isosteviol 10, es un diterpeno tetracíclico que presenta actividades biológicas, ha sido

biotransformado con el fin de potenciar su bioactividad. Como se observa en la Figura

1-11, la transformación microbiológica con C. gloeosporioides dio como único producto el

17-hidroxi-isosteviol 11, el cual presentó actividad de inhibición significativa en un ensayo

preliminar de quimiopreventivos (91).

Figura 1-11. Biotransformación de isosteviol (5) por C. gloeosporioides (91).

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

16

15

O17

18O19

OH20

21

H22

23

H24

1

3

4

5 7

10

11

12

13

14

16

15

O17

18

O19

O20

21

H22

CH2OH23

H24

10 11

El (+)-α-Bulnesena 12, es un sesquiterpeno con actividad insecticida, que fue

bitransformado con G. cingulata obteniéndose mayoritariamente (4S,5S,7R)-1(10)-

27 ________________________________________________________________________



guaien-11,13,15-triol 13. En la Figura 1-12 se observan las oxidaciones del grupo isoprenílo

en los carbonos 11 y 13 y en el carbono metílico 15. El metabolito 13 tuvo una

abundancia relativa del 25% después de 10 días de iniciado el proceso (92).

Figura 1-12. Biotransformación de (+)-α-Bulnesena (43) por G.cingulata (92).

1

12

3

4

5

6

7

8

9

10

11

CH3

15

13

14

H16

17

17

1

12

3

4

5

6

7

9

10

12

13

14

15

H16

17

OH18

OH19

OH20

21 22

Widrol 14 es un compuesto al cual se le ha reportado actividad antifúngica, fue

biotransformado por C. gloeosporioides obteniéndose productos oxidados con alta

regioselectividad en el carbono C-10 así: 10-oxowidrol 15, 10-hidroxiwidrol 16,

10hidroxiwidrol 17, y 14-hidroxiwidrol 18, Figura 1-13. Estos compuestos fueron

inactivos a 100 mg/L contra Botrytis cinerea (93).

Figura 1-13. Biotransformación de widrol por C. gloeosporioides (93).

1

2

3

5

4

7

8

3

2

11

1212

HO13

14 15 R'16

R17

18

1

2

3

5

6

7

8

9

10

11

1212

HO13

14 15

O17

17

14 R=R'=H

16 R=OH, R'=H

17 R= OH, R'=H

18 R= H, R'=OH

15

En Colombia C.acutaum afecta principalmente el cultivo de tomate de árbol Solanum

betaceum (cav.) sinónimo Cyphomandra betacea (cav.) (Sendt). Debido a estos factores,

la mayor parte de los estudios llevados a cabo sobre C. acutatum se han encaminado a

conocer aspectos relevantes de su epidemiología y control, desconociéndose su

potencialidad para obtener sustancias químicas con valor agregado mediante la

biotransformación de sustratos orgánicos (62). El grupo de Productos Naturales de la

Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, desde un tiempo atrás ha venido

realizando trabajos de biotransformación con especies de Colletotrichum y se ha

observado la tendencia de estos hongos para realizar reacciones sobre anillos aromáticos


_________________________________________________________________________

y cadenas alquílicas. En la biotransformación del 2-feniletanol 19 con C. acutatum se

obtuvieron los productos: éter metílico del 2-feniletanol 20, 1-fenil-1,2-etanodiol 21, y el

acetato de 2-feniletanol 22 Figura 1-14 (94).

Figura 1-14. Biotransformación del 2-feniletanol con C. acutatum (94).

OH9

O9

10

OH9

OH10

O9

10

11

O12

1920

21

22

La biotransformación de la acetofenona 23 con esta especie produjó los compuestos 1-

feniletanol 24, 2-feniletanol 25 y 1-fenil-1,2-etanodiol 26 Figura 1-15 (94).

Figura 1-15. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (94).

O

9

OH9

OH9

OH10

OH10

2324

2526

Los metabolitos obtenidos en la biotransformación del 2-feniletanol 19 y de la

acetofenona 23, demuestran la capacidad que tiene C. acutatum para realizar

oxidaciones y reducciones en el sustituyente alquílico del grupo aromático; así como

también metilaciones y acetilaciones del hidroxilo (94).

Las biotransformaciones realizadas por el hongo filamentoso fitopatógeno Colletotrichum

acutatum sobre el sustrato arilpropanoide trans-cinamaldehído 27, empleando el medio

29 ________________________________________________________________________



de cultivo líquido Czapeck-Dox. En la biotransformación se obtienen los productos

metabólicos alcohol cinamílico 28, 3-fenil-1-propanol 29, 3-fenil-oxiranometanol 30 y 1-

fenil-1,3-propanodiol 31. Figura 1-16. Se observa una tendencia del hongo fitopatógeno a

producir hidroxilaciones sobre el sustituyente del anillo aromático; asimismo tiene la

capacidad de reducir el grupo carbonilo y el doble enlace (83).

Figura 1-16. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (83).

OH

OH

OH

OH

H

O

OH

O

2728

29

3031

1.6.3.2. Biotransformaciones con la especie Botryodiplodia theobromae

En Colombia, este microorganismo es considerado como un patógeno de consideración

para la agricultura. La mayor parte de los estudios que se encuentran en la literatura

sobre este microorganismo se refieren a su fisiología, y han sido realizados con el fin de

conocer la dinámica de los procesos infectivos en plantas y frutos. Debido a estas

circunstancias de índole económica, B. theobromae ha sido estigmatizado por su carácter

nocivo y considerado únicamente desde la perspectiva de su control, desconociéndose y

subvalorando su potencialidad para la realización de procesos de biotransformación (24).

Además la gran mayoría de trabajos investigativos existentes son desde el punto de vista

del control de la enfermedad, ocasionada por B. theobromae, determinación de

compuestos que ejecuten control antifúngico sobre el hongo. Se muestran la incidencia

de los fungicidas y el control que se le hace a los hongos fitopatógenos B. theobromae y

Botryosphaeria dothidea, antes y después de haber infectado los frutos de melocotón y

albaricoque en China. Cabe resaltar el hecho de que a medida que el árbol tiene mayor


_________________________________________________________________________

edad, la severidad de la infección es mayor, es decir, se vuelven con el pasar del tiempo

más susceptibles de ser infectados por los hongos (95). La biotransformación a partir del

sustrato 2- feniletanol 32, (96)se obtienen los metabolitos feniletanodiol 33, ácido 2-

fenilacético 34, fenilacetato de 2-feniletanol 35, acetato de 2-feniletanol 36 Figura 1-17. Y

para el sustrato acetofenona 37, Figura 1-18, (96) los metabolitos 1-feniletanol 38, ácido 2-

fenilacético 34, 2-feniletanol 32, 2-feniletanal 39, o-hidroxiacetofenona 40 y acetato de 1-

feniletanol con B.theobromae 41.

Figura 1-18. Biotransformación de acetofenona con B.theobrome (96).

Figura 1-17. Biotransformación de 2- feniletanol con B.theobrome (96).

OH9

OH9

OH10

O9

10

11

O12

32

36

3334

O9

10

11

O12

O9

OH

35

CH3

OH

CH3

O CH3

O

CH3

O

OH

CH3

O

H

O

OH

O

OH

37

32 39 34

40

3841

31 ________________________________________________________________________



1.6.4. Biotransformaciones para el diseño biosintético de fungicidas

Durante los últimos años, los fungicidas de síntesis han sido una de las armas más

utilizadas por los agricultores para controlar las enfermedades causadas por hongos

fitopatógenos. Los fungicidas modernos han alcanzado un nivel de eficacia elevado junto

con una importante reducción de la toxicidad. Aunque el impacto ambiental y los efectos

toxicológicos se han minimizado, la mayoría de los fungicidas utilizados contra estos

patógenos, siguen actuando lentamente. El avance en el estudio de los factores de

patogenecidad de los hongos y su mecanismo de acción, ha abierto el camino para

desarrollar nuevas alternativas para la innovación en el control de dichas enfermedades.

Asimismo, M. Soledade C. Pedras (Ph.D) en la Universidad de Saskatchewan en Canadá

utiliza técnicas biotecnológicas para entender importancia de las enfermedades de las

semillas oleaginosas de crucíferas como la canola, semilla de colza y mostaza, vegetales

como el nabo, brócoli, nabo, y condimentos como la mostaza y wasabi. En particular

estudia, la interacción de las crucíferas, con pie negro, mancha negra, pudrición de la raíz,

pudrición del tallo, roya blanca y los hongos con el fin de realizar un diseño biosintético a

partir de su vía de detoxificacion. También el grupo de investigación de la universidad de

Cadiz “Diseño biosintético de fungicidas” liderado por Isidro González Collado (Ph.D),

sugieren que las toxinas excretadas por los hongos fitopatógenos en el mecanismo de

infección, permite desarrollar análogos biosintéticos de fungicidas.

Para entender el mecanismo de detoxficacion de los hongos se incluye: la determinación

de la estructura química de los metabolitos bioactivos sintetizados por los patógenos y

por las plantas a partir del desarrollo de un ensayo de toxicidad, el metabolismo de los

compuestos por los patógenos y las plantas, síntesis de los compuestos bioactivos y

productos de la desintoxicación. También nuestro grupo de investigación “Química de

los Productos Naturales” de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín a través

de las biotransformaciones realizadas por los hongos C. acutatum y B. theobromae

pretendemos entender las rutas metabólicas realizas por estos hongos a partir de varios


_________________________________________________________________________

sustratos, un ejemplo de ello son timol y carvacrol.[ (50), (97), (98), (99), (19), (90)].

Un ejemplo es el metabolismo de la fitoalexina camalexin por cepas de Rhizoctonia

solani Kuhn, se realizó la biotransformación de 5-hidroxicamalexin, que se transformó

biológicamente en metabolitos más polares, se encontró que estos metabolitos de

camalexin fueron significativamente menos tóxicos para el patógeno, por lo que

concluyen que R. solani puede desintoxicar camalexin a través de la oxidación del anillo

indol. Además, se determinó la actividad antifúngica de de compuestos intermedios

sintetizados a partir de la vía metabólica Figura 1-19 (97). Los hongos fitopatógenos son

capaces de superar las defensas químicas de la planta a través de reacciones de

desintoxicación que son enzima mediada. Como resultado de tales detoxificaciones, la

planta se agota rápidamente, de sus más importantes metabolitos antifúngicos y puede

sucumbir al ataque de patógenos. La comprensión y la predicción de dichas vías de

desintoxicación utilizados por los hongos fitopatógenos podría conducir a enfoques para

el control de patógenos de plantas (98).

Figura 1-19. Transformación de camalexin por Rhizoctonia solani (97).

NH

NS

NH

NS

OH

NH

NO

NH

ONH

OH

N

NS

OH

OH

NH

CN

OH

+

CAMALEXIN

33 ________________________________________________________________________



Las actividades inhibidoras y el metabolismo de las fitoalexinas camalexin, brassinin,

ciclobrassinin, y brassilexin por el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea fue investigado.

Brassilexin resulto ser el más antifúngico de las fitoalexinas, seguido por camalexin,

ciclobrassinin y brassinin. Aunque B. cinerea es una especie filogenéticamente

relacionados con el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum, La desintoxicación del

fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin y brassilexin por el fitopatógeno Botrytis

cinerea, se produce a través de degradación oxidativa o la hidrólisis y esto se puede

corroborar a través de ensayos de toxicidad Figura 1-20 (98).

Figura 1-20. Desintoxicación de las crucíferas fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin, y brassilexin

por el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum (98).

NH

SN

NH

SN

O

DGlc

NH

NH

S

SN

NH

S

S

DGlc

NH

N

S

S

N

N

S

S

DGlc

NH

N

S

N

N

S

DGlc

camalexin

brassinin

ciclobrassinin

brassilexin

Objetivos 34

_________________________________________________________________________

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Estudiar el metabolismo de timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (2-metil-5-

isopropilfenol) con los hongos filamentosos fitopatógenos Colletotrichum acutatum y

Botryodiplodia theobromae, junto con su actividad antifúngica y la de algunos

compuestos relacionados estructuralmente.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Evaluar la toxicidad de los sustratos timol y carvacrol contra los hongos

filamentosos Colletotrichum acutatum y Botryodiplodia theobromae, mediante la

metodología del “agar envenenado” ó “placa perforada”.

Realizar la biotransformación de timol y carvacrol con los hongos fitopatógenos,

en medio líquido agitado.

Desarrollar una metodología de análisis cromatográfico (cromatografía de gases)

para detectar los productos metabólicos.

Analizar el progreso (concentración relativa en el transcurso del tiempo) de la

biotransformación de los sustratos timol y carvacrol con los hongos fitopatógenos,

mediante técnicas cromatográficas convencionales.

Aislar mediante la combinación de diferentes técnicas cromatográficas algunos de

los productos metabólicos mayoritarios.

Identificar mediante métodos espectroscópicos y/o espectrométricos algunos de

los productos metabólicos.

Analizar la regioselectividad y la quimioselectividad de las biotransformaciones

producidas por los hongos C. acutatum y B. theobromae sobre los sustratos timol

y carvacrol

Preparar compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol, y

evaluar su actividad antifúngica, contra el hongos C. acutatum.


mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 35

_________________________________________________________________________

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL

3.1. MATELIALES Y EQUIPOS

La cromatografía de capa fina (CCF) se realizó en cromatoplacas de sílica gel 60 (F254, 0.25

mm de espesor, Merck), y como fase móvil mezclas de n-hexano-AcOEt en diferente

relación. Los compuestos se visualizaron bajo radiación UV a 254 y 365 nm, y mediante

aspersión con la mezcla AcOH: H2SO4:H2O (143:28:30) y solución de FeCl3 al 5%, seguido

por un calentamiento breve. La CCF preparativa (CCFP) se llevó a cabo empleando

cromatoplacas de sílica gel 60 (F254, 20x20 cm, 1mm de espesor, Merck); en la

cromatografía de columna (CC) se emplearon como fases estacionarias sílica gel 60

(0.040-0.063 mm; Merck) y Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich). Los análisis mediante

cromatografía de gases (CG) se realizaron en un cromatógrafo Hewlett-Packard 6890

(Agilent Technologies), acoplado a un detector de masas Agilent MSD 5973, en el modo

de ionización electrónica. Se empleó una columna HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm,

Agilent Technologies). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes:

temperatura de la columna 50°C, temperatura del inyector 150°C, temperatura del

detector 280°C. El programa de temperatura para el horno se realizó con una rampa de

calentamiento a razón de 10°C/min hasta 250°C, y conservada a la temperatura final

durante 6 minutos. El tiempo total del análisis fue de 30 minutos y el gas de arrastre

utilizado fue N2 a un flujo de 1 mL/min. La composición relativa de los constituyentes

individuales se determinó a partir del área promedio de los picos.

Los espectros de masas se obtuvieron por ionización electrónica (EM-IE), mediante

cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM), en las condiciones citadas

previamente; los metabolitos se identificaron por comparación de sus espectros con los

reportados en la literatura y en la base de datos NIST 2002. Los espectros de RMN de 1H

y 13C se determinaron usando CDCl3 en un equipo Bruker AMX 300 con 300,12 MHz para

Sección experimental 36 _________________________________________________________________________

1H y 75,42 MHz para 13C. Los desplazamientos químicos están expresados como valores

de δ (ppm) y las constantes de acoplamiento J en Hertz (Hz). La biotransformación se

realizó en un agitador orbital tipo shaker (Centricol-serie 0239), con cámara de

incubación. El carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol) empleado fue suministrado por Sigma-

Aldrich, y el timol (2-isopropil-5-metilfenol) por Abaquim. Se utilizó una cepa de C.

acutatum, aislada de frutos de tomate de árbol (Solanum betacea L.) infectados con

antracnosis, y caracterizada morfológica y molecularmente en el Laboratorio de

Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. El hongo B.

theobromae se aisló de frutos de aguacate (Persea americana L.) infectados con muerte

negra, y se caracterizó morfologicamente. Las cepas se mantuvieron en medio de cultivo

sólido PDA (agar papa-dextrosa), a temperatura promedio de 24°C y humedad relativa

entre 45 y 60%. Los medios de cultivo se prepararon con sales y micronutrientes grado

analítico, provenientes de las casas comerciales Aldrich y Merck. El Agar-Agar y el

extracto de levadura, de calidad microbiológica, se compraron a Merck.

3.2. METODOLOGIA

3.2.1. Mantenimiento de las Cepas C. acutatum y B. theobromae

Las cepas se mantuvieron en medios de cultivo estándares del tipo PDA [Papa 400 g/L,

Dextrosa (glucosa) 40 g/L (en la preparación del medio se sustituyó la glucosa por

sacarosa en la misma proporción), Agar-agar 40 g/L, agua hasta completar un litro]; la

temperatura promedio fue de 24oC y la humedad relativa entre 45 y 60 %. Toda la

vidriería y medios de cultivo utilizados se esterilizaron en una autoclave Figura 3-1.

Figura 3-1. C. acutatum conservado en PDA



_________________________________________________________________________

3.2.2. Evaluación de la toxicidad de los sustratos timol y carvacrol frente a los hongos C.

acutatum y B. theobromae.

Las evaluaciones se llevaron a cabo empleando la metodología de la placa perforada (ó

“agar envenenado”) y utilizando los frotis de los microorganismos realizados sobre PDA e

incubados durante 48 horas para C. acutatum y 24 horas para B. theobromae. Pasado

este tiempo, se retiraron con un sacabocados de 6 mm de diámetro los correspondientes

cilindros, que se utilizaron para inocular nuevas cajas que contenían el medio de cultivo y

timol o carvacrol a diferentes concentraciones que variaron en un rango entre 50 y 200

µg/mL. El inóculo se colocó en las perforaciones que se habían realizado previamente en

estas cajas, con un sacabocados de diámetro idéntico. La actividad antifúngica se

determinó midiendo los diámetros de crecimiento micelial cada 24 horas y durante un

tiempo de 10 días. Las evaluaciones se realizaron por triplicado, cada ensayo se respaldó

con los correspondientes controles (blanco absoluto y blanco solvente). La actividad

antifúngica de los sustratos se evaluó como el porcentaje de inhibición: 100 x (diámetro

promedio de crecimiento del micelio en el medio de control – diámetro promedio de

crecimiento del micelio en el medio del ensayo)/diámetro promedio de crecimiento del

micelio en el medio de control Figura3-2.

Figura 3-2. Evaluación de la toxicidad de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B. theobromae

Para el timol y carvacrol se construyeron las correspondientes curvas de toxicidad contra

el hongo, a partir de estas se determinó la concentración que produjo un porcentaje de

inhibición que osciló entre 50 y 60%; este valor se utilizó como concentración inicial del

sustrato en el proceso de biotransformación.


3.2.3. Biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos

fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae.

En los procesos de biotransformación se utilizó el medio de cultivo líquido Czapeck-Dox,

preparado con los siguientes componentes: (FUENTES DE CARBONO, disolución A):

Glucosa: 5 % (50 g/L), Extracto de Levadura: 0,1 % (1,0 g/L), (MICRONUTRIENTES,

disolución B): K2HPO4: 0,5 % (5 g/L), NaNO3: 0,2 % (2 g/L), MgSO4·7H2O: 0,05 %, (0,5 g/L,

500 mg/L), FeSO4·7H2O: 0.001% (0,01 g/L, 10 mg/L). El volumen de solución se ajustó con

agua destilada hasta alcanzar 1,0 L. En la formulación original se sustituyó la glucosa por

sacarosa en la misma proporción. En la preparación del medio de cultivo se esterilizaron

por separado las disoluciones A y B, para evitar el ennegrecimiento de la solución final; la

mezcla de los componentes se realizó antes de su utilización, mezclando partes iguales en

volumen de la disolución A y B Figura 3-3.

Los inóculos de C. acutatum y B. theobromae se obtuvieron a partir de los trozos de

cultivos esporulados, los cuales se depositaron en 6 Erlenmeyer de 1,0 L, conteniendo

cada uno 500 mL de medio. Los erlenmeyers inoculados se taponaron con tarugos de

algodón estéril y se preincubaron durante 10 días en un agitador orbital tipo shaker a 150

rpm; una vez terminado el periodo de preincubación, se retiró la biomasa mediante

filtración con un lienzo de nylon estéril y se transfirió a un nuevo medio de cultivo fresco.

Sobre este material se adicionó el timol y carvacrol disuelto en etanol al 50% v/v. La

biotransformación se realizó a 24°C con agitación a 120 rpm durante un periodo de 14

días; en el proceso se procuró que el hongo metabolizara la mayor parte del sustrato

Figura 3-3. Inóculos de los hongos C. acutatum y B. theobromae (periodo de incubación).



_________________________________________________________________________

Figura 3-4.

3.2.4. Evaluación del avance de la biotransformación de los sustratos timol

y carvacrol en el curso del tiempo.

Durante todo el proceso de biotransformación del timol y carvacrol, bajo las condiciones

descritas anteriormente, se realizaron muestreos cada 24 horas; en cada uno se retiró un

erlenmeyer de 100 mL con 50,0 mL de medio de cultivo, que incluía parte del micelio

durante 14 días. Este material se combinó con 50,0 mL de etanol al 95 % con la finalidad

de inhibir el proceso enzimático y detener la biotransformación. Cada una de las

muestras se saturó con cloruro de sodio (NaCl) y se extrajo con tres porciones de 50,0 ml

de acetato de etilo (AcOEt).

Los extractos se combinaron y secaron con sulfato de sodio anhidro y posteriormente se

filtraron y destilaron a presión reducida en un rotoevaporador. Cada extracto en AcOEt,

se redisolvió con 3,0 mL de cloroformo grado analítico, se filtró a través de un microfiltro

Whatman (0,45 μm) y analizó por CCF y CG-EM. La relación entre el sustrato y los

productos metabólicos se determinó con base en el área de los picos en CG. Los

productos puros que se lograron obtener mediante CCFP y CC se utilizaron como

patrones de referencia en el análisis CG-EM e igualmente se emplearon compuestos

Figura 3-4. Procesos de biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos

C. acutatum y B. theobromae.


puros obtenidos de marcas comerciales reconocidas. A partir de las estructuras de los

productos obtenidos y los experimentos realizados en el curso del tiempo, se planteó una

posible ruta metabólica para la biotransformación del timol y carvacrol frente a los

hongos fitopattógenos C. acutatum y B theobromae.

3.2.5. Extracción y purificación de algunos de los metabolitos mayoritarios

resultantes de la biotransformación

Después de transcurrido un tiempo de biotransformación de 14 días, los medios de

cultivo se filtraron a través de un lienzo de nylon fino, para retirar la mayor parte de la

biomasa (micelio); el filtrado se saturó con NaCl y AcOEt, y se sometió nuevamente a un

proceso de filtración utilizando tierra de diatomeas (celita).

El filtrado se reunió y se extrajo con tres volúmenes de AcOEt, en una proporción de 1/3

v/v. El extracto obtenido se denominó Fracción Neutra. El micelio obtenido se mezcló con

NaCl hasta saturación y se adicionó acetona hasta cubrirlo completamente. Se realizaron

tres extracciones con acetona, las cuales se reunieron y después de ser filtradas se

sometieron a destilación a presión reducida, con la finalidad de eliminar el solvente. El

extracto acuoso obtenido se extrajo con AcOEt por tres veces, diclorometano (CH2Cl2) dos

veces y se obtuvo la Fracción Micelio Todas las fracciones obtenidas, se analizaron

mediante cromatografía de capa fina comparativa, con la finalidad de determinar su

composición. La elusión de las placas se realizó con mezclas de polaridad creciente de n-

hexano, AcOEt y el revelado se efectuó con luz UV, vapores de yodo, FeCl3 (para visualizar

compuestos de tipo fenólico), y revelador universal. La separación y aislamiento de los

metabolitos se realizó mediante la aplicación de diferentes técnicas cromatográficas tales

como: Cromatografía de capa fina (CCF) y Cromatografía de Columna (CC) o exclusión

molecular en diferentes soportes tales como: sílica gel 60 (gel de sílice) y Sephadex LH-

20.

La elusión se realizó con solventes de polaridades crecientes para la CC de adsorción, y la



_________________________________________________________________________

mezcla n-hexano-CH2Cl2-metanol (2:1:1, v/v) y luego metanol para la CC de exclusión

molecular. Adicionalmente, las fracciones cromatográficas se purificaron por CCF, con el

propósito de obtener los metabolitos mayoritarios Figura 3-5.

Figura 3-5. Diagrama del proceso de extracción de los filtrados de los medios de cultivo.

-Extracción con Acetato de Etilo (3 x

2L)

EXTRACTO TOTAL ANHIDRO

-Destilación a presión reducida

EXTRACTO TOTAL CRUDO

-Filtración parcial sobre mallas de Nylon

FASE ACUOSA

(descartar)

EXTRACTO TOTAL

FILTRADO TRASLÚCIDO

vol. aprox. 4 L

MICELIO

(descartar)

EXTRACCION - FRACCIONAMIENTO

MEDIO DE CULTIVO: CZAPECK-DOX

INOCULO: Trozos de cultivo de placas

-Fermentación durante 15 dias en

erlermeyer-Luz difusa 24 horas

-Agitación orbital 120 rpm

-Volumen total de fermentación 4 litros

FILTRADO TURBIO

Vol. Aprox. 4L

MICELIO

(descartar)

-Na2SO4 Anhidro

-Filtración sobre papel de filtro

-NaCl hasta saturación

-Filtración sobre CELITA 545

-Extracción con Acetato de Etilo (3 x

2L)

EXTRACTO TOTAL ANHIDRO

-Destilación a presión reducida

EXTRACTO TOTAL CRUDO

-Filtración parcial sobre mallas de Nylon

FASE ACUOSA

(descartar)

EXTRACTO TOTAL

FILTRADO TRASLÚCIDO

vol. aprox. 4 L

MICELIO

(descartar)

EXTRACCION - FRACCIONAMIENTO

MEDIO DE CULTIVO: CZAPECK-DOX

INOCULO: Trozos de cultivo de placas

-Fermentación durante 15 dias en

erlermeyer-Luz difusa 24 horas

-Agitación orbital 120 rpm

-Volumen total de fermentación 4 litros

FILTRADO TURBIO

Vol. Aprox. 4L

MICELIO

(descartar)

-Na2SO4 Anhidro

-Filtración sobre papel de filtro

-NaCl hasta saturación

-Filtración sobre CELITA 545


3.2.6. Identificación de los productos mayoritarios aislados de las

biotransformaciones

La identificación estructural de los diferentes productos de biotransformación, se realizó

mediante la aplicación de técnicas espectroscópicas y espectrométricas modernas tales

como Espectrometría de Masas y Resonancia Magnética Nuclear (RMN 1H y RMN 13C).

3.2.7. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el

timol y carvacrol y evaluación de su actividad antifúngica contra los hongos

C. acutatum y B. theobromae

Entre los compuestos relacionados estructuralmente con el timol y carvacrol, se

prepararon los productos obtenidos mediante la biotransformación, con el fin de

confirmar su estructura (por co-elusión y propiedades espectroscópicas y

espectrométricas) y realizar un análisis de la actividad antifúngica contra C. acutatum.

Para ello se sintetizaron el timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter.

Adicionalmente, se empleó timoquinona comercial (Sigma-Aldrich), y se preparó y

purificó parcialmente la timohidroquinona. De otro lado, se sintetizaron algunos

derivados nitrados y bromados del timol y carvacrol. Una vez obtenidos los compuestos

relacionados estructuralmente con el timol y carvacrol, se determinó su actividad

antifúngica contra el hongo C. acutatum.

Los ésteres timil- y carvacril acetato se prepararon de la siguiente forma: a una solución

de timol o carvacrol (1,0 equiv) en diclorometano anhidro se agregó cloruro de acetilo

(1.1 equiv), y 3 gotas de piridina como catalizador. La mezcla se agitó continuamente a

0 ºC durante 6 h, el proceso de reacción se monitoreó por CCF. Después de terminada la

reacción, se inactivo agregando salmuera y se extrajo con CH2Cl2 (3x 25 mL). Por último,

la fase orgánica se lavó con agua destilada y se secó con sulfato de sodio anhidro. Luego,

se eliminó el solvente a presión reducida y se purifico por CC sobre sílica gel (fase móvil n-

hexano y n-hexano-AcOEt, 9:1 v/v).



_________________________________________________________________________

Los éteres metílicos timil- y carvacril metil éter, se prepararon disolviendo timol o

carvacrol en acetona (1,0 equiv), luego a la solución se le agrego carbonato de potasio y

se agito durante media hora a 0 ºC. Posteriormente, a la solución se agregó yoduro de

metilo (1,1 equiv) y se calentó a reflujo durante 6 h. El proceso de la reacción se

monitoreó por CCF. Finalmente, se agregó salmuera, se extrajo con CH2Cl2, y se secó con

sulfato de sodio anhidro. Luego se eliminó el solvente a presión reducida y se purifico por

CC en sílica gel usando n-hexano como fase móvil.

Para realizar las nitraciones del timol o carvacrol, se llevaron a enfriamiento (-5 ºC)

soluciones de cada compuesto (1,0 equiv) disueltos en ácido acético; y se agregó gota a

gota, lentamente y en agitación, la mezcla nitrante (ácido sulfúrico/ácido nítrico en

relación 10:1). Las reacciones se sometieron a agitación entre 4 y 6 h, realizándose un

seguimiento del progreso mediante CCF. Al finalizar este tiempo, se agregaron 20 mL de

solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3), y se extrajeron los compuestos con CH2Cl2

(3x25 mL). Por último se descartaron las fases acuosas y se secaron las fases orgánicas

con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4); el solvente se evaporó por completo mediante

destilación a presión reducida y los compuestos obtenidos se purificaron por CC.

Para la preparación de los productos bromados, se agregó a una solución de timol o

carvacrol (1,0 equiv.) en CH2Cl2 (5 mL), N-bromosuccinimida (1,2 equiv) y se sometió en

agitación a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó gota a gota 1 mL de H2O2 al

30%. Después de finalizada la reacción (entre 4 y 5 horas), se agregó salmuera y se

extrajo con CH2Cl2. El disolvente se evaporó a presión reducida y los compuestos se

purificaron por CC.

Discusión de resultados 44

_______________________________________________________________________ __

4. DISCUSION DE RESULTADOS

4.3. ASPECTOS GENERALES

Los hongos seleccionados para el presente trabajo crecieron satisfactoriamente en el

medio de cultivo solido PDA a una temperatura de 25º C y una humedad relativa entre 45

y 60%; así mismo, se observó un desarrollo adecuado de los microorganismos en el

medio liquido Czapeck-Dox.

4.2. TOXICIDAD DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL

FRENTE A LOS HONGOS C. acutatum Y B. theobromae.

La actividad antifúngica de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B.

theobromae se llevó a cabo utilizando la técnica de la placa perforada o también

conocida como “agar o alimento envenenado”; para ello se realizó un estudio preliminar

empleando concentraciones de los monoterpenos aromáticos desde 50 hasta 500 µg/mL.

Posteriormente, el rango de concentraciones se estrechó entre 50 y 200 µg/mL, debido a

la elevada toxicidad de los compuestos contra los dos microorganismos y su competa

inhibición entre 400 y 500 µg/mL. Los resultados de la actividad antifúngica de timol y

carvacrol contra C. acutatum y B. theobromae se presentan en las Figura 4-1 hasta Figura

4-4. Como se puede observar, el crecimiento micelial de estos hongos fue dependiente de

la concentración de ambos monoterpenos aromáticos en el medio de cultivo. A 150

µg/mL o más, timol y carvacrol inhibieron el crecimiento radial de C. acutatum por

completo y este efecto se mantuvo durante las 240 h del experimento Figura 4-1. Además,

C. acutatum inició su crecimiento pasadas 48 y 96 h posteriores a la inoculación, cuando

se trató con timol y carvacrol a 100 µg/mL, respectivamente. Además, los porcentajes de

inhibición Figura 4-2 de C. acutatum a 75 µg/mL estuvieron entre 25 y 30% para carvacrol,

y entre 50 y 60% para timol. Esto muestra una mayor actividad antifúngica de timol en



_________________________________________________________________________

comparación con carvacrol frente a C. acutatum. Los porcentajes de inhibición de C.

acutatum alcanzados por timol y carvacrol a 100 µg/mL durante los 10 días de evaluación,

oscilaron entre 86,0 (día 1) y 55,0% (día 10), y entre 63,0 (día 1) y 30,5% (día10), respectivamente. Como se

puede apreciar de la figura, la inhibición del crecimiento micelial decreció con el tiempo

para las concentraciones menores a 150 µg/mL.

Figura 4-1. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C.

acutatum.

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Cre

cim

ien

to m

ice

lial r

adia

l (m

m)

.

Tiempo (h)

Control

Controlethanol50 μg/mL 75 μg/mL 100 μg/mL 125 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL

Carvacrol - C. acutatum

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240Cre

cim

ien

to m

ice

lial r

adia

l (m

m)

.

Tiempo (h)

Control

Controlethanol50 μg/mL 75 μg/mL 100 μg/mL 125 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL

Timol - C. acutatum


_______________________________________________________________________ __

.

En el caso de B. theobromae, el crecimiento se inhibió completamente a una

concentración de 150 y 200 µg/mL de carvacrol o timol. Para B. theobromae, sólo

pequeñas diferencias se encontraron en el porcentaje de inhibición entre timol y

carvacrol Figura 4-3. La inhibición del crecimiento de B. theobromae por timol a 100 µg/mL

y durante 6 días alcanzó valores entre 97,7 (día 1) y 86,5% (día 6), mientras que para

carvacrol los valores oscilaron entre 93,2 (día 1) y 69,1% (día 6). En general, los

porcentajes de inhibición del crecimiento de B. theobromae, al igual que con C. acutatum,

alcanzados por timol y carvacrol a 100 µg/mL disminuyeron con el tiempo Figura 4-4. Este

hallazgo sugiere que ambos hongos poseen un mecanismo de desintoxicación de timol y

carvacrol. Distintos estudios indican que la posición del grupo hidroxilo es muy

importante en la actividad antifúngica e insecticida del timol y carvacrol (100).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24

48

72

96

12

0

14

4

16

8

19

2

21

6

24

0

50 75 100

125 150 200

Carvacrol - C. acutatum

Tiempo ( h)

% de inibición

0

20

40

60

80

100

24

48

72

96

120

144

168

192

216

240

50 75 100125 150 200

% de inhibición

Tiempo ( h)

Timol- C. acutatum

Figura 4-2. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C. acutatum.



_________________________________________________________________________

Figura 4-3. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B.

theobromae.

0

10

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50

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0 24 48 72 96 120 144

Cre

cim

ien

to m

ice

lial r

adia

l (m

m)

.

Tiempo (h)

Control

Controlethanol

50 μg/mL

75 μg/mL

100 μg/mL

150 μg/mL

200 μg/mL

Carvacrol - B. theobromae

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 24 48 72 96 120 144

Cre

cim

ien

to m

ice

liar

rad

ial

(mm

) .

Tiempo (h)

Control

Controlethanol50 μg/mL

75 μg/mL

100 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL

Timol - B. theobromae


_______________________________________________________________________ __

En general, los resultados revelan que carvacrol y timol muestran un efecto antifúngico

relativamente alto contra C. acutatum y B. theobromae. La actividad antifúngica de timol

y carvacrol contra otros hongos fitopatógenos también ha sido investigada [ (101), (102)].

En particular, timol y carvacrol mostraron una fuerte actividad antifúngica contra

Phytophthora cactorum y Cryphonectria parasitica a 28 x 10-3 µg/mL (100), se inhibieron

completamente Alternaria arborescens y Rhizopus stolonifer (103). Además, se han

reportado propiedades antimicrobianas para el timol y carvacrol contra bacterias

involucradas en la putrefacción y patogenización de alimentos, por lo que se ha sugerido

su uso como conservante (104). El modo de acción del carvacrol y timol es aún incierto;

sin embargo, la actividad podría estar relacionada con la hidrofobicidad y, en

consecuencia, la capacidad de ambos compuestos para atravesar la membrana celular de

los hongos (105), lo que afecta a la homeostasis del pH y el equilibrio de los iones

inorgánicos, dañando las estructuras celulares [ (106), (69)]. Por otra parte, la

participación del grupo hidroxilo en la formación de enlaces de hidrógeno y la acidez de

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24 48 72 96 120 144

50 75 100

150 200

Tiempo ( h )

% de inhibición

Timol - B.theobromae

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24 48 72 96 120 144

50 75 100

150 200

Tiempo ( h)

% de inhibición

Carvacrol - B.theobromae

Figura 4-4. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B. theobromae.



_________________________________________________________________________

estos compuestos fenólicos pueden ser otro factor importante que participa en la

bioactividad (106) han sugerido que el carvacrol actúa como un intercambiador de

protones, lo que reduce el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática. Esto

lleva al colapso de la bomba de protones y al agotamiento de la reserva de ATP, causando

la muerte celular. Además, parece posible que ambos compuestos puedan interferir en la

actividad de enzimas α- y β-glucanasas del hongo (107). Con base en la actividad

antifúngica de timol y carvacrol contra C. acutatum y B. theobromae, se seleccionaron

como concentraciones para los estudios metabólicos 80 y 125 µg/mL respectivamente

4.3. BIOTRANSFORMACIONES LOS SUSTRATOS TIMOL Y

CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS C. acutatum Y B.

theobromae.

4.3.1 Extracción, aislamiento e identificación de productos

La biotransformación se llevó a cabo en medio líquido Czapeck-Dox, empleando las

concentraciones seleccionadas para timol y carvacrol. Además, se realizó un control (sin

sustrato) con el fin de comparar la presencia/ausencia de los productos metabólicos. Los

extractos orgánicos obtenidos se evaluaron por CCF y CG-EM. Debido a la limitada

biotransformación de los monoterpenos aromáticos empleados y su buena actividad

antifúngica, no fue posible aislar los metabolitos en cantidad suficiente como para

realizar su elucidación estructural sin ambigüedades por resonancia magnética nuclear

directa. Por lo anterior, se hizo necesario llevar a cabo la identificación por comparación

de los espectros de masas con aquellos reportados por la base de datos NIST 2002.

Además, los compuestos se confirmaron por co-elusión con muestras auténticas

comerciales u obtenidas por vía sintética. En las Tabla 4-1 a Tabla 4-4, se presentan los

metabolitos detectados y tentativamente elucidados resultantes de la biotransformación.


_______________________________________________________________________ __


productos detectados en la biotransformación de carvacrol con C. acutatum.

Compuesto

No.

TR (min) m/z de iones fragmentados (%intensidad

relativa)

Identificación

(CC1) * 18,94

166 (M+) [47], 152 [14], 151 (M+−CH3) [100],

137, 123 (M+−C3H7) [10], 95 (10), 83 [10], 77,

71, 69, 57, 55, 43 (C3H7+) [14], 41 [10].

Timohidroquinona

(CC2) ‡ 16,96

166 (M+) [24], 151 (M+−CH3) [41], 138 [21],

107 [71] (M+−C3H6O−H), 83, 77, 57, 43 (C3H7+)

(100).

5-(1-Hidroxi-1-

metil-etil)-2-metil-

fenol

(CC3) ‡ 19,34

164 (M+) [100], 149 (M+−CH3) [30], 147

(M+−OH) *12+, 137 *11+, 121 (M+−C3H7) [26],

107, 91 (C7H7+) [19], 77 (C5H5

+) [11], 57, 55, 39.

2-Isopropenil-5-

metil-benceno-1,4-

diol

(CC4) † , * 17,50

164 (M+) [100], 149 (M+−CH3) [40], 121

(M+−C3H7) [27], 103, 91 (C7H7+) [16], 77 (C5H5

+)

[11], 43.

Carvacril metil eter

(CC5) † ,* 14,05

164 (M+) [63], 149 (M+−CH3) [70], 136

(M+−CO) *40+, 135 (M+−HCO) *51+, 121

(M+−C3H7) [81], 108 (M+−CO−C2H4) [29], 107

[25], 93 [100], 91 (C7H7+) [61], 79 [35], 77

(C5H5+) [47], 68 [45], 39 [85].

Timoquinona

(CC6) † , * 13,28

192 (M+) [7], 150 (M+−H2C2O) [58], 135

(M+−H2C2O−CH3) [100], 91 (C7H7+) [14], 83, 77

(C5H5+), 44.

Carvacril acetato

Identificado por: *, comparación con estándar autentico y RMN; †, comparación con espectro de masas reportado en la literatura; ‡,

estructura derivada de la interpretación del espectro de masas.



_________________________________________________________________________


productos detectados en la biotransformación de timol con C. acutatum.

Compuesto

No.


relativa)

Identificación

(TC1) ‡ 19,36

166 (M)+ [40], 151 (M+−CH3) [100], 133

(M+−H2O−CH3) [9], 121 (M+−H2CO−CH3)

[20], 107 (M+−H2CO−C2H4−H) *8+, 105

[8], 103 [8], 95 [10], 91 [10], 77 (C6H5+)

[18].

2-(1-

hidroxipropan-

2-il)-5-

metilfenol

(TC2) * 18,85

166 (M)+ [42], 151 (M+−CH3) [100], 142

[20], 123 (M+−C3H7) [7], 77 (C6H5+) [9],

43 (C3H7+) [22].

Timohidroquina

(TC3) * 18,33

164 (M)+ [41], 149 (M+−CH3) [100], 135

[29], 121 (M+−C3H7) [29], 105 [38], 103

[24], 91 (C7H7+) [46], 77 (C6H5

+) [36], 43

(C3H7+) [81].

Timil metil

51ter


estructura derivada de la interpretación del espectro de masas


_______________________________________________________________________ __

Tabla 4-3.Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los

productos detectados en la biotransformación de carvacrol con B. theobromae.

Compuesto

No.


relativa)

Identificación

(CB1) ‡ 19,25

166 (M+) [28], 135 (M+−H2CO−H) *100+, 115

[11], 105 (M+−H2O−C2H4−CH3) [32], 91

(C7H7+) [22], 79 [8], 77 (C6H5

+) [10].

5-(2-hidroxi-1-

metil-etil)-2-

metil-fenol

(CB2) * 18,94

166 (M+) [39], 151 (M+−CH3) [100], 123

(M+−C3H7) [13], 95, 85, 71, 57 [17], 43

(C3H7+) [15], 41 [12].

Timohidroquinon

a

(CB3) ‡ 18,35

166 (M+) [29], 148 (M+−H2O) [56], 133

(M+−H2O−CH3) [21], 105 [100], 91 (C7H7)+

[19], 83, 77 (C6H5+) [25], 57 [14], 43 (C3H7

+)

[15].

2-hidroximetil-5-

isopropil-fenol

(CB4) ‡ 16,96

166 (M+) [24], 151 (M+−CH3) [41], 138 [16],

107 [71], 91 (C7H7+) [15], 77 (C6H5

+) [24], 71,

65, 57, 43 (C3H7+) [100].

5-(1-Hidroxi-1-

metil-etil)-2-

methyl-phenol

(CB5) †, * 14,05

164 (M+) [94], 149 (M+−CH3) [100], 135 [24],

121 (M+−C3H7) [29], 103 [25], 91 (C7H7)+

[30], 77 (C6H5+) [33], 65 [13].

Timoquinona

(CB6) ‡ 14,15

148 (M+) [100], 133 (M+−CH3) [44], 108 [29],

107 (M+−C3H5) [22], 105 [30], 91 (C7H7+)

[22], 77, 57 [20], 43, 41 [14].

5-Isopropenil-2-

metil-fenol

(CB7) †, * 13,28

192 (M+) [7], 150 (M+−H2C2O) [58], 135

(M+−H2C2O−CH3) [100], 91 (C7H7+) [14], 83,

77 (C5H5+), 44.

Carvacril acetato





_________________________________________________________________________


productos detectados en la biotransformación de timol con B. theobromae.

Compuesto

No.


relativa)

Identificación

(TB1) ‡ 19,36

166 (M)+ [40], 151 (M+−CH3) [100], 133

(M+−H2O−CH3) [9], 121 (M+−H2CO−CH3)

[20], 107 (M+−H2CO−C2H4−H) *8+, 105 *8+,

103 [8], 95 [10], 91 (C7H7+) [10], 77 (C6H5

+)

[18].

2-(1-

hidroxipropan-2-

il)-5-metilfenol

(TB2) * 18,94 166 (M)+ [42], 151 (M+−CH3) [100], 142 [20],

123 [7], 77 (C6H5+) [9], 43 [22].

Timohidroquinon

a

(TB3) ‡ 14,08

168 (M)+ [7], 153 (M+−CH3) [13], 150

(M+−H2O) [47], 139 [9], 135 (M+−H2O−CH3)

[41], 126 (M+−C3H6) [100], 111 [42], 104

[55], 97 [37], 91 (C7H7+) [25], 83 [65], 69

[30], 55 [31], 43 [26], 41 [31].

4-Hidroxi-3-

isopropil-6-metil-

ciclohex-2-enona

o isómero de

posición

(TB4) *, † 13,28

192 (M)+ [6], 150 (M+−H2C2O) [34], 135

(M+−H2C2O−CH3) [100], 115 [10], 105, 91

(C7H7+) [15], 77 (C6H5

+) [7].

Timil acetato

(TB5) ‡ 13,88

168 (M)+ [6], 153 (M+−CH3) [12], 150

(M+−H2O) [49], 139 [8], 135 (M+−H2O−CH3)

[31], 126 (M+−C3H6) [100], 111 [41], 107

[24], 97 [37], 83 [55], 69 [32], 55 [34], 43

[43].

4-Hidroxi-6-

isopropil-3-metil-

ciclohex-2-enona

o isómero de

posición

(TB6) ‡ 13,04

182 (M)+ [7], 140 (M+−H2C2O) [20], 139

(M+−H2C2O−H) *15+, 122 *19+, 112 *25+, 111

(M+−H2C2O−C2H4−H) *100+, 96 *39+, 83 *19+,

96 [39], 83 [18].

2-Hidroximetil-5-

isopropil-

benceno-1,4-diol




_______________________________________________________________________ __

4.3.2 Análisis espectroscópicos de los metabolitos obtenidos en la biotransformación

Para aclarar el mecanismo de detoxificacion de los sustratos timol y carvacrol con los

hongos C. acutatum y B. theobromae se realizó una comparación por CCF y CG entre el

extracto obtenido a partir de la biotransformación y el control. Los resultados muestran

que el carvacrol fue transformado por C .acutatum en seis metabolitos principales y otros

productos detectados en menor proporción Figura 4-5. Las estructuras de estos

compuestos se determinaron a partir de la interpretación de los datos espectrales (EM y

RMN), y la comparación con muestras auténticas.

Dos compuestos (CC1 y CC2), tienen una fórmula molecular C10H14O2 basado en su

espectro de masas, M+ = 166 uma. El ion molecular es de 16 unidades de masa (1

oxígeno) superior a la del compuesto original (el carvacrol), lo que indica la adición de un

(i

(ii

(iii)

CC3

CC1

CC4 CC2

CC5 CC6

(C)

Figura 4-5. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de carvacrol con C. acutatum después: 2

(i), 7 (ii), y 14 días (iii).



_________________________________________________________________________

grupo hidroxi a la estructura del sustrato. El metabolito (CC1) tiene un ion fragmento a

m/z 151 (pico base) atribuido a la pérdida de grupo metilo. Además, picos de baja

intensidad en m/z 123 y 43 uma correspondiente a la pérdida de grupo isopropilo y

formación de catión isopropilo, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CC1)

se identificó tentativamente como 2-metil-5-isopropilhidroquinona (timohidroquinona)

Tabla 4-5.

Tabla 4-5. Espectro de masas y estructura de timohidroquinona.

Masas

OH

OH

CC1

Desafortunadamente, la baja abundancia de (CC1) en la biotransformación impidió el

aislamiento y caracterización espectroscópica sin ambigüedades. Por lo tanto, se requirió

de la preparación de este compuesto por oxidación de timoquinona, empleando dicloro-

diciano-quinona (DDQ). Su presencia en la biotransformación se confirmó por

comparación en CCF del extracto proveniente de la biotransformación y la mezcla de

reacción de la timoquinona y DDQ. Además, el espectro de masas y tiempo de retención

para (CC1) fueron consistentes con los de la timohidroquinona sintética. La

timohidroquinona se reportó anteriormente como un producto metabólico en la

biotransformación de timol y carvacrol con una cepa de Pseudomonas (108). De manera

similar, el producto metabólico (CC2) dio iones fragmentados m/z 43 (pico base) y 151

que indica la formación de catión isopropilo y la pérdida de grupo metilo. Además, un

pico m/z 107 (ausente en CC1) correspondiente a la pérdida de (CH3)2CO y el radical

hidrógeno. Este metabolito se identificó 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol Tabla 4-6.


_______________________________________________________________________ __

Tabla 4-6. Espectro de masas y estructura de 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol.

Masas

OH

OH

CC2

Tres compuestos (CC3, CC4 y CC5) presentan una fórmula molecular C10H12O2 en

concordancia con el ión molecular, M+ = 164 uma. El metabolito (CC3) tiene iones

fragmentados m/z 149, 147, 121 y atribuye a la pérdida de metilo, grupos hidroxilo e

isopropilo, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CC3) se ha dilucidado

tentativamente a ser 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol Tabla 4-7.

Tabla 4-7. Espectro de masas y estructura de 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol.

Masas

OH

OH

CC3

El compuesto metabólico (CC4) corresponde al derivado metilado de carvacrol, metil

carvacril éter. Los fragmentos en m/z 149 (M+ -CH3), 121 (M+-C3H7), 91 (C7H7+) y 77 (C5H5

+)

confirman esta propuesta. Además, el compuesto (CC4) se identificó por comparación del

tiempo de retención en CG y CCF con una muestra auténtica. Los datos de RMN se

presentan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.14 (d, 6H, J = 7.0), 2.24 (s, 3H),

2.85 (sept, 1H, 7.0), 3.90 (s, 3H), 6.88 (d, 1H, J = 2.0), 7.13 (dd, 1H, J = 7.8, 2.0), 7.27 (d,

1H, J = 7.8) Tabla 4-8. El espectro de masas del producto (CC5) se caracterizó

principalmente por los iones fragmento a m/z 149, 136 y 121 correspondientes a la

pérdida de grupo metilo, monóxido de carbono, y el grupo isopropilo, respectivamente.

La comparación del espectro de masas de (CC5) con lo reportado en la biblioteca



_________________________________________________________________________

espectral NIST 2002, indicó que el compuesto corresponde con la timoquinona. Además,

el metabolito (CC5) presentó el mismo tiempo de retención en CG, e igual factor de

retención (Rf) en CCF que una muestra auténtica de timoquinona (Sigma-Aldrich). Los

datos de RMN son: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.10 a 1.30 (d, 6H), 2.24 (s, 3H), 3.10 a

3.20 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.64 (s, 1H) Tabla 4-9.

Tabla 4-8. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de metil carvacril éter.

Masas

1H RMN

OCH3

CC4

Tabla 4-9. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de Timoquinona

Masas

1H RMN

O

O

CC5


_______________________________________________________________________ __

La timoquinona se reportó anteriormente como un producto de la biotransformación de

timol con microalgas inmovilizadas durante 24 horas (109). La biotransformación máxima

se llevó a cabo por Synechococcus sp. MCCS 034 con un 1,5% de eficiencia en la

producción de timoquinona. Los autores encontraron que el timol se convirtió

débilmente en timoquinona y se sugirió que este bajo nivel de transformación puede ser

debido a la toxicidad de timol.

La fórmula molecular del compuesto (CC6) es C12H16O2 sobre la base de su espectro de

masas (M+ = 192 uma). Adicionalmente se apreció un ion fragmento (m/z = 150 uma),

que corresponde a la pérdida de una molécula neutra de ceteno (M+ - CH2=C=O). Estos

datos espectrales sugieren la presencia del grupo acetilo. El metabolito (CC6) fue

identificado como carvacril acetato.

La estructura de (CC6) se confirmó por co-elución en CCF y CG con una muestra auténtica

de carvacril acetato. Los datos de RMN se presentan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300

MHz): δ 1.32 (d, 6H, J = 7.0), 2.22 (s, 3H), 2.37 (s, 3H), 2.95 (sept, 1H, J = 7.0), 6.94 (d, 1H, J

= 2.0), 7.10 (dd, 1H, J = 8.0, 2.0), 7.23 (d, 1H, J = 8.0); 13C RMN (CDCl3, 75 MHz): 16.2, 21.3,

24.4, 34.0, 120.2, 124.6, 127.6, 131.4, 148.5, 149.8, 169.7. Tabla4-10.

Algunos de estos mismos metabolitos se encontraron también en la biotransformación

de carvacrol utilizando B. theobromae. De hecho, los tiempos de retención (TR) y

espectros de masas de (CC1), (CC2), (CC5), y (CC6) fueron similares a los obtenidos para

(CB2), (CB4), (CB5), y (CB7), respectivamente. Además, la timohidroquinona se detectó

en un medio de cultivo de B. theobromae conteniendo timol.



_________________________________________________________________________


13C RMN y estructura de carvacril acetato.

Masas

O

O

CC6

1H RMN 13C RMN

Usando timol como sustrato (a 80 µg/mL) y C. acutatum como biocatalizador, se

obtuvieron tres metabolitos mayoritarios (TC1, TC2, y TC3) y muchos compuestos

minoritarios, que fueron detectados por un análisis de CG. El espectro de masas del

metabolito (TC1) exhibió un ión molecular a m/z = 166 (M)+ y un patrón de fragmentación

consistente con la pérdida de un grupo metilo (M + - 15, m/z = 151), para dar un ion

fragmento abundante (pico base), la pérdida de grupo metilo y agua (M + - 18 - 15), y la

pérdida de acetaldehído y radical hidrógeno (en m/z = 121 uma). Como resultado, el

metabolito (TC1) se identificó tentativamente como 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-

fenol Tabla 4-11.

Tabla 4-11. Espectro de masas y estructura de 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-fenol.

Masas

OH

OH

(TC1)


_______________________________________________________________________ __

El compuesto (TC2) mostró un tiempo de retención (TR) y espectro de masas

indistinguible del obtenido para una muestra auténtica de timohidroquinona, (CC1) =

(TC2). Además, el metabolito (TC3) se identificado mediante la comparación del tiempo

de retención de CG con una muestra auténtica de timil metil éter. Los datos de RMN

correspondientes se describen a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.22 (d, 6H, J

= 7.0), 2.33 (s, 3H), 3.37 (sept, 1H, J = 7.0), 3.80 (s, 3H), 6.79 (d, 1H, J = 8.0), 6.92 (dd, 1H, J

= 8.0, 2.0), 7.05 (d, J = 8.0). 13C RMN (CDCl3, 75 MHz): δ 21.3, 23.5, 27.6, 56.3, 112.3,

125.9, 126.6, 137.0, 137.5, 158.4 Tabla 4-12.


13C RMN y estructura de Timil metil eter.

Masas

O

(TC3)

1H RMN

13C RMN

Del mismo modo, la transformación microbiana de carvacrol por B. theobromae mostro

siete metabolitos principales. Los productos metabólicos (CB2), (CB4), (CB5) y (CB7)

mostraron tiempos de retención y espectro de masas idénticos a los observados para

timohidroquinona, 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol, timoquinona, y carvacril

acetato, respectivamente. Además, la identificación de (CB5) y (CB7) se confirmó por

coelución en CG con estándares auténticos. Además, la estructura de (CB1), (CB3), y

(CB6) se derivó a partir de sus espectros de masas. El metabolito (CB1) presentó una

fórmula molecular C10H14O2 consistente con el ion molecular, M + = 166 uma. Además,



_________________________________________________________________________

este compuesto mostró iones fragmento a m/z = 135, coherentes con la pérdida de H2CO

y radical hidrógeno, y m/z 105 atribuibles a la perdida de agua, etileno y radical metilo.

Así, (CB1) se sugirió como el 5-(2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol Tabla 4-13.

Tabla 4-13. Espectro de masas y estructura de 5 - (2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol.

Masas

OH

OH

(CB1)

El metabolito (CB3) tiene una fórmula molecular (C10H14O2; M+ = 166) y iones fragmentos

a m/z 148 (M+ - 18), 133 (M+ - 18 - 15), y 105 (M+ - 18 - 28 - 15), atribuidos a las pérdidas

de agua, agua junto con el radical metilo, y agua, etileno y radical metilo,

respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CB3) se elucidó tentativamente como

2-hidroximetil-5-isopropil-fenol Tabla 4-14.

Tabla 4-14. Espectro de masas y estructura de 2-hidroximetil-5-isopropil-fenol

Masas

OH

OH

(CB3)

El compuesto metabólico (CB6) tiene una fórmula molecular C10H12O basado en su

espectro de masas, (M)+ = 148 uma. El ion molecular es 2 unidades de masa (2H) menor

que la del compuesto de partida (carvacrol), lo que indica la eliminación de hidrógeno a

partir de carvacrol. El metabolito (CB6) tiene iones fragmento a m/z 133 y 107

atribuibles, en ese orden, a la pérdida de los radicales metilo e isopropileno. A partir de

los datos espectrales, (CB6) se ha identificó como 5-isopropenil-2-metil-fenol Tabla 4-15.


_______________________________________________________________________ __

Tabla 4-15. Espectro de masas y estructura de 5-isopropenil-2-metil-fenol

Masas

OH

(CB6)

La comparación del espectro de masas con el reportado en la biblioteca espectral NIST

2002 indicó que (CB7) es el timil acetato. Además, el compuesto (CB7) se identificó

mediante la comparación del tiempo de retención en CG con una muestra auténtica. Los

datos de RMN se reportan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.22 (d, 6H, J =

7.0), 2.38 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 3.05 (sept, 1H, J = 7.0), 6.89 (d, 1H, J = 2.0), 7.11 (dd, 1H, J =

8.0, 2.0), 7.29 (d, 1H, J = 8.0). Cabe destacar que los datos sólo tentativamente sugieren la

identidad de estos metabolitos Tabla4-16.

Tabla 4-16. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de carvacril acetato

Masas

1H RMN

O

O

(CB7)



_________________________________________________________________________

En la incubación de timol con B. theobromae, se detectaron por análisis de CG-EM seis

metabolitos mayoritarios Figura 4-6. Los compuestos (TB2) y (TB4) se identificaron

mediante la comparación de los tiempos de retención de CG con los de muestras

auténticas. Las estructuras de (TB1), (TB3), (TB5), y (TB6) se obtuvieron a partir de sus

espectros de masas.

El metabolito (TB1) se detectó previamente utilizando C. acutatum como biocatalizador y

se identificó como 2-(1-hidroxipropano-2-il)-5-metilfenol. Por otro lado, la fórmula

molecular de los compuestos (TB3) y (TB5) ha demostrado ser C10H16O2 en base a su

espectro de masas (M+ = 168 uma). Estos productos metabólicos dan iones fragmento a

m/z 153, 150, y 135 que indican en ese orden, la pérdida de radical metilo, agua, y

ambos.

Figura 4-6. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de timol con B. theobromae después: 2

(i), 7 (ii), y 14 días (iii).

(i)

(ii)

(iii)

TB2

TB1

TB6 TB4

TB3 TB5

(T)


_______________________________________________________________________ __

Además, un pico prominente en m/z = 126 (pico base), correspondiente a un fragmento

de fisión del anillo. Aunque estos datos no permiten una identificación definitiva,

sugieren una hidroxi-ciclohexenona sustituida como el esqueleto estructural de los

metabolitos (TB3) y (TB5) Tabla 4-17.

Tabla 4-17. Espectros de masas y estructuras de 4-Hidroxi-3-isopropil-6-metil-ciclohex-2-enona y 4-Hidroxi-

6-isopropil-3-metil-ciclohex-2-enona

TB3

O

OH

(TB3)

TB5

O

OH

(TB5)

Además, el metabolito (TB6) presentó una fórmula molecular C10H14O3 consistente con el

ion molecular, M+ = 182 uma. El espectro de masas mostró iones fragmento a m/z 140,

139, 111 (pico base), y 96 entre otros, que corresponden a la pérdida de la molécula

neutra de ceteno (M+-CH2=C=O), ceteno y radical hidrógeno, ceteno + etileno + radical

hidrógeno, y M+-C5H10O, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (TB6) se

elucidó tentativamente como 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1,4-diol Tabla 4-18.



_________________________________________________________________________

Tabla 4-18. Espectro de masas de 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1 ,4-diol.

OH

OH

OH

4.3.3 Experimento curso en el tiempo

Luego de precultivado, el hongo C. acutatum se transfirió a 14 matraces Erlenmeyer de

500 mL que contenían 125 mL de medio líquido Czapeck-Dox y el sustrato (timol o

carvacrol), y se agitaron bajo las mismas condiciones que para el precultivo durante 14

días. El medio de cultivo de cada matraz se retiró cada día, se saturó con NaCl, se extrajo

con AcOEt y CH2Cl2, y el disolvente se evaporó posteriormente. Los extractos se

analizaron por CCF y CG. Las relaciones entre el sustrato y los productos metabólicos se

determinaron sobre la base de las áreas de los picos de CG. También se realizó un control

carente del sustrato y bajo las mismas condiciones de agitación.

El estudio en el curso del tiempo de los cambios en la concentración relativa de timol y

carvacrol y los metabolitos se registró cualitativamente por CCF y se midió

cuantitativamente por CG Figura 4-7 a-d. El sustrato de partida, carvacrol, se consumió

lentamente por ambos hongos. El hongo B. theobromae sólo transformó alrededor del

50% de carvacrol después de 14 días, siendo principalmente convertido en (CB1) y (CB4).

Sin embargo, la abundancia relativa de ambos metabolitos fue siempre inferior al 20%.

Como se muestra en la Figura 4-7 a, los otros metabolitos alcanzaron niveles muy bajos.

Por otra parte, C. acutatum metabolizó carvacrol de una manera muy baja, aunque lo

hizo más rápido que B. theobromae; curiosamente, algunos metabolitos producidos a

partir de carvacrol usando C. acutatum como biocatalizador, no se detectaron en el


_______________________________________________________________________ __

cultivo de B. theobromae con el mismo sustrato.

De acuerdo con la Figura 4-7b, el carvacrol se transformó mayoritariamente por C.

acutatum en (CC4) (~ 12%), y aproximadamente el 60% del sustrato se consumió durante

los 14 días del estudio. Estos resultados sugieren que bajo las condiciones utilizadas,

carvacrol pudo ser lentamente destoxificado por los hongos fitopatógenos, C. acutatum y

B. theobromae. Este factor es importante si se desea emplear este monoterpeno

aromático fenólico para el control de enfermedades ocasionadas por ambos hongos.

En general, el carvacrol fue metabolizado a una velocidad superior que el timol. Como se

puede ver en la Figura 4-7c, el timol se transformó sólo en aproximadamente un 50%

después de 14 días de evaluación, utilizando C. acutatum como biocatalizador. El

producto metabólico mayoritario correspondió al (TB1), el cual alcanzó una abundancia

relativa de alrededor del 20% después de 11 días. Además, los metabolitos (TB2), (TB3),

(TB4), (TB5), y (TB6) presentaron abundancias relativas inferiores al 10% durante el

tiempo de análisis.

Parece digno de mención que el timol fue consumido por B. theobromae en un grado

muy inferior al encontrado en la biotransformación con C. acutatum. De hecho, el análisis

de los extractos obtenidos a partir de cultivos del hongo C. acutatum incubados con timol

mostró que éste fue metabolizado débilmente (<90%) Figura 4-7. Además, algunos

metabolitos detectados previamente en la incubación de timol con B. theobromae

estuvieron ausentes en la biotransformación con C. acutatum.



_________________________________________________________________________

Figura 4-7. Evolución en el tiempo de la transformación microbiana de: carvacrol por B. theobromae (a) y C.

acutatum (b); y timol por B. theobromae (c) y C. acutatum (d).

4.3.4 Posible ruta metabólica

La diferencia marcada entre el metabolismo de carvacrol y timol por C. acutatum puede

resultar de la mayor toxicidad (actividad antifúngica) de timol contra este hongo

patógeno. De la misma manera, las pequeñas diferencias entre el metabolismo de ambos

compuestos por B. theobromae son consistentes con las similitudes observadas en la

actividad antifúngica contra este microorganismo. Basados en las estructuras de los

metabolitos identificados, se propuso una posible ruta metabólica para la

biotransformación de carvacrol y timol con C. acutatum y B. theobromae Figura 4-8


_______________________________________________________________________ __

OH

O

HO

HO

OH O

O

OH

HO

O

O

OH

HO

OH OH

OH

OH

OH

OHO

OH

HO

B. theobromae

C. acutatum

B. theobromae

C. acutatum

C. acutatum

B. theobromae

B. theobromae

B. theobromae

B. theobromae

B. theobromae

C. acutatum

C. acutatum

C. acutatum

B. theobromae

B. theobromae

C. acutatum

B. theobromae

C. acutatum

O

O

B. theobromae

B. theobromae

(CC4)

(CC1)=(TC2)=(CB2)=(TB2)

(CC2)=(CB4)

(CC3) (CC5)=(CB5)

(CC6)=(CB7)

OH

OH

(TC1)=(TB1)

C. acutatum

(TC3)

(CB1)

(CB3)

(CB6)

(TB4)(TB6)

O

HO

O

HO

(TB5)

(TB3)

B. theobromae

B. theobromae

(C)

(T)

Figura 4-8 Posible ruta metabólica de carvacrol (denotado como C) y timol (T) con C. acutatum y B.

theobromae



_________________________________________________________________________

En general, se hace evidente que la hidroxilación del anillo aromático y las cadenas

alifáticas, así como la metilación y acetilación del grupo hidroxilo, representan la principal

ruta metabólica de carvacrol y timol para ambos hongos fitopatógenos. Estas

transformaciones pueden ser el resultado de un proceso de desintoxicación de ambos

compuestos fenólicos por C. acutatum y B. theobromae. Estudios recientes han

demostrado la necesidad del grupo hidroxilo del carvacrol para la actividad

antimicrobiana [ (110), (106)]. La eliminación del grupo hidroxilo mediante la sustitución

con el éter de metilo o un grupo éster metílico afecta a la hidrofobicidad de la molécula y

el tamaño del sustituyente de anillo, lo cual puede tener una influencia importante en

interacciones específicas con las células microbianas (111), encontraron que el éter

metílico del carvacrol, que contiene un grupo éter en lugar del grupo hidroxilo libre, no

inhibió el crecimiento de B. cereus a las concentraciones evaluadas (0 a 10 mM), mientras

que no se observó crecimiento microbiano cuando se empleó carvacrol a

concentraciones de 0,75 mM y superiores. Además, (TC3), (TB4), y (CC6) = (CB7), no

tienen la capacidad de liberar un protón y comportarse como intercambiadores de

protón, uno de los modos de acción antimicrobiano asociados al carvacrol.

La eliminación de los sustituyentes del anillo de carvacrol (usando 3-isopropilfenol y o-

cresol) conduce a una reducción en la actividad antimicrobiana (106). Por lo tanto, la

hidroxilación en las cadenas alifáticas de carvacrol y timol puede ser un mecanismo

utilizado por C. acutatum y B. theobromae, para reducir la actividad antifúngica. Estas

transformaciones microbianas pueden afectar las características estructurales de estas

moléculas anfipáticas asociadas con el mecanismo de acción antimicrobiano, y afectar la

interacción inicial con la membrana. En consecuencia, se sugiere que estas reacciones de

hidroxilación emergen como posibles objetivos metabólicos (“metabolic targets”) para el

control de C. acutatum y B. theobromae, mediante la aplicación combinada de timol o

carvacrol e inhibidores enzimáticos. Otra característica estructural importante asociada

con la actividad antimicrobiana de carvacrol y timol es la presencia de un sistema de

electrones deslocalizados. Se ha descrito previamente que el grupo hidroxilo unido a un


_______________________________________________________________________ __

anillo de benceno (sistema fenólico) es importante para la actividad de algunos

compuestos antimicrobianos [ (110), (106), (111)]. Esta característica permite a los

compuestos desestabilizar la membrana citoplásmática y actuar como intercambiadores

de protones, lo que reduce el gradiente de pH a través de la membrana. Por lo tanto, se

sugiere que la formación de (CC5) = (CB5), (TB5), y (TB3), refleja la necesidad de C.

acutatum y B. theobromae de reducir la toxicidad de carvacrol y timol eliminando el

sistema de electrones deslocalizados del anillo.

4.3.5. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el

timol y carvacrol y evaluación de la actividad antifúngica.

En aras de confirmar si efectivamente las transformaciones realizadas por los hongos

sobre el timol y carvacrol corresponden a un proceso de desintoxicación, se prepararon

algunos de los productos de biotransformación y se evaluó su actividad antifúngica

contra C. acutatum. Adicionalmente, se incluyeron algunos derivados bromados y

nitrados, para determinar si modificaciones estructurales llevadas a cabo sobre el timol y

carvacrol afectan la actividad antifúngica. Entre los productos sintéticos se incluyeron el

timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter y la timoquinona comercial. Los

procedimientos de preparación de los derivados se describen a continuación Figura 4-9,

junto con los datos espectroscópicos correspondientes.

Figura 4-9. Reacciones de metilación y acetilación de timol y carvacrol.

O

O

O

O

O

O

OH

OH

(C)

(T)



_________________________________________________________________________

Acetilación de timol. Se llevó a cabo por reacción de timol con cloruro de acetilo bajo

condiciones anhidras. El espectro de 1H RMN muestra una señal doblete a δ 1.30 ppm,

acoplada con la señal múltiple (septuplete) a δ 2.90 ppm, y que corresponde al

sustituyente isopropilo. Además, se aprecian dos señales singlete en δ 2.22 y 2.37 ppm,

correspondientes al grupo metilo enlazado al anillo aromático y al metilo presente en el

grupo acetilo. Además se observan a campo bajo tres señales que integran para 3

hidrógenos y pertenecen a los protones aromáticos. La presencia del grupo acetilo se

confirmó del espectro de 13C RMN y la señal en δ 169.73 ppm. En el espectro además

aparecen 4 señales a campo alto que corresponden a 4 carbonos metílicos, seguido de 3

carbonos metínicos aromáticos (a δ 120.25, 124.64, y 131.36 ppm) y cuatro carbonos

cuaternarios (a δ 127.64, 148.53, 149.79, y 169.73 ppm). Con base en la información

espectroscópica se confirmó la estructura del timil acetato Tabla 4-19.


13C RMN de timil acetato.

O

O


_______________________________________________________________________ __

Acetilación de carvacrol. Se llevó a cabo por reacción de carvacrol con cloruro de acetilo

bajo condiciones anhidras. En el espectro de 1H RMN se aprecian las señales producidas

por el grupo isopropilo (doblete a δ 1.26 ppm acoplado con septuplete a δ 3.03 ppm) y

los dos grupos metilo (singletes a δ 2.38 y 2.39 ppm), uno como sustituyente del anillo y

el otro en el grupo acetilo. En la región aromática, se aprecian señales para 3 hidrógenos.

Además, la presencia de la unidad de acetilo se confirmó del espectro de 13C RMN, y la

señal en δ 170.21 ppm. Con base en esta evidencia, se confirmó la estructura del carvacril

acetato para este compuesto Tabla 4-20.


13C RMN de carvacril acetato.

O

O



_________________________________________________________________________

Metilación de timol. Se preparó por reacción de timol con yoduro de metilo. El espectro

de 1H RMN mostró una señal doblete a δ 1.47 ppm y que integra para seis hidrógenos,

acoplada con el septuplete en δ 3.05 ppm. Lo anterior confirma la presencia del grupo

isopropilo. Además se presenta dos singletes que integran cada uno para tres hidrógenos

en δ 2.42 ppm y 4.03 ppm. Esta última señal, confirma la metilación del hidroxilo fenólico

del timol.También aparecen las señales en la región aromática integrando para tres

hidrógenos. La metilación también se evidenció por la presencia de la señal en δ 55.54

ppm, y que corresponde al carbono metílico oxigenado. La estructura se confirmó como

el timil metil éter Tabla 4-21.


13C RMN de timil metil éter.

O


_______________________________________________________________________ __

Metilación de carvacrol. Al igual que para el timil metil éter, se presentó una señal en el

espectro de 1H RMN en δ 3.75 ppm y en 13C RMN en δ 56.11 ppm atribuidas a la

presencia del grupo metilo del sustituyente metoxi, sobre el anillo aromático. La

estructura se confirmó como el carvacril metil éter Tabla 4-22.


13C RMN de carvacril metil éter.

O

Timoquinona. En el espectro de 1H RMN se observó una señal doblete en δ 1.04 ppm y

una señal septuplete en δ 2.93 ppm, mutuamente acopladas y que corresponden al

sustituyente isopropilo. Además, se observa un singlete en δ 1.96 ppm, del grupo metilo

enlazado al sistema cíclico. A campo bajo se observan dos señales singlete (δ 6.44 y 6.52

ppm) y que corresponden a los protones olefínico de la timoquinona Tabla 4-23.



_________________________________________________________________________

Tabla 4-23. Espectro de 1H RMN de timoquinona.

O

O

Asimismo se presentan los procedimientos empleados para la obtención de algunos

derivados bromados y nitrados del timol y carvacrol.

Derivados bromados.

Bromación de timol. Se obtuvo por reacción de timol con N-bromosuccinimida en

presencia de peróxido de hidrógeno. El espectro de 1H RMN Tabla 4-24 mostró una señal

doblete a δ 1.21 ppm acoplada con una señal septuplete a δ 3.25 ppm, correspondiente

al sustituyente isopropilo del anillo aromático. Adicionalmente se observó un singlete a δ

2.52 ppm que integra para 3 hidrógenos y corresponde al grupo metilo sobre el anillo

aromático. Las señales a campo bajo muestran un singlete a δ 7.32 ppm que integra para

un hidrógeno. Está única señal sugiere que el anillo aromático se encuentra

pentasustituido. Dado el carácter activante del grupo hidroxilo y las cadenas alquílicas, y

su efecto orientador a orto- y para- se propuso para este compuesto una dibromación en

posiciones 2 y 4 con respecto al grupo OH. Así, el compuesto se identificó como el 2,4-

dibromo-6-isopropil-3-metil fenol.


_______________________________________________________________________ __


13C RMN de 2,4-dibromo-6-isopropil-3-metil fenol.

1H RMN

OH

Br Br

OH

(T)

Bromación de carvacrol. Se obtuvo por reacción de carvacrol con N-bromosuccinimida en

presencia de peróxido de hidrógeno. El espectro de RMN muestra la señal doblete a δ

1.40 ppm acoplada con el septuplete a δ 3.75 que confirma el radical isopropilo. Además

se observa el singlete en δ 2.23 pm del sustituyente metílico. En la región aromática, se

observa una señal multiplete (solapada con el solvente) y que integra para un hidrógeno.

Lo anterior confirma la dibromación del anillo aromático. Con base en los datos

espectroscópicos, el compuesto se identificó como 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol

Tabla 4-25.

Tabla 4-25. Espectro de 1H RMN de 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol

1H RMN

BrBr

OH

OH

(C)



_________________________________________________________________________

Derivados nitrados.

Nitración de timol y carvacrol. Se llevó a cabo por reacción entre el timol o carvacrol y la

mezcla nitrante (ácido sulfúrico/ácido nítrico en relación 10:1). Los datos de RMN para el

compuesto nitrado del timol indican la presencia del grupo isopropilo sustituyente: señal

doblete en δ 1.17 ppm acoplata a septuplete en δ 3.11 ppm.

Además se observa un singlete que integra para tres hidrógenos a δ 2.49 ppm que

confirma el radical metilo. A campos bajos se aprecian dos señales singlete, que

establecen un sistema tetrasustituido para el anillo aromático. Debido a la ausencia de

acoplamiento entre las señales de los protones aromáticos, se intuye una disposición 1,4-

entre ellos.

El espectro de 13C RMN presentó 9 señales, tres de las cuales corresponden a carbonos

metílicos (a δ 21.56, 22.62, y 27.25 ppm), dos carbonos metínicos aromáticos en δ 119.14

y 125.05 ppm, y cuatro carbonos cuaternarios en δ 134.06, 134.96, 140.22 (C-NO2,

pequeña), y 157.93 ppm (carbono aromático oxigenado). Por lo anterior, el compuesto

nitrado se elucidó como 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol Tabla 4-26.

Los datos de RMN para el compuesto nitrado de carvacrol: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ

1,2 (d, 6H, J = 7,0) correspondiente al isopropilo, 2,5 (s, 3H) del grupo metilo, 3,15 (sept,

1H, J = 7,0) del isopropilo, 6,65 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), lo que muestra que la nitración se

presentó en posición para con respecto al hidroxilo Por lo anterior, el compuesto nitrado

se elucidó como 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol Tabla 4-27.


_______________________________________________________________________ __


13C RMN de 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol.

1H RMN

OH

O2N

OH

(T)

Tabla 4-27. Espectro de 1H RMN de 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol.

1H RMN

OH

(C)

O2N

OH



_________________________________________________________________________

Los resultados de los ensayos de actividad antifúngica de los productos de

biotransformación, evaluados a una concentración de 100 µg/mL, muestran una

disminución de la inhibición del crecimiento radial de C. acutatum Figura 4-10 (a y b).

En la Figura 4-10 a se puede observar que el crecimiento micelial de C. acutatum en

presencia de timol y carvacrol y luego de 144 h fue inferior a 15 y 25 mm

respectivamente. Mientras que para la timoquinona, timil- y carvacril-acetato, timil metil

éter y carvacril metil éter el diámetro micelial fue mayor que 35 mm, al cabo de 144 h.

En la Figura 4-10 b se aprecia que los derivados acetilados y metilados de timol y carvacrol

alcanzaron su mayor inhibición de C. acutatum a las 48 h, oscilando entre el 60 y el 70%

para los productos acetilados y entre 40 y 65% para los metilados.

La timoquinona por su parte, mostró una inhibición inferior al 45% durante todo el

tiempo de análisis. Estos hallazgos confirman nuestra hipótesis, de que los productos

metabólicos identificados en la biotransformación corresponden a productos de

desintoxicación del timol y carvacrol, en los cuales se elimina el grupo hidroxílico fenólico

libre. Como se mencionó anteriormente, el grupo hidroxilo fenólico ha sido

responsabilizado de parte del modo de acción antimicrobiano del timol y carvacrol.

En general, los resultados también muestran que los derivados acetilados y metilados del

timol exhibieron un mayor efecto inhibitorio de C. acutatum que los de carvacrol.

Además, la actividad antifúngica de los derivados decreció rápidamente con el tiempo,

llegando a ser inferior al 20 % de inhibición luego de 144 h.


_______________________________________________________________________ __

Figura 4-10 a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de

derivados del carvacrol y timol (productos metabólicos) b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial

de C. acutatum de derivados de timol y carvacrol (productos metabólicos).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144

Cre

cim

ien

to m

icel

iar

rad

ial (

mm

) .

Tiempo (h)

Control

Controlethanolti acet 100 μg/mL ti met100 μg/mL cv acet 100 μg/mL cv met 100μg/mL timoq 100 μg/mL carvacrol

timol

Productos de Biotransformación - C.acutaum

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

24 48 72 96 120 144

ti acet ti met cv acet cv met

timoq carvacrol timol

Tiempo ( h )

%

d

e

i

n

h

i

b

i

c

i

ó

n

Productos de Biotransformacion



_________________________________________________________________________

Los resultados de las propiedades fungiestáticas de los derivados bromados y nitrados de

timol y carvacrol, evaluados a una concentración de 100 µg/mL, muestran un incremento

substancial de la inhibición del crecimiento radial de C. acutatum Figura 4-11 a y b.

A esta concentración, los derivados nitrados inhibieron completamente el crecimiento

micelial de C. acutatum durante las primeras 72 h, mientras que los bromados lo hicieron

durante 48 h. Luego de 144 h, los diámetros de crecimiento micelial del hongo en

presencia de los derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol fueron inferiores a

los 15 mm. La Figura 4-11 b, reveló que ambos derivados nitrados alcanzaron inhibiciones

superiores al 80% entre 72 y 144 h. Por su parte, los derivados bromados presentaron

inhibiciones que oscilaron entre el 60 y el 80%, siendo superiores entre 48 y 96 h.

En general, los nitro compuestos presentaron la mayor actividad antifúngica contra C.

acutatum, seguido por los derivados bromados,el timol y el carvacrol. No se observaron

diferencias apreciables en la actividad fungiestática de los derivados del timol y los del

carvacrol. Es de resaltar que la actividad de los derivados nitrados y bromados cambio

muy poco con el pasar de los días, lo que sugiere un proceso de detoxificación lento por

parte del hongo. Estos hechos confirman nuestra hipótesis de que es posible emplear los

metabolitos defensivos de las plantas como plantillas estructurales, para el diseño de

sustancias más activas para el control de microorganismos patogénicos. Tanto el timol

como el carvacrol pueden ser consideradas sustancias promisorias para el desarrollo de

nuevas sustancias antifúngicas biorracionales.


_______________________________________________________________________ __

Figura 4-11. a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de

derivados bromados y nitrados del carvacrol y timol b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de C.

acutatum de derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144

Cre

cim

ien

to m

icel

iar

rad

ial (

mm

) .

Tiempo (h)

Control

Controlethanol

ti Br 100 μg/mL

ti NO2 100 μg/mL

cv Br 100 μg/mL

cv NO2 100μg/mL

carvacrol

timol

derivados 2 - C.acutaum

0102030405060708090

24 48 72 96 120 144

ti Br ti NO2 cv Br

cv NO2 carvacrol timol

Tiempo ( h )

%

d

e

i

n

h

i

b

i

c

i

ó

n

Derivados Nitrados y Bromados


mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 83 ____________________________________________________________________

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

La actividad antifúngica de timol fue mayor que la observada para el carvacrol contra

C. acutatum, como consecuencia la transformación de timol fue un proceso mucho más

lento que el de carvacrol. Además, para B. theobromae las pequeñas diferencias entre los

metabolitos de ambos compuestos son consistentes con las similitudes observadas en la

actividad antifúngica contra este hongo.

La alta actividad antifúngica junto con el bajo nivel de transformación microbiana, hace

que los candidatos prometedores de timol y carvacrol para controlar C. acutatum

y B. theobromae debido a que se metaboliza principalmente a través de la hidroxilacion

aromatica y alifática o la metilación y acetilación del grupo hidroxilo del anillo aromático

Se determinó que los hongos C. acutatum y B. theobromae metabolizaron a timol y

carvacrol en baja proporción varios compuestos, incluyendo timoquinona,

timohidroquinona, timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter, entre otros. Se

midió la actividad de los metabolitos de biotransformación y encontró que estos

presentan un menor porcentaje de inhibición que sus precursores lo que sugiere un

mecanismo de desintoxicación por parte del hongo.

Se sintetizaron compuestos bromados y nitrados de timol y carvacrol, los compuestos

nitrados presentaron la mayor actividad antifúngica contra C. acutatum, seguido por los

derivados bromados de él timol y el carvacrol.

Conclusiones y recomendaciones 84

____________________________________________________________________ __

5.2. Recomendaciones

Realizar un estudio que permita optimizar el proceso de producción de los metabolitos

producidos por los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae, se debe someter

al proceso de biotransformación una cantidad mayor de los sustratos de partida, y de

medio de cultivo con la finalidad de aumentar las cantidades de metabolitos obtenidos y

facilitar los procesos de purificación e identificación.

Preparar otros derivados sintéticos, incluyendo el grupo amino y otros halógenos de

timol y carvacrol, y realizar ensayos de actividad antifúngica contra los hongos C.

acutatum y B. theobromae, que nos permitan comparar los resultados obtenidos con los

compuestos nitrados y bromados de estos compuestos.



6. BIBLIOGRAFÍA

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species. Bailey, J.A., R.J. O´Connell, y R.J. and Nash, C. Pring. 1992., CAB International,

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