UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL
MEDIANTE EL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum acutatum
LUIS ALBERTO OVIEDO BERROCAL
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Química
Medellín, Colombia
2014
BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL
MEDIANTE EL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum acutatum
LUIS ALBERTO OVIEDO BERROCAL
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Química
Director:
Químico, M.Sc. Candidato a Ph.D. Diego Luis Durango Restrepo
Codirector:
Químico, M.Sc., Ph.D. Carlos Mario García Pajón
Línea de Investigación:
Productos Naturales
Grupo de Investigación:
Química de los Productos Naturales y los Alimentos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Química
Medellín, Colombia
2014
AGRADECIMIENTOS
Expreso mi más sincero agradecimiento a la Universidad Nacional de Colombia sede
Medellín, en especial al grupo de investigación Química de los Productos Naturales y los
Alimentos por permitirme hacer parte de él, a los laboratorios de Separaciones Químicas y
Productos Naturales por hacer posible la realización de este trabajo.
A DIEGO LUIS DURANGO RESTREPO, Químico, M.Sc., Candidato a Ph.D., por sus
enseñanzas, por el aporte de su conocimiento a la realización de este proyecto y por su
infinita paciencia, gracias por todo.
A CARLOS MARIO GARCIA PAJÓN, Químico, M.Sc., Ph.D., y a JESUS HUMBERTO GIL,
Químico, Ph.D., por sus valiosos aportes en mi formación como investigador.
A NANCY VANEGAS B. Química farmacéutica, laboratorista del grupo de Productos
Naturales, por sus valiosos aportes.
A MANUEL NUMPAQUE por su gran aporte a este proyecto, compañero mil gracias.
A los docentes de la escuela de química Angelina Hormaza, Cristina Valencia, Jorge
Correa, Tatiana Lobo, Benjamin Rojano, y Elizabeth Pabon por su colaboración.
Al Daniel Barragán (Director) y Ana Silvia Arboleda (Secretaria), del Área Curricular de
Ciencias Naturales por su colaboración.
A mis amigos, Mauricio Espitia, Gustavo Hernández, Carlos García, Fredys Sánchez,
Yeray Rodriguez, Samuel Vizcaíno y Leonardo Aleman por compartir como familia en
Medellín.
A mis compañeros de laboratorio, Natalí, Rodrigo Velasco, Rodrigo Pineda, Fredy Vélez,
Juan, Anderson, Diego Montenegro, Janio, Lina, Natalia, Lorena, Carlos Alberto, Jesús
David, Víctor, Jenny y Lina Cristina.
A mis compañeros de la Maestría Jhon Jairo, Edward, Efrain, Carlos Corrales, Saul y
Madeleine.
A mi familia:
A mis padres Ruby y luis, hermanos Luifer y Xiomi y abuela Graciela
A Teresa Ramos y Hugo Constain por ser incondicionales y un apoyo en momentos
difíciles de mi vida.
A Zury Constain por estar a mi lado y vencer juntos todos los obstáculos.
A DIOS por darme esperanza en los momentos difíciles de mi vida.
Dedicatoria
A mi abuelito Francisco Berrocal,
Porque me enseñaste a creer en mí. Fuiste mi primer profesor.
Te extraño y sé que desde el cielo te sientes orgulloso.
A Zury Constain por ser el amor de mi vida,
A mis padres Ruby y Luis, mis hermanos Luifer y Xiomi, y
Mi abuelita Graciela Por su amor incondicional y su
Constante apoyo siempre los llevo en mi corazón.
A mi segunda madre Teresa Ramos y
Segundo Padre Hugo Constain por haberme ofrecido
Su afecto y haberme apoyado cuando más lo necesite.
Resumen y abstract VI _______________________________________________________________________ __
Resumen
Los hongos fitopatógenos de las especies Colletotrichum acutatum y Botryodiplodia
theobromae, están asociados con las enfermedades de las plantas conocidas como
antracnosis y muerte negra, respectivamente. Desde el punto de vista económico, estos
hongos causan pérdidas elevadas al sector agrícola, las cuales se ven incrementadas por
la tendencia de los patógenos a causar daños en los frutos en el cultivo y durante los
procesos de pos-cosecha. El objetivo del presente trabajo fue investigar la actividad
antifúngica y el metabolismo de timol y carvacrol por C. acutatum y B. theobromae.
Inicialmente, se evaluó la toxicidad de cada uno los compuestos sobre los
microorganismos, empleando el método del “agar envenenado”. A partir de las curvas de
toxicidad, se demostró que ambos compuestos ejercen un control relativamente bueno
contra los hongos fitopatógenos; el crecimiento micelial de C. acutatum y B. theobromae
se inhibió significativamente a concentraciones mayores de 75 µg/mL para carvacrol y 50
µg/mL para timol, respectivamente. Tomando en cuenta la toxicidad de los compuestos
hacia los hongos, se seleccionaron para la biotransformación las concentraciones de timol
y carvacrol de 80 y 125 µg/mL respectivamente, las cuales inhibieron casi entre un 50 y
60 %. Los resultados de la biotransformación muestran que el timol y carvacrol fueron
metabolizados en baja proporción a varios compuestos, incluyendo timoquinona,
timohidroquinona, timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter, entre otros. A
partir de la estructura de los productos metabólicos se propuso una posible ruta
metabólica. Además, se sugiere que las modificaciones realizadas por los
microorganismos afectan los requerimientos estructurales a los cuales se les
responsabiliza de la actividad antimicrobiana y modo de acción del timol y el carvacrol.
Por último, se prepararon algunos compuestos estructuralmente relacionados con estos
monoterpenos fenólicos y se evaluó su actividad inhibitoria contra C. acutatum. Los
resultados muestran que los compuestos correspondientes con los de la
biotransformación, presentan un efecto fungiestático inferior al del timol y carvacrol.
Este comportamiento insinúa un posible mecanismo de detoxificación del timol y
Resumen y abstract VII _________________________________________________________________________
carvacrol por parte de ambos microorganismos. De otro lado, los derivados bromados y
nitrados de timol y carvacrol exhibieron efectos inhibitorios del crecimiento micelial de C.
acutatum mayores a los encontrados para los monoterpenos aromáticos precursores. En
general, la alta actividad antifúngica de timol y carvacrol contra C. acutatum y B.
theobromae y los niveles de transformación microbiana bajos, indican que ambos
compuestos podrían ser una alternativa a los fungicidas químicos tradicionales para el
control de los hongos fitopatogénicos, en la pre- y poscosecha de frutas y vegetales. De
otro lado, los metabolitos de defensa de las plantas podrían servir de plantillas
estructurales interesantes para el desarrollo de nuevos agentes para el control de
enfermedades en plantas importantes nutricional y comercialmente.
Palabras claves: Fungitoxicidad, Antracnosis, Muerte Negra, metabolismo, timoquinona.
Abstract
Phytopathogenic fungi Colletotrichum acutatum and Botryodiplodia theobromae are
associated with plant diseases known as Anthracnose and Black Death, respectively. From
the economic point of view, these fungi cause heavy losses to agriculture. The effects of
those diseases have increased because of the tendency of the pathogen to damage the
fruit during post-harvest processes. The aim of this study was to investigate the
antifungal activity and metabolism of thymol and carvacrol by C. acutatum and B.
theobromae. Initially, the toxicity of each compound against the plant pathogens using
the “poisoned agar technique” was evaluated. From toxicity curves, it was shown that
both compounds have a relatively good control against pathogenic fungi. The mycelial
growth of C. acutatum and B. theobromae was significantly inhibited at concentrations
higher than 75 µg/mL and 50 µg/mL. Taking in account the toxicity of both compounds
against fungi, thymol and carvacrol at 80 and 125 g/mL, respectively, were choice for
biotransformation processes. These levels were able to inhibit between 50 and 60% of
radial growth. Results from biotransformation showed that the pathogenic fungi
Resumen y abstract VIII _______________________________________________________________________ __
metabolized thymol and carvacrol in low proportion to several compounds, including
thymoquinone, thymohidroquinone, carvacryl- and thymyl acetate, and carvacryl- and
thymyl methyl ether, among others. From structure of metabolic products, a possible
biosynthetic pathway was proposed. Also, it was suggested that modifications carried out
by microorganisms affect the structural requirements which were associated with the
antifungal activity and action mode of thymol and carvacrol. Finally, some structurally
related compounds with these phenolic monoterpenes were prepared and their activity
against C. acutatum was evaluated. Results showed that, the compounds corresponding
to those from biotransformation, exhibited a higher fungistatic effect in comparison to
thymol and carvacrol. This behavior proposes a possible detoxification mechanism of
thymol and carvacrol by both microorganisms. On the other hand, brominated and
nitrated derivatives of thymol and carvacrol displayed inhibitory effects of mycelial
growth of C. acutatum higher than those found by the precursor aromatic monoterpenes.
Overall, the relatively high antifungal activity of thymol and carvacrol against C. acutatum
and B. theobromae and the low levels of microbial transformation indicate that both
compounds could be an alternative to traditional chemical fungicides for control of pre-
and postharvest phytopathogenic fungi on fruits or vegetables. Moreover, plant defense
metabolites could provide interesting structural templates for the development of new
agents for the control of plant diseases, in nutritional and commercially important crops.
Keywords: Fungitoxicity, Anthracnose, Black Death, metabolism, thymoquinone.
Contenido IX
_________________________________________________________________________
Contenido
Resumen ............................................................................................................................... VI
Abstract ................................................................................................................................ VII
Lista de figuras ....................................................................................................................... XI
Lista de tablas ...................................................................................................................... XIII
Abreviaturas ........................................................................................................................ XIV
Introducción ........................................................................................................................... 1
1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE .............................................................................. 4
1.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS Colletotrichum
acutatum Y Botryodiplodia theobromae .............................................................................. 4
1.1.1. Colletotrichum acutatum ........................................................................................ 4
1.1.2. Botryodiplodia theobromae .................................................................................... 5
1.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum
Y Botryodiplodia theobromae .............................................................................................. 8
1.2.1. C. acutatum ........................................................................................................... 8
1.2.2. B. theobromae ....................................................................................................... 9
1.3. CONTROL QUÍMICO DE LA ANTRACNOISIS Y LA MUERTE DESCENDENTE (Ó
PODREDUMBRE DE LOS FRUTOS) ........................................................................................ 10
1.4. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA EL CONTROL DE HONGOS FITOPATÓGENOS .................. 15
1.4.1. Productos naturales .............................................................................................. 16
1.4.2. Aceites esenciales ................................................................................................. 16
1.5. IMPORTANCIA DE TIMOL Y CARVACROL ....................................................................... 18
1.6. BIOTRANSFORMACIONES: GENERALIDADES Y APLICACIÓN PARA EL DISEÑO RACIONAL
DE FUNGICIDAS .................................................................................................................. 21
1.6.1. Aspectos generales de las biotransformaciones ..................................................... 21
1.6.2. Biotransformaciones de compuestos aromáticos sustituidos .................................. 22
1.6.3 Biotransformaciones con hongos fitopatógenos ...................................................... 25
1.6.3.1. Biotransformaciones con la especie Colletotrichum acutatum ............................. 25
1.6.3.2. Biotransformaciones con la especie Botryodiplodia theobromae ........................ 29
Contenido X
_______________________________________________________________________ __
1.6.4. Biotransformaciones para el diseño biosintético de fungicidas ............................... 31
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 34
2.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 34
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 34
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL................................................................................................. 35
3.1. MATELIALES Y EQUIPOS ........................................................................................... 35
3.2. METODOLOGIA ............................................................................................................ 36
3.2.1. Mantenimiento de las Cepas C. acutatum y B. theobromae ................................... 36
3.2.3. Biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos C.
acutatum y B. theobromae. ............................................................................................ 38
3.2.4. Evaluación del avance de la biotransformación de los sustratos timol y carvacrol en
el curso del tiempo. ........................................................................................................ 39
3.2.5. Extracción y purificación de algunos de los metabolitos mayoritarios resultantes de
la biotransformación ...................................................................................................... 40
3.2.6. Identificación de los productos mayoritarios aislados de las biotransformaciones .. 42
3.2.7. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol y
evaluación de su actividad antifúngica contra los hongos C. acutatum y B. theobromae ... 42
4. DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................................... 44
4.3. ASPECTOS GENERALES ............................................................................................. 44
4.2. TOXICIDAD DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS C.
acutatum Y B. theobromae. ............................................................................................... 44
4.3. BIOTRANSFORMACIONES LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS
C. acutatum Y B. theobromae. ........................................................................................... 49
4.3.1 Extracción, aislamiento e identificación de productos ............................................. 49
4.3.3 Experimento curso en el tiempo ............................................................................. 65
4.3.4 Posible ruta metabólica .......................................................................................... 67
4.3.5. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol y
evaluación de la actividad antifúngica. ............................................................................ 70
5. Conclusiones y recomendaciones .................................................................................... 83
5.1 Conclusiones ................................................................................................................ 83
5.2. Recomendaciones ........................................................................................................ 84
6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 85
Figuras XI _________________________________________________________________________
Lista de figuras
Figura 1-1. Lesiones causadas por antracnosis. a) Guanábana, b) Fresa, c) Tomate de árbol d) Tallos de mora
e) Arándanos y f) Mangos [ (18), (19)]. .................................................................................................... 7
Figura 1-2. Lesiones causadas por la muerte negra. a) Coco no infectado e infectado, b) Anón, c) Maíz y d) y
e) Tallos de manzano f) banano (13) (27). ............................................................................................... 7
Figura 1-3. Transformación de metil 2-naftil metil ditiocarbamato por S. sclerotiorum (50). ......................... 14
Figura 1-4. Estructura química de timol (59), (60)]. ......................................................................................... 17
Figura 1-5. Estructura química de la carvona (61). .......................................................................................... 17
Figura 1-6. Estructura química del alcohol perílico (63). ................................................................................. 18
Figura 1-7. Estructura química del α-terpineol (62). ....................................................................................... 18
Figura 1-8. Estructura de carvacrol y timol indicando su fuente de origen (68). ............................................ 19
Figura 1-9. Glicosilación de Timol, carvacrol y eugenol por las células cultivadas de E perriniana. (72)......... 20
Figura 1-10. Biotransformación de los pterocarpanos (−)-maackiaina y (−)-medicarpina por Colletotrichum
spp (2). ................................................................................................................................................... 26
Figura 1-11. Biotransformación de isosteviol (5) por C. gloeosporioides (91). ................................................ 26
Figura 1-12. Biotransformación de (+)-α-Bulnesena (43) por G.cingulata (92). .............................................. 27
Figura 1-13. Biotransformación de widrol por C. gloeosporioides (93). .......................................................... 27
Figura 1-14. Biotransformación del 2-feniletanol con C. acutatum (94). ....................................................... 28
Figura 1-15. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (94). ...................................................... 28
Figura 1-16. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (83). ...................................................... 29
Figura 1-17. Biotransformación de 2- feniletanol con B.theobrome (96). ....................................................... 30
Figura 1-18. Biotransformación de acetofenona con B.theobrome (96). ........................................................ 30
Figura 1-19. Transformación de camalexin por Rhizoctonia solani (97). ........................................................ 32
Figura 1-20. Desintoxicación de las crucíferas fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin, y brassilexin
por el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum (98). ...................................................................... 33
Figura 3-1. C. acutatum conservado en PDA ................................................................................................... 36
Figura 3-2. Evaluación de la toxicidad de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B. theobromae
................................................................................................................................................................ 37
Figura 3-3. Inóculos de los hongos C. acutatum y B. theobromae (periodo de incubación). .......................... 38
Figura 3-4. Procesos de biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos
C. acutatum y B. theobromae. ............................................................................................................... 39
Figuras XII _______________________________________________________________________ __
Figura 3-5. Diagrama del proceso de extracción de los filtrados de los medios de cultivo. ............................ 41
Figura 4-1. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C.
acutatum ................................................................................................................................................ 45
Figura 4-2. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C. acutatum ................................ 46
Figura 4-3. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B.
theobromae. ........................................................................................................................................... 47
Figura 4-4. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B. theobromae. ......................... 48
Figura 4-5. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de carvacrol con C. acutatum después: 2
(i), 7 (ii), y 14 días (iii). ............................................................................................................................ 54
Figura 4-6. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de timol con B. theobromae después: 2
(i), 7 (ii), y 14 días (iii). ............................................................................................................................ 63
Figura 4-7. Evolución en el tiempo de la transformación microbiana de: carvacrol por B. theobromae (a) y C.
acutatum (b); y timol por B. theobromae (c) y C. acutatum (d). ............................................................ 67
Figura 4-8 Posible ruta metabólica de carvacrol (denotado como C) y timol (T) con C. acutatum y B.
theobromae ............................................................................................................................................ 68
Figura 4-9. Reacciones de metilación y acetilación de timol y carvacrol. ........................................................ 70
Figura 4-10 a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de
derivados del carvacrol y timol (productos metabólicos) b) Porcentaje de inhibición del crecimiento
radial de C. acutatum de derivados de timol y carvacrol (productos metabólicos)............................... 80
Figura 4-11. a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de
derivados bromados y nitrados del carvacrol y timol b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial
de C. acutatum de derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol. .............................................. 82
Tablas XIII _________________________________________________________________________
Lista de tablas
Tabla 1-1. Algunos fungicidas sintéticos comunes usados contra hongos fitopatógenos [ (46), (43)]. ........... 12
Tabla 1-2. Biotransformaciones de benzaldehido, ácido coumarico, ácido p-coumarico y ácido vanilico (82).
................................................................................................................................................................ 23
Tabla 4-1. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de carvacrol con C. acutatum. .................................... 50
Tabla 4-2. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de timol con C. acutatum. .......................................... 51
Tabla 4-3.Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de carvacrol con B. theobromae. ................................ 52
Tabla 4-4. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de timol con B. theobromae. ...................................... 53
Tabla 4-5. Espectro de masas y estructura de timohidroquinona. .................................................................. 55
Tabla 4-6. Espectro de masas y estructura de 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol. ................................. 56
Tabla 4-7. Espectro de masas y estructura de 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol. ................................ 56
Tabla 4-8. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de metil carvacril éter. .................................................. 57
Tabla 4-9. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de Timoquinona ............................................................ 57
Tabla 4-10. Espectro de masas, 1H RMN,
13C RMN y estructura de carvacril acetato. .................................... 59
Tabla 4-11. Espectro de masas y estructura de 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-fenol. ............................... 59
Tabla 4-12. Espectro de masas, 1H RMN,
13C RMN y estructura de Timil metil eter. ...................................... 60
Tabla 4-13. Espectro de masas y estructura de 5 - (2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol. ............................. 61
Tabla 4-14. Espectro de masas y estructura de 2-hidroximetil-5-isopropil-fenol ........................................... 61
Tabla 4-15. Espectro de masas y estructura de 5-isopropenil-2-metil-fenol ................................................. 62
Tabla 4-16. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de timil acetato ........................................................... 62
Tabla 4-17. Espectros de masas y estructuras de 4-Hidroxi-3-isopropil-6-metil-ciclohex-2-enona y 4-Hidroxi-
6-isopropil-3-metil-ciclohex-2-enona ..................................................................................................... 64
Tabla 4-18. Espectro de masas de 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1 ,4-diol. .......................................... 65
Tabla 4-19. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de timil acetato. ........................................................................ 71
Tabla 4-20. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de carvacril acetato. ................................................................... 72
Tabla 4-21. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de timil metil éter. ..................................................................... 73
Tabla 4-22. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de carvacril metil éter. ............................................................... 74
Tabla 4-23. Espectro de 1H RMN de timoquinona. .......................................................................................... 75
Tabla 4-24. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de 2,4-dibromo-6-isopropil-3-metil fenol. ................................. 76
Abreviaturas XIV
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-25. Espectro de 1H RMN de 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol ................................................... 76
Tabla 4-26. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol. .......................................... 78
Tabla 4-27. Espectro de 1H RMN de 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol. ............................................................ 78
Abreviaturas
C. acutatum Colletotrichum acutatum
B. theobromae Botryodiplodia theobromae
CG-EM Cromatografía de gases - Espectrometría de masas
13C RMN Resonancia magnética nuclear de Carbono
1H RMN Resonancia magnética nuclear de protón
ppm Partes por millón
U.E Unión Europea
LOX Lipoxigenasa oxidativa
HPL Hidroperóxi liasa
AE Aceites esenciales
CLAE Cromatografía liquida de alta eficiencia
CG Cromatografía de gases
CCF Cromatografía en capa fina
CC Cromatografía en columna
CCFP Cromatografía en capa fina preparativa
EM-IE Espectrometría de masas por ionización electrónica
δ (ppm) desplazamiento químico en unidades de δ
Hz Hertzios
J Constante de acoplamiento en Hertzios
AcOEt Acetato de etilo
AcOH Ácido acético
PDA Agar-Papa-Dextrosa
TR Tiempo de retención
Abreviaturas XV
_________________________________________________________________________
C Carvacrol
T Timol
equiv Equivalente-gramo
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
OMS Organización mundial de la salud
DDQ dicloro-diciano-quinona
Introducción 1 _________________________________________________________________________
Introducción
Los hongos fitopatógenos pertenecientes a los géneros Colletotrichum y Botryodiplodia
presentan una amplia distribución a nivel mundial. Estos microorganismos son
considerados como algunos de los más importantes en la agricultura, debido a la gran
diversidad de especies vegetales que pueden afectar y la magnitud de los daños que
ocasionan a las plantas. Los hongos del género Colletotrichum son los agentes causales de
la enfermedad de las plantas conocida como antracnosis; la especie C. acutatum, no
posee especificidad hacia familias particulares de plantas (es un hongo multihospedero) y
se ha encontrado patogenizando los cultivos de almendras dulces, aguacate, melocotón,
duraznos, arándanos, naranjas y cítricos en general, mangos, olivo, fresa, tomate de árbol
entre otros. Por su parte, la especie Botryodiplodia theobromae causa las enfermedades
conocidas normalmente con los nombres de muerte súbita, muerte basal o secamiento
de los cítricos, gomosis, cáncer negro y muerte negra, entre otros. Este hongo afecta los
cítricos, cacao, cacahuete, algodón, plátano, mango, maíz, cebolla, ajo, piña, coco, ñame,
aguacate, berenjena, té, melón, alcachofa, soya, patata dulce o batata, tabaco, arroz,
granadilla gigante, caña de azúcar, papaya, pera africana, zanahoria, guayaba común,
entre otros. En general, estos hongos fitopatógenos pueden afectar a la mayor parte de
la planta, incluyendo raíces, hojas, flores, ramas, brotes tiernos y retoños. Además, los
frutos pueden ser atacados tanto en pre- (especialmente frutos en formación y en
estados avanzados de desarrollo) como en postcosecha.
Tradicionalmente, el control de dichas enfermedades se ha llevado a cabo mediante la
aplicación de fungicidas químicos de síntesis. Sin embargo, debido al desarrollo de cepas
patogénicas más resistentes, muchos de estos productos químicos son cada vez menos
efectivos. Como consecuencia de lo anterior, se requiere para el control de las
enfermedades dosis más elevadas y aplicaciones más frecuentes del fungicida en el
campo, lo que incrementa notablemente los costos de producción y profundiza el
problema de residuos tóxicos (algunos de los cuales son reconocidos por sus efectos
carcinogénicos, teratogénicos, y con alta toxicidad aguda) en productos alimenticios.
Introducción 2
_______________________________________________________________________ __
Además, el uso de fungicidas de baja selectividad ha sido restringido para controlar el
deterioro poscosecha de frutos y hortalizas debido a sus posibles efectos adversos en la
salud humana. Además, se ha encontrado que algunos productos químicos presentan
efectos deletéreos para el medio ambiente y poseen largos periodos de degradación.
Todos estos factores han estimulado la necesidad de buscar productos alternativos
más seguros para el control eficaz de los hongos fitopatogénicos, entre los cuales se
destacan aquellos de origen natural y biológicamente activos, tales como los aceites
esenciales, extractos vegetales y/o sus constituyentes mayoritarios. Estos materiales
poseen una mayor aceptación y son reconocidos por los consumidores como de menor
peligrosidad para el medio ambiente y la salud humana que sus contrapartes sintéticas.
Una ventaja adicional que presentan los aceites esenciales y sus constituyentes volátiles
es su bioactividad en la fase de vapor; esta característica los hace atractivos como
posibles fumigantes para la protección de los productos almacenados.
Actualmente, se cree que la producción de aceites esenciales en las plantas es un
mecanismo para contrarrestar el ataque de patógenos y plagas; además, algunos de
estos materiales han demostrado poseer propiedades antimicrobianas y antifúngicas
valiosas para la industria. Así por ejemplo, los aceites esenciales de hierbas y especias
como el tomillo (Thymus vulgaris) y el oregano (Origanum syriacum) han sido
reconocidos por su actividad para inhibir múltiples hongos fitopatógenos, tales como C.
acutatum, Botrytis cinerea, Fusarium sp., y Aspergillus flavus, entre otros. La elevada
bioactividad de estos materiales ha sido asociada con la presencia de los constituyentes
timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol). Ambos compuestos
han exhibido propiedades antimicrobianas importantes y tienen gran utilidad en la
industria alimenticia, especialmente como conservantes naturales al evitar la
proliferación de hongos. Estos agentes causan alteraciones de la morfología de la hifa,
resultando en diámetros reducidos de la hifa y lisis de la pared hifal, cuando interactúan
con la membrana celular del patógeno. Sin embargo, la modificación química de estos
compuestos fenólicos a varios derivados éter y éster resulta en cambios importantes en
la actividad biológica de los micoorganismos. Además, se ha reportado que líneas de
Introducción 3 _________________________________________________________________________
Pseudomonas pueden degradar completamente el timol y parcialmente el carvacrol, lo
que puede limitar seriamente la aplicación de ambos compuestos como agentes para el
control de enfermedades en plantas.
De otro lado, los experimentos de biotransformación pueden proporcionar información
sobre los mecanismos de detoxificacion usados por los microorganismos fitopatogénicos
y dar un indicio de las modificaciones estructurales que se deben llevar a cabo sobre los
sustratos, si se pretende desarrollar agentes selectivos de control de hongos a partir de
sus estructuras. Por lo anterior, en el presente trabajo se evaluaron las propiedades
antifúngicas contra C. acutatum y B. theobromae del timol y carvacrol, junto con su
metabolismo. Adicionalmente, se prepararon algunos compuestos relacionados
estructuralmente con el timol y carvacrol, y se evaluó su actividad inhibitoria contra C.
acutatum.
Marco teórico y estado del arte 4
_________________________________________________________________________
1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE
1.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS HONGOS
FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum Y Botryodiplodia
theobromae
1.1.1. Colletotrichum acutatum
El género Colletotrichum está constituido por hongos filamentosos imperfectos; estos
hongos pertenecen al reino Mycetae, division Eumycota, subdivisión Deuteromycotina,
clase Coelomycetes del orden Melanconiales (1). Las especies del género se encuentran
distribuidas ampliamente en todos los continentes y están implicadas en la enfermedad
de las plantas conocida con el nombre vulgar de antracnosis. Las especies del genero
Colletotrichum son consideradas como algunos de los mayores agentes patógenos en
poscosecha; sus daños incluyen los cereales, leguminosas, frutas y hortalizas entre otros.
La enfermedad incluye el marchitamiento, podredumbre y en estados avanzados puede
conducir a la muerte de la planta (2).
Colletotrichum acutatum es una especie que en la agricultura es responsable de pérdidas
económicas importantes en frutales de climas subtropicales y tropicales. La biología del
género es compleja y se desconocen muchos aspectos claves; esto es válido para C.
acutatum el cual es confundido en muchas ocasiones con otras especies como C
gloeosporioides; pero en la actualidad las clasificaciones han mejorado notablemente con
el uso de las técnicas de biología molecular que han posibilitado la distinción entre ambas
(3). La especie C. acutatum no posee especificidad hacia familias particulares de plantas y
se ha encontrado como patógeno en los cultivos de almendras dulces (Prunus dulcis) [ (4),
(5), (6)], aguacate (Persea americana L.) (7), melocotón y duraznos (Prunus persica L.)[
(5), (8)], arándanos (Vaccinium spp.) [ (9), (10)], naranja y cítricos en general (Citrus spp.)
5 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
[ (11), (12)], mango (Mangifera indica L.)[ (13), (14)], olivo (Olea europea L.) (15), y fresa
(Fragaria spp. Duch.); [ (9), (16), (17)]. En los ataques puede afectar a la mayor parte de la
planta, incluyendo raíces, hojas, flores, ramas, brotes tiernos y retoños; es notable la
pérdida de frutos inmaduros y la defoliación que conduce a reducciones en la capacidad
fotosintética Figura 1-1 [ (18), (19)]. El sector frutícola se ve afectado cuando C. acutatum
ocasiona la pudrición de la corona y de la raíz, defoliación y caída prematura de flores, y
especialmente, pudrición de las frutas, tanto en los árboles como en todos los procesos
de poscosecha (3).
La antracnosis del fruto, ocasionada por el hongo filamentoso fitopatógeno C. acutatum,
es la enfermedad más importante del cultivo de tomate de árbol (Solanum betaceum L.,
syn: Cyphomandra betacea), por su amplia distribución y por las pérdidas económicas
que ocasiona [ (20), (21), (22)]. Específicamente el departamento de Antioquia es
actualmente uno los mayores productores de tomate de árbol en Colombia y la
antracnosis es la mayor limitante que se presenta en los cultivos comerciales y en las
pequeñas explotaciones domésticas.
1.1.2. Botryodiplodia theobromae
La especie B. theobromae pertenece al reino Mycetae, División Eumycota, Subdivisión
Deuteromycotina, Clase Coelomycetes, Orden Sphaeropsidales, Familia
Sphaeropsidaceae, género Lasiodiplodia (Pat.) Griffon & Maubl. (Botryodiplodia
theobromae Pat.) (23). En estado natural se encuentra en los estados imperfecto
(anamórfo) con el nombre de Botryodiplodia y perfecto (teleomórfo) Botryosphaeria.
Otros nombres son: Lasiodiplodia theobromae (anamórfo) (Pat.) Griffiths & Maubl,
Diplodia theobromae (Pat.) W. Novell, Diplodia natalensis Pole-Evans, Diplodia gossypina
Cooke, Diplodia cacaoicola Hen, Macrophomina vestita Prillinger & Delac, Lasiodiplodia
tubericola Ellis & Everh, y Diplodia tubericola (Ellis & Everh.) (24).
Marco teórico y estado del arte 6
_________________________________________________________________________
Las enfermedades causadas por este hongo afectan un amplio número de plantas
cultivadas en diferentes áreas ecológicas y se conocen normalmente con los nombres de
muerte súbita, muerte basal o secamiento de los cítricos, gomosis, enfermedad
pedúncular, cáncer negro y muerte negra entre otras (25). Entre las especies afectadas se
encuentran los cítricos, cacao, cacahuete, algodón, plátano, mango, maíz, cebollas, ajo,
puerro, piña, pino colonial, coco, ñame, caucho, aguacate, berenjena, té, melón,
alcachofa, soja, patata dulce, tabaco, arroz, granadilla gigante, caña de azúcar, zahína,
vid, carambola, papaya, pera africana, zanahoria, guayaba común, etc [ (26); (24)]. En
general, la gran cantidad de especies de árboles frutales afectados por B. theobromae son
el resultado de un mal manejo agronómico del cultivo, ya sea por estrés hídrico o
deficiencias nutricionales, y por el descuido de las labores de poda que se realizan
durante la conducción del cultivo, resultando en daños como la muerte descendente de
las ramas que puede incluso llegar a matar la planta (13).
Las plantas afectadas por B. theobromae presentan la siguiente sintomatología: hojas
necróticas y de formas anormales, vástagos con cáncer, gomosis o resinosis y
podredumbre del corazón; en las raíces se observa una leve putrefacción de la corteza;
las flores, semillas y frutas presentan decoloración y lesiones con tonalidades marrón a
negro, Figura 1-2 (27). Además como resultado de la enfermedad, las ramas terminales
presentan secamiento y necrosis, en donde es posible observar muerte descendente así
como defoliación parcial y muerte del árbol. Por su parte en los frutos, la pudrición
pedúncular llega a causar la pérdida total, por lo que a pesar de que su incidencia es
menor a la de antracnosis, su severidad en frutos individuales es mayor (13). En hongo B.
theobromae ha sido considerado como un patógeno oportunista, que ocasiona grandes
daños en los procesos de poscosecha de frutas y verduras; las pérdidas económicas son
significativas en los frutos de mango, aguacate, papaya, guanábana, durazno y carambolo
entre otros frutos y hortalizas (13).
7 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
Figura 1-2. Lesiones causadas por la muerte negra. a) Coco no infectado e infectado, b) Anón, c) Maíz y
d) y e) Tallos de manzano f) banano [ (13) (27)].
Anón, c) Maíz y d) y e) Tallos de manzano f) banano (13) (27).
Figura 1-1. Lesiones causadas por antracnosis. a) Guanábana, b) Fresa, c) Tomate de árbol d) Tallos de
mora e) Arándanos y f) Mangos [ (18), (19)].
Marco teórico y estado del arte 8
_________________________________________________________________________
1.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LOS HONGOS
FITOPATOGENOS Colletotrichum acutatum Y Botryodiplodia
theobromae
1.2.1. C. acutatum
La mayor parte de las pérdidas económicas producidas por C. acutatum están asociadas
con el ataque sobre los frutos del huésped; esto en gran medida es debido a que el hongo
infecta la fruta verde en el campo, permaneciendo inactivo durante la cosecha. Luego
este se activa en la fruta madura infectando a las demás que estén alrededor durante el
almacenamiento. A nivel mundial, la antracnosis causada por el hongo C. acutatum
genera pérdidas agrícolas graves; por ejemplo, afecta los frutos de mango en la India,
Latinoamérica y el Caribe, dónde este cultivo es considerado de gran importancia
económica. Igualmente se ven afectados el plátano en Tennessee, Mississippi, Luisiana y
Alabama, y los cultivos de uvas en California, Indonesia, Brasil y Ecuador (28). En Brasil,
este hongo también es responsable de la caída prematura de los cítricos. Además, se ha
reportado la enfermedad en frutos de fresa (en este cultivo C. acutatum es el segundo
patógeno más importante después de Botrytis cinerea) en el Estado Mérida (Venezuela)
(29), y en Francia; donde la enfermedad ha causado más del 80% de las pérdidas en
cultivos de fresa no tratados con fungicidas, especialmente cultivos de floración
permanente. Los cultivos tratados con fungicidas para controlar B. cinerea han sufrido
mucho menos. Por su parte en Gran Bretaña, la detección de la enfermedad en fresa
hace obligatoria la quema de los cultivos y la fumigación del suelo. De otro lado en
Queensland (Australia), C. acutatum causa reducciones del 25 al 30% en el apio. Otros
cultivos más pequeños también pueden ser gravemente afectados, tales como las
anémonas e incluso las hojas del árbol akebia (Akebia trifoliata) en Saitama (Japón); una
plata trepadora de hoja caduca que crece salvaje en las montañas de Japón y es usada
como planta “bonsái” (30).
9 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
En Colombia, los cultivos de tomate de árbol (Cyphomandra betacea), mora (Rubus
glaucus Benth), manzano (Malus domestica Borkh), mango (Mangifera indica), lima Tahití
y pasifloras son severamente afectados por la antracnosis, la cual puede llegar a
ocasionar pérdidas superiores al 50% (31). Los costos de control de la enfermedad en
tomate de árbol, planta cuyo fruto tiene una alta demanda a nivel nacional y además se
exporta a varios países del mundo, corresponden al 45% de los costos totales de
producción. A pesar del esfuerzo realizado por los productores, las pérdidas alcanzan
hasta un 50% o más, debido exclusivamente a la severidad e intensidad del problema;
esto sin tener en cuenta la contaminación ambiental, los daños ecológicos y los costos
socioeconómicos que ocasiona el uso indiscriminado de fungicidas de síntesis química
empleados para el control de la enfermedad y que redunda en el empleo (32).
Adicionalmente, se ha indicado que la enfermedad produce una disminución en el
período productivo de los árboles de tomate de árbol de 5 a 2 o 3 años, y cuando no se
aplican medidas de control las pérdidas son totales. Por su parte, en cultivos comerciales,
bajo condiciones de uso continuo de fungicidas, se estiman reducciones que oscilan entre
el 10 y 25% de los frutos cosechados.
Se ha reportado que en el altiplano norte de Antioquia estaban afectados más de 66000
árboles de tomate de árbol, calculándose reducciones en la zona, en un período de 6
meses, del orden de 360 millones de pesos. La antracnosis causada por C. acutatum en el
cultivo de mora ha alcanzado una incidencia promedio de 52.9%, en la zona cafetera, en
departamentos como Caldas, Quindío y Risaralda (18). En este cultivo, C. acutatum
produce lesiones y la muerte en las ramas.
1.2.2. B. theobromae
B. theobromae es un hongo cosmopolita que se presenta predominantemente en las
regiones tropicales y subtropicales. Adicionalmente, se ha reconocido como un patógeno
humano causante de keratomicosis y feohifomicosis y como un patógeno de plantas
asociado con más de 500 hospederos (33). Por ejemplo, este hongo se ha reportado
Marco teórico y estado del arte 10
_________________________________________________________________________
como un patógeno del mango a nivel mundial, siendo el principal responsable del
decaimiento y la muerte descendente. Las enfermedades ocasionadas por este hongo en
mango se reportaron por primera vez en India, pero se han encontrado en otros países
de Asia, África y el continente Americano (34). De otro lado, B. theobromae está
considerado como uno de los organismos más vitales causante de diversas enfermedades
en Annona spp; se ha reportado en India, Brasil, Nigeria y EE.UU (Florida). En maíz, se ha
reportado la presencia de B. theobromae como patógeno en India, Nigeria, Pakistán y
Tailandia y, en menor grado, en el Continente Americano (35). Además, esta enfermedad
impacta negativamente la producción de cacao en los estados de Tabasco y Chiapas
(México) con aproximadamente 60,324 y 35,014 hectáreas respectivamente, causando
pérdidas del potencial productivo considerables que pueden llegar a ser del 30% o más
(36). En banano, papaya, mango y rambutan, B. theobromae causa la podredumbre de la
corona en Sri Lanka [ (37), (38)]. En Egipto, se ha reportado que B. theobromae causa la
pudrición de la raíz en remolacha azucarera (39), y la muerte regresiva en la vid (40), el
maíz (41), cítricos (39), y Annona spp (42). En Colombia, B. theobromae afecta especies
agrícolas y forestales importantes; en los departamentos de Antioquia, Caldas,
Cundinamarca, Magdalena y Valle del Cauca este hongo ataca los cultivos de aguacate y
mango tanto en precosecha como en poscosecha (43). Para el caso de los frutos de
mango, se ha reportado que la infección con el patógeno no permite que logren el
máximo climaterio (36).
1.3. CONTROL QUÍMICO DE LA ANTRACNOSIS Y LA MUERTE
DESCENDENTE (Ó PODREDUMBRE DE LOS FRUTOS)
Es necesario destacar que durante los últimos 50 años, la lucha contra las plagas en
Colombia se ha basado en gran medida en el uso intensivo y extensivo de plaguicidas de
cuestionados efectos sobre el hombre y el medio ambiente (43); además de estos efectos
indeseables hay sobrecostos adicionales de producción. El uso de productos químicos
11 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
sintéticos es el principal método de control de podredumbres fúngicas de pre- y
poscosecha causadas por ambos microorganismos. No obstante algunos de los fungicidas
empleados actualmente poseen baja selectividad y pueden generar efectos deletéreos a
la salud humana y el medio ambiente. Así por ejemplo, los plaguicidas como el Folpet,
Maneb, Paraquat, Zineb, Benomil y Carbaril son considerados teratogénicos y alteran o
destruyen el material celular, bloqueando parcial o totalmente procesos enzimáticos que
afectan directamente al feto, es decir, son embriotóxicos y generarían abortos espontáneos
y en no pocos casos, malformaciones congénitas [ (43), (44)]. Cuando el plaguicida genera
cambios en el material genético del núcleo celular, de manera que puedan ser trasmitidos
en la división celular, puede dar origen a cáncer si el daño es a nivel de las células somáticas
o a malformaciones congénitas si el daño ocurre a nivel de las células gaméticas; éstos son
denominados mutagénicos como es el caso de bromuro de metilo, ziram, atrazina, captan,
folpet. Los efectos mutagénicos se manifestarían en futuras generaciones y el daño sería
irreversible. Como consecuencia de lo anterior, el uso de productos químicos para
controlar el deterioro de los productos alimenticios básicos en poscosecha está
restringido [ (44), (45)].
Para el control de la antracnosis (causada por C. acutatum), y la muerte descendente ó la
podredumbre de los frutos (causada por B. theobromae) se proponen tratamientos con
fungicidas sintéticos de baja selectividad como el benomyl, carbendazim y Maneb entre
otros [ (43), (46)]. A continuación se describen algunos de los efectos adversos a la salud
humana y el medio ambiente de algunos de los fungicidas empleados para el control de
los microorganismos fitopatogénicos mencionados Tabla 1-1.
Marco teórico y estado del arte 12
_________________________________________________________________________
Tabla 1-1. Algunos fungicidas sintéticos comunes usados contra hongos fitopatógenos [ (46), (43)].
FUNGICIDAS SINTETICOS COMUNES
Benomyl
Nombre IUPAC: Metil 1-(butilcarbamoil)
bencimidazol-2-il carbamato
N
N
NH
O
O
NH
O
CH3
CH3
Una exposición intensa o continua (pero no
crónica) podría causar incapacidad temporal o
posibles lesiones residuales, a menos de que se
proporciones un rápido tratamiento médico. Su
toxicidad varía de alta a prácticamente nula para
peces. Es extremadamente tóxico para lombrices
de tierra, pero ligeramente tóxico para anfibios y
prácticamente no es tóxico para aves.
Carbendazim
Nombre IUPAC: Metil benzimidazol-2-il
carbamato
N
NH
NH
O
O
CH3
En el suelo presenta una movilidad moderada y
prácticamente no se volatiliza. En este medio es
biodegradado lentamente bajo condiciones
normales; sin embargo, su degradación biológica
puede incrementarse en suelos pre-tratados. El
Carbendazim presenta un potencial de
bioconcentración bajo en organismos acuáticos.
Maneb
Nombre IUPAC: Etilen-1,2 bistiocarbamato
de manganeso
S-
S-
S S
NH NH
Mn2+
Su potencial tóxico agudo es bajo, la reacción a
bebidas alcohólicas después de una absorción
elevada se caracteriza por, cefalea, sudoración,
sensación de calor, debilidad, congestión nasal,
dificultad respiratoria, opresión torácica,
taquicardia, palpitaciones e hipotensión. Las dosis
muy elevadas pueden resultar en choque,
convulsiones, depresión respiratoria y alteración
del estado de la conciencia.
13 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
Otro factor que dificulta el control de las enfermedades fúngicas en cultivos importantes
lo representa el empleo de tratamientos dispendiosos a lo largo de la cosecha; por
ejemplo para el tratamiento del aguacate con antracnosis se realiza lo siguiente (43).
Dado que el hongo puede infectar la pepa de aguacate, esta se debe tratar con
hipoclorito de calcio (40%) (1,5 mL/l) durante 15 minutos, con posterior inmersión
durante igual período de tiempo en un producto a base Carboxin y Captan (Vitavax 300)
(2 a 6 g/L), a fin de prevenir posibles pudriciones o la manifestación del hongo en el
semillero o almácigo. En condiciones de campo, se deben realizar aspersiones al inicio de
la floración, hasta dos o tres semanas después del cuajamiento del fruto, con fungicidas a
base de Oxicloruro de Cobre (Oxiclor 35)(2 g/L), Hidróxido Cúprico (Kocide 101)(2 g/L),
Benomil (Benlate)(Bezil 50)(0,5 g/L), Metil Tiofanato (Topsin M 50)(1 mL/L), Carbendazim
(Derosal 500)(0,75 a 1,25 mL/L)(Bavistin 500)(0,5 mL/ L), Tiabendazol (Mertect 500)(1
mL/L), Procloraz (Mirage 45)(0,5 mL/L)(Sportak 45)(0,5 mL/L)(Octave 50)(0,5 g/L) o
Difenoconazol (Score 250)(0,5 mL/L).
Para evitar la aparición de poblaciones del patógeno resistentes a los fungicidas se deben
sumergir los frutos de aguacate después de la cosecha por tres minutos, en suspensiones
de fungicidas a base Benomil (Benlate)(Bezil 50)(0,5 g/L), Procloraz (Mirage 45)(0,5
mL/L)(Sportak 45)(0,5 mL/L)(Octave 50)(0,5 g/L) o Tiabendazol (Mertect 500)(1 mL/L),
que también reducen la incidencia de antracnosis en el almacenamiento. Además, los
cuartos de almacenamiento y las canastillas en las cuales se comercializa la fruta, se
deben desinfectar periódicamente con productos a base de hipoclorito de sodio al 2%
(43).
Una limitante importante en el uso de estos fungicidas comerciales es el rápido
desarrollo de tolerancia por parte de los microorganismos fitopatogénicos. Así, se ha
reportado que algunas especies del género Colletrotrichum poseen muchos hongos, una
capacidad extraordinaria de adaptación y variación [ (47), (5)]. En particular C. acutatum,
mostró ser intrínsecamente resistente al benomil y a otros fungicidas tipo bencimidazol
Marco teórico y estado del arte 14
_________________________________________________________________________
(48). Además, también se reportó para Colletotrichum gloesporioides aislado de mango,
resistencia a benomil y tiabendazol (49), lo que ha conducido a un aumento en la
cantidad de estos compuestos que tiene que ser usada en los cultivos. Como
consecuencia de lo anterior, la presencia de residuos de fungicidas en los frutos y
productos procesados puede incrementarse, disminuyendo su calidad e impidiendo su
exportación a algunos mercados extranjeros (45).
Se ha establecido que el metabolismo dentro de la célula fúngica es uno de los
mecanismos que el patógeno usa para detoxificar un compuesto extraño, tal como un
fungicida. Un hongo con la habilidad para degradar rápidamente un fungicida puede
inactivar potencialmente éste antes de que pueda alcanzar su sitio de acción. En
particular, se ha demostrado que Sclerotinia sclerotiorum produce enzimas capaces de
detoxificar activamente carbamatos, a productos glicosilados que carecen de actividad
antifúngica Figura 1-3 (50).
Figura 1-3. Transformación de metil 2-naftil metil ditiocarbamato por S. sclerotiorum (50).
N
NHS
S
R
NH S
S
NH S
S
NH S
S
OO
OHOH
OH
OH
Carbamatos
Glicosilado
Adicionalmente, el hongo Leptosphaeria maculans detoxifica los ditiocarbamatos
principalmente vía oxidativa de la cadena lateral en el C3 del anillo indol (50).
Por lo anterior, se hace necesario el estudio sobre el metabolismo de sustancias con
aplicación potencial como antifúngicos, de cara a establecer la viabilidad real de su uso
para el control de un microorganismo específico. Es importante resaltar además, que en
nuestro país el uso de pesticidas, la mayoría costosos, ha dejado de ser una práctica
15 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
rentable en el caso del mango, el tomate de árbol y el aguacate, debido al incremento
considerable en su precio comparado con el de los frutos importados, perdiendo
competitividad en el mercado. De esta manera, la gran capacidad de adaptación de los
patógenos a los plaguicidas de síntesis, la persistencia de estos compuestos en el suelo
durante largos periodos de tiempo y la incorporación de estos a la cadena alimentaria,
están haciendo disminuir la confianza en la utilización de pesticidas de síntesis
tradicionales y están motivando la aparición de nuevas técnicas y métodos de control
compatibles con el entorno ambiental (51). Lo anterior se suma a las restricciones
sanitarias impuestas por entidades internacionales como la EPA, FAO o la OMS a los
residuos de pesticidas en productos animales y vegetales. Lo anterior limita seriamente
las posibilidades comerciales de productos agrícolas para Colombia, ahora que se realizan
diferentes tratados de libre comercio con países como Estados Unidos, Japón, China, y la
Unión Europea.
1.4. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA EL CONTROL DE
HONGOS FITOPATÓGENOS
Los productos químicos sintéticos destinados a controlar enfermedades como la
antracnosis y muerte negra, han tenido un papel muy marcado en el incremento de la
producción agrícola. Sin embargo, el uso continuo e indiscriminado de agroquímicos con
baja especificidad ha generado diversos inconvenientes, tales como el incremento en los
costos de producción, el desarrollo de resistencia por parte de algunos microorganismos,
la presencia de residuos de pesticidas en los alimentos y, en consecuencia, los riesgos que
acarrean para la salud humana y el medio ambiente (20). Por estos motivos, desde las
últimas décadas del siglo XX se ha incrementado el interés en la búsqueda de alternativas
más seguras que permitan mitigar el impacto negativo de este tipo de productos. Una
estrategia que ha resultado satisfactoria para reducir la utilización de agroquímicos
costosos y potencialmente dañinos y peligrosos, ha sido el manejo integrado de plagas
Marco teórico y estado del arte 16
_________________________________________________________________________
mejor conocido como MIP y dentro de esta opción, la utilización de sustancias de origen
natural, consideradas más seguras para la salud humana y el medio ambiente, y más
aceptadas por los consumidores (52).
1.4.1. Productos naturales
La búsqueda de compuestos bioactivos de origen vegetal contra los hongos ha sido
objeto de interés para encontrar productos ecológicamente seguros (53). El uso de
fungicidas en el control de enfermedades de las frutas por hongos está limitado
principalmente por las restricciones impuestas a su uso (54). Además, los fungicidas
sintéticos imponen una presión selectiva sobre las poblaciones de patógenos y pueden
resultar cepas resistentes a fungicidas (55), deben ser desarrolladas alternativas seguras
de manera viable, para ello compuestos volátiles de origen natural provenientes de las
plantas, son fundamentales constituyentes de sabor y fragancia además poseen cierta
actividad antifúngica (56). Algunos fungicidas orgánicos como ultra aceite fino Sunspray,
concentrado de Neem, y Rhapsody, se compararon con algunos de origen sintético, para
contrarestar la antracnosis en Alabama obteniéndose resultados similares (57). Los ácidos
grasos, los principales precursores de compuestos volátiles responsables del aroma de
plantas, se transforman en aldehídos, alcoholes, ácidos, y ésteres a través de la
degradación por la lipoxigenasa de soja oxidativa (LOX) y la vía hidroperóxido liasa (HPL).
Además de su papel en el aroma biosíntesis, tanto LOX y HPL puede tener relevancia
fisiológica debido a que sus productos tienen los antimicrobianos y antifúngicos que
están implicados en la respuesta de la planta herida (53).
1.4.2. Aceites esenciales
La aplicación de aceites esenciales (AE) es un método muy atractivo para controlar
enfermedades tanto en cosecha como en post-cosecha. Estos materiales son una mezcla
compleja de compuestos volátiles producidos en diferentes partes de las plantas, y han
sido reconocidos por poseer diversas funciones, incluyendo conferir la resistencia a
plagas y enfermedades; algunos AE, así como sus constituyentes, han demostrado poseer
propiedades antibacterianas y antifúngicas [ (58), (53)]. El AE de tomillo, Thymus vulgaris,
17 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
presenta como componente mayoritario el timol Figura 1-4 y en algunas variedades su
composición puede alcanzar valores hasta del 80%. Tanto los AE obtenidos de las
especies de Thymus, como el timol, han sido reconocidos por su actividad antibacteriana
y antifúngica, razón por la cual se emplean industrialmente en la preparación de
desinfectantes de uso humano, enjuagues bucales y otros agentes antimicrobianos
utilizados a nivel doméstico [ (59), (60)].
Figura 1-4. Estructura química de timol (59), (60)].
OH
También el aceite esencial de Tagetes patual Linn. Fue evaluados para propiedades
fungicidas contra las cinco cepas Aspergillus niger, Penicillium feniculosa, Fusarium solani,
Rhizomucor sp., y Trichoderma viride. Las concentraciones de aceite, 1600 y 3200 ppm,
eran plenamente inhibidor, mientras que a concentraciones 10, 200, 400 y 800 ppm,
hubo una dosis dependiente, disminuir las tasas de crecimiento de hongos (61). La
carvona Figura 1-5 es uno de los componentes principales de los aceites esenciales de
plantas como Alcaravea (Carum carvi), Eneldo (Anethum graveolens) e Hierbabuena
(Mentha spicata). Cuando se compara con químicos tradicionales antibrote de papa
como isopropilfenilcarbamato y 3-isopropilclorofenilcarbamato, la carvona muestra igual
o mejor comportamiento durante el almacenamiento a largo plazo, manifestando
también actividad antifúngica contra Fusarium sulphureum, Phoma exigua y
Helminthosporium solana (62).
Figura 1-5. Estructura química de la carvona (61).
O
Marco teórico y estado del arte 18
_________________________________________________________________________
El alcohol perílico Figura 1-6 es un monoterpeno con actividad antifúngica y potente
actividad anticancer y se encuentra en baja concentración en aceites esenciales de
Lavandula hybrida, Mentha piperita, Mentha spicata, Prunas sp., Carum carvi y Perilla
frutescens (63). Es un agente con baja toxicidad, propiedades terapéuticas y actividad
quimiopreventiva y/o quimioterapéutica contra una amplia variedad de cánceres.
Recientemente se ha estudiado su efecto como agente terapéutico en el tratamiento de
tumores de próstata (64), tumores de pulmón (65) y cáncer de mama (66).
Figura 1-6. Estructura química del alcohol perílico (63).
OH
El α-terpineol Figura 1-7 es el alcohol terpénico monocíclico cuyo aceite esencial es
obtenido a partir de muchos cítricos, comercialmente es importante, se ubica entre los
30 compuestos saborizantes con mayor demanda mundial. Ambos enantiómeros tienen
olor diferente, el R-(+)- α- terpineol tiene un aroma floral a lilas mientras que el S-(-)-
terpineol tiene un aroma a madera de coníferas. Es usado como perfume, repelente de
insectos, antifúngico, desinfectante, agente para flotación de metales y para fabricación
de copolímeros funcionales (62).
Figura 1-7. Estructura química del α-terpineol (62).
OH
1.5. IMPORTANCIA DE TIMOL Y CARVACROL
Timol y carvacrol son dos compuestos fenolicos que tienen potentes propiedades
19 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
antimicrobianas naturales y son los principales componentes de los aceites esenciales de
tomillo y orégano, timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol)
son los componentes principales de los aceites esenciales de algunas Laminaceae
miembros como el orégano, el tomillo y ajedrea Figura 1-8. Se producen por estas especies
de plantas como un mecanismo de defensa química contra microorganismos
fitopatógenos. En consecuencia, presentan propiedades antimicrobianas y fungitóxicas
contra diversos patógenos de las plantas (67).
Figura 1-8. Estructura de carvacrol y timol indicando su fuente de origen (68).
OH
Timol Tomillo
OH
Carvacrol Orégano
Los aceites esenciales que contienen carvacrol y el timol que se conocen como
antibacterianos y antifúngicos naturales. Algunos investigadores están estudiando los
efectos antimicrobianos de los aceites esenciales y sus componentes activos (65). Timol y
carvacrol son eficaces contra E. coli (65), aunque carvacrol es más eficaz que el timol (69),
Con E. coli, carvacrol fue encontrado para ser completamente eficaz contra Penicillium
citrinum (70). El timol es significativamente eficaz contra Staphylococcus aureus (69).
Timol y carvacrol parece dañar las membranas de células bacterianas, así como entrar en
las bacterias y los procesos de cambio celular. Estos efectos pueden dar cuenta de sus
propiedades antibacterianas. Además, conociendo el mecanismo de detoxificacion de
hongos y bacterias sobre este tipo de compuestos mediante biotranformaciones se
Marco teórico y estado del arte 20
_________________________________________________________________________
puede diseñar una estrategia que permita potencializar el uso de compuestos naturales [
(69), (71), (65)]. Un estudio de la evaluación de la fitotoxicidad y la actividad antifúngica
contra colletotrichum acutatum de los aceites esenciales de tomillo (thymus vulgaris),
limoncillo (cymbopogon citratus), y sus componentes mayoritarios, encontraron que Los
resultados demuestran que el timol a 125 mg/L y el citral a 300 mg/L inhiben el
crecimiento micelial completamente durante once días de incubación. La germinación de
las esporas se evita en un 100% con el AE de limoncillo a 350 y 400 mg/L, timol a 100 y
125 mg/L, y citral a 250 y 300 mg/L, después de un período de doce horas (20).
Por ejemplo el uso de las biotransformaciones de compuestos aroma de especias, tales
como timol, carvacrol, y eugenol mostrados en la Figura 1-9 (72), se investigaron mediante
las células en cultivo de plantas de Eucalyptus perriniana. Las células cultivadas de E.
perriniana son capaces de convertir estos compuestos de aroma de especias en los
glucósidos que se acumulan en las células, la Glicosilación permite la conversión de
compuestos orgánicos insolubles en agua e inestable en el los correspondientes solubles
en agua y estables para mejorar sus propiedades biológicas y farmacológicas. Desde el
punto de vista fisiológico, los glicósidos de timol, carvacrol, y eugenol, que están
compuestos de aroma de hierbas naturales y especias, pueden ser de interés
farmacológico, así como utilizable para los aditivos alimentarios y cosméticos (72).
Figura 1-9. Glicosilación de Timol, carvacrol y eugenol por las células cultivadas de E perriniana. (72).
OH
OH
O
OH
OO
OH
OHOH
OH
O
OO
OH
OHOH
OH
O
OH
O
OHOH
OH
O
OO
O
OH
OH
OH OHOH
OHOH
O
O
O
OH
OH
OH OHOH
OHOH
O
O
O
O
OH
OH
OH OHOH
OHOH
O
O
Timol
Carvacrol
Eugenol
21 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
1.6. BIOTRANSFORMACIONES: GENERALIDADES Y
APLICACIÓN PARA EL DISEÑO RACIONAL DE FUNGICIDAS
1.6.1. Aspectos generales de las biotransformaciones
Los procesos de biotransformación se definen como aquellos en los cuales se emplean
sistemas biológicos para llevar a cabo transformaciones químicas de cualquier tipo. Estos
sistemas se denominan biocatalizadores y se caracterizan por ser enzimas o células
completas, ya sean de microorganismos naturales o recombinantes [ (73), (74)]. Las
biotransformaciones se encuentran enmarcadas dentro de los procesos biotecnológicos
que tienen una gran potencialidad para la industria química, especialmente en la
actualidad tiene la necesidad imperiosa de utilizar estrategias que sean de bajo costo,
eficientes y que no contaminen el medio ambiente; los productos obtenidos deben
satisfacer la demanda comercial de las industrias farmacéuticas, alimenticias, agrícolas,
entre otras (75).
En este tipo de procesos se utilizan las metodologías desarrolladas por diferentes campos
de la ciencia, incluyendo la biología, la genética y la química entre otras, que incluyen
diferentes sectores de la Ingeniería. Los procesos biotecnológicos en general son más
limpios y menos contaminantes, ya que son menos exigentes en consumos energéticos.
Los Hongos, las levaduras, las bacterias y otros organismos inferiores, se han utilizado
durante algún tiempo para la transformación de compuestos orgánicos; recientemente la
utilización de algunos microorganismos completos o sus sistemas enzimáticos para
realizar reacciones estereospecificas y estereoselectivas ha cobrado gran relevancia (24).
Los procesos de biotransformación se han estudiado extensivamente y son considerados
una dinámica importante, para modificar la estructura de los compuestos orgánicos de
bajo costo y obtener en el proceso productos con alto valor agregado especialmente
Marco teórico y estado del arte 22
_________________________________________________________________________
aquellos que son difíciles de conseguir desde fuentes naturales o mediante estrategias
sintéticas.
Las biotransformaciones se caracterizan porque poseen alta versatilidad, eficiencia,
regioselectividad, quimioselectividad y enantioselectividad [ (76), (77)]. Un buen número
de reacciones pueden ser realizadas mediante la utilización de organismos completos o
sus partes, muchas se han logrado optimizar y son empleadas en la síntesis de moléculas
quirales ópticamente activas, que son de importancia en las industrias [ (78), (79), (80)].
En términos generales la producción de compuestos se realiza mediante procesos que
involucran catalizadores organometálicos especializados y procesos de protección-
desprotección de grupos funcionales que utilizan reactivos y catalizadores novedosos;
muy pocas de estas estrategias sintéticas son amigables con el medio ambiente, debido a
que la mayor parte de ellas generan subproductos tóxicos que son difíciles de eliminar y
no son reutilizables. Como una contraparte los procesos de biotransformación son
considerados como una tecnología económica y ecológicamente competitiva. Además
transcurre a presión atmosférica, temperatura ambiente o muy cercana a ella y no
requieren de la presencia de otros catalizadores diferentes. Las condiciones de reacción
bajo las que se llevan a cabo son consideradas suaves y muchas de ellas se distinguen por
poseer un sello verde (amigable con el entorno) (81).
1.6.2. Biotransformaciones de compuestos aromáticos sustituidos
Los compuestos aromáticos alquilsustituidos han sido empleados como sustratos en
diferentes procesos de biotransformación, con el objeto de obtener productos con valor
agregado a partir de sustratos económicos y disponibles comercialmente. La
biotransformación de compuestos ha permitido la obtención de moléculas pequeñas
mediante procesos económicos de bajo impacto ambiental, los cuales han sido utilizados
como precursores en la industria química, farmacéutica y para la obtención de sabores,
fragancias y cristales líquidos (82).
23 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
La aplicación de estos procesos pretende aprovechar el alto grado de selectividad, e
incluso especificidad, que poseen los sistemas enzimáticos para la obtención de
materiales especializados. Se observa en la Tabla 1-2 (82), algunos ejemplos de
biotransformaciones en las que se obtienen compuestos de valor agregado.
Además los compuestos aromáticos sustituidos; en el contexto comercial los productos
obtenidos mediante transformaciones microbiológicas son considerados naturales y este
calificativo es un factor importante debido a que pueden ser modificados por vía
metabólica o enzimática sin perder dicha categoría, esto hace que esta tecnología
biológica se presente como una ruta importante para la producción a gran escala de
derivados de estas moléculas (83).
Tabla 1-2. Biotransformaciones de benzaldehido, ácido coumarico, ácido p-coumarico y ácido vanilico (82).
SUBSTRATO PRODUCTOS ORGANISMO REFERENCIA
Benzaldehido
O H
Fenilacetilcarbinol
OH
O
OH
O
Hongos
Rhizopus javanicus,
Rhizopus oryzae,
Aspergillus oryzae,
Aspergillus tamarii,
Neurospora crassa,
Polyporus
eucalyptorum,
Fusarium lateritium,
Fusarium sp., Monilia
sitophila,
Paecilomyces
lilacinus y Mucor rouxii
(84)
Marco teórico y estado del arte 24
_________________________________________________________________________
Continuación tabla 2
SUBSTRATO PRODUCTOS ORGANISMO REFERENCIA
Ácido p-coumarico
O
OH
OH
Ácido cafeico
O
OH
OH
OH
Hongo
Pycnoporus
cinnabarinus
(85)
Ácido vanilico
OHO
OH
O
CH3
Metoxihidroquinona,
OH
OH
O
CH3
Alcohol vanilico,
OH
OH
O
CH3
Vainillina
HO
OH
O
CH3
Hongo
Phanerochaete
chrysosporium
(86)
Ácido pcoumarico
O
OH
OH
Ácido cafeico O
OH
OH
OH
Ácido phidroxibenzoico
OHO
OH
Ácido protocatecuico
OHO
OH
OH
Bacteria
Streptomyces
caeruleus
(87)
25 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
1.6.3 Biotransformaciones con hongos fitopatógenos
Dentro de la literatura científica se encuentran publicados muchos trabajos de
biotransformación, desarrollados con hongos fitopatógenos que causan daños en cultivos
de importancia comercial; en algunos casos, los sustratos utilizados son compuestos
antifúngicos y en los estudios se pretende elucidar los mecanismos de detoxificacion
empleados por el patógeno, con el fin de esclarecer su dinámica enzimática y
fundamentados en ella desarrollar antimicóticos potencialmente más activos (88). Los
compuestos utilizados como sustratos tienen alguna similitud estructural con los
metabolitos producidos por el hongo; en muchos casos estos compuestos tienen
importancia económica y se pretende aumentar su producción por parte del organismo
(83). Algunos de los substratos empleados en biotransformaciones no tienen ninguna
relación con el patógeno y son evaluados por sus características estructurales con la
finalidad de modificarlos y obtener productos con mayor valor agregado [ (89), (90)].
1.6.3.1. Biotransformaciones con la especie Colletotrichum acutatum
Se reportan en la literatura científica muchos artículos de trabajos investigativos
relacionados con las biotransformaciones realizadas por este hongo fitopatógeno, se
citan muchos trabajos sobre biotransformaciones con el género Colletotrichum mas con
la especie Colletotrichum gloeosporioides (Glomerella cingulata) y muy pocos con
colletotrichum acutatum. Los pterocarpanos: (-)-maackiaina 1 y (-) – medicarpina 2,
realizan la función de fitoalexinas en las especies, se sometieron a ensayos de
detoxificación, utilizando 9 hongos fitopatógenos dentro de los cuales se incluyeron tres
especies de Colletotrichum: C. trifolii, C. dematium (f. truncatum) y C.destructivum. Las
tres especies hidroxilaron los compuestos 1 y 2 en posición C-6, para producir los
metabolitos 3 y 4. La especie C. trifolii, rompe el anillo de ambos sustratos, para producir
los isoflavonoles sophorol 5 y vestitona 6 Figura 1-10 (2). Lo que muestra un mecanismo de
detoxificacion.
Marco teórico y estado del arte 26
_________________________________________________________________________
Figura 1-10. Biotransformación de los pterocarpanos (−)-maackiaina y (−)-medicarpina por Colletotrichum
spp (2).
O
O
OH
R1
R2
H
H
O
O
OH
R1
R2
H
OH
O
O
OH
OH
H
H
O
R1
R2
OH
OOH
OH
A B
CD
(1) R1- R2 = 0CH2-O
(2) R1= H R2=OCH3
(3) R1- R2 = 0CH2-O
(4) R1= H R2=OCH3
(9)
O
O R1
R2
OH
O
OHH
(5) R1- R2 = 0CH2-O
(6) R1= H R2=OCH3
(7) R1- R2 = 0CH2-O
(8) R1= H R2=OCH3
El isosteviol 10, es un diterpeno tetracíclico que presenta actividades biológicas, ha sido
biotransformado con el fin de potenciar su bioactividad. Como se observa en la Figura
1-11, la transformación microbiológica con C. gloeosporioides dio como único producto el
17-hidroxi-isosteviol 11, el cual presentó actividad de inhibición significativa en un ensayo
preliminar de quimiopreventivos (91).
Figura 1-11. Biotransformación de isosteviol (5) por C. gloeosporioides (91).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
16
15
O17
18O19
OH20
21
H22
23
H24
1
3
4
5 7
10
11
12
13
14
16
15
O17
18
O19
O20
21
H22
CH2OH23
H24
10 11
El (+)-α-Bulnesena 12, es un sesquiterpeno con actividad insecticida, que fue
bitransformado con G. cingulata obteniéndose mayoritariamente (4S,5S,7R)-1(10)-
27 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
guaien-11,13,15-triol 13. En la Figura 1-12 se observan las oxidaciones del grupo isoprenílo
en los carbonos 11 y 13 y en el carbono metílico 15. El metabolito 13 tuvo una
abundancia relativa del 25% después de 10 días de iniciado el proceso (92).
Figura 1-12. Biotransformación de (+)-α-Bulnesena (43) por G.cingulata (92).
1
12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
CH3
15
13
14
H16
17
17
1
12
3
4
5
6
7
9
10
12
13
14
15
H16
17
OH18
OH19
OH20
21 22
Widrol 14 es un compuesto al cual se le ha reportado actividad antifúngica, fue
biotransformado por C. gloeosporioides obteniéndose productos oxidados con alta
regioselectividad en el carbono C-10 así: 10-oxowidrol 15, 10-hidroxiwidrol 16,
10hidroxiwidrol 17, y 14-hidroxiwidrol 18, Figura 1-13. Estos compuestos fueron
inactivos a 100 mg/L contra Botrytis cinerea (93).
Figura 1-13. Biotransformación de widrol por C. gloeosporioides (93).
1
2
3
5
4
7
8
3
2
11
1212
HO13
14 15 R'16
R17
18
1
2
3
5
6
7
8
9
10
11
1212
HO13
14 15
O17
17
14 R=R'=H
16 R=OH, R'=H
17 R= OH, R'=H
18 R= H, R'=OH
15
En Colombia C.acutaum afecta principalmente el cultivo de tomate de árbol Solanum
betaceum (cav.) sinónimo Cyphomandra betacea (cav.) (Sendt). Debido a estos factores,
la mayor parte de los estudios llevados a cabo sobre C. acutatum se han encaminado a
conocer aspectos relevantes de su epidemiología y control, desconociéndose su
potencialidad para obtener sustancias químicas con valor agregado mediante la
biotransformación de sustratos orgánicos (62). El grupo de Productos Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, desde un tiempo atrás ha venido
realizando trabajos de biotransformación con especies de Colletotrichum y se ha
observado la tendencia de estos hongos para realizar reacciones sobre anillos aromáticos
Marco teórico y estado del arte 28
_________________________________________________________________________
y cadenas alquílicas. En la biotransformación del 2-feniletanol 19 con C. acutatum se
obtuvieron los productos: éter metílico del 2-feniletanol 20, 1-fenil-1,2-etanodiol 21, y el
acetato de 2-feniletanol 22 Figura 1-14 (94).
Figura 1-14. Biotransformación del 2-feniletanol con C. acutatum (94).
OH9
O9
10
OH9
OH10
O9
10
11
O12
1920
21
22
La biotransformación de la acetofenona 23 con esta especie produjó los compuestos 1-
feniletanol 24, 2-feniletanol 25 y 1-fenil-1,2-etanodiol 26 Figura 1-15 (94).
Figura 1-15. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (94).
O
9
OH9
OH9
OH10
OH10
2324
2526
Los metabolitos obtenidos en la biotransformación del 2-feniletanol 19 y de la
acetofenona 23, demuestran la capacidad que tiene C. acutatum para realizar
oxidaciones y reducciones en el sustituyente alquílico del grupo aromático; así como
también metilaciones y acetilaciones del hidroxilo (94).
Las biotransformaciones realizadas por el hongo filamentoso fitopatógeno Colletotrichum
acutatum sobre el sustrato arilpropanoide trans-cinamaldehído 27, empleando el medio
29 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
de cultivo líquido Czapeck-Dox. En la biotransformación se obtienen los productos
metabólicos alcohol cinamílico 28, 3-fenil-1-propanol 29, 3-fenil-oxiranometanol 30 y 1-
fenil-1,3-propanodiol 31. Figura 1-16. Se observa una tendencia del hongo fitopatógeno a
producir hidroxilaciones sobre el sustituyente del anillo aromático; asimismo tiene la
capacidad de reducir el grupo carbonilo y el doble enlace (83).
Figura 1-16. Biotransformación de la acetofenona con C. acutatum (83).
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
O
2728
29
3031
1.6.3.2. Biotransformaciones con la especie Botryodiplodia theobromae
En Colombia, este microorganismo es considerado como un patógeno de consideración
para la agricultura. La mayor parte de los estudios que se encuentran en la literatura
sobre este microorganismo se refieren a su fisiología, y han sido realizados con el fin de
conocer la dinámica de los procesos infectivos en plantas y frutos. Debido a estas
circunstancias de índole económica, B. theobromae ha sido estigmatizado por su carácter
nocivo y considerado únicamente desde la perspectiva de su control, desconociéndose y
subvalorando su potencialidad para la realización de procesos de biotransformación (24).
Además la gran mayoría de trabajos investigativos existentes son desde el punto de vista
del control de la enfermedad, ocasionada por B. theobromae, determinación de
compuestos que ejecuten control antifúngico sobre el hongo. Se muestran la incidencia
de los fungicidas y el control que se le hace a los hongos fitopatógenos B. theobromae y
Botryosphaeria dothidea, antes y después de haber infectado los frutos de melocotón y
albaricoque en China. Cabe resaltar el hecho de que a medida que el árbol tiene mayor
Marco teórico y estado del arte 30
_________________________________________________________________________
edad, la severidad de la infección es mayor, es decir, se vuelven con el pasar del tiempo
más susceptibles de ser infectados por los hongos (95). La biotransformación a partir del
sustrato 2- feniletanol 32, (96)se obtienen los metabolitos feniletanodiol 33, ácido 2-
fenilacético 34, fenilacetato de 2-feniletanol 35, acetato de 2-feniletanol 36 Figura 1-17. Y
para el sustrato acetofenona 37, Figura 1-18, (96) los metabolitos 1-feniletanol 38, ácido 2-
fenilacético 34, 2-feniletanol 32, 2-feniletanal 39, o-hidroxiacetofenona 40 y acetato de 1-
feniletanol con B.theobromae 41.
Figura 1-18. Biotransformación de acetofenona con B.theobrome (96).
Figura 1-17. Biotransformación de 2- feniletanol con B.theobrome (96).
OH9
OH9
OH10
O9
10
11
O12
32
36
3334
O9
10
11
O12
O9
OH
35
CH3
OH
CH3
O CH3
O
CH3
O
OH
CH3
O
H
O
OH
O
OH
37
32 39 34
40
3841
31 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
1.6.4. Biotransformaciones para el diseño biosintético de fungicidas
Durante los últimos años, los fungicidas de síntesis han sido una de las armas más
utilizadas por los agricultores para controlar las enfermedades causadas por hongos
fitopatógenos. Los fungicidas modernos han alcanzado un nivel de eficacia elevado junto
con una importante reducción de la toxicidad. Aunque el impacto ambiental y los efectos
toxicológicos se han minimizado, la mayoría de los fungicidas utilizados contra estos
patógenos, siguen actuando lentamente. El avance en el estudio de los factores de
patogenecidad de los hongos y su mecanismo de acción, ha abierto el camino para
desarrollar nuevas alternativas para la innovación en el control de dichas enfermedades.
Asimismo, M. Soledade C. Pedras (Ph.D) en la Universidad de Saskatchewan en Canadá
utiliza técnicas biotecnológicas para entender importancia de las enfermedades de las
semillas oleaginosas de crucíferas como la canola, semilla de colza y mostaza, vegetales
como el nabo, brócoli, nabo, y condimentos como la mostaza y wasabi. En particular
estudia, la interacción de las crucíferas, con pie negro, mancha negra, pudrición de la raíz,
pudrición del tallo, roya blanca y los hongos con el fin de realizar un diseño biosintético a
partir de su vía de detoxificacion. También el grupo de investigación de la universidad de
Cadiz “Diseño biosintético de fungicidas” liderado por Isidro González Collado (Ph.D),
sugieren que las toxinas excretadas por los hongos fitopatógenos en el mecanismo de
infección, permite desarrollar análogos biosintéticos de fungicidas.
Para entender el mecanismo de detoxficacion de los hongos se incluye: la determinación
de la estructura química de los metabolitos bioactivos sintetizados por los patógenos y
por las plantas a partir del desarrollo de un ensayo de toxicidad, el metabolismo de los
compuestos por los patógenos y las plantas, síntesis de los compuestos bioactivos y
productos de la desintoxicación. También nuestro grupo de investigación “Química de
los Productos Naturales” de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín a través
de las biotransformaciones realizadas por los hongos C. acutatum y B. theobromae
pretendemos entender las rutas metabólicas realizas por estos hongos a partir de varios
Marco teórico y estado del arte 32
_________________________________________________________________________
sustratos, un ejemplo de ello son timol y carvacrol.[ (50), (97), (98), (99), (19), (90)].
Un ejemplo es el metabolismo de la fitoalexina camalexin por cepas de Rhizoctonia
solani Kuhn, se realizó la biotransformación de 5-hidroxicamalexin, que se transformó
biológicamente en metabolitos más polares, se encontró que estos metabolitos de
camalexin fueron significativamente menos tóxicos para el patógeno, por lo que
concluyen que R. solani puede desintoxicar camalexin a través de la oxidación del anillo
indol. Además, se determinó la actividad antifúngica de de compuestos intermedios
sintetizados a partir de la vía metabólica Figura 1-19 (97). Los hongos fitopatógenos son
capaces de superar las defensas químicas de la planta a través de reacciones de
desintoxicación que son enzima mediada. Como resultado de tales detoxificaciones, la
planta se agota rápidamente, de sus más importantes metabolitos antifúngicos y puede
sucumbir al ataque de patógenos. La comprensión y la predicción de dichas vías de
desintoxicación utilizados por los hongos fitopatógenos podría conducir a enfoques para
el control de patógenos de plantas (98).
Figura 1-19. Transformación de camalexin por Rhizoctonia solani (97).
NH
NS
NH
NS
OH
NH
NO
NH
ONH
OH
N
NS
OH
OH
NH
CN
OH
+
CAMALEXIN
33 ________________________________________________________________________
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae
Las actividades inhibidoras y el metabolismo de las fitoalexinas camalexin, brassinin,
ciclobrassinin, y brassilexin por el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea fue investigado.
Brassilexin resulto ser el más antifúngico de las fitoalexinas, seguido por camalexin,
ciclobrassinin y brassinin. Aunque B. cinerea es una especie filogenéticamente
relacionados con el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum, La desintoxicación del
fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin y brassilexin por el fitopatógeno Botrytis
cinerea, se produce a través de degradación oxidativa o la hidrólisis y esto se puede
corroborar a través de ensayos de toxicidad Figura 1-20 (98).
Figura 1-20. Desintoxicación de las crucíferas fitoalexinas camalexin, brassinin, ciclobrassinin, y brassilexin
por el hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum (98).
NH
SN
NH
SN
O
DGlc
NH
NH
S
SN
NH
S
S
DGlc
NH
N
S
S
N
N
S
S
DGlc
NH
N
S
N
N
S
DGlc
camalexin
brassinin
ciclobrassinin
brassilexin
Objetivos 34
_________________________________________________________________________
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Estudiar el metabolismo de timol (2-isopropil-5-metilfenol) y carvacrol (2-metil-5-
isopropilfenol) con los hongos filamentosos fitopatógenos Colletotrichum acutatum y
Botryodiplodia theobromae, junto con su actividad antifúngica y la de algunos
compuestos relacionados estructuralmente.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar la toxicidad de los sustratos timol y carvacrol contra los hongos
filamentosos Colletotrichum acutatum y Botryodiplodia theobromae, mediante la
metodología del “agar envenenado” ó “placa perforada”.
Realizar la biotransformación de timol y carvacrol con los hongos fitopatógenos,
en medio líquido agitado.
Desarrollar una metodología de análisis cromatográfico (cromatografía de gases)
para detectar los productos metabólicos.
Analizar el progreso (concentración relativa en el transcurso del tiempo) de la
biotransformación de los sustratos timol y carvacrol con los hongos fitopatógenos,
mediante técnicas cromatográficas convencionales.
Aislar mediante la combinación de diferentes técnicas cromatográficas algunos de
los productos metabólicos mayoritarios.
Identificar mediante métodos espectroscópicos y/o espectrométricos algunos de
los productos metabólicos.
Analizar la regioselectividad y la quimioselectividad de las biotransformaciones
producidas por los hongos C. acutatum y B. theobromae sobre los sustratos timol
y carvacrol
Preparar compuestos estructuralmente relacionados con el timol y carvacrol, y
evaluar su actividad antifúngica, contra el hongos C. acutatum.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 35
_________________________________________________________________________
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL
3.1. MATELIALES Y EQUIPOS
La cromatografía de capa fina (CCF) se realizó en cromatoplacas de sílica gel 60 (F254, 0.25
mm de espesor, Merck), y como fase móvil mezclas de n-hexano-AcOEt en diferente
relación. Los compuestos se visualizaron bajo radiación UV a 254 y 365 nm, y mediante
aspersión con la mezcla AcOH: H2SO4:H2O (143:28:30) y solución de FeCl3 al 5%, seguido
por un calentamiento breve. La CCF preparativa (CCFP) se llevó a cabo empleando
cromatoplacas de sílica gel 60 (F254, 20x20 cm, 1mm de espesor, Merck); en la
cromatografía de columna (CC) se emplearon como fases estacionarias sílica gel 60
(0.040-0.063 mm; Merck) y Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich). Los análisis mediante
cromatografía de gases (CG) se realizaron en un cromatógrafo Hewlett-Packard 6890
(Agilent Technologies), acoplado a un detector de masas Agilent MSD 5973, en el modo
de ionización electrónica. Se empleó una columna HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm,
Agilent Technologies). Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes:
temperatura de la columna 50°C, temperatura del inyector 150°C, temperatura del
detector 280°C. El programa de temperatura para el horno se realizó con una rampa de
calentamiento a razón de 10°C/min hasta 250°C, y conservada a la temperatura final
durante 6 minutos. El tiempo total del análisis fue de 30 minutos y el gas de arrastre
utilizado fue N2 a un flujo de 1 mL/min. La composición relativa de los constituyentes
individuales se determinó a partir del área promedio de los picos.
Los espectros de masas se obtuvieron por ionización electrónica (EM-IE), mediante
cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM), en las condiciones citadas
previamente; los metabolitos se identificaron por comparación de sus espectros con los
reportados en la literatura y en la base de datos NIST 2002. Los espectros de RMN de 1H
y 13C se determinaron usando CDCl3 en un equipo Bruker AMX 300 con 300,12 MHz para
Sección experimental 36 _________________________________________________________________________
1H y 75,42 MHz para 13C. Los desplazamientos químicos están expresados como valores
de δ (ppm) y las constantes de acoplamiento J en Hertz (Hz). La biotransformación se
realizó en un agitador orbital tipo shaker (Centricol-serie 0239), con cámara de
incubación. El carvacrol (5-isopropil-2-metilfenol) empleado fue suministrado por Sigma-
Aldrich, y el timol (2-isopropil-5-metilfenol) por Abaquim. Se utilizó una cepa de C.
acutatum, aislada de frutos de tomate de árbol (Solanum betacea L.) infectados con
antracnosis, y caracterizada morfológica y molecularmente en el Laboratorio de
Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. El hongo B.
theobromae se aisló de frutos de aguacate (Persea americana L.) infectados con muerte
negra, y se caracterizó morfologicamente. Las cepas se mantuvieron en medio de cultivo
sólido PDA (agar papa-dextrosa), a temperatura promedio de 24°C y humedad relativa
entre 45 y 60%. Los medios de cultivo se prepararon con sales y micronutrientes grado
analítico, provenientes de las casas comerciales Aldrich y Merck. El Agar-Agar y el
extracto de levadura, de calidad microbiológica, se compraron a Merck.
3.2. METODOLOGIA
3.2.1. Mantenimiento de las Cepas C. acutatum y B. theobromae
Las cepas se mantuvieron en medios de cultivo estándares del tipo PDA [Papa 400 g/L,
Dextrosa (glucosa) 40 g/L (en la preparación del medio se sustituyó la glucosa por
sacarosa en la misma proporción), Agar-agar 40 g/L, agua hasta completar un litro]; la
temperatura promedio fue de 24oC y la humedad relativa entre 45 y 60 %. Toda la
vidriería y medios de cultivo utilizados se esterilizaron en una autoclave Figura 3-1.
Figura 3-1. C. acutatum conservado en PDA
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 37
_________________________________________________________________________
3.2.2. Evaluación de la toxicidad de los sustratos timol y carvacrol frente a los hongos C.
acutatum y B. theobromae.
Las evaluaciones se llevaron a cabo empleando la metodología de la placa perforada (ó
“agar envenenado”) y utilizando los frotis de los microorganismos realizados sobre PDA e
incubados durante 48 horas para C. acutatum y 24 horas para B. theobromae. Pasado
este tiempo, se retiraron con un sacabocados de 6 mm de diámetro los correspondientes
cilindros, que se utilizaron para inocular nuevas cajas que contenían el medio de cultivo y
timol o carvacrol a diferentes concentraciones que variaron en un rango entre 50 y 200
µg/mL. El inóculo se colocó en las perforaciones que se habían realizado previamente en
estas cajas, con un sacabocados de diámetro idéntico. La actividad antifúngica se
determinó midiendo los diámetros de crecimiento micelial cada 24 horas y durante un
tiempo de 10 días. Las evaluaciones se realizaron por triplicado, cada ensayo se respaldó
con los correspondientes controles (blanco absoluto y blanco solvente). La actividad
antifúngica de los sustratos se evaluó como el porcentaje de inhibición: 100 x (diámetro
promedio de crecimiento del micelio en el medio de control – diámetro promedio de
crecimiento del micelio en el medio del ensayo)/diámetro promedio de crecimiento del
micelio en el medio de control Figura3-2.
Figura 3-2. Evaluación de la toxicidad de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B. theobromae
Para el timol y carvacrol se construyeron las correspondientes curvas de toxicidad contra
el hongo, a partir de estas se determinó la concentración que produjo un porcentaje de
inhibición que osciló entre 50 y 60%; este valor se utilizó como concentración inicial del
sustrato en el proceso de biotransformación.
Sección experimental 38 _________________________________________________________________________
3.2.3. Biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos
fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae.
En los procesos de biotransformación se utilizó el medio de cultivo líquido Czapeck-Dox,
preparado con los siguientes componentes: (FUENTES DE CARBONO, disolución A):
Glucosa: 5 % (50 g/L), Extracto de Levadura: 0,1 % (1,0 g/L), (MICRONUTRIENTES,
disolución B): K2HPO4: 0,5 % (5 g/L), NaNO3: 0,2 % (2 g/L), MgSO4·7H2O: 0,05 %, (0,5 g/L,
500 mg/L), FeSO4·7H2O: 0.001% (0,01 g/L, 10 mg/L). El volumen de solución se ajustó con
agua destilada hasta alcanzar 1,0 L. En la formulación original se sustituyó la glucosa por
sacarosa en la misma proporción. En la preparación del medio de cultivo se esterilizaron
por separado las disoluciones A y B, para evitar el ennegrecimiento de la solución final; la
mezcla de los componentes se realizó antes de su utilización, mezclando partes iguales en
volumen de la disolución A y B Figura 3-3.
Los inóculos de C. acutatum y B. theobromae se obtuvieron a partir de los trozos de
cultivos esporulados, los cuales se depositaron en 6 Erlenmeyer de 1,0 L, conteniendo
cada uno 500 mL de medio. Los erlenmeyers inoculados se taponaron con tarugos de
algodón estéril y se preincubaron durante 10 días en un agitador orbital tipo shaker a 150
rpm; una vez terminado el periodo de preincubación, se retiró la biomasa mediante
filtración con un lienzo de nylon estéril y se transfirió a un nuevo medio de cultivo fresco.
Sobre este material se adicionó el timol y carvacrol disuelto en etanol al 50% v/v. La
biotransformación se realizó a 24°C con agitación a 120 rpm durante un periodo de 14
días; en el proceso se procuró que el hongo metabolizara la mayor parte del sustrato
Figura 3-3. Inóculos de los hongos C. acutatum y B. theobromae (periodo de incubación).
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 39
_________________________________________________________________________
Figura 3-4.
3.2.4. Evaluación del avance de la biotransformación de los sustratos timol
y carvacrol en el curso del tiempo.
Durante todo el proceso de biotransformación del timol y carvacrol, bajo las condiciones
descritas anteriormente, se realizaron muestreos cada 24 horas; en cada uno se retiró un
erlenmeyer de 100 mL con 50,0 mL de medio de cultivo, que incluía parte del micelio
durante 14 días. Este material se combinó con 50,0 mL de etanol al 95 % con la finalidad
de inhibir el proceso enzimático y detener la biotransformación. Cada una de las
muestras se saturó con cloruro de sodio (NaCl) y se extrajo con tres porciones de 50,0 ml
de acetato de etilo (AcOEt).
Los extractos se combinaron y secaron con sulfato de sodio anhidro y posteriormente se
filtraron y destilaron a presión reducida en un rotoevaporador. Cada extracto en AcOEt,
se redisolvió con 3,0 mL de cloroformo grado analítico, se filtró a través de un microfiltro
Whatman (0,45 μm) y analizó por CCF y CG-EM. La relación entre el sustrato y los
productos metabólicos se determinó con base en el área de los picos en CG. Los
productos puros que se lograron obtener mediante CCFP y CC se utilizaron como
patrones de referencia en el análisis CG-EM e igualmente se emplearon compuestos
Figura 3-4. Procesos de biotransformación de los sustratos timol y carvacrol por los hongos fitopatógenos
C. acutatum y B. theobromae.
Sección experimental 40 _________________________________________________________________________
puros obtenidos de marcas comerciales reconocidas. A partir de las estructuras de los
productos obtenidos y los experimentos realizados en el curso del tiempo, se planteó una
posible ruta metabólica para la biotransformación del timol y carvacrol frente a los
hongos fitopattógenos C. acutatum y B theobromae.
3.2.5. Extracción y purificación de algunos de los metabolitos mayoritarios
resultantes de la biotransformación
Después de transcurrido un tiempo de biotransformación de 14 días, los medios de
cultivo se filtraron a través de un lienzo de nylon fino, para retirar la mayor parte de la
biomasa (micelio); el filtrado se saturó con NaCl y AcOEt, y se sometió nuevamente a un
proceso de filtración utilizando tierra de diatomeas (celita).
El filtrado se reunió y se extrajo con tres volúmenes de AcOEt, en una proporción de 1/3
v/v. El extracto obtenido se denominó Fracción Neutra. El micelio obtenido se mezcló con
NaCl hasta saturación y se adicionó acetona hasta cubrirlo completamente. Se realizaron
tres extracciones con acetona, las cuales se reunieron y después de ser filtradas se
sometieron a destilación a presión reducida, con la finalidad de eliminar el solvente. El
extracto acuoso obtenido se extrajo con AcOEt por tres veces, diclorometano (CH2Cl2) dos
veces y se obtuvo la Fracción Micelio Todas las fracciones obtenidas, se analizaron
mediante cromatografía de capa fina comparativa, con la finalidad de determinar su
composición. La elusión de las placas se realizó con mezclas de polaridad creciente de n-
hexano, AcOEt y el revelado se efectuó con luz UV, vapores de yodo, FeCl3 (para visualizar
compuestos de tipo fenólico), y revelador universal. La separación y aislamiento de los
metabolitos se realizó mediante la aplicación de diferentes técnicas cromatográficas tales
como: Cromatografía de capa fina (CCF) y Cromatografía de Columna (CC) o exclusión
molecular en diferentes soportes tales como: sílica gel 60 (gel de sílice) y Sephadex LH-
20.
La elusión se realizó con solventes de polaridades crecientes para la CC de adsorción, y la
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 41
_________________________________________________________________________
mezcla n-hexano-CH2Cl2-metanol (2:1:1, v/v) y luego metanol para la CC de exclusión
molecular. Adicionalmente, las fracciones cromatográficas se purificaron por CCF, con el
propósito de obtener los metabolitos mayoritarios Figura 3-5.
Figura 3-5. Diagrama del proceso de extracción de los filtrados de los medios de cultivo.
-Extracción con Acetato de Etilo (3 x
2L)
EXTRACTO TOTAL ANHIDRO
-Destilación a presión reducida
EXTRACTO TOTAL CRUDO
-Filtración parcial sobre mallas de Nylon
FASE ACUOSA
(descartar)
EXTRACTO TOTAL
FILTRADO TRASLÚCIDO
vol. aprox. 4 L
MICELIO
(descartar)
EXTRACCION - FRACCIONAMIENTO
MEDIO DE CULTIVO: CZAPECK-DOX
INOCULO: Trozos de cultivo de placas
-Fermentación durante 15 dias en
erlermeyer-Luz difusa 24 horas
-Agitación orbital 120 rpm
-Volumen total de fermentación 4 litros
FILTRADO TURBIO
Vol. Aprox. 4L
MICELIO
(descartar)
-Na2SO4 Anhidro
-Filtración sobre papel de filtro
-NaCl hasta saturación
-Filtración sobre CELITA 545
-Extracción con Acetato de Etilo (3 x
2L)
EXTRACTO TOTAL ANHIDRO
-Destilación a presión reducida
EXTRACTO TOTAL CRUDO
-Filtración parcial sobre mallas de Nylon
FASE ACUOSA
(descartar)
EXTRACTO TOTAL
FILTRADO TRASLÚCIDO
vol. aprox. 4 L
MICELIO
(descartar)
EXTRACCION - FRACCIONAMIENTO
MEDIO DE CULTIVO: CZAPECK-DOX
INOCULO: Trozos de cultivo de placas
-Fermentación durante 15 dias en
erlermeyer-Luz difusa 24 horas
-Agitación orbital 120 rpm
-Volumen total de fermentación 4 litros
FILTRADO TURBIO
Vol. Aprox. 4L
MICELIO
(descartar)
-Na2SO4 Anhidro
-Filtración sobre papel de filtro
-NaCl hasta saturación
-Filtración sobre CELITA 545
Sección experimental 42 _________________________________________________________________________
3.2.6. Identificación de los productos mayoritarios aislados de las
biotransformaciones
La identificación estructural de los diferentes productos de biotransformación, se realizó
mediante la aplicación de técnicas espectroscópicas y espectrométricas modernas tales
como Espectrometría de Masas y Resonancia Magnética Nuclear (RMN 1H y RMN 13C).
3.2.7. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el
timol y carvacrol y evaluación de su actividad antifúngica contra los hongos
C. acutatum y B. theobromae
Entre los compuestos relacionados estructuralmente con el timol y carvacrol, se
prepararon los productos obtenidos mediante la biotransformación, con el fin de
confirmar su estructura (por co-elusión y propiedades espectroscópicas y
espectrométricas) y realizar un análisis de la actividad antifúngica contra C. acutatum.
Para ello se sintetizaron el timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter.
Adicionalmente, se empleó timoquinona comercial (Sigma-Aldrich), y se preparó y
purificó parcialmente la timohidroquinona. De otro lado, se sintetizaron algunos
derivados nitrados y bromados del timol y carvacrol. Una vez obtenidos los compuestos
relacionados estructuralmente con el timol y carvacrol, se determinó su actividad
antifúngica contra el hongo C. acutatum.
Los ésteres timil- y carvacril acetato se prepararon de la siguiente forma: a una solución
de timol o carvacrol (1,0 equiv) en diclorometano anhidro se agregó cloruro de acetilo
(1.1 equiv), y 3 gotas de piridina como catalizador. La mezcla se agitó continuamente a
0 ºC durante 6 h, el proceso de reacción se monitoreó por CCF. Después de terminada la
reacción, se inactivo agregando salmuera y se extrajo con CH2Cl2 (3x 25 mL). Por último,
la fase orgánica se lavó con agua destilada y se secó con sulfato de sodio anhidro. Luego,
se eliminó el solvente a presión reducida y se purifico por CC sobre sílica gel (fase móvil n-
hexano y n-hexano-AcOEt, 9:1 v/v).
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 43
_________________________________________________________________________
Los éteres metílicos timil- y carvacril metil éter, se prepararon disolviendo timol o
carvacrol en acetona (1,0 equiv), luego a la solución se le agrego carbonato de potasio y
se agito durante media hora a 0 ºC. Posteriormente, a la solución se agregó yoduro de
metilo (1,1 equiv) y se calentó a reflujo durante 6 h. El proceso de la reacción se
monitoreó por CCF. Finalmente, se agregó salmuera, se extrajo con CH2Cl2, y se secó con
sulfato de sodio anhidro. Luego se eliminó el solvente a presión reducida y se purifico por
CC en sílica gel usando n-hexano como fase móvil.
Para realizar las nitraciones del timol o carvacrol, se llevaron a enfriamiento (-5 ºC)
soluciones de cada compuesto (1,0 equiv) disueltos en ácido acético; y se agregó gota a
gota, lentamente y en agitación, la mezcla nitrante (ácido sulfúrico/ácido nítrico en
relación 10:1). Las reacciones se sometieron a agitación entre 4 y 6 h, realizándose un
seguimiento del progreso mediante CCF. Al finalizar este tiempo, se agregaron 20 mL de
solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3), y se extrajeron los compuestos con CH2Cl2
(3x25 mL). Por último se descartaron las fases acuosas y se secaron las fases orgánicas
con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4); el solvente se evaporó por completo mediante
destilación a presión reducida y los compuestos obtenidos se purificaron por CC.
Para la preparación de los productos bromados, se agregó a una solución de timol o
carvacrol (1,0 equiv.) en CH2Cl2 (5 mL), N-bromosuccinimida (1,2 equiv) y se sometió en
agitación a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó gota a gota 1 mL de H2O2 al
30%. Después de finalizada la reacción (entre 4 y 5 horas), se agregó salmuera y se
extrajo con CH2Cl2. El disolvente se evaporó a presión reducida y los compuestos se
purificaron por CC.
Discusión de resultados 44
_______________________________________________________________________ __
4. DISCUSION DE RESULTADOS
4.3. ASPECTOS GENERALES
Los hongos seleccionados para el presente trabajo crecieron satisfactoriamente en el
medio de cultivo solido PDA a una temperatura de 25º C y una humedad relativa entre 45
y 60%; así mismo, se observó un desarrollo adecuado de los microorganismos en el
medio liquido Czapeck-Dox.
4.2. TOXICIDAD DE LOS SUSTRATOS TIMOL Y CARVACROL
FRENTE A LOS HONGOS C. acutatum Y B. theobromae.
La actividad antifúngica de timol y carvacrol contra los hongos C. acutatum y B.
theobromae se llevó a cabo utilizando la técnica de la placa perforada o también
conocida como “agar o alimento envenenado”; para ello se realizó un estudio preliminar
empleando concentraciones de los monoterpenos aromáticos desde 50 hasta 500 µg/mL.
Posteriormente, el rango de concentraciones se estrechó entre 50 y 200 µg/mL, debido a
la elevada toxicidad de los compuestos contra los dos microorganismos y su competa
inhibición entre 400 y 500 µg/mL. Los resultados de la actividad antifúngica de timol y
carvacrol contra C. acutatum y B. theobromae se presentan en las Figura 4-1 hasta Figura
4-4. Como se puede observar, el crecimiento micelial de estos hongos fue dependiente de
la concentración de ambos monoterpenos aromáticos en el medio de cultivo. A 150
µg/mL o más, timol y carvacrol inhibieron el crecimiento radial de C. acutatum por
completo y este efecto se mantuvo durante las 240 h del experimento Figura 4-1. Además,
C. acutatum inició su crecimiento pasadas 48 y 96 h posteriores a la inoculación, cuando
se trató con timol y carvacrol a 100 µg/mL, respectivamente. Además, los porcentajes de
inhibición Figura 4-2 de C. acutatum a 75 µg/mL estuvieron entre 25 y 30% para carvacrol,
y entre 50 y 60% para timol. Esto muestra una mayor actividad antifúngica de timol en
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 45
_________________________________________________________________________
comparación con carvacrol frente a C. acutatum. Los porcentajes de inhibición de C.
acutatum alcanzados por timol y carvacrol a 100 µg/mL durante los 10 días de evaluación,
oscilaron entre 86,0 (día 1) y 55,0% (día 10), y entre 63,0 (día 1) y 30,5% (día10), respectivamente. Como se
puede apreciar de la figura, la inhibición del crecimiento micelial decreció con el tiempo
para las concentraciones menores a 150 µg/mL.
Figura 4-1. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C.
acutatum.
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Cre
cim
ien
to m
ice
lial r
adia
l (m
m)
.
Tiempo (h)
Control
Controlethanol50 μg/mL 75 μg/mL 100 μg/mL 125 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL
Carvacrol - C. acutatum
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240Cre
cim
ien
to m
ice
lial r
adia
l (m
m)
.
Tiempo (h)
Control
Controlethanol50 μg/mL 75 μg/mL 100 μg/mL 125 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL
Timol - C. acutatum
Discusión de resultados 46
_______________________________________________________________________ __
.
En el caso de B. theobromae, el crecimiento se inhibió completamente a una
concentración de 150 y 200 µg/mL de carvacrol o timol. Para B. theobromae, sólo
pequeñas diferencias se encontraron en el porcentaje de inhibición entre timol y
carvacrol Figura 4-3. La inhibición del crecimiento de B. theobromae por timol a 100 µg/mL
y durante 6 días alcanzó valores entre 97,7 (día 1) y 86,5% (día 6), mientras que para
carvacrol los valores oscilaron entre 93,2 (día 1) y 69,1% (día 6). En general, los
porcentajes de inhibición del crecimiento de B. theobromae, al igual que con C. acutatum,
alcanzados por timol y carvacrol a 100 µg/mL disminuyeron con el tiempo Figura 4-4. Este
hallazgo sugiere que ambos hongos poseen un mecanismo de desintoxicación de timol y
carvacrol. Distintos estudios indican que la posición del grupo hidroxilo es muy
importante en la actividad antifúngica e insecticida del timol y carvacrol (100).
0
10
20
30
40
50
60
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80
90
100
24
48
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125 150 200
Carvacrol - C. acutatum
Tiempo ( h)
% de inibición
0
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240
50 75 100125 150 200
% de inhibición
Tiempo ( h)
Timol- C. acutatum
Figura 4-2. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno C. acutatum.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 47
_________________________________________________________________________
Figura 4-3. Evaluación de actividad antifúngica de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B.
theobromae.
0
10
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30
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0 24 48 72 96 120 144
Cre
cim
ien
to m
ice
lial r
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l (m
m)
.
Tiempo (h)
Control
Controlethanol
50 μg/mL
75 μg/mL
100 μg/mL
150 μg/mL
200 μg/mL
Carvacrol - B. theobromae
0
10
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30
40
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0 24 48 72 96 120 144
Cre
cim
ien
to m
ice
liar
rad
ial
(mm
) .
Tiempo (h)
Control
Controlethanol50 μg/mL
75 μg/mL
100 μg/mL 150 μg/mL 200 μg/mL
Timol - B. theobromae
Discusión de resultados 48
_______________________________________________________________________ __
En general, los resultados revelan que carvacrol y timol muestran un efecto antifúngico
relativamente alto contra C. acutatum y B. theobromae. La actividad antifúngica de timol
y carvacrol contra otros hongos fitopatógenos también ha sido investigada [ (101), (102)].
En particular, timol y carvacrol mostraron una fuerte actividad antifúngica contra
Phytophthora cactorum y Cryphonectria parasitica a 28 x 10-3 µg/mL (100), se inhibieron
completamente Alternaria arborescens y Rhizopus stolonifer (103). Además, se han
reportado propiedades antimicrobianas para el timol y carvacrol contra bacterias
involucradas en la putrefacción y patogenización de alimentos, por lo que se ha sugerido
su uso como conservante (104). El modo de acción del carvacrol y timol es aún incierto;
sin embargo, la actividad podría estar relacionada con la hidrofobicidad y, en
consecuencia, la capacidad de ambos compuestos para atravesar la membrana celular de
los hongos (105), lo que afecta a la homeostasis del pH y el equilibrio de los iones
inorgánicos, dañando las estructuras celulares [ (106), (69)]. Por otra parte, la
participación del grupo hidroxilo en la formación de enlaces de hidrógeno y la acidez de
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 48 72 96 120 144
50 75 100
150 200
Tiempo ( h )
% de inhibición
Timol - B.theobromae
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 48 72 96 120 144
50 75 100
150 200
Tiempo ( h)
% de inhibición
Carvacrol - B.theobromae
Figura 4-4. Inhibición de carvacrol y timol frente a el hongo fitopatógeno B. theobromae.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 49
_________________________________________________________________________
estos compuestos fenólicos pueden ser otro factor importante que participa en la
bioactividad (106) han sugerido que el carvacrol actúa como un intercambiador de
protones, lo que reduce el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática. Esto
lleva al colapso de la bomba de protones y al agotamiento de la reserva de ATP, causando
la muerte celular. Además, parece posible que ambos compuestos puedan interferir en la
actividad de enzimas α- y β-glucanasas del hongo (107). Con base en la actividad
antifúngica de timol y carvacrol contra C. acutatum y B. theobromae, se seleccionaron
como concentraciones para los estudios metabólicos 80 y 125 µg/mL respectivamente
4.3. BIOTRANSFORMACIONES LOS SUSTRATOS TIMOL Y
CARVACROL FRENTE A LOS HONGOS C. acutatum Y B.
theobromae.
4.3.1 Extracción, aislamiento e identificación de productos
La biotransformación se llevó a cabo en medio líquido Czapeck-Dox, empleando las
concentraciones seleccionadas para timol y carvacrol. Además, se realizó un control (sin
sustrato) con el fin de comparar la presencia/ausencia de los productos metabólicos. Los
extractos orgánicos obtenidos se evaluaron por CCF y CG-EM. Debido a la limitada
biotransformación de los monoterpenos aromáticos empleados y su buena actividad
antifúngica, no fue posible aislar los metabolitos en cantidad suficiente como para
realizar su elucidación estructural sin ambigüedades por resonancia magnética nuclear
directa. Por lo anterior, se hizo necesario llevar a cabo la identificación por comparación
de los espectros de masas con aquellos reportados por la base de datos NIST 2002.
Además, los compuestos se confirmaron por co-elusión con muestras auténticas
comerciales u obtenidas por vía sintética. En las Tabla 4-1 a Tabla 4-4, se presentan los
metabolitos detectados y tentativamente elucidados resultantes de la biotransformación.
Discusión de resultados 50
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-1. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de carvacrol con C. acutatum.
Compuesto
No.
TR (min) m/z de iones fragmentados (%intensidad
relativa)
Identificación
(CC1) * 18,94
166 (M+) [47], 152 [14], 151 (M+−CH3) [100],
137, 123 (M+−C3H7) [10], 95 (10), 83 [10], 77,
71, 69, 57, 55, 43 (C3H7+) [14], 41 [10].
Timohidroquinona
(CC2) ‡ 16,96
166 (M+) [24], 151 (M+−CH3) [41], 138 [21],
107 [71] (M+−C3H6O−H), 83, 77, 57, 43 (C3H7+)
(100).
5-(1-Hidroxi-1-
metil-etil)-2-metil-
fenol
(CC3) ‡ 19,34
164 (M+) [100], 149 (M+−CH3) [30], 147
(M+−OH) *12+, 137 *11+, 121 (M+−C3H7) [26],
107, 91 (C7H7+) [19], 77 (C5H5
+) [11], 57, 55, 39.
2-Isopropenil-5-
metil-benceno-1,4-
diol
(CC4) † , * 17,50
164 (M+) [100], 149 (M+−CH3) [40], 121
(M+−C3H7) [27], 103, 91 (C7H7+) [16], 77 (C5H5
+)
[11], 43.
Carvacril metil eter
(CC5) † ,* 14,05
164 (M+) [63], 149 (M+−CH3) [70], 136
(M+−CO) *40+, 135 (M+−HCO) *51+, 121
(M+−C3H7) [81], 108 (M+−CO−C2H4) [29], 107
[25], 93 [100], 91 (C7H7+) [61], 79 [35], 77
(C5H5+) [47], 68 [45], 39 [85].
Timoquinona
(CC6) † , * 13,28
192 (M+) [7], 150 (M+−H2C2O) [58], 135
(M+−H2C2O−CH3) [100], 91 (C7H7+) [14], 83, 77
(C5H5+), 44.
Carvacril acetato
Identificado por: *, comparación con estándar autentico y RMN; †, comparación con espectro de masas reportado en la literatura; ‡,
estructura derivada de la interpretación del espectro de masas.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 51
_________________________________________________________________________
Tabla 4-2. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de timol con C. acutatum.
Compuesto
No.
TR (min) m/z de iones fragmentados (%intensidad
relativa)
Identificación
(TC1) ‡ 19,36
166 (M)+ [40], 151 (M+−CH3) [100], 133
(M+−H2O−CH3) [9], 121 (M+−H2CO−CH3)
[20], 107 (M+−H2CO−C2H4−H) *8+, 105
[8], 103 [8], 95 [10], 91 [10], 77 (C6H5+)
[18].
2-(1-
hidroxipropan-
2-il)-5-
metilfenol
(TC2) * 18,85
166 (M)+ [42], 151 (M+−CH3) [100], 142
[20], 123 (M+−C3H7) [7], 77 (C6H5+) [9],
43 (C3H7+) [22].
Timohidroquina
(TC3) * 18,33
164 (M)+ [41], 149 (M+−CH3) [100], 135
[29], 121 (M+−C3H7) [29], 105 [38], 103
[24], 91 (C7H7+) [46], 77 (C6H5
+) [36], 43
(C3H7+) [81].
Timil metil
51ter
Identificado por: *, comparación con estándar autentico y RMN; †, comparación con espectro de masas reportado en la literatura; ‡,
estructura derivada de la interpretación del espectro de masas
Discusión de resultados 52
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-3.Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de carvacrol con B. theobromae.
Compuesto
No.
TR (min) m/z de iones fragmentados (%intensidad
relativa)
Identificación
(CB1) ‡ 19,25
166 (M+) [28], 135 (M+−H2CO−H) *100+, 115
[11], 105 (M+−H2O−C2H4−CH3) [32], 91
(C7H7+) [22], 79 [8], 77 (C6H5
+) [10].
5-(2-hidroxi-1-
metil-etil)-2-
metil-fenol
(CB2) * 18,94
166 (M+) [39], 151 (M+−CH3) [100], 123
(M+−C3H7) [13], 95, 85, 71, 57 [17], 43
(C3H7+) [15], 41 [12].
Timohidroquinon
a
(CB3) ‡ 18,35
166 (M+) [29], 148 (M+−H2O) [56], 133
(M+−H2O−CH3) [21], 105 [100], 91 (C7H7)+
[19], 83, 77 (C6H5+) [25], 57 [14], 43 (C3H7
+)
[15].
2-hidroximetil-5-
isopropil-fenol
(CB4) ‡ 16,96
166 (M+) [24], 151 (M+−CH3) [41], 138 [16],
107 [71], 91 (C7H7+) [15], 77 (C6H5
+) [24], 71,
65, 57, 43 (C3H7+) [100].
5-(1-Hidroxi-1-
metil-etil)-2-
methyl-phenol
(CB5) †, * 14,05
164 (M+) [94], 149 (M+−CH3) [100], 135 [24],
121 (M+−C3H7) [29], 103 [25], 91 (C7H7)+
[30], 77 (C6H5+) [33], 65 [13].
Timoquinona
(CB6) ‡ 14,15
148 (M+) [100], 133 (M+−CH3) [44], 108 [29],
107 (M+−C3H5) [22], 105 [30], 91 (C7H7+)
[22], 77, 57 [20], 43, 41 [14].
5-Isopropenil-2-
metil-fenol
(CB7) †, * 13,28
192 (M+) [7], 150 (M+−H2C2O) [58], 135
(M+−H2C2O−CH3) [100], 91 (C7H7+) [14], 83,
77 (C5H5+), 44.
Carvacril acetato
Identificado por: *, comparación con estándar autentico y RMN; †, comparación con espectro de masas reportado en la literatura; ‡,
estructura derivada de la interpretación del espectro de masas.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 53
_________________________________________________________________________
Tabla 4-4. Tiempo de retención (TR) por CG, propiedades del espectro de masas e identificación de los
productos detectados en la biotransformación de timol con B. theobromae.
Compuesto
No.
TR (min) m/z de iones fragmentados (%intensidad
relativa)
Identificación
(TB1) ‡ 19,36
166 (M)+ [40], 151 (M+−CH3) [100], 133
(M+−H2O−CH3) [9], 121 (M+−H2CO−CH3)
[20], 107 (M+−H2CO−C2H4−H) *8+, 105 *8+,
103 [8], 95 [10], 91 (C7H7+) [10], 77 (C6H5
+)
[18].
2-(1-
hidroxipropan-2-
il)-5-metilfenol
(TB2) * 18,94 166 (M)+ [42], 151 (M+−CH3) [100], 142 [20],
123 [7], 77 (C6H5+) [9], 43 [22].
Timohidroquinon
a
(TB3) ‡ 14,08
168 (M)+ [7], 153 (M+−CH3) [13], 150
(M+−H2O) [47], 139 [9], 135 (M+−H2O−CH3)
[41], 126 (M+−C3H6) [100], 111 [42], 104
[55], 97 [37], 91 (C7H7+) [25], 83 [65], 69
[30], 55 [31], 43 [26], 41 [31].
4-Hidroxi-3-
isopropil-6-metil-
ciclohex-2-enona
o isómero de
posición
(TB4) *, † 13,28
192 (M)+ [6], 150 (M+−H2C2O) [34], 135
(M+−H2C2O−CH3) [100], 115 [10], 105, 91
(C7H7+) [15], 77 (C6H5
+) [7].
Timil acetato
(TB5) ‡ 13,88
168 (M)+ [6], 153 (M+−CH3) [12], 150
(M+−H2O) [49], 139 [8], 135 (M+−H2O−CH3)
[31], 126 (M+−C3H6) [100], 111 [41], 107
[24], 97 [37], 83 [55], 69 [32], 55 [34], 43
[43].
4-Hidroxi-6-
isopropil-3-metil-
ciclohex-2-enona
o isómero de
posición
(TB6) ‡ 13,04
182 (M)+ [7], 140 (M+−H2C2O) [20], 139
(M+−H2C2O−H) *15+, 122 *19+, 112 *25+, 111
(M+−H2C2O−C2H4−H) *100+, 96 *39+, 83 *19+,
96 [39], 83 [18].
2-Hidroximetil-5-
isopropil-
benceno-1,4-diol
Identificado por: *, comparación con estándar autentico y RMN; †, comparación con espectro de masas reportado en la literatura; ‡,
estructura derivada de la interpretación del espectro de masas.
Discusión de resultados 54
_______________________________________________________________________ __
4.3.2 Análisis espectroscópicos de los metabolitos obtenidos en la biotransformación
Para aclarar el mecanismo de detoxificacion de los sustratos timol y carvacrol con los
hongos C. acutatum y B. theobromae se realizó una comparación por CCF y CG entre el
extracto obtenido a partir de la biotransformación y el control. Los resultados muestran
que el carvacrol fue transformado por C .acutatum en seis metabolitos principales y otros
productos detectados en menor proporción Figura 4-5. Las estructuras de estos
compuestos se determinaron a partir de la interpretación de los datos espectrales (EM y
RMN), y la comparación con muestras auténticas.
Dos compuestos (CC1 y CC2), tienen una fórmula molecular C10H14O2 basado en su
espectro de masas, M+ = 166 uma. El ion molecular es de 16 unidades de masa (1
oxígeno) superior a la del compuesto original (el carvacrol), lo que indica la adición de un
(i
(ii
(iii)
CC3
CC1
CC4 CC2
CC5 CC6
(C)
Figura 4-5. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de carvacrol con C. acutatum después: 2
(i), 7 (ii), y 14 días (iii).
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 55
_________________________________________________________________________
grupo hidroxi a la estructura del sustrato. El metabolito (CC1) tiene un ion fragmento a
m/z 151 (pico base) atribuido a la pérdida de grupo metilo. Además, picos de baja
intensidad en m/z 123 y 43 uma correspondiente a la pérdida de grupo isopropilo y
formación de catión isopropilo, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CC1)
se identificó tentativamente como 2-metil-5-isopropilhidroquinona (timohidroquinona)
Tabla 4-5.
Tabla 4-5. Espectro de masas y estructura de timohidroquinona.
Masas
OH
OH
CC1
Desafortunadamente, la baja abundancia de (CC1) en la biotransformación impidió el
aislamiento y caracterización espectroscópica sin ambigüedades. Por lo tanto, se requirió
de la preparación de este compuesto por oxidación de timoquinona, empleando dicloro-
diciano-quinona (DDQ). Su presencia en la biotransformación se confirmó por
comparación en CCF del extracto proveniente de la biotransformación y la mezcla de
reacción de la timoquinona y DDQ. Además, el espectro de masas y tiempo de retención
para (CC1) fueron consistentes con los de la timohidroquinona sintética. La
timohidroquinona se reportó anteriormente como un producto metabólico en la
biotransformación de timol y carvacrol con una cepa de Pseudomonas (108). De manera
similar, el producto metabólico (CC2) dio iones fragmentados m/z 43 (pico base) y 151
que indica la formación de catión isopropilo y la pérdida de grupo metilo. Además, un
pico m/z 107 (ausente en CC1) correspondiente a la pérdida de (CH3)2CO y el radical
hidrógeno. Este metabolito se identificó 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol Tabla 4-6.
Discusión de resultados 56
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-6. Espectro de masas y estructura de 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol.
Masas
OH
OH
CC2
Tres compuestos (CC3, CC4 y CC5) presentan una fórmula molecular C10H12O2 en
concordancia con el ión molecular, M+ = 164 uma. El metabolito (CC3) tiene iones
fragmentados m/z 149, 147, 121 y atribuye a la pérdida de metilo, grupos hidroxilo e
isopropilo, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CC3) se ha dilucidado
tentativamente a ser 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol Tabla 4-7.
Tabla 4-7. Espectro de masas y estructura de 2-isopropenil-5-metil-benceno-1 ,4-diol.
Masas
OH
OH
CC3
El compuesto metabólico (CC4) corresponde al derivado metilado de carvacrol, metil
carvacril éter. Los fragmentos en m/z 149 (M+ -CH3), 121 (M+-C3H7), 91 (C7H7+) y 77 (C5H5
+)
confirman esta propuesta. Además, el compuesto (CC4) se identificó por comparación del
tiempo de retención en CG y CCF con una muestra auténtica. Los datos de RMN se
presentan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.14 (d, 6H, J = 7.0), 2.24 (s, 3H),
2.85 (sept, 1H, 7.0), 3.90 (s, 3H), 6.88 (d, 1H, J = 2.0), 7.13 (dd, 1H, J = 7.8, 2.0), 7.27 (d,
1H, J = 7.8) Tabla 4-8. El espectro de masas del producto (CC5) se caracterizó
principalmente por los iones fragmento a m/z 149, 136 y 121 correspondientes a la
pérdida de grupo metilo, monóxido de carbono, y el grupo isopropilo, respectivamente.
La comparación del espectro de masas de (CC5) con lo reportado en la biblioteca
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 57
_________________________________________________________________________
espectral NIST 2002, indicó que el compuesto corresponde con la timoquinona. Además,
el metabolito (CC5) presentó el mismo tiempo de retención en CG, e igual factor de
retención (Rf) en CCF que una muestra auténtica de timoquinona (Sigma-Aldrich). Los
datos de RMN son: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.10 a 1.30 (d, 6H), 2.24 (s, 3H), 3.10 a
3.20 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.64 (s, 1H) Tabla 4-9.
Tabla 4-8. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de metil carvacril éter.
Masas
1H RMN
OCH3
CC4
Tabla 4-9. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de Timoquinona
Masas
1H RMN
O
O
CC5
Discusión de resultados 58
_______________________________________________________________________ __
La timoquinona se reportó anteriormente como un producto de la biotransformación de
timol con microalgas inmovilizadas durante 24 horas (109). La biotransformación máxima
se llevó a cabo por Synechococcus sp. MCCS 034 con un 1,5% de eficiencia en la
producción de timoquinona. Los autores encontraron que el timol se convirtió
débilmente en timoquinona y se sugirió que este bajo nivel de transformación puede ser
debido a la toxicidad de timol.
La fórmula molecular del compuesto (CC6) es C12H16O2 sobre la base de su espectro de
masas (M+ = 192 uma). Adicionalmente se apreció un ion fragmento (m/z = 150 uma),
que corresponde a la pérdida de una molécula neutra de ceteno (M+ - CH2=C=O). Estos
datos espectrales sugieren la presencia del grupo acetilo. El metabolito (CC6) fue
identificado como carvacril acetato.
La estructura de (CC6) se confirmó por co-elución en CCF y CG con una muestra auténtica
de carvacril acetato. Los datos de RMN se presentan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300
MHz): δ 1.32 (d, 6H, J = 7.0), 2.22 (s, 3H), 2.37 (s, 3H), 2.95 (sept, 1H, J = 7.0), 6.94 (d, 1H, J
= 2.0), 7.10 (dd, 1H, J = 8.0, 2.0), 7.23 (d, 1H, J = 8.0); 13C RMN (CDCl3, 75 MHz): 16.2, 21.3,
24.4, 34.0, 120.2, 124.6, 127.6, 131.4, 148.5, 149.8, 169.7. Tabla4-10.
Algunos de estos mismos metabolitos se encontraron también en la biotransformación
de carvacrol utilizando B. theobromae. De hecho, los tiempos de retención (TR) y
espectros de masas de (CC1), (CC2), (CC5), y (CC6) fueron similares a los obtenidos para
(CB2), (CB4), (CB5), y (CB7), respectivamente. Además, la timohidroquinona se detectó
en un medio de cultivo de B. theobromae conteniendo timol.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 59
_________________________________________________________________________
Tabla 4-10. Espectro de masas, 1H RMN,
13C RMN y estructura de carvacril acetato.
Masas
O
O
CC6
1H RMN 13C RMN
Usando timol como sustrato (a 80 µg/mL) y C. acutatum como biocatalizador, se
obtuvieron tres metabolitos mayoritarios (TC1, TC2, y TC3) y muchos compuestos
minoritarios, que fueron detectados por un análisis de CG. El espectro de masas del
metabolito (TC1) exhibió un ión molecular a m/z = 166 (M)+ y un patrón de fragmentación
consistente con la pérdida de un grupo metilo (M + - 15, m/z = 151), para dar un ion
fragmento abundante (pico base), la pérdida de grupo metilo y agua (M + - 18 - 15), y la
pérdida de acetaldehído y radical hidrógeno (en m/z = 121 uma). Como resultado, el
metabolito (TC1) se identificó tentativamente como 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-
fenol Tabla 4-11.
Tabla 4-11. Espectro de masas y estructura de 2-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-5-metil-fenol.
Masas
OH
OH
(TC1)
Discusión de resultados 60
_______________________________________________________________________ __
El compuesto (TC2) mostró un tiempo de retención (TR) y espectro de masas
indistinguible del obtenido para una muestra auténtica de timohidroquinona, (CC1) =
(TC2). Además, el metabolito (TC3) se identificado mediante la comparación del tiempo
de retención de CG con una muestra auténtica de timil metil éter. Los datos de RMN
correspondientes se describen a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.22 (d, 6H, J
= 7.0), 2.33 (s, 3H), 3.37 (sept, 1H, J = 7.0), 3.80 (s, 3H), 6.79 (d, 1H, J = 8.0), 6.92 (dd, 1H, J
= 8.0, 2.0), 7.05 (d, J = 8.0). 13C RMN (CDCl3, 75 MHz): δ 21.3, 23.5, 27.6, 56.3, 112.3,
125.9, 126.6, 137.0, 137.5, 158.4 Tabla 4-12.
Tabla 4-12. Espectro de masas, 1H RMN,
13C RMN y estructura de Timil metil eter.
Masas
O
(TC3)
1H RMN
13C RMN
Del mismo modo, la transformación microbiana de carvacrol por B. theobromae mostro
siete metabolitos principales. Los productos metabólicos (CB2), (CB4), (CB5) y (CB7)
mostraron tiempos de retención y espectro de masas idénticos a los observados para
timohidroquinona, 5-(1-Hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol, timoquinona, y carvacril
acetato, respectivamente. Además, la identificación de (CB5) y (CB7) se confirmó por
coelución en CG con estándares auténticos. Además, la estructura de (CB1), (CB3), y
(CB6) se derivó a partir de sus espectros de masas. El metabolito (CB1) presentó una
fórmula molecular C10H14O2 consistente con el ion molecular, M + = 166 uma. Además,
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 61
_________________________________________________________________________
este compuesto mostró iones fragmento a m/z = 135, coherentes con la pérdida de H2CO
y radical hidrógeno, y m/z 105 atribuibles a la perdida de agua, etileno y radical metilo.
Así, (CB1) se sugirió como el 5-(2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol Tabla 4-13.
Tabla 4-13. Espectro de masas y estructura de 5 - (2-hidroxi-1-metil-etil)-2-metil-fenol.
Masas
OH
OH
(CB1)
El metabolito (CB3) tiene una fórmula molecular (C10H14O2; M+ = 166) y iones fragmentos
a m/z 148 (M+ - 18), 133 (M+ - 18 - 15), y 105 (M+ - 18 - 28 - 15), atribuidos a las pérdidas
de agua, agua junto con el radical metilo, y agua, etileno y radical metilo,
respectivamente. A partir de los datos espectrales, (CB3) se elucidó tentativamente como
2-hidroximetil-5-isopropil-fenol Tabla 4-14.
Tabla 4-14. Espectro de masas y estructura de 2-hidroximetil-5-isopropil-fenol
Masas
OH
OH
(CB3)
El compuesto metabólico (CB6) tiene una fórmula molecular C10H12O basado en su
espectro de masas, (M)+ = 148 uma. El ion molecular es 2 unidades de masa (2H) menor
que la del compuesto de partida (carvacrol), lo que indica la eliminación de hidrógeno a
partir de carvacrol. El metabolito (CB6) tiene iones fragmento a m/z 133 y 107
atribuibles, en ese orden, a la pérdida de los radicales metilo e isopropileno. A partir de
los datos espectrales, (CB6) se ha identificó como 5-isopropenil-2-metil-fenol Tabla 4-15.
Discusión de resultados 62
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-15. Espectro de masas y estructura de 5-isopropenil-2-metil-fenol
Masas
OH
(CB6)
La comparación del espectro de masas con el reportado en la biblioteca espectral NIST
2002 indicó que (CB7) es el timil acetato. Además, el compuesto (CB7) se identificó
mediante la comparación del tiempo de retención en CG con una muestra auténtica. Los
datos de RMN se reportan a continuación: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ 1.22 (d, 6H, J =
7.0), 2.38 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 3.05 (sept, 1H, J = 7.0), 6.89 (d, 1H, J = 2.0), 7.11 (dd, 1H, J =
8.0, 2.0), 7.29 (d, 1H, J = 8.0). Cabe destacar que los datos sólo tentativamente sugieren la
identidad de estos metabolitos Tabla4-16.
Tabla 4-16. Espectro de masas, 1H RMN y estructura de carvacril acetato
Masas
1H RMN
O
O
(CB7)
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 63
_________________________________________________________________________
En la incubación de timol con B. theobromae, se detectaron por análisis de CG-EM seis
metabolitos mayoritarios Figura 4-6. Los compuestos (TB2) y (TB4) se identificaron
mediante la comparación de los tiempos de retención de CG con los de muestras
auténticas. Las estructuras de (TB1), (TB3), (TB5), y (TB6) se obtuvieron a partir de sus
espectros de masas.
El metabolito (TB1) se detectó previamente utilizando C. acutatum como biocatalizador y
se identificó como 2-(1-hidroxipropano-2-il)-5-metilfenol. Por otro lado, la fórmula
molecular de los compuestos (TB3) y (TB5) ha demostrado ser C10H16O2 en base a su
espectro de masas (M+ = 168 uma). Estos productos metabólicos dan iones fragmento a
m/z 153, 150, y 135 que indican en ese orden, la pérdida de radical metilo, agua, y
ambos.
Figura 4-6. Perfil cromatográfico de (CG) para la biotransformación de timol con B. theobromae después: 2
(i), 7 (ii), y 14 días (iii).
(i)
(ii)
(iii)
TB2
TB1
TB6 TB4
TB3 TB5
(T)
Discusión de resultados 64
_______________________________________________________________________ __
Además, un pico prominente en m/z = 126 (pico base), correspondiente a un fragmento
de fisión del anillo. Aunque estos datos no permiten una identificación definitiva,
sugieren una hidroxi-ciclohexenona sustituida como el esqueleto estructural de los
metabolitos (TB3) y (TB5) Tabla 4-17.
Tabla 4-17. Espectros de masas y estructuras de 4-Hidroxi-3-isopropil-6-metil-ciclohex-2-enona y 4-Hidroxi-
6-isopropil-3-metil-ciclohex-2-enona
TB3
O
OH
(TB3)
TB5
O
OH
(TB5)
Además, el metabolito (TB6) presentó una fórmula molecular C10H14O3 consistente con el
ion molecular, M+ = 182 uma. El espectro de masas mostró iones fragmento a m/z 140,
139, 111 (pico base), y 96 entre otros, que corresponden a la pérdida de la molécula
neutra de ceteno (M+-CH2=C=O), ceteno y radical hidrógeno, ceteno + etileno + radical
hidrógeno, y M+-C5H10O, respectivamente. A partir de los datos espectrales, (TB6) se
elucidó tentativamente como 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1,4-diol Tabla 4-18.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 65
_________________________________________________________________________
Tabla 4-18. Espectro de masas de 2-hidroximetil-5-isopropil-benceno-1 ,4-diol.
OH
OH
OH
4.3.3 Experimento curso en el tiempo
Luego de precultivado, el hongo C. acutatum se transfirió a 14 matraces Erlenmeyer de
500 mL que contenían 125 mL de medio líquido Czapeck-Dox y el sustrato (timol o
carvacrol), y se agitaron bajo las mismas condiciones que para el precultivo durante 14
días. El medio de cultivo de cada matraz se retiró cada día, se saturó con NaCl, se extrajo
con AcOEt y CH2Cl2, y el disolvente se evaporó posteriormente. Los extractos se
analizaron por CCF y CG. Las relaciones entre el sustrato y los productos metabólicos se
determinaron sobre la base de las áreas de los picos de CG. También se realizó un control
carente del sustrato y bajo las mismas condiciones de agitación.
El estudio en el curso del tiempo de los cambios en la concentración relativa de timol y
carvacrol y los metabolitos se registró cualitativamente por CCF y se midió
cuantitativamente por CG Figura 4-7 a-d. El sustrato de partida, carvacrol, se consumió
lentamente por ambos hongos. El hongo B. theobromae sólo transformó alrededor del
50% de carvacrol después de 14 días, siendo principalmente convertido en (CB1) y (CB4).
Sin embargo, la abundancia relativa de ambos metabolitos fue siempre inferior al 20%.
Como se muestra en la Figura 4-7 a, los otros metabolitos alcanzaron niveles muy bajos.
Por otra parte, C. acutatum metabolizó carvacrol de una manera muy baja, aunque lo
hizo más rápido que B. theobromae; curiosamente, algunos metabolitos producidos a
partir de carvacrol usando C. acutatum como biocatalizador, no se detectaron en el
Discusión de resultados 66
_______________________________________________________________________ __
cultivo de B. theobromae con el mismo sustrato.
De acuerdo con la Figura 4-7b, el carvacrol se transformó mayoritariamente por C.
acutatum en (CC4) (~ 12%), y aproximadamente el 60% del sustrato se consumió durante
los 14 días del estudio. Estos resultados sugieren que bajo las condiciones utilizadas,
carvacrol pudo ser lentamente destoxificado por los hongos fitopatógenos, C. acutatum y
B. theobromae. Este factor es importante si se desea emplear este monoterpeno
aromático fenólico para el control de enfermedades ocasionadas por ambos hongos.
En general, el carvacrol fue metabolizado a una velocidad superior que el timol. Como se
puede ver en la Figura 4-7c, el timol se transformó sólo en aproximadamente un 50%
después de 14 días de evaluación, utilizando C. acutatum como biocatalizador. El
producto metabólico mayoritario correspondió al (TB1), el cual alcanzó una abundancia
relativa de alrededor del 20% después de 11 días. Además, los metabolitos (TB2), (TB3),
(TB4), (TB5), y (TB6) presentaron abundancias relativas inferiores al 10% durante el
tiempo de análisis.
Parece digno de mención que el timol fue consumido por B. theobromae en un grado
muy inferior al encontrado en la biotransformación con C. acutatum. De hecho, el análisis
de los extractos obtenidos a partir de cultivos del hongo C. acutatum incubados con timol
mostró que éste fue metabolizado débilmente (<90%) Figura 4-7. Además, algunos
metabolitos detectados previamente en la incubación de timol con B. theobromae
estuvieron ausentes en la biotransformación con C. acutatum.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 67
_________________________________________________________________________
Figura 4-7. Evolución en el tiempo de la transformación microbiana de: carvacrol por B. theobromae (a) y C.
acutatum (b); y timol por B. theobromae (c) y C. acutatum (d).
4.3.4 Posible ruta metabólica
La diferencia marcada entre el metabolismo de carvacrol y timol por C. acutatum puede
resultar de la mayor toxicidad (actividad antifúngica) de timol contra este hongo
patógeno. De la misma manera, las pequeñas diferencias entre el metabolismo de ambos
compuestos por B. theobromae son consistentes con las similitudes observadas en la
actividad antifúngica contra este microorganismo. Basados en las estructuras de los
metabolitos identificados, se propuso una posible ruta metabólica para la
biotransformación de carvacrol y timol con C. acutatum y B. theobromae Figura 4-8
Discusión de resultados 68
_______________________________________________________________________ __
OH
O
HO
HO
OH O
O
OH
HO
O
O
OH
HO
OH OH
OH
OH
OH
OHO
OH
HO
B. theobromae
C. acutatum
B. theobromae
C. acutatum
C. acutatum
B. theobromae
B. theobromae
B. theobromae
B. theobromae
B. theobromae
C. acutatum
C. acutatum
C. acutatum
B. theobromae
B. theobromae
C. acutatum
B. theobromae
C. acutatum
O
O
B. theobromae
B. theobromae
(CC4)
(CC1)=(TC2)=(CB2)=(TB2)
(CC2)=(CB4)
(CC3) (CC5)=(CB5)
(CC6)=(CB7)
OH
OH
(TC1)=(TB1)
C. acutatum
(TC3)
(CB1)
(CB3)
(CB6)
(TB4)(TB6)
O
HO
O
HO
(TB5)
(TB3)
B. theobromae
B. theobromae
(C)
(T)
Figura 4-8 Posible ruta metabólica de carvacrol (denotado como C) y timol (T) con C. acutatum y B.
theobromae
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 69
_________________________________________________________________________
En general, se hace evidente que la hidroxilación del anillo aromático y las cadenas
alifáticas, así como la metilación y acetilación del grupo hidroxilo, representan la principal
ruta metabólica de carvacrol y timol para ambos hongos fitopatógenos. Estas
transformaciones pueden ser el resultado de un proceso de desintoxicación de ambos
compuestos fenólicos por C. acutatum y B. theobromae. Estudios recientes han
demostrado la necesidad del grupo hidroxilo del carvacrol para la actividad
antimicrobiana [ (110), (106)]. La eliminación del grupo hidroxilo mediante la sustitución
con el éter de metilo o un grupo éster metílico afecta a la hidrofobicidad de la molécula y
el tamaño del sustituyente de anillo, lo cual puede tener una influencia importante en
interacciones específicas con las células microbianas (111), encontraron que el éter
metílico del carvacrol, que contiene un grupo éter en lugar del grupo hidroxilo libre, no
inhibió el crecimiento de B. cereus a las concentraciones evaluadas (0 a 10 mM), mientras
que no se observó crecimiento microbiano cuando se empleó carvacrol a
concentraciones de 0,75 mM y superiores. Además, (TC3), (TB4), y (CC6) = (CB7), no
tienen la capacidad de liberar un protón y comportarse como intercambiadores de
protón, uno de los modos de acción antimicrobiano asociados al carvacrol.
La eliminación de los sustituyentes del anillo de carvacrol (usando 3-isopropilfenol y o-
cresol) conduce a una reducción en la actividad antimicrobiana (106). Por lo tanto, la
hidroxilación en las cadenas alifáticas de carvacrol y timol puede ser un mecanismo
utilizado por C. acutatum y B. theobromae, para reducir la actividad antifúngica. Estas
transformaciones microbianas pueden afectar las características estructurales de estas
moléculas anfipáticas asociadas con el mecanismo de acción antimicrobiano, y afectar la
interacción inicial con la membrana. En consecuencia, se sugiere que estas reacciones de
hidroxilación emergen como posibles objetivos metabólicos (“metabolic targets”) para el
control de C. acutatum y B. theobromae, mediante la aplicación combinada de timol o
carvacrol e inhibidores enzimáticos. Otra característica estructural importante asociada
con la actividad antimicrobiana de carvacrol y timol es la presencia de un sistema de
electrones deslocalizados. Se ha descrito previamente que el grupo hidroxilo unido a un
Discusión de resultados 70
_______________________________________________________________________ __
anillo de benceno (sistema fenólico) es importante para la actividad de algunos
compuestos antimicrobianos [ (110), (106), (111)]. Esta característica permite a los
compuestos desestabilizar la membrana citoplásmática y actuar como intercambiadores
de protones, lo que reduce el gradiente de pH a través de la membrana. Por lo tanto, se
sugiere que la formación de (CC5) = (CB5), (TB5), y (TB3), refleja la necesidad de C.
acutatum y B. theobromae de reducir la toxicidad de carvacrol y timol eliminando el
sistema de electrones deslocalizados del anillo.
4.3.5. Preparación de compuestos estructuralmente relacionados con el
timol y carvacrol y evaluación de la actividad antifúngica.
En aras de confirmar si efectivamente las transformaciones realizadas por los hongos
sobre el timol y carvacrol corresponden a un proceso de desintoxicación, se prepararon
algunos de los productos de biotransformación y se evaluó su actividad antifúngica
contra C. acutatum. Adicionalmente, se incluyeron algunos derivados bromados y
nitrados, para determinar si modificaciones estructurales llevadas a cabo sobre el timol y
carvacrol afectan la actividad antifúngica. Entre los productos sintéticos se incluyeron el
timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter y la timoquinona comercial. Los
procedimientos de preparación de los derivados se describen a continuación Figura 4-9,
junto con los datos espectroscópicos correspondientes.
Figura 4-9. Reacciones de metilación y acetilación de timol y carvacrol.
O
O
O
O
O
O
OH
OH
(C)
(T)
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 71
_________________________________________________________________________
Acetilación de timol. Se llevó a cabo por reacción de timol con cloruro de acetilo bajo
condiciones anhidras. El espectro de 1H RMN muestra una señal doblete a δ 1.30 ppm,
acoplada con la señal múltiple (septuplete) a δ 2.90 ppm, y que corresponde al
sustituyente isopropilo. Además, se aprecian dos señales singlete en δ 2.22 y 2.37 ppm,
correspondientes al grupo metilo enlazado al anillo aromático y al metilo presente en el
grupo acetilo. Además se observan a campo bajo tres señales que integran para 3
hidrógenos y pertenecen a los protones aromáticos. La presencia del grupo acetilo se
confirmó del espectro de 13C RMN y la señal en δ 169.73 ppm. En el espectro además
aparecen 4 señales a campo alto que corresponden a 4 carbonos metílicos, seguido de 3
carbonos metínicos aromáticos (a δ 120.25, 124.64, y 131.36 ppm) y cuatro carbonos
cuaternarios (a δ 127.64, 148.53, 149.79, y 169.73 ppm). Con base en la información
espectroscópica se confirmó la estructura del timil acetato Tabla 4-19.
Tabla 4-19. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de timil acetato.
O
O
Discusión de resultados 72
_______________________________________________________________________ __
Acetilación de carvacrol. Se llevó a cabo por reacción de carvacrol con cloruro de acetilo
bajo condiciones anhidras. En el espectro de 1H RMN se aprecian las señales producidas
por el grupo isopropilo (doblete a δ 1.26 ppm acoplado con septuplete a δ 3.03 ppm) y
los dos grupos metilo (singletes a δ 2.38 y 2.39 ppm), uno como sustituyente del anillo y
el otro en el grupo acetilo. En la región aromática, se aprecian señales para 3 hidrógenos.
Además, la presencia de la unidad de acetilo se confirmó del espectro de 13C RMN, y la
señal en δ 170.21 ppm. Con base en esta evidencia, se confirmó la estructura del carvacril
acetato para este compuesto Tabla 4-20.
Tabla 4-20. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de carvacril acetato.
O
O
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 73
_________________________________________________________________________
Metilación de timol. Se preparó por reacción de timol con yoduro de metilo. El espectro
de 1H RMN mostró una señal doblete a δ 1.47 ppm y que integra para seis hidrógenos,
acoplada con el septuplete en δ 3.05 ppm. Lo anterior confirma la presencia del grupo
isopropilo. Además se presenta dos singletes que integran cada uno para tres hidrógenos
en δ 2.42 ppm y 4.03 ppm. Esta última señal, confirma la metilación del hidroxilo fenólico
del timol.También aparecen las señales en la región aromática integrando para tres
hidrógenos. La metilación también se evidenció por la presencia de la señal en δ 55.54
ppm, y que corresponde al carbono metílico oxigenado. La estructura se confirmó como
el timil metil éter Tabla 4-21.
Tabla 4-21. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de timil metil éter.
O
Discusión de resultados 74
_______________________________________________________________________ __
Metilación de carvacrol. Al igual que para el timil metil éter, se presentó una señal en el
espectro de 1H RMN en δ 3.75 ppm y en 13C RMN en δ 56.11 ppm atribuidas a la
presencia del grupo metilo del sustituyente metoxi, sobre el anillo aromático. La
estructura se confirmó como el carvacril metil éter Tabla 4-22.
Tabla 4-22. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de carvacril metil éter.
O
Timoquinona. En el espectro de 1H RMN se observó una señal doblete en δ 1.04 ppm y
una señal septuplete en δ 2.93 ppm, mutuamente acopladas y que corresponden al
sustituyente isopropilo. Además, se observa un singlete en δ 1.96 ppm, del grupo metilo
enlazado al sistema cíclico. A campo bajo se observan dos señales singlete (δ 6.44 y 6.52
ppm) y que corresponden a los protones olefínico de la timoquinona Tabla 4-23.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 75
_________________________________________________________________________
Tabla 4-23. Espectro de 1H RMN de timoquinona.
O
O
Asimismo se presentan los procedimientos empleados para la obtención de algunos
derivados bromados y nitrados del timol y carvacrol.
Derivados bromados.
Bromación de timol. Se obtuvo por reacción de timol con N-bromosuccinimida en
presencia de peróxido de hidrógeno. El espectro de 1H RMN Tabla 4-24 mostró una señal
doblete a δ 1.21 ppm acoplada con una señal septuplete a δ 3.25 ppm, correspondiente
al sustituyente isopropilo del anillo aromático. Adicionalmente se observó un singlete a δ
2.52 ppm que integra para 3 hidrógenos y corresponde al grupo metilo sobre el anillo
aromático. Las señales a campo bajo muestran un singlete a δ 7.32 ppm que integra para
un hidrógeno. Está única señal sugiere que el anillo aromático se encuentra
pentasustituido. Dado el carácter activante del grupo hidroxilo y las cadenas alquílicas, y
su efecto orientador a orto- y para- se propuso para este compuesto una dibromación en
posiciones 2 y 4 con respecto al grupo OH. Así, el compuesto se identificó como el 2,4-
dibromo-6-isopropil-3-metil fenol.
Discusión de resultados 76
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-24. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de 2,4-dibromo-6-isopropil-3-metil fenol.
1H RMN
OH
Br Br
OH
(T)
Bromación de carvacrol. Se obtuvo por reacción de carvacrol con N-bromosuccinimida en
presencia de peróxido de hidrógeno. El espectro de RMN muestra la señal doblete a δ
1.40 ppm acoplada con el septuplete a δ 3.75 que confirma el radical isopropilo. Además
se observa el singlete en δ 2.23 pm del sustituyente metílico. En la región aromática, se
observa una señal multiplete (solapada con el solvente) y que integra para un hidrógeno.
Lo anterior confirma la dibromación del anillo aromático. Con base en los datos
espectroscópicos, el compuesto se identificó como 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol
Tabla 4-25.
Tabla 4-25. Espectro de 1H RMN de 2,4-dibromo-3-isopropil-6-metil fenol
1H RMN
BrBr
OH
OH
(C)
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 77
_________________________________________________________________________
Derivados nitrados.
Nitración de timol y carvacrol. Se llevó a cabo por reacción entre el timol o carvacrol y la
mezcla nitrante (ácido sulfúrico/ácido nítrico en relación 10:1). Los datos de RMN para el
compuesto nitrado del timol indican la presencia del grupo isopropilo sustituyente: señal
doblete en δ 1.17 ppm acoplata a septuplete en δ 3.11 ppm.
Además se observa un singlete que integra para tres hidrógenos a δ 2.49 ppm que
confirma el radical metilo. A campos bajos se aprecian dos señales singlete, que
establecen un sistema tetrasustituido para el anillo aromático. Debido a la ausencia de
acoplamiento entre las señales de los protones aromáticos, se intuye una disposición 1,4-
entre ellos.
El espectro de 13C RMN presentó 9 señales, tres de las cuales corresponden a carbonos
metílicos (a δ 21.56, 22.62, y 27.25 ppm), dos carbonos metínicos aromáticos en δ 119.14
y 125.05 ppm, y cuatro carbonos cuaternarios en δ 134.06, 134.96, 140.22 (C-NO2,
pequeña), y 157.93 ppm (carbono aromático oxigenado). Por lo anterior, el compuesto
nitrado se elucidó como 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol Tabla 4-26.
Los datos de RMN para el compuesto nitrado de carvacrol: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ
1,2 (d, 6H, J = 7,0) correspondiente al isopropilo, 2,5 (s, 3H) del grupo metilo, 3,15 (sept,
1H, J = 7,0) del isopropilo, 6,65 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), lo que muestra que la nitración se
presentó en posición para con respecto al hidroxilo Por lo anterior, el compuesto nitrado
se elucidó como 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol Tabla 4-27.
Discusión de resultados 78
_______________________________________________________________________ __
Tabla 4-26. Espectro de 1H RMN y
13C RMN de 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol.
1H RMN
OH
O2N
OH
(T)
Tabla 4-27. Espectro de 1H RMN de 5-isopropil-2-metil-4-nitrofenol.
1H RMN
OH
(C)
O2N
OH
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 79
_________________________________________________________________________
Los resultados de los ensayos de actividad antifúngica de los productos de
biotransformación, evaluados a una concentración de 100 µg/mL, muestran una
disminución de la inhibición del crecimiento radial de C. acutatum Figura 4-10 (a y b).
En la Figura 4-10 a se puede observar que el crecimiento micelial de C. acutatum en
presencia de timol y carvacrol y luego de 144 h fue inferior a 15 y 25 mm
respectivamente. Mientras que para la timoquinona, timil- y carvacril-acetato, timil metil
éter y carvacril metil éter el diámetro micelial fue mayor que 35 mm, al cabo de 144 h.
En la Figura 4-10 b se aprecia que los derivados acetilados y metilados de timol y carvacrol
alcanzaron su mayor inhibición de C. acutatum a las 48 h, oscilando entre el 60 y el 70%
para los productos acetilados y entre 40 y 65% para los metilados.
La timoquinona por su parte, mostró una inhibición inferior al 45% durante todo el
tiempo de análisis. Estos hallazgos confirman nuestra hipótesis, de que los productos
metabólicos identificados en la biotransformación corresponden a productos de
desintoxicación del timol y carvacrol, en los cuales se elimina el grupo hidroxílico fenólico
libre. Como se mencionó anteriormente, el grupo hidroxilo fenólico ha sido
responsabilizado de parte del modo de acción antimicrobiano del timol y carvacrol.
En general, los resultados también muestran que los derivados acetilados y metilados del
timol exhibieron un mayor efecto inhibitorio de C. acutatum que los de carvacrol.
Además, la actividad antifúngica de los derivados decreció rápidamente con el tiempo,
llegando a ser inferior al 20 % de inhibición luego de 144 h.
Discusión de resultados 80
_______________________________________________________________________ __
Figura 4-10 a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de
derivados del carvacrol y timol (productos metabólicos) b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial
de C. acutatum de derivados de timol y carvacrol (productos metabólicos).
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Cre
cim
ien
to m
icel
iar
rad
ial (
mm
) .
Tiempo (h)
Control
Controlethanolti acet 100 μg/mL ti met100 μg/mL cv acet 100 μg/mL cv met 100μg/mL timoq 100 μg/mL carvacrol
timol
Productos de Biotransformación - C.acutaum
0
10
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24 48 72 96 120 144
ti acet ti met cv acet cv met
timoq carvacrol timol
Tiempo ( h )
%
d
e
i
n
h
i
b
i
c
i
ó
n
Productos de Biotransformacion
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 81
_________________________________________________________________________
Los resultados de las propiedades fungiestáticas de los derivados bromados y nitrados de
timol y carvacrol, evaluados a una concentración de 100 µg/mL, muestran un incremento
substancial de la inhibición del crecimiento radial de C. acutatum Figura 4-11 a y b.
A esta concentración, los derivados nitrados inhibieron completamente el crecimiento
micelial de C. acutatum durante las primeras 72 h, mientras que los bromados lo hicieron
durante 48 h. Luego de 144 h, los diámetros de crecimiento micelial del hongo en
presencia de los derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol fueron inferiores a
los 15 mm. La Figura 4-11 b, reveló que ambos derivados nitrados alcanzaron inhibiciones
superiores al 80% entre 72 y 144 h. Por su parte, los derivados bromados presentaron
inhibiciones que oscilaron entre el 60 y el 80%, siendo superiores entre 48 y 96 h.
En general, los nitro compuestos presentaron la mayor actividad antifúngica contra C.
acutatum, seguido por los derivados bromados,el timol y el carvacrol. No se observaron
diferencias apreciables en la actividad fungiestática de los derivados del timol y los del
carvacrol. Es de resaltar que la actividad de los derivados nitrados y bromados cambio
muy poco con el pasar de los días, lo que sugiere un proceso de detoxificación lento por
parte del hongo. Estos hechos confirman nuestra hipótesis de que es posible emplear los
metabolitos defensivos de las plantas como plantillas estructurales, para el diseño de
sustancias más activas para el control de microorganismos patogénicos. Tanto el timol
como el carvacrol pueden ser consideradas sustancias promisorias para el desarrollo de
nuevas sustancias antifúngicas biorracionales.
Discusión de resultados 82
_______________________________________________________________________ __
Figura 4-11. a) Evaluación del crecimiento radial del hongo fitopatógeno C. acutatum en presencia de
derivados bromados y nitrados del carvacrol y timol b) Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de C.
acutatum de derivados bromados y nitrados de timol y carvacrol.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Cre
cim
ien
to m
icel
iar
rad
ial (
mm
) .
Tiempo (h)
Control
Controlethanol
ti Br 100 μg/mL
ti NO2 100 μg/mL
cv Br 100 μg/mL
cv NO2 100μg/mL
carvacrol
timol
derivados 2 - C.acutaum
0102030405060708090
24 48 72 96 120 144
ti Br ti NO2 cv Br
cv NO2 carvacrol timol
Tiempo ( h )
%
d
e
i
n
h
i
b
i
c
i
ó
n
Derivados Nitrados y Bromados
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 83 ____________________________________________________________________
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
La actividad antifúngica de timol fue mayor que la observada para el carvacrol contra
C. acutatum, como consecuencia la transformación de timol fue un proceso mucho más
lento que el de carvacrol. Además, para B. theobromae las pequeñas diferencias entre los
metabolitos de ambos compuestos son consistentes con las similitudes observadas en la
actividad antifúngica contra este hongo.
La alta actividad antifúngica junto con el bajo nivel de transformación microbiana, hace
que los candidatos prometedores de timol y carvacrol para controlar C. acutatum
y B. theobromae debido a que se metaboliza principalmente a través de la hidroxilacion
aromatica y alifática o la metilación y acetilación del grupo hidroxilo del anillo aromático
Se determinó que los hongos C. acutatum y B. theobromae metabolizaron a timol y
carvacrol en baja proporción varios compuestos, incluyendo timoquinona,
timohidroquinona, timil- y carvacril acetato, timil- y carvacril metil éter, entre otros. Se
midió la actividad de los metabolitos de biotransformación y encontró que estos
presentan un menor porcentaje de inhibición que sus precursores lo que sugiere un
mecanismo de desintoxicación por parte del hongo.
Se sintetizaron compuestos bromados y nitrados de timol y carvacrol, los compuestos
nitrados presentaron la mayor actividad antifúngica contra C. acutatum, seguido por los
derivados bromados de él timol y el carvacrol.
Conclusiones y recomendaciones 84
____________________________________________________________________ __
5.2. Recomendaciones
Realizar un estudio que permita optimizar el proceso de producción de los metabolitos
producidos por los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae, se debe someter
al proceso de biotransformación una cantidad mayor de los sustratos de partida, y de
medio de cultivo con la finalidad de aumentar las cantidades de metabolitos obtenidos y
facilitar los procesos de purificación e identificación.
Preparar otros derivados sintéticos, incluyendo el grupo amino y otros halógenos de
timol y carvacrol, y realizar ensayos de actividad antifúngica contra los hongos C.
acutatum y B. theobromae, que nos permitan comparar los resultados obtenidos con los
compuestos nitrados y bromados de estos compuestos.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 85 ____________________________________________________________________
6. BIBLIOGRAFÍA
1. Colletotrichum: Biology, Pathology and ControlInfection strategies of Colletotrichum
species. Bailey, J.A., R.J. O´Connell, y R.J. and Nash, C. Pring. 1992., CAB International,
pp. pp. 88-120.
2. In Host Specificity, Pathology and Host–Pathogen Interaction of Colletotrichum.
Cannon, P. F., Bridge, P. D. and Montes, E. 2000, Linking the past, present and future of
Colletotrichum systematics.
3. The biology of Colletotrichum acutatum. Wharton, J. and Diéguez, P S. 2004, Anales
del Jardín Botánico de Madrid, pp. 61(1): 3-22.
4. Diseases of Temperate Zone Tree Fruit and Nut Crops. Ogawa, J.M. and English, H.
1991, University of California, Division of Agriculture and Natural Resources, Oakland CA.
., pp. pp. 345- 461.
5. Characterization of Colletotrichum acutatum isolates causing anthracnose of almond
and peach in California. Adaskaveg, J.E. and Hartin, R.J. 1997, Phytopathology, pp. 87:
979-987.
6. Identification of subpopulations of Colletotrichum acutatum and epidemiology of
almond anthracnose in California. Förster, H. and Adaskaveg, J.E. 1999, Phytopathology,
pp. 89: 1056-1065.
7. Genetic diversity and host specificity of Colletotrichum species on various fruits.
Colletotrichum: Host Specificity, Pathology, and Host-Pathogen Interaction,. Freeman, S.
2000, plant diss, pp. pages 131-144.
8. Latent infection on peach caused by Colletotrichum gloeosporioides and by
Colletotrichum acutatum. Zaitlin, B., Zehr, E.I. and Dean, R.A. 2000, Canadian Journal of
Botany , pp. 22: 224-228.
9. Susceptibility of rabbiteye blueberry cultivars to postharvest diseases. Smith, B.J.,
Magee, J.B. and Gupton, C.L. 1996, Plant Disease , pp. 80: 215-218.
10. Evaluation of fungicides for control of anthracnose fruit rot of blueberries. Schilder,
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 86
____________________________________________________________________ __
A.M.C., Gillett, J.M. and Sysak, R.W. 2001, Fungicide and Infanticide Tests, pp. SMF5,
[http://www.scisoc. org/online/FNtests/2001/top.htm].
11. Infection of flower and vegetative tissues of citrus by Colletotrichum acutatum and C.
gloeosporioides. Zulfiqar, M., Brlansky, R.H. and Timmer, L.W. 1996., Mycologia , pp. 88:
121-128.
12. Biology and control of anthracnose diseases of citrus. Colletotrichum: Host Specificity,
Pathology, and Host-Pathogen Interaction. Timmer, L.W. and Brown, G.E. 2000, The
American Phytopathology, pp. pp. 300-316.
13. Mango anthracnose: Economic impact and current options from integrated
management. Arauz, L.F. 2000, Plant Disease , pp. 84: 600-611.
14. Colletotrichum acutatum as a cause of anthracnoseof mango in New-South-Wales.
Fitzell, R.D. 1979., Plant Disease Reporter , pp. 63: 1067-1070.
15. Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides caused anthracnose on olives.
Martín, M.P. and García, F. 1999., European Journal of Plant Pathology , pp. 105: 733-
745.
16. Anthracnose of strawberry caused by Colletotrichum complex in Florida. Howard,
C.M., et al., et al. 1992, Plant Disease, pp. 76: 796-981.
17. Strawberry anthracnose: Histopathology of Colletotrichum acutatum and C. fragariae.
Curry, K.J., et al., et al. 2002, Phytopathology , pp. 92: 1055-1063.
18. Identification of Colletotrichum specie responsable for antrhacnose of Andean
blackberry in crops grown in Colombia. Marulanda, M., Isaza, L. and Ramirez, L. 2007,
Scientia et Technica. Universidad Tecnológica de Pereira. ISSN 0122, p. No 37.
19. García, C.M. Aceites esenciales curan ‘cáncer’ de tomate de árbol. *En línea+ 23 de
abril de 2010. http://jccarvajalmo.blogspot.com/.
20. Evaluación de la fitotoxicidad y la actividad antifúngica contra colletotrichum
acutatum de los aceites esenciales de tomillo (thymus vulgaris), limoncillo (cymbopogon
citratus), y sus componentes mayor. Alzate, D, et al., et al. 2009, Vitae,, p. issn 0121 4004
volumen 16 número 1.
21. Characterization of Colletotrichum species responsible for anthracnose diseases of
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 87 ____________________________________________________________________
various fruits. Freeman, S., Katan, T. and Shabi, E. 1998, Plant Dis., pp. 82 (6): 596-605.
22. The biology and control of Colletotrichum species on tropical fruit crops. Jeffries, P., et
al., et al. 1990, Plant Pathol , pp. 39 (3): 343-366.
23. Identificación, caracterización, y aislamiento in vitro de hongos fitopatógenos del
camu - camu Myrciaria dubia (H.B.K.). Verde, W.G. s.l. : Mc. Vaugh en Pucallpa, , 2005.
24. Valverde, I., Velasco, R. and García, C. Biotransformación de los Compuestos 2-
Feniletanol y Acetofenona Mediante el Hongo Fitopatógeno Botryodiplodia theobromae.
s.l. : Universidad Nacional de Colombia., 2006.
25. Capera B.D, Leguizamo C.J y Lopez J.D. Diversificación; El secamiento de los cítricos en
la zona cafetera central. . Manizales : Cenicafe, 1995.
26. Biotransformación de compuestos aromáticos sustituidos mediante hongos
filamentosos fitopatógenos de los géneros Botryodiplodia y Colletotrichum. Velasco, R., et
al., et al. 2009, Rev Soc Quím Perú., Vol. 75 (1) .
27. Cassava: Research, production and utilization Leaf and item rust spot, (Colombia).
Cock, J.H. and Reyes, J.A. 1985, UNDP-CIAT, pp. primera edición 546-560.
28. Aislamiento y determinación estructural de los metabolitos secundarios y de
biotransformación del hongo fitopatógeno Colletotrichum gloeosporiodes (Penz) Penz y
Sacc. . García, C.M. 2002, Tesis Doctoral en Ciencias Químicas, , p. 200.
29. Antracnosis causada por Colletotrichum acutatum en frutos de fresa en Mérida,
Venezuela. Cedeño, Luis and Carrero, Chrystian. 1997, Interciencia, pp. 22(6), 315-319.
30. Anthracnose of three-leaf akebia (Akebia trifoliata Koidzumi) caused by
Colletotrichum acutatum. Kobayashi, Yi, Tsukamoto, T and Miyai, N. 2004, J Gen Plant
Pathol, pp. 70, 295-296.
31. : Caracterización del agente causante de la antracnosis en tomate de árbol, manzano
y mora. Saldarriaga, J., Z.R, Castaño and Arango, I.R. 2008, . Rev. Acad. Colomb. Cienc.
ISSN 0370-3908., pp. 32(123): 145-156.
32. DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum gloeosporioides ) (Penz)
Penz & Sacc. EN TOMATE DE ÁRBOL MEDIANTE EL EMPLEO DE INFECCIONES
QUIESCENTES. . Alarcón, J.J. and Chavarriaga, W. 2007, agron. , pp. 15(1): 89 - 102,.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 88
____________________________________________________________________ __
33. Subcutaneous phaeohyphomycosis caused by Lasiodiplodia theobromae and
successfully treated surgically. Summerbell, R.C, et al., et al. 2004, Med Mycol, pp.
42:543–547.
34. L. Lasiodiplodia species associated with dieback disease of mango (Mangifera indica)
in Egypt. Inc. Ismail, et al., et al. 2012, Australasian Plant Pathology Society.
35. Improving the biological control of Botryodiplodia disease on som Annona cultivars
using single or multi-bioagents in Egypt. Wafaa, M, Haggag, M.A and Nofal. 2006 ,
Department of Plant Pathology, Division of Agricultural and Biological Research, National
Research Center, pp. 341–349.
36. Mascarenhas, P., et al., et al. 1996, Mycological Research, pp. 100, 27.
37. An integrated strategy to control post-harvest decay of Embul banana by combining
essential oils with modified atmosphere packaging. Ranasinghe, Jayawardena and
Abeywickrama. 2004, International Journal of Food Science & Technology, pp. Volume
40, Issue 1, pages 97–103, January 2005.
38. Host Specificity of Colletotrichum gloeosporioides and Botryodiplodia theobromae
Isolates from Mango, Papaya and Rambutan and their Response to Trichoderma
harzianum. Wijeratnam, S. W, Dharmathilaka, Y and Weerasinghe, D. 2008, Conference
on International Research on Food Security, Natural Resource Management and Rural
Development.
39. Biochemical changes in citrus fruits infected with Botryodiplodia theobromae. Abo-El-
Dahab, MK, et al., et al. 1992, J Agric Sci Mansoura Univ, pp. 17:3525–3532.
40. Dieback of grapevine by Botryodiplodia theobromae Pat. in Egypt. El-Goorani, M.A
and El Meleigi, M.A. 1972, Phytopathol Mediter, pp. 11:210–211.
41. Ear and grain rot of maize caused by Botryodiplodia theobromae pathogens in Egypt. .
Diab, M.M, et al., et al. 1984, Minufiya J Agric Res, pp. 9:129–138.
42. Biol Control . Haggag, W.M and Nofal, M.A. 2006, Improving the biological control of
Botryodiplodia disease on some Annona cultivars using single or multi-bioagents in
Egypt., pp. 38:341–349.
43. Enfermedades del Aguacate. Tamayo, P.J. 2007, POLITÉCNICA No. 4. Medellín, pp. pp.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 89 ____________________________________________________________________
51-70 .
44. Emerging non-conventional technologies for control of post harvest diseases of
Perishables . Tripath, i P. and Shukla, A.K. 2007, Fresh Produce, pp. 1:111-120.
45. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest
fungal rotting of fruit and vegetables. Tripathi, P. and Dubey, N.K. 2004, Postharvest
Biology and Technology, pp. 32:235-245.
46. Control químico de hongos causantes de pudriciones en almacenajes de palta.
Morales, A. and Berger, H. 1981, Simiente, pp. Vol 21 Nº 1,2 .
47. Activity of benomyl for control of postbloom fruit drops of citrus caused by
Colletotrichum acutatum. Peres, N.A.R., et al., et al. 2002, Plant Dis, pp. 86, 620–624.
48. Benomyl resistance of Colletotrichum acutatum is caused by enhanced expression of
beta-tubulin 1 gene regulated by putative leucine zipper protein CaBEN1. Nakaune, R.
and Nakano, M. 2007, Fungal Genet Biol Dec, pp. 44(12):1324-35.
49. Resistencia a benomil a tiabendazol en aislamiento de Colletotrichum gloesporiodes
(penz) penz y Sacc. Obtenidos de mango ( magifera Indica) en cinco regiones de Mexico.
Gutierrez, J., et al., et al. 2003, Revista mexicana de fitopatología ., p. vol 21.pag 260.
50. Detoxification of the cruciferous phytoalexin brassinin in Sclerotinia sclerotiorum
requires an inducible glucosyltransferase. Pedras, M.Soledade., Pearson W.K. and
Mohammad, C. 2004, Phytochemistry 65, pp. 2685–2694.
51. Agrochemicals Preparation and Mode of Action. Cremlin, R. J. 1991 , Hatfield
Polytechnic, Hertfordshire, p. pp. 1.
52. Caracterizacion del proceso de infeccion de Colletotrichum acutatum Simmonds en
plantas de fresa (Fragaria ananassa Duch.): Estructura y ultraestructura. Arroyo, F. T.
2004, Thesis, University of Seville, Ph.D.
53. Antifungal Activity of Some Essential Oils. Soundharrajan, r. s., et al., et al. 2003, J.
Agric. Food Chem, pp. 51, 7596-7599.
54. Effect of different fungicides in the control of Colletotrichum acutatum, causal agent
of anthracnose crown rot in strawberry plants. De los Santos, B. and Romero, F. 2002,
Crop Prot., pp. 21, 11- 15.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 90
____________________________________________________________________ __
55. The biological characteristics of dicarboximide-resistant isolates of Monilinia fructicola
from New Zealand stone fruit orchards. Elmer, P. A. G. and Gaunt, R. E. 1994, Plant
Pathol., pp. 43, 130-137.
56. Relationship between C6-C12 alkanal and alkenal volatile contents and resistance of
maize genotypes to Aspergillus flaVus and aflatoxin production. Zeringue, H. J., et al., et
al. 1996, J. Agric. Food Chem, pp. 44, 403.
57. Comparison of Synthetic and Organic Fungicides for the Control of Spot Anthracnose,
Powdery Mildew, and Cercospora Leaf Spot on Flowering Dogwood in Alabama. Guthrie,
R. 2007, Alabama Agricultural Experiment Station Auburn University, p. 668.
58. Antifungal properties of essential oil and crude extracts of Hypericum linarioides Bosse
. Ahmet, C, et al., et al. 2005, Biochem Syst Ecol., pp. 33 (3): 245-256.
59. Essential oils for the disinfection of grey water. Winward, G.P, et al., et al. 2008,
Water Res, pp. 42 (8-9): 2260-2268.
60. Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and
Thymus hyemalis essential oils. Rota MC, Herrera A, Martínez RM, Sotomayor JA, Jordán
MJ. 2008, Food Control, pp. 19 (7): 681-687.
61. Antifungal activity of Tagetes patula essential oil. Vidya sagar, D., Naik, S. N. and
Vasudevan, P. 2002, J. Ind. Perfumer, pp. 46 (3), 269-272.
62. Biotransformación de limoneno, α-pineno y aceites esenciales de naranja y mandarina
empleando aspergillus niger. Castellanos, M.F.E. 2007, Tesis. Universidad Industrial De
Santander Facultad De Ciencias Escuela De Química Bucaramanga.
63. Development of a perillyl alcohol topical cream formulation. . Gupta, A. and Myrdal,
P.B. 2004, J. Pharm. , pp. 269, 373-383.
64. , . Perillyl alcohol and genistein differentially regulate PKB/Akt and 4E-BP1
phosporylation as well as eIF4E/eIF4G interactions in human tumor cells. Peffley, D.M., et
al., et al. 2007, Arch. Biochem. Biophys.
65. The antibacterial mechanism of carvacrol and thymol against Escherichia coli. Xu, J.,
et al., et al. 2008, Letters in Applied Microbiology, pp. 47(3), 174-179.
66. Perillyl alcohol inhibits human breast cancer cell growth in vitro and in vivo. . Yuri, T.,
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 91 ____________________________________________________________________
et al., et al. 2004, Breast Cancer Res. Treat., pp. 84, 251-260.
67. Inhibitory effects of eugenol and thymol on Penicillium citrium strains in culture media
and cheese. Vazquez, B.I., et al., et al. 2001, J. Food Microbiol, pp. 67, 157–163.
68. Estudio de species aromaticas con alto contenido de timol, carvacrol, trans-anetol o
estragol y empleo y empleo de fenoles y sus derivados en la síntesis 2,5-dihidro-1-
benzoxepinas y evaluación de actividad biológica. Muñoz, A. 2010, Tesis doctoral
Univesidad Industrial de Santander.
69. Interaction of four monoterpenes contained in essential oils with model membranes:
Implications for their antibacterial activity. Cristani, M., et al., et al. 2007, Journal of Agr.
70. Chemistry, antioxidant, antibacterial and antifungal activities of volatile oils and their
components. De Martino, L., et al., et al. 2009, Natural Product Communications, pp.
4(12), 1741-1750.
71. Changes in the proteome of Salmonella enterica serovar Thompson as stress
adaptation to sublethal concentrations of thymol . Di Pasqua, R., et al., et al. 2010,
Proteomics. Advance online publication.
72. Biotransformation of thymol, carvacrol, and eugenol by cultured cells of Eucalyptus
perriniana . Shimoda, K., et al., et al. 2006, Phytochemistry, pp. 67 2256–2261.
73. Biotransformations and Bioprocesses. Doble, M., Kruthiventi, A.K. and Gaikar, V.G.
2004, CRC Press, USA.
74. An Introduction to Biotransformations in Organic Chemistry . Hanson, J.R. 1998,
Oxford.
75. Biotechnology a sustainable alternative forchemical industry. Gavrilescu, M. C. 2005,
Biotechnology Advances,, pp. 23, 471–499.
76. Homogeneous biocatalysis in organic solvents and water–organic mixtures. Castro,
G.R. and Knubovets, T. 2003, Rev. Biotechnol, pp. 23, 195–231.
77. Lonza: 20 years of biotransformations. Shaw, N.M., Robins, K.T. and Kiener, A. 2003,
Adv. Synth. Catal., pp. 345, 425–435.
78. Biocatalysis for the production of cosmetic ingredients. Veit, T. 2004, Eng. Life Sci., pp.
4, 508–511.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 92
____________________________________________________________________ __
79. Enzymes from higher eukaryotes for industrial biocatalysis. . Liu, Z., Weis, R. and
Gleider, A. 2004, Food Technol. Biotechnol. , pp. 42, 237–249.
80. Biocatalysis application for preparing intermediates for drug synthesis. Luna, H. 2004,
Rev. Soc. Quim. Mex, pp. 48, 211–219.
81. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. . Straathof, A.J., et
al., et al. 2002, Trends Biotechnol., pp. 6, 238–242.
82. Rev Soc Quím Perú. Velasco, R., Montenegro, D., Velez, J., Garcia, C. Durango, D.
2009, Biotransformación de compuestos aromáticos sustituidos mediante hongos
filamentosos fitopatógenos de los géneros Botryodiplodia y Colletotrichum, p. 75 (1) .
83. Correa, Yaned. Biotransformación de los sustratos cinamaldehído y ácido (±)-2,4-
isobutilfenilpropanóico mediante el hongo fitopatógeno colletotrichum acutatum.
Medellin : s.n., 2009.
84. Stereoselective reduction of ketone by Daucus carota hairy root cultures. . Caron, D.,
Coughlan, A. and Simard, M. 2005, Biotechnology Letters, pp. 27, 713–716.
85. Fungal biotransformation of -coumaric acid into caffeic acid by Pycnoporus
cinnabarinus: an alternative for producing a strong natural antioxidant. Estrada, I,
Navarro, D and Record, E. 2003, J. Microbiology&Biotechnology.,, pp. 19, 157-160.
86. Short communication: By-passing of unwanted vanillyl alcohol formation using
selective adsorbents to improve vanillin production with Phanerochaete chysosporium.
Stentelaire, C., Lesage-MeessenL and Delattre, M. 1998, J. Microbiology &
Biotechnology.
87. . Biotransformation of p-coumaric acid by Paecilomyces variotii. Sachan A., Ghosh S.,
Kumar S., et a. 2006, Letters in Applied Microbiology, pp. 42, 35–41.
88. Antifungal activity and biotransformation of diisophorone by Botrytis cinerea. Daoubi,
M., et al., et al. 2005, Journal of Agriculture and Food Chemistry, pp. 53, 6.
89. Biotransformations of ent-18-acetoxy-6-ketomanoyl oxides epimers at C-13 with
filamentous fung. Ghoumari, H., et al., et al. 2006, Phytochemistry, pp. 67, 2294–2302.
90. Biotransformation of ent-13-epi-manoyl oxides difunctionalized at C-3 and C-12 by
filamentous fungi . Garcia, A., Fernandez, A., et al., et al. 2004, Phytochemistry, pp. 65,
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 93 ____________________________________________________________________
107–115.
91. Microbial transformation of isosteviol and inhibitory effects on epstein-barr virus
activation of the transformation products. Akihisa, T., et al., et al. 2004, Journal of
Natural Products, pp. 67, 407-410.
92. Biotransformation of a-bulnesene using a plant pathogenic fungus, Glomerella
cingulata as a biocatalyst. Miyazawa, M. and Sugawara, A. 2005, Natural Product
Research, pp. 19, 111–115.
93. The Antifungal activity of widdrol and its biotransformation by Colletotrichum
gloeosporioides (penz.) Penz. & Sacc. and Botrytis cinerea. Ortíz, Y., et al., et al. 2006,
Journal of Agriculture and Food Chemistry.
94. Biotransformación de los sustratos 2-feniletanol y acetofenona con el hongo
fitopatógeno colletotrichum acutatum. Aristizába, l diego a, et al., et al. 2008, Revista
colombiana de química, p. volumen 37.
95. In vitro inhibition of Botryosphaeria dothidea and Lasiodiplodia theobromae, and
chemical control of gummosis disease of Japanese apricot and peach trees in Zhejiang
Province, China. . ,. Hong-Ye, Li., Rou-Bin, Cao. and Yong-Tan, Mu. 1995, Crop Protection,
p. 14(3).
96. Biotransformacion de los compuestos 2- feniletanol y acetofenona mediante el hongo
fitopatogeno. Botryodiplodia theobromae.,. Velasco, R, Valverde, I and Durango D., et al.
2007, Revista de la Facultad de Quimica Farmaceutica de la Universidad de Antioquia.
97. Biotransformation of the phytoalexin camalexin by the phytopathogen Rhizoctonia
solani. Pedras, M.Soledade. and Khan, A.Q. 2000, Phytochemistry, pp. 59-69.
98. Detoxification of cruciferous phytoalexins in Botrytis cinerea: Spontaneous. Pedras, M.
Soledade, Hossain, S and Snitynsky, R. B. 2011, Phytochemistry.
99. Metabolism and detoxification of phytoalexins and analogs phytopathogenic fungi.
Pedras, M. and Ahiahonu, P. 2005, Phytochemistry, pp. 199–206.
100. Fumigant antifungal activity of plant essential oils and components from West Indian
bay (Pimenta racemosa) and thyme (Thymus vulgaris) oils against two phytopathogenic
fungi. Kim, J, et al., et al. 2008, Flavour and Fragrance Journal, pp. 23:272–277.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 94
____________________________________________________________________ __
101. Antifungal activity of monoterpenoids against postharvest pathogens Botrytis
cinerea and Monilinia fructicola. Tsao, R and Zhou, T. 2000, Journal of Essential Oil
Research , pp. 12:113-121.
102. Improvement in shelf-life and safety of perishable foods by plant essential oils and
smoke antimicrobials. Holley, RA and Pate, l D. 2005, Review Food Microbiology, pp.
22:273-292.
103. Evaluation of plant essential oils as natural postharvest disease control of tomato
(Lycopersicon esculentum). Plotto, A, Roberts, DD and Roberts, RG. 2003, Acta
Horticulturae, pp. 628:737-745.
104. The combination of modified atmosphere packaging with eugenol or thymol to
maintain quality, safety and functional properties of table grapes. Valero, D, et al., et al.
2006, Postharvest Biology and Techno, pp. 41:317-327.
105. Mode of action of essential oil components on whole cells and fungi in plate tests. In:
Schreier P (Ed.) Bioflavor ’87. Knobloch, K, et al., et al. 1988, Berlin, New York. Walter de
Gruyter Verlag., pp. pp. 287-299.
106. Adaptation of the food-borne pathogen Bacillus cereus to carvacrol. Ultee, A, et al.,
et al. 2000, Archives of Microbiology , pp. 174:233-238.
107. Mycelial deformations of Cladosporium herbarum due to the application of Eugenol
and Carvacrol. Adams, S, Kunz, B and Weidenbörner, M. 1996, Journal of Essential Oil
Research, pp. 8:535-540.
108. The metabolism of thymol by a Pseudomonas. . Chamberlain EM, Dagley S. 1968,
Biochemical Journal, págs. 110:755-763.
109. Biotransformation of monoterpenes by immobilized microalgae. Rasoul-Amini, S,
Fotooh-Abadi, E y Ghasemi, Y. 2010, Journal of Applied Phycology, págs. 22:1-7.
110. Antimicrobial agents from plants: Antibacterial activity of plant volatile oils. .
Dorman, HJ y Deans, SG. 2000, Journal of Applied Microbiology, págs. 88:308-316.
111. Structural requirements for the antimicrobial activity of carvacrol. . Veldhuizen EJA,
Tjeerdsma-Van Bokhoven JLM, Zweijtzer C, Burt SA, Haagsman HP. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, págs. 54:1874-1879.
Actividad antifúngica y biotransformación de los sustratos timol y carvacrol
mediante los hongos fitopatógenos C. acutatum y B. theobromae 95 ____________________________________________________________________
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