Biología de Clostridium difficile: Implicaciones para Epidemiología y Diagnóstico

Biología de Clostridium difficile:Implicaciones para Epidemiología y Diagnóstico

Karen C. Carroll y John G. BartlettAnnu. Rev. Microbiol. 2011. 65:501-21

Lucas Fernández LalanneProf. Enrique Iáñez Pareja

BacteriologíaDepartamento de Microbiología

Clostridium difficile" 1

Contenido

Introducción ............................................................. 3

Rasgos generales ....................................................... 3

Aspectos genómicos ................................................ 4

Locus de patogenicidad ...................................... 5

Factores de virulencia .............................................. 7

Toxinas A y B ....................................................... 7

Transferasa ........................................................... 8

Otros factores de virulencia ............................... 8

Patogénesis ............................................................... 8

Diversidad: ribotipo 027 ......................................... 10

Epidemiología .......................................................... 10

Riesgos para la infección .................................... 11

Cambios en la epidemiología ............................. 11

Emergencia del ribotipo 027 .............................. 11

Diagnóstico .............................................................. 12

Conclusiones ............................................................ 13


Introducción

Clostridium difficile fue descubierta en 1935 mientras se realizaban estudios sobre enterocolitis asociada a antibióticos en cerdos de Guinea. Paralelamente, se estaban realizando estudios de la colitis asociada a antibióticos producida por Staphylococcus aureus, la cual se pensaba que era la más virulenta conocida hasta el momento. A finales de la década de los 70, se llegó a la conclusión de que C. difficile era el prin-cipal agente de la colitis asociada a antibióticos en humanos y animales. Para comprender la biología de la colonización causada por C. difficile en humanos y como se relaciona con la microbiota intestinal se utilizaron numerosos modelos de ratones como son:

- Ratones gnotoxénicos, que están libres de gérmenes.

- Ratones monoxénicos, que han sido inoculados con una sola especie.

La microbiota aislada de las heces humanas permanece estable y retiene sus propiedades enzimáticas y microbiológicas, al introducirse en ratones gnotobióticos (libres de gérmenes). Estos animales asociados a la microbiota humana facilitan la investigación sobre los efectos de los tratamientos antimicrobianos que actúan sobre esta microbiota y también sobre los efectos protectores de los probióticos.

Rasgos generalesClostridium difficile es una bacteria gram positiva, anaeróbica obligada, formadora de esporas, sacarolíti-ca (degrada hidratos de carbono) y proteolítica (degrada proteínas). Su nombre proviene de la dificultad que tiene a la hora de aislarlo, debido a su lento crecimiento. Durante el crecimiento logarítmico, cuan-do las células vegetativas predominan, este microorganismo es anaeróbico. La forma transmisible son las esporas, que son responsables de su supervivencia dentro del hospedador y de la recurrencia de la enfermedad en caso de que se pare el tratamiento. Estas esporas, como muchas otras, son metabólica-mente durmientes, sobreviven largos periodos de tiempo y son resistentes a tratamientos tanto quími-cos, como físicos. Estas esporas fueron estudiadas y se determinó que eran resistentes a las altas tempe-raturas y al etanol (70%), y eran inactivadas por agentes esporicidas. Su estructura es la siguiente:

1. Exosporio, que es liso en la fase durmiente y forma numerosas proyecciones filamentosas que se adhieren a las microvellosidades del colon durante la germinación.

2. Por debajo del exosporio se encuentran las cubiertas.

3. Membrana esporal externa.

4. Corteza o córtex.

5. Pared de la espora.

6. Membrana esporal interna, o membrana citoplásmica de la es-pora.

7. Protoplasto o núcleo. Observamos ribosomas empaquetados y nucleoproteínas.


La dosis requerida de las esporas para infectar al 50 % de los ratones (ID50) es de unas 7 esporas por cm2 aproximadamente (probablemente se expresa en cm2 refiriéndose al área que hay en la superficie intestinal).Los genes que codifican las proteínas de la espora están dispersas por todo el genoma de la bacteria.

- Proteasas, proteínas de respuesta al estrés oxidativo y proteínas metabólicas son abundantes durante la germinación.

- Proteínas de la superficie externa que interaccionan con el ambiente extracelular, serán fundamentales para la adhesión y germinación. Estas proteínas son candidatas para la búsqueda de vacunas y tests de diagnóstico.

Es importante saber que la regulación de la esporulación está íntimamente relacionada con la regulación de las toxinas.

Aspectos genómicosClostridium difficile es unas bacteria virulenta y resistente a los antibióticos. Su genoma consiste en un cromosoma circular de unos 4,3 Mb, y un plásmido de 7,8 Kb. C. difficile comparte sólo un 15 % de sus secuencias codificantes con sus parientes C. tetani y C. botulinum, mientras que el 50 % de sus secuencias son únicas para su especie. Además, el 11 % de su genoma consiste en elementos genéticos móviles co-mo por ejemplo los transposones conjugativos, que son capaces de integrarse y escindirse del genoma del hospedador.

Una de las regiones más importantes del genoma es el locus de patogenicidad (PaLoc) que contiene 5 genes (tcdA, tcdB, tcdC, tcdR, tcdE), que son responsables de la síntesis y regulación de las toxinas A (TcdA) y B (TcdB). Los genes que codifican la toxina binaria son cdtA y cdtB, y no se encuentran locali-zados en el PaLoc.

Otros loci importantes en la virulencia son:

- El gen slpA, que codifica la capa S.

- Genes que codifican dominios de unión a la matriz extracelular.

- Un gen que codifica una colagenasa.

- Genes que codifican proteínas ancladas en la superficie, que son importantes para la unión covalente al peptidoglucano.

- Un locus para la biosíntesis de fimbrias tipo IV.

- Un clúster de genes involucrados en la síntesis de polisacáridos extracelulares.


Clostridium difficile también tiene un gran número de genes implicados en la supervivencia en el tracto intestinal. Muchas de estas secuencias se encargan del transporte y metabolismo de carbohidratos:

- Posee genes que codifican la enzima p-hidroxifenilacetato descarboxilasa que permite a esta bacteria producir y tolerar altas concentraciones de p-cresol, un compuesto bacteriostático. Esto le proporcio-na ventajas para competir con las bacterias pertenecientes a la flora intestinal.

- Hay genes que están implicados en la degradación de la etanolamina, un importante constituyente de los fosfolípidos y una fuente de carbono y nitrógeno para C. difficile.

- Por último, también codifica una enzima importante para la síntesis de ácido biliar, así como otros ge-nes que le permiten tolerar estos ácidos.

Se llevaron a cabo análisis de microarray sobre el genoma completo de C.fifficile, basándose en el geno-ma secuenciado de la cepa 630. Esto proporcionó una visión de la evolución filogenética de esta especie. Este detallado análisis reveló la existencia de 4 clados:

1. Un clado hipervirulento. Poseen fragmentos de transposones conjugativos (CTn2 y Ctn5), que po-drían tener función de transporte de antibióticos.

2. Un clado carente de una toxina (TcdA-, TcdB+). Los aislados provenían de distintos continentes, demostrando su distribución mundial.

3. HA1. Presente en muestras humanas. Hiperproducción de las toxinas A y B.

4. HA2. Presente en muestras animales.

Locus de patogenicidad

La secuencia PaLoc de C. difficile es de aproximadamente 19,6 Kb y sólo está presente en las cepas viru-lentas (las no virulentas carecen del PaLoc), aunque se ha visto que cepas con el PaLoc defectuoso toda-vía causan enfermedad. Como ya se ha comentado anteriormente, el PaLoc posee los genes tcdA, tcdB, tcdC, tcdE y tcdR.

• Los genes tcdA y tcdB, que codifican las toxinas, están separadas por la secuencia tcdE, y son transcri-tas en la misma dirección. Expresión en la fase estacionaria.

• La secuencia tcdE codifica una holina, una proteína que posee una actividad formadora de poros, que permite la liberación de TcdA y TcdB desde la célula. Expresión en la fase estacionaria.

• El gen tcdR se encuentra río arriba de tcdB y es un regulador positivo de la expresión de tcdA y tcdB, y responde frente a las condiciones ambientales, aumentando su respuesta en la fase estacionaria.

• Al contrario que tcdR, la secuencia tcdC (que se encuentra aguas abajo de tcdA) es un regulador negati-vo de la expresión de la toxina, y se expresa durante la fase exponencial de crecimiento. Es un factor antisigma que desestabiliza la holoenzima TcdR, para prevenir la transcripción del PaLoc.


Hay otro gen regulador, represor de la toxina, llamado CodY. Este regulador actúa controlando factores nutricionales del ambiente. En presencia de una cantidad suficiente de nutrientes, como ciertos ami-noácidos y GTP, CodY se une al promotor de tcdR y reprime la expresión del gen de la toxina. Cuando hay falta de nutrientes, la expresión de los genes de la toxina se reprime. La identificación de este gen podría ser útil para el desarrollo de tratamientos.

G E N F U N C I Ó N

tcdA Codifica la toxina TcdA

tcdB Codifica la toxina TcdB

tcdC Regulador negativo de la expresión de toxina

tcdE Codifica una holina, que permite la liberación de toxina

tcdR Regulador positivo de la expresión de toxina

codY Represión de producción de toxina


Factores de virulencia

Toxinas A y B

Son unas toxinas que poseen un gran tamaño (205-308 kDa) y son glucosiltransferasas. Transfieren UDP-glucosa a pequeñas GTPasas, tales como Rho, Rac y Cdc42 (estas pequeñas proteínas son muy importantes en la regulación de rutas de señalización). La glicosilación interrumpe las rutas, lo cual da lugar a cambios morfológicos e inhibición de la división celular y del tráfico de membrana, produciendo en última instancia la muerte celular.

La enterotoxina TcdA (308 kDa) se pensaba que era la única toxina imprescindible para que se diera la infección, hasta que se encontraron cepas TcdA-, TcdB+ responsables de importantes brotes de infec-ción. TcdB (270 kDa) es una citotoxina, que es de 100 a 1000 veces más tóxico a cultivos celulares que TcdA. Se demostró que TcdB, no TcdA, es esencial para la virulencia.

- Los hamsters que eran infectados por mutantes de la toxina B (la toxina A era activa, pero no la toxina B) morían con menor probabilidad.

- Los hamsters que eran infectados por mutantes de la toxina A (toxina A inactiva, toxina B activa) morían con mayor rapidez.

Sin embargo, un estudio reciente refutó esta idea, reestableciéndose la idea de que ambas toxinas causan una infección considerable. En este estudio, cepas mutantes TcdA+, TcdB- causaban la misma infección que la cepas normales. El autor estableció que los resultados del estudio anterior podrían de-berse a los modelos animales utilizados.

Ambas toxinas poseen 4 dominios estructurales:

a. Un extremo N-terminal, con actividad glucosiltransferasa (sólo los primeros 543 aa son responsables de esta actividad). Aquí se encuentra la actividad de la toxina y, por lo tanto, esta porción se transfiere al citosol de la célula hospedadora. La región de 543 aa se corta entre Leu543 y Gly544, en una región muy conservada.

b. Un dominio cisteín-proteasa, encargada de la autoproteolisis de la región anterior para que pase al interior de la célula. Este dominio depende del inositolfosfato de la célula hospedadora.

c. Una sección translocasa, que posee una región hidrofóbica implicada en el transporte de la toxina. Ocupa el 50 % de la toxina y posee una región hidrofóbica para facilitar el paso de la toxina por la membrana, durante la translocación.

d. Un extremo C-terminal, con actividad de unión al receptor. Esta región posee cortos oligopéptidos combinados repetitivos (CROPs) para la unión al receptor. En modelos animales del TcdA, ciertas estructuras de carbohidratos juegan un papel muy importante en la unión de la toxina al receptor.


Transferasa de C. difficile (CDT)

Esta transferasa también se conoce por el nombre de toxina binaria y es codificada por el locus Cdt (CdtLoc). Se encuentra en el 6-12.5% de todas las cepas. Las cepas que no poseen el CdtLoc en su lugar poseen una secuencia de 68 pares de bases altamente conservada. La CDT es una toxina ADP-ribosilan-te que desestabiliza el citoesqueleto de la célula, dando lugar a pérdidas de líquidos y posterior muerte celular. Esta toxina está compuesta de dos subunidades, CDTa y CDTb. Por separado no son citotóxi-cas, sólo lo son cuando están unidas. La incidencia de CDT es mucho más alta en las cepas que causan epidemias, por lo que esta toxina podría contribuir a la severidad de la infección. La toxina CDT induce la formación de microtúbulos delgados y dinámicos en la superficie de células epiteliales, dando lugar al incremento de la adherencia de Clostridium en estas células, por lo que juega un papel muy importante en la colonización intestinal.

Otros factores de virulencia

Aunque TcdA y TcdB son los mecanismos de virulencia más importantes, en Clostridium difficile hay otros muchos factores que contribuyen a la infección. C. difficile tiene una capa S que consiste en dos proteínas de la superficie extracelular que envuelve la superficie de la célula vegetativa. Estas proteínas contribuyen en la adherencia, estimulan la inflamación e inducen respuesta humoral en el hospedador. Muchas otras proteínas participan en la adherencia a las células epiteliales del intestino.

PatogénesisLos factores fisiológicos que permiten la colonización incluyen la ausencia de microbiota intestinal o que ésta esté afectada. En este contexto, las esporas endógenas o exógenas de la bacteria germinan y las células vegetativas comienzan a multiplicarse. El organismo se adhiere a la mucosa debido a sus adhesi-nas y penetra la mucosa usando sus flagelos y proteasas. Una vez que penetra la mucosa, la bacteria se adhiere a los enterocitos y ocurre la colonización y posterior producción de la toxina.

1. Colonización. Hay varios factores que promueven la colonización:- La enzima proteolítica cisteín-proteasa Cwp84.- Adhesinas, como las proteínas de la capa S.- La proteína Cwp66 de la pared celular.- La proteína GroEL, que une fibronectina.- Los componentes flagelares FliC y FliD.

2. Las toxinas penetran la célula hospedadora mediante una endocitosis mediada por receptor, requi-riendo un endosoma acidificado para dicha translocación. La acidificación induce un cambio con-formacional en ambas toxinas dando lugar a la exposición de las regiones hidrofóbicas del dominio de translocación, para inducir la formación de poros por donde se producirá la translocación poste-rior.

3. Una vez dentro de la célula, las toxinas se unen a las GTPasas de la superfamilia Ras, modificándolas mediante glucosilación, por lo que no pueden cumplir su actividad.


4. Estas células se reducen debido a la despolimerización de los filamentos de actina del citoesqueleto, y finalmente mueren.

5. La muerte celular produce rupturas en las uniones entre enterocitos. Esto da lugar a la migración de neutrófilos al intestino para dar lugar a la respuesta inflamatoria típica de una colitis.

6. La inactivación de las GTPasas da lugar a inhibición de las secreciones, regulación transcripcional y apoptosis. Además, el TcdA estimula la liberación del factor de necrosis tumoral desde los macrófa-gos activados, así como la producción de citoquinas. Estas actividades dan lugar a la acumulación de fluidos (formación de pseudomembrana) y , por lo tanto, aceleran la respuesta inflamatoria.

Hay otra toxina que se encuentra en muy pocas cepas de C. difficile (entre un 6-12.5 %) y se llama CDTa, que está codificada por el locus Cdt. CDT es una toxina ADP-ribosilante que destruye el citoesqueleto produciendo la misma patogenia que la toxina AB (también posee dos subunidades, llamadas CDTa y CDTb). Esta toxina posee una característica muy importante, ya que induce la formación de microtúbu-los en la superficie de los enterocitos, aumentando la capacidad de adhesión y colonización intestinal en Clostridium.


Diversidad: ribotipo 027El aislamiento de cepas TcdA negativas está aumentando considerablemente en los pacientes. Estas ce-pas poseen TcdB, pero poseen deleciones en tcdA, específicamente en la región responsable de la adhe-sión a los receptores de la célula hospedadora. La inexistencia de esta región impide la detección de C. difficile en diagnósticos que usan anticuerpos dirigidos a la región de la toxina.

En 2003, hubo casos serios de infección en EEUU y Canadá debido a clones de C. difficile con caracte-rísticas únicas, que recibió el nombre de ribotipo 027. Esta cepa posee características únicas:

• Presenta la toxina binaria CDT.

• Resistente a las quinolonas.

• Deleción de 18 pares de bases en la región tcdC de la PaLoc, que puede estar relacionado con el au-mento en la producción de la toxina.

• Produce las toxinas A y B más rápido, en cantidades mayores y la duración de su producción es mayor.

• Poseen 5 genes exclusivos para esta cepa que incluyen mutaciones. Estas mutaciones no sólo explican su mayor toxicidad, sino también su motilidad, supervivencia, el aumento en la esporulación y la resis-tencia a antibióticos. Esta combinación de factores explica el aumento en la severidad de la infección y la mortalidad asociada a estos clones hipervirulentos.

Epidemiología

Clostridium difficile está ampliamente distribuida en el medio ambiente y constantemente se detecta en el colon sin que haya consecuencias patológicas. La infección causada por C. difficile (CDI) ocurre cuando hay replicación y producción de toxinas. Los porcentajes de colonización y positivos en análisis de toxinas en heces se recogen en la siguiente tabla:

C. difficile se ha detectado en las heces de muchos animales, incluyendo caballos, camellos, serpientes, burros, focas, perros y gatos. No está claro si causa infecciones en todos ellos, excepto en caballos trata-dos con antibióticos y roedores. También se ha encontrado a esta bacteria en muestras de agua de río y de tierra.


La infección de C. difficile por ingesta de alimentos no ha sido demostrada, pero biológicamente es po-sible, ya que se aisló a la bacteria de 90 muestras de carne de un total de 592 muestras (15 %) recogidas por distintas localidades de EEUU y Canadá. Los clones dominantes en este estudio fueron los riboti-pos 027 y 078.

Riesgos para la infección

Los riesgos más importantes para adquirir la infección son los siguientes:

1. El tratamiento con antibióticos es el primario. Ej: clindamicinas o fluoroquinolonas.

2. La vejez. Hay una alta incidencia en el grupo de edad de >65 años.

3. El contacto con el sistema sanitario, es decir, enfermedades nosocomiales.

Cambios en la epidemiología

Desde el años 2000 ha habido un incremento en las proporciones y severidad CDI, notablemente en Norte América y Europa. En varios hospitales de Quebec (Canadá) se informó de un 6.9 % de mortali-dad por la bacteria, en la cual la causa dominante era el tratamiento con fluoroquinolonas, muy común en pacientes con más de 65 años y se atribuyó a la cepa 027 como el causante de la epidemia.

Emergencia del ribotipo 027

La incidencia y gravedad de las CDI en Norte América y Europa han sido atribuidas a la emergencia del ribotipo 027. Entre 1984-1993, sólo 14 de 6000 casos (<o.o2%) en EEUU pertenecían a este ribotipo, pero entre 2000-2003 se vio implicada en 96 de 187 casos (51 %). Esto puede deberse a su resistencia a las fluoroquinolonas. En Europa su incidencia es mucho menor (un 5 % de los casos).


DiagnósticoPara el diagnóstico se recomienda utilizar muestras de diarrea, excepto en casos especiales. A continua-ción se expone una tabla con los métodos disponibles actualmente para el diagnóstico de la infección por Clostridium difficile.

• Cultivos anaerobios toxicogénicos: estos cultivos permiten que crezcan las bacterias de C. difficile de una muestra de heces, mientras que las bacterias intestinales normales son inhibidas por sustancias específicas. Luego se reaislan estas bacterias de C. difficile para estudiar la producción de toxinas.

• Inmunoensayos con enzimas (EIAs): se utilizan anticuerpos mono- o policlonales para atacar única-mente al TcdA, o al TcdA y TcdB (ésta es mejor, ya que hay cepas que no poseen TcdA y sólo poseen TcdB).

• Análisis de neutralización de la citotoxicidad en cultivos de células (CCCNAs): una muestra de heces se dispone encima de un tipo celular y se observa la respuesta citotóxica debida a la toxina. Una vez hecho esto, se procede a la neutralización con antitoxinas.

• Glutamato deshidrogenasa (GDH): esta enzima está altamente expresada en todas las cepas de C. difficile , y también en cepas toxicogénicas y no toxicogénicas. Cuando se realiza este análisis y éste es positivo, se debe hacer otro análisis para las toxinas de la bacteria. Aquí se representa el método com-pleto con la GDH.


Conclusiones1. El genoma completo de la cepa clínica de Clostridium difficile y de los genomas parciales de las va-

riantes de las toxinas han sido secuenciados.

2. C. difficile causa enfermedades ya que elabora una o dos toxinas clostridiales codificadas por un lo-cus de patogenicidad que posee 3 genes adicionales que regulan la producción de las toxinas.

3. Ambas toxinas son proteínas monoméricas y modelos recientes de cristalografía con rayos X del TcdB sugieren que hay 4 dominios estructurales que son necesarios para la entrada de la toxina y la posterior citotoxicidad.

4. La toxina binaria, que no es codificada por el PaLoc, puede contribuir a la gravedad de la infección por su actividad citotóxica y por la inducción de microtúbulos móviles en la superficie de las células intestinales, dando lugar a la adherencia de la bacteria.

5. Diversas mutaciones en el PaLoc han dado lugar a la aparición de 4 cepas de C. difficile en las que se incluyen especies hipervirulentas, responsables de infecciones más severas.

6. Hay factores de riesgo como las quinolonas, los inhibidores de la bomba de protones y la edad avan-zada que, en combinación con la aparición de cepas más patogénicas, han dado lugar a la ‘‘tormenta perfecta’’ de nuevas epidemias.

7. El reconocimiento de cepas variantes de toxinas en animales domésticos y productos alimentarios podría explicar la aparición de nuevas infecciones en pequeñas comunidades, aunque esto requiere mucho más estudio.

8. El incremento en la incidencia y gravedad de las infecciones ha vuelto a enfocar la atención en la posible ineptitud de los inmunoensayos con enzimas (EIAs) y de los análisis de neutralización de citotoxicidad en cultivos de células (CCCNAs), y ha suscitado el desarrollo de análisis moleculares de diagnóstico.


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