Artigo CLA Publicado - RVQ

Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |no prelo| 000

Artigo

cidos Linoleicos Conjugados (ALC) Os Benefcios que Exercem sobre a Sade Humana e as Principais Metodologias

Analticas Aplicadas para a sua Determinao em Leites

Gouva, M. M.; Franco, C. F. J.; Marques, F. F. C.;* Pereira Netto, A. D.

Rev. Virtual Quim., 2012, 4 (6), no prelo. Data de publicao na Web: 29 de novembro de 2012

http://www.uff.br/rvq

Conjugated Linoleic Acids (CLA) - The Benefits they Have on Human Health and the Main Analytical Methodologies Applied to its Determination in Milk

Abstract: The term conjugated linoleic acid (CLA) refers to a group of fatty acids with 18 carbon atoms and two conjugated double bonds that is naturally present in animal products such as milk and meat. In the last years, this nutrient has received great attention from researchers because of the biological activities assigned to it, especially the properties of anticancer, antidiabetic and the capacity to reduce body fat. This review aims to evaluate the real influences that CLA exerts on human health; to describe some methods used for its determination in milk, addressing parameters necessary for analysis such as extraction of lipids, transesterification reactions and identification by gas chromatography; and discuss some results concerning the CLA content in milk samples.

Keywords: Milk; CLA; cancer; transesterification; gas chromatography.

Resumo

O termo cido linoleico conjugado (ALC) se refere a um grupo de cidos graxos com 18 tomos de carbono e duas ligaes duplas conjugadas que est naturalmente presente em produtos de origem animal, como o leite e a carne. Nos ltimos anos, os ALC receberam grande ateno dos pesquisadores devido s atividades biolgicas que lhe so atribudas, especialmente as propriedades anticarcinognica, antidiabtica e por reduzir a gordura corporal.

Esta reviso teve como objetivo avaliar de maneira crtica as reais influncias que os ALC exercem sobre a sade humana; descrever algumas metodologias utilizadas para sua determinao em leites, abordando parmetros indispensveis anlise como extrao lipdica, reaes de transesterificao e identificao por cromatografia em fase gs; e avaliar alguns resultados obtidos a respeito do teor de ALC em amostras de leite.

Palavras-chave: Leite; ALC; cncer; transesterificao; cromatografia a gs.

* Universidade Federal Fluminense, Instituto de Qumica, Campus do Valonguinho, CEP: 24020-150, Niteri-RJ, Brasil.

[email protected]

Volume 4, Nmero 6

Revista Virtual de Qumica

ISSN 1984-6835

Novembro-Dezembro 2012

000 Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |XXX|

cidos Linoleicos Conjugados (ALC) Os Benefcios que Exercem sobre a Sade Humana e as Principais Metodologias

Analticas Aplicadas para a sua Determinao em Leites

Marcos M. Gouva, Caroline F. J. Franco, Flvia F. de C. Marques,* Annibal D. Pereira Netto

Universidade Federal Fluminense, Instituto de Qumica, Campus do Valonguinho, CEP: 24020-150, Niteri-RJ, Brasil.

* [email protected]

Recebido em 10 de maio de 2012. Aceito para publicao em 12 de novembro de 2012

1. Introduo

2. Biossntese dos ALC

3. Atividade biolgica dos ALC

3.1. Anticarcinognese 3.2. Reduo da gordura corporal 3.3. Outras propriedades

4. Determinao dos ALC em leite

4.1. Extrao lipdica 4.2. Reao de transesterificao 4.3. Identificao cromatogrfica 4.4. Teores de cis-9, trans-11 ALC reportados em diferentes pases

5. Concluses

1. Introduo

O leite considerado um alimento muito importante para a alimentao de crianas e adultos devido presena de diversos nutrientes essenciais para a sade como protenas, vitaminas, lipdios, e tambm minerais, como o clcio.1

Com relao frao lipdica, o leite industrializado pode ser classificado como

integral, quando contm aproximadamente 3,2 % de gordura; como desnatado com 0,3 %; e semidesnatado com valores entre 1,5 e 1,8 %, dependendo da marca e do produtor.2

A gordura do leite essencialmente composta por triglicerdeos (triacilgliceris - TAG), ou seja, steres formados por 3 cidos graxos e glicerol. Estes cidos graxos podem conter de 4 a 22 tomos de carbono e as cadeias formadas podem ser saturadas ou conter at 6 insaturaes, sendo que, de modo geral, a configurao cis predomina

Gouva, M. M. et al


nestas ligaes duplas.1

Os cidos graxos que apresentam duas ou mais ligaes duplas so chamados de poli-insaturados (PUFAs Polyunsaturated Fatty Acids) e, do ponto de vista nutracutico, so considerados gorduras boas, devendo estar inclusos na dieta alimentar para manter os nveis saudveis de lipdios no sangue e a adequada coagulao sangunea; alm disso, tambm auxiliam a regular a presso arterial, a controlar inflamaes nos casos de infeces ou leses, e o sistema de defesa imunolgico.1

No caso do leite bovino, h predominncia de cidos saturados, representando em mdia cerca de 80% dos cidos graxos.

Em relao aos cidos graxos insaturados, destacam-se os cidos linoleicos conjugados (ALC), por apresentarem vrias caractersticas benficas sade. Estes cidos graxos correspondem a um grupo de cidos octadecadienoicos (C18:2), que apresentam ligaes duplas conjugadas nas posies 9 e 11 ou 10 e 12 e geometria cis (c) e trans (t) varivel (c,t; t,c; c,c; e t,t).3 Entre os possveis ismeros, o c9, t11 ALC e o t10, c12 ALC (Figura 1) so os predominantes em leites, correspondendo a cerca de 75% a 90% do total de ALC presente neste alimento.4

A alta concentrao do cido linoleico (AL) e seus ismeros conjugados (ALC) conferem ao leite qualidades como atividades antiaterosclertica,5 antibacteriana,6 antidiabtica,7 de reduo da gordura corporal e da incidncia de doenas coronarianas, proteo contra o cncer,8,9 inibio de radicais livres e imunomodulao.10,11

A quantidade de ALC produzida pelas glndulas mamrias dos animais produtores de leite depende de diversos fatores, como alimentao do gado (componentes do pasto), altitude e raa do animal. A alimentao a mais importante para mudanas significativas na concentrao de ALC, devido modificao da microflora ruminal (estomacal) e, por conseguinte, alteraes nos parmetros fermentativos. Assim, dependendo do rebanho estudado, possvel obter diferentes concentraes de ALC.12 Vale ressaltar que alm do leite, matriz de interesse deste trabalho, os leos vegetais, os frutos do mar, os diferentes tipos de carne e os laticnios, tambm so boas fontes de ALC.13

Este trabalho teve como objetivo avaliar os reais efeitos positivos proporcionados pelo consumo de ALC e discutir as principais metodologias aplicadas para a sua determinao.

Figura 1. Estrutura molecular do cis-9, trans-11 ALC (A) e do trans-10, cis-12 ALC (B)

2. Biossntese dos ALC

Os ALC presentes na carne e no leite de animais ruminantes possuem duas origens possveis: (i) a partir da bio-hidrogenao

parcial do cido linoleico (via enzima cis-trans isomerase) no rmen do animal ou (ii) a partir da ao da enzima 9-desaturase, largamente presente em tecidos mamrios e adiposos de animais ruminantes, sobre o cido trans-11 octadecenoico (Figura 2).14-18

A primeira etapa da bio-hidrogenao

Gouva, M. M. et al


consiste na isomerizao do cido 18:2 cis-9, cis-12 linoleico, presente na dieta do animal, por uma cis-trans isomerase, ao cido 18:2 cis-9, trans-11 linoleico (ou cido rumnico). Na etapa seguinte, este rapidamente reduzido (via redutase) para o cido 18:1, trans-11 vacnico. A reduo do cido vacnico para cido esterico a etapa mais lenta do processo de bio-hidrogenao; como consequncia, este penltimo intermedirio acumula-se no rmen e est, portanto, mais disponvel para ser absorvido pela mucosa do animal e para ser usado como intermedirio na sntese do ALC no tecido adiposo e, principalmente, nas glndulas mamrias. O cido 18:2 cis-9, trans-11 linoleico formado atravs da bio-hidrogenao tambm absorvido pelas glndulas mamrias, mas em menor proporo (0-10% em relao ao cido 18:2, cis-9, cis-12 linoleico inicialmente bio-hidrogenado).14-18

Semelhante bio-hidrogenao do cido linoleico, o cido 18:3 cis-9, cis-12, cis-15 linolnico ingerido, tambm sofre processo semelhante para formar o cido 18:1, trans-11 vacnico (Figura 2).15

O mecanismo endgeno provavelmente

representa a principal fonte de produo do cis-9, trans-11 ALC pelos ruminantes. Os outros ismeros do cido linoleico, entre eles o trans-10, cis-12 ALC, possivelmente so produzidos a partir da combinao da migrao das ligaes duplas e da ao de enzimas cis-trans isomerases no rmen.16 Isso explica, em parte, o fato do cis-9, trans-11 ALC ser o mais abundante no leite, representando mais de 80% da quantidade total.

O teor de ALC no leite pode ser aumentado com a administrao de dietas enriquecidas com cido linoleico, de forma a aumentar a produo do ismero conjugado desse cido graxo pelo animal. No entanto, algumas dietas no enriquecidas com cido linoleico, mas sim com a administrao direta de outros cidos graxos poli-insaturados, tambm so capazes de induzir o aumento da produo de ALC pelos ruminantes.16 Neste caso, a bio-hidrogenao dos cidos poli-insaturados leva produo de cido trans-11 octadecenoico como intermedirio, que pode ser convertido a cidos linoleicos conjugados tambm pela ao da enzima 9-desaturase.

Figura 2. Esquema representativo de reaes que ocorrem no rmen e nas glndulas mamrias para a sntese do cis-9, trans-11 ALC (adaptado de Leite e colaboradores)16

Glndula mamria

0 - 10%

90 - 100%

Leite Rmen

Bio-hidrogenao

cido Linolnico 18:3 cis-9, cis-12, cis-15

18:3 cis-9, trans-11, cis-15

18:2 trans-11, cis-15

cido Linoleico 18:2 cis-9, cis-12

cido Rumnico 18:2 cis-9, trans-11 ALC

cido Vacnico 18:1 trans-11

cido Esterico 18:0

Redutase

Redutase Redutase

Isomerase Isomerase


cido Vacnico 18:1 trans-11

9-Desaturase


Gouva, M. M. et al


3. Atividade biolgica dos ALC

3.1. Anticarcinognese

Testes in vitro e in vivo mostraram um largo espectro funcional dos cidos linoleicos conjugados. Em 1992, o trabalho desenvolvido por Shultz e colaboradores,19 sugeriu que os ALC eram capazes de reduzir o crescimento e a proliferao celular in vitro de clulas MCF-7, responsveis pelo desenvolvimento de um tipo de cncer mamrio. Testes realizados por Ip e colaboradores20 em ratos revelaram que mesmo dietas com suplementao muito pequena de ALC (0,1%) eram suficientes para uma reduo estatisticamente significativa de tumores de mama. Em 1994, um grupo tambm liderado por Ip,21 concluiu que os ALC preveniram o desenvolvimento de tumores de mama em ratos. Quatro anos mais tarde, Cesano e colaboradores mostraram que esses cidos graxos tambm foram efetivos contra tumores prostticos e evitaram a sua metstase em ratos.22

Em oposio aos efeitos positivos observados pelos testes in vitro19 e pela suplementao alimentar com ALC contra o cncer,20 os estudos realizados com cido linoleico por estes mesmos pesquisadores,22 sob as mesmas condies, mostraram que esta forma do cido graxo apresenta funo oposta ao da molcula na forma conjugada, ou seja, ocorre um efeito estimulatrio para a proliferao celular, agravando o quadro clnico da doena. Isso refora a ideia de que dietas ricas em gordura esto associadas a um prognstico negativo na cura do cncer, o que torna o ALC um cido graxo muito especial do ponto de vista da sade humana.22

Os ALC apresentam alguns mecanismos de ao que lhes permitem apresentar as j citadas atividades anticarcinognicas. Eles so capazes de modular a proliferao celular atravs do bloqueio da sntese de DNA e da ao sobre protenas do ciclo celular que regulam esse processo, como as protenas

p16 e a p27. Alguns estudos mostraram que eles tambm reduzem a expresso da protena Bcl-2, que inibe a apoptose, diminuindo a possibilidade da clula se dividir descontroladamente sem responder a um mecanismo de morte celular.23

Os resultados obtidos com animais de laboratrio e com testes in vitro so muito promissores, porm, quando aplicados a seres humanos, no foram observados com tanto sucesso. Um estudo realizado na Sucia durante trs anos, por Larsson e colaboradores,24 com mais de 61 mil mulheres saudveis, avaliou o efeito do consumo de ALC presente em suas dietas, na preveno contra o cncer de mama. Os resultados mostraram que no houve diferena significativa entre o grupo que apresentava dieta rica em ALC e o grupo de controle. Os autores citam, ainda, que resultados semelhantes foram obtidos por outros pesquisadores na Frana. Apenas um grupo holands obteve resultados ligeiramente considerveis. Porm, neste caso foi utilizada uma quantidade mdia de ALC superior em relao aos outros dois, o que sugeriu aos autores suecos que a quantidade mnima necessria de ALC para que resultados significativos fossem obtidos, no foi alcanada em seus estudos.24

Levando-se em considerao o valor mnimo de suplementao necessrio para a obteno de resultados significativos em ratos (0,1% ou 15 mg por dia), um adulto de 70 Kg deveria consumir 3000 mg de ALC por dia. No estudo realizado na Holanda, o consumo dirio de ALC correspondeu a 200 mg, enquanto, no estudo sueco, esse valor foi de apenas 120 mg dirios.24 Esses parmetros nos levam a concluir que ajustes quantitativos das substncias estudadas devem ser feitos na metodologia aplicada para que resultados com maior relevncia sobre a propriedade anticarcinognica sejam obtidos.

Gouva, M. M. et al


3.2. Reduo de gordura corporal

Uma propriedade muito interessante dos ALC chamou a ateno de diversos pesquisadores. A administrao destes cidos graxos atravs de dietas enriquecidas a roedores provocou uma considervel reduo da sua gordura corporal, o que despertou o interesse econmico de introduzi-los no mercado como um agente emagrecedor em humanos. Atualmente, h vrias marcas comerciais que vendem plulas de ALC com essa finalidade, embora no sejam aprovadas pela ANVISA no Brasil (Resoluo RE N 833, de 28 de maro de 2007).25 Assim como nos estudos feitos para a propriedade anticarcinognica, apesar de excelentes resultados obtidos com animais de laboratrio, os benefcios gerados pelo seu consumo por humanos ainda so muito controversos.

Em 2010, Racine e colaboradores26 investigaram a influncia da suplementao com ALC s dietas de 62 crianas obesas (incluindo o grupo de controle) entre 6 e 10 anos de idade. Este estudo mostrou que houve um efeito positivo para a modificao corporal dessa populao. Entretanto, no ano seguinte, uma extensa reviso realizada por Onakpoya e colaboradores27 mostrou que dietas enriquecidas com ALC no foram capazes de reduzir a gordura corporal de adultos com sobrepeso ou obesos de maneira clinicamente significativa. Esta publicao reforou o trabalho realizado por Whigham e colaboradores,28 que sugeriu que os ALC apenas proporcionam um efeito ligeiramente positivo sobre a composio lipdica corporal de humanos.

Navarro e colaboradores29 estudaram os possveis motivos que levariam s diferenas observadas entre os estudos realizados em animais e em humanos. Mais uma vez, houve o questionamento sobre as doses utilizadas. Para os roedores, a dose variou entre 210 e 250 mg/Kg de massa corporal, enquanto a dose administrada para humanos no ultrapassou a faixa de 20 a 97 mg/Kg de

massa corporal. Um indivduo de 70 Kg deveria consumir, sob estas condies, uma quantidade total de aproximadamente 15 a 18 g de ALC por dia, um valor claramente muito alto.

Os mecanismos pelos quais os ALC promovem seus efeitos tambm foram abordados por este mesmo grupo de pesquisadores.29 Os autores reportaram que os ALC so agentes inibitrios da lipognese em tecido adiposo branco e h evidncias de que clulas adiposas humanas deste tecido, ao contrrio das clulas hepticas, apresentam uma capacidade muito reduzida de sintetizar cidos graxos, quando comparadas com as mesmas clulas de roedores. Sendo assim, a gordura proveniente da alimentao a principal fonte de cidos graxos para a sntese de triacilgliceris no tecido adiposo branco. Portanto, este mecanismo proposto para a ao que os ALC exercem sobre a inibio da deposio de gordura seria pouco relevante no metabolismo humano de estocagem lipdica.29

Outro mecanismo proposto neste mesmo trabalho,29 e que mais aceito para a ao dos ALC, diz respeito ao aumento da oxidao de gorduras na mitocndria e no peroxissomo das clulas hepticas. Os roedores so muito sensveis aos fatores que levam proliferao de peroxissomos (induzidos indiretamente pelos ALC), enquanto primatas so relativamente insensveis. Caso esta seja a principal via de ao dos ALC para reduzir a gordura corporal, o uso destes cidos graxos para esta finalidade pode ser extremamente limitado.

Assim, nos estudos feitos para avaliar a capacidade dos ALC de reduo de gordura corporal, apesar de excelentes resultados obtidos com animais de laboratrio, os benefcios gerados pelo seu consumo por humanos ainda muito controverso.

Gouva, M. M. et al


3.3. Outras propriedades

Alm das j citadas caractersticas anticarcinognicas e redutora de gordura corporal, outras propriedades so atribudas ao consumo de cidos linoleicos conjugados, como por exemplo, atividade antiaterosclertica, antidiabtica e anti-inflamatria. Entretanto, Raff e colaboradores no observaram alteraes dos nveis de LDL (lipoprotenas de baixa densidade ou Low Density Lipoproteins), HDL (lipoprotenas de alta densidade ou High Density Lipoproteins), triacilgliceris e dos fatores inflamatrios no plasma, assim como das concentraes de glicose e de insulina de homens jovens dinamarqueses que receberam dietas enriquecidas com ALC.30

Estudos semelhantes utilizando o cis-9, trans-11 ALC, realizados por Moloney e colaboradores31, mostraram que a atividade antidiabtica mediada pela reduo de fatores inflamatrios em tecido adiposo branco pode ser efetiva em ratos e camundongos. Por outro lado, o trabalho desenvolvido por Poirier e colaboradores32 mostrou que a administrao apenas do trans-10, cis-12 ALC causa um efeito oposto, ocorrendo um aumento da atividade inflamatria local, levando a um quadro de resistncia insulnica nos animais estudados.

Como no estudo feito em jovens dinamarqueses30 foi utilizada uma mistura de cidos linoleicos conjugados composta por quantidades quase equivalentes do cis-9, trans-11 ALC e do trans-10, cis-12 ALC, os resultados negativos obtidos podem ter sido mascarados pela contraposio dos efeitos entre os dois cidos graxos.

Por fim, alguns estudos tambm reportaram a possibilidade dos ALC, especialmente o cis-9, trans-11, acentuarem a resposta imunolgica em ratos.33-35 Porm, pesquisas com essa perspectiva so escassas em seres humanos.

4. Determinao dos ALC em leite

A determinao de cidos graxos em alimentos requer o pr-tratamento da amostra para que os analitos sejam extrados e convertidos a uma forma adequada para identificao e quantificao, de acordo com a tcnica instrumental adotada. As etapas envolvidas na anlise esto descritas no fluxograma a seguir (Figura 3), e foram explicadas mais detalhadamente nos tpicos seguintes, enfatizando-se as condies necessrias para a determinao dos ALC em leites.

Figura 3. Fluxograma representativo das etapas envolvidas na determinao de cidos

graxos em leites

Amostra de leite

Extrao lipdica

Reao de transesterificao

Catlise cida Catlise bsica

Cromatografia em fase gs acoplada Espectrometria de Massas

Resultados

TAG

steres Metlicos

Gouva, M. M. et al


4.1. Extrao lipdica

A primeira etapa que deve ser realizada para se determinar cidos linoleicos conjugados, bem como qualquer outro cido graxo em leites, a extrao da poro lipdica do alimento. Porm, importante que este procedimento seja adequado, pois alguns deles podem levar isomerizao das ligaes duplas.36

Muitos pesquisadores optam por adotar procedimentos clssicos que so tradicionalmente utilizados para a extrao de lipdios, como aquele descrito por Folch e colaboradores em 1957, no qual utilizada a mistura clorofrmio:metanol 2:1 (v/v).37

Entretanto, nos anos seguintes, vrias metodologias alternativas foram propostas para esta finalidade por diferentes pesquisadores (Tabela 1). Algumas so extremamente trabalhosas como o procedimento realizado por Leite e colaboradores,16 em que uma extensa sequncia de extraes com isopropanol seguida por hexano deve ser feita. Ainda h uma etapa de resfriamento, duas de secagem e uma de evaporao, de forma que o gasto de solventes muito grande e cada procedimento pode levar horas para ser feito.

Tambm existem os procedimentos padronizados, como o ISO 2001.38 As extraes previstas por esse mtodo so realizadas em ampolas de separao, utilizando solues de amnia e sulfato de sdio, alm de etanol, ter etlico e pentano. A grande vantagem desse tipo de procedimento o fato de ser um mtodo internacionalmente estabelecido e que, portanto, pode ser aplicado nos trabalhos sem ser um dos focos principais da pesquisa.

4.2. Reao de transesterificao

Como os cidos graxos so encontrados nos alimentos como TAG e, em menor

quantidade, como cidos graxos livres; a fim de determin-los por cromatografia em fase gs, principal tcnica utilizada para determinao dos ALC em amostras de alimentos, necessrio converter os TAG a cidos graxos livres e em substncias com maior volatilidade.39,40,41

Os mtodos de derivatizao mais comuns envolvem a transesterificao dos TAG, e a esterificao dos cidos graxos livres, a steres metlicos de cidos graxos (EMAG ou fatty acid methyl esters - FAME). Estes so mais facilmente volatilizados que os TAG ou que os cidos graxos que os compem.

Alguns fatores devem ser levados em considerao quando se deseja realizar as reaes de transesterificao. Condies de reao como o tempo e, principalmente, a temperatura so fundamentais para a correta obteno dos steres metlicos. Se a temperatura e o tempo no forem ideais, os TAG no sero completamente derivatizados, podendo ocorrer a formao de produtos de degradao dos cidos graxos e a perda dos mais leves por volatilizao.

Um grande problema em relao transesterificao em meio cido, por exemplo, a possibilidade de isomerizao dos cis,trans ALC a seus correspondentes ismeros trans,trans ALC, ou ainda, converso a derivados metoxilados em posies allicas. A temperatura elevada o principal fator que influencia na gerao desses produtos de degradao, uma vez que, mesmo em tempos de reao muito longos, as reaes realizadas a baixas temperaturas no causam a degradao dos ALC na mesma proporo.3

A concentrao dos reagentes tambm muito importante. Geralmente, utiliza-se um excesso de lcool (metanol) para garantir que a reao sempre se proceda no sentido de formao dos produtos desejados. As reaes de transesterificao necessariamente demandam a utilizao de um catalisador, que pode ser uma substncia de carter cido ou bsico, e a classificao da reao feita justamente com base no tipo de

Gouva, M. M. et al


catalisador utilizado (Figura 4).

Em geral, este processo de transesterificao uma sequncia de trs reaes consecutivas, na qual mono e diacilgliceris so formados como intermedirios. Para uma transesterificao estequiometricamente completa, necessria uma proporo molar 3:1 de

lcool por triacilglicerol. Entretanto, devido ao carter reversvel da reao, o agente transesterificante (lcool) geralmente adicionado em excesso contribuindo, assim, para aumentar o rendimento do ster, bem como permitir a sua separao do glicerol formado.42

Figura 4. Reao de transesterificao de TAG

Os produtos da reao so uma mistura de steres, glicerol, lcool, catalisador (cido ou bsico) e tri-, di- e monoacilgliceris (caso a reao no tenha sido completa). O glicerol pode ser separado por decantao ou centrifugao.43 A melhor maneira de retirar

os demais interferentes do meio de reao extrair os analitos da mistura. Isso geralmente feito atravs de uma extrao lquido-lquido com solventes pouco polares ou apolares, principalmente hexano.16,45,48,49,54

Tabela 1. Procedimentos descritos na literatura para a extrao lipdica de amostras de leite

Procedimentos de extrao Ref.

10 mL de leite + 100 mL de clorofrmio:metanol (2:1 v/v) + agitao por 30 min. + filtrao + 25 mL de soluo aquosa saturada de NaCl + secagem da fase de

clorofrmio com Na2SO4 anidro + evaporao dos solventes sob presso reduzida (procedimento modificado por Christie (1989)37)

37(a)

100 mL de leite + 80 mL de etanol, 20 mL de NH4OH, 100 mL de Et2O + 100 mL de pentano + 2 x 100 mL de Na2SO4 0,70 mol L

-1 + 10 g de Na2SO4 anidro + filtrao +evaporao dos solventes sob presso reduzida

38

15 mL de leite + 25 mL de isopropanol + 3 x 20 mL de hexano + 10 mL Na2SO4 0,5 mol L-1 + resfriamento a -20 C por 20 min. + centrifugao a 2500 rpm a 5 C por 5

min. + evaporao do solvente + 5 mL CH2Cl2 + secagem com Na2SO4 anidro + secagem sob N2 at o resduo apresentar peso constante

16

1,5 mL de leite + 3,6 mL de isopropanol + 5,4 mL de hexano + filtrao + lavagem com 2,5 mL de hexano:isopropanol (3:2 v/v) + evaporao dos solventes sob N2 +

ressuspenso do extrato em 10 mL de diclorometano:metanol (10:1 v/v) 45

4 mL de leite + 8 mL de acetonitrila + agitao por 20 min. + resfriamento a -18 C por 24 h + secagem da fase orgnica com 1 g de Na2SO4 anidro

54

Gouva, M. M. et al


4.2.1. Transesterificao bsica

As reaes em meio bsico representam o mtodo mais utilizado para a converso dos TAG em steres metlicos. Entre elas, destacam-se as reaes com KOH/MeOH e NaOCH3/MeOH.

A primeira etapa da transesterificao bsica consiste na reao da base com o

lcool, produzindo um alcoxido e o catalisador protonado (A). O ataque nucleoflico do alcoxido ao grupo carbonlico do TAG gera um intermedirio tetradrico (B), a partir do qual so formados o ster metlico e o correspondente nion do diacilglicerol, que desprotona o catalisador (C). Os diacilgliceris e os monoacilgliceris sofrem o mesmo mecanismo de reao, levando formao dos steres metlicos e, na ltima etapa, o glicerol (D) (Figura 5).44

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 5. Mecanismo de reao da transesterificao via catlise bsica

Em 2010, Nunes e colaboradores45

descreveram um mtodo muito trabalhoso, no qual utilizado NaOCH3 como catalisador. Nesta metodologia, o extrato contendo os lipdios deve ser seco em um suave fluxo de N2 e dissolvido em hexano. Em seguida, esta soluo em hexano adicionada a uma soluo de metanol contendo NaOCH3 e esta mistura aquecida em banho-maria a 80C sob fluxo de N2 e agitao por 10 min. Aps esfriar at temperatura ambiente, uma soluo de metanol contendo HCl adicionada e a mistura novamente aquecida nas mesmas condies anteriores.

Aps a adio de uma soluo de NaCl, os steres metlicos formados so extrados com hexano seguido por centrifugao e, finalmente, a soluo evaporada e os analitos so ressuspendidos em um volume adequado de hexano.

Uma reao com KOH como catalisador foi padronizada na ISO 2002.46 Esta reao feita a frio e apenas adequada para extratos de gordura que possuam ndice de acidez em cido oleico inferior a 4,0. Devido sua simplicidade, ideal para anlises rpidas e de rotina.

Vrios pesquisadores adaptaram esses

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

R'

O

RO

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

OR

R'

O

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

HB

CH2

CH2

OH

R''COO

CH2

R'''COO

B ROH

RO R'

OH B

+

CH2

CH2

OH

R''COO

CH2

R'''COO OH

OH

OHROOCR'

ROOCR''

B

R O

+ ++

+

+

+ +

+

Gouva, M. M. et al


tipos de reaes de derivatizao de acordo com sua convenincia.16,47 A principal ressalva que sempre feita em relao aos catalisadores bsicos a possibilidade de no ocorrer a completa metilao dos cidos graxos, o que pode levar a erros de quantificao.

Outro inconveniente que merece destaque a necessidade do lcool e do extrato lipdico serem anidros. Isso se deve ao fato da gua provocar a ocorrncia de uma reao de saponificao paralela. A consequente formao de sabo reduz o rendimento da reao de transesterificao e dificulta a separao dos steres metlicos do glicerol. A reao em meio bsico tambm requer que o contedo de cidos graxos livres seja pequeno. Caso a matriz lipdica contenha alto teor de gua e de cidos graxos livres, o procedimento mais indicado para realizar a reao de transesterificao via catlise cida.43

4.2.2. Transesterificao cida

Metodologias alternativas foram propostas por outros pesquisadores utilizando catalisadores cidos, como as reaes com HCl/MeOH, H2SO4/MeOH e BF3/MeOH.

Conforme mostra a Figura 6, o mecanismo da transesterificao cida consiste na protonao do grupo carbonlico, levando formao de um carboction (A). Aps o ataque nucleoflico do lcool, um intermedirio tetradrico formado (B). Em seguida, o acilglicerol correspondente eliminado e o novo ster formado, regenerando-se o catalisador cido (C). O diacilglicerol sofre as mesmas reaes anteriores, levando primeiramente formao do monoacilglierol e, na ltima etapa, o glicerol, alm de mais duas molculas de ster transesterificado (D).44

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 6. Mecanismo de reao da transesterificao via catlise cida

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

R'

O

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

R'

OH+

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

O+

R'

OH

HR

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

ROOCR'

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

CH2

CH2

OH

R''COO

CH2

R'''COO OH

OH

OHROOCR'

ROOCR''

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

OH

R'

H A

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

OH

R'

CH2

CH2

O

R''COO

CH2

R'''COO

O

R'

O

R

H O R'

O+

R

H

A

O+ H

R

H

A

HA

RO

H

R

O H

+

+

+

+ +

+

+

Gouva, M. M. et al


Molt-Puigmart e colaboradores48 avaliaram a eficincia do cido clordrico como catalisador. Uma soluo de HCl/MeOH foi adicionada a uma certa quantidade de soluo-padro dos ALC e a mistura foi mantida temperatura ambiente por 30 min. ou a 80C por 30 ou 60 min. para reao. Neste estudo, a metilao da soluo-padro foi satisfatria em temperatura ambiente, porm o mesmo no ocorreu com o extrato do leite. Ento, procedeu-se a reao em temperatura elevada e o que se observou, alm da completa metilao dos cidos graxos, foi a gerao de produtos de degradao dos ALC.

O mesmo no ocorreu no trabalho de OFallon e colaboradores49, que realizaram um procedimento semelhante, porm com BF3 como catalisador e temperatura de reao de 55 C por 90 min. Os resultados confirmaram o que foi observado pelos grupos de Park3 (em 2002) e de Luna50 (em 2008), quando H2SO4 foi utilizado como catalisador.

As reaes de transesterificao em meio cido, portanto, mostraram-se ser mais eficientes para a completa metilao dos cidos graxos do que as reaes catalisadas por substncias bsicas. Porm, deve-se ter muito cuidado com as condies de reao para que no ocorra a degradao dos analitos.

Alm disso, esse procedimento o mais indicado para ser aplicado a extratos lipdicos de alimentos, devido ao alto contedo de gua que apresentam.

4.3. Identificao cromatogrfica

Devido complexidade da matriz leite e semelhana estrutural dos ismeros ALC, a principal tcnica utilizada para determin-los e quantific-los em amostras biolgicas, aps

a transesterificao, a cromatografia em fase gs acoplada espectrometria de massas (CG/EM) ou com deteco por ionizao de chama (CG/DIC).37,49,51,52 Esta tcnica tornou-se, desde 1952, a principal ferramenta para determinao e quantificao de cidos graxos em diversas aplicaes e matrizes.51

Dentre as diferentes fases estacionrias empregadas nas colunas capilares de slica fundida utilizadas nos sistemas de cromatografia em fase gs, as fases de alta polaridade de polisiloxano de cianopropila so as que proporcionam a maior seletividade e poder de resoluo na separao dos ismeros de ALC. Na maior parte das anlises, o gs Hlio utilizado como gs de arraste.16,37,49,51,52,53

A sensibilidade e a seletividade que podem ser obtidas nas determinaes dos steres metlicos por CG/EM e CG/DIC permitem determinaes precisas dos ALC em amostras de leite, com boa reprodutibilidade, alcanando baixos limites de deteco e de quantificao. No caso da determinao por CG/EM, a confirmao espectromtrica das estruturas tambm proporciona uma investigao mais detalhada dos ismeros.51,53

Em particular, no acoplamento CG/EM, os ALC ou os teres metlicos so ionizados pela fonte de ionizao por eltrons (IE) a 70 eV. Aps ionizao, os ons de peso molecular destes steres so pouco estveis e no so usados como base para determin-los e quantific-los. Os ons apropriados para estes fins so fragmentos mais estveis, como por exemplos os ons de m/z 67, 81, 95 para os ALC.51

Na Tabela 2, esto listadas algumas condies cromatogrficas utilizadas para identificao e quantificao dos ALC em amostras de alimentos.

Gouva, M. M. et al


Tabela 2. Condies cromatogrficas para determinao dos ALC e outros steres metlicos em diferentes amostras de alimento

Amostras Fases Estacionrias

(dimenses) Gs de Arraste

(Vazo) Acoplamento/

Deteco

Leite bovino16

100% polisiloxano de cianopropila

(100 m x 0,25 mm x 0,20 m)

He (1,66 mL min-1)

CG/EM

leo de peixe, canola,

alfafa, carne49


(100 m x 0,25 mm x 0,20 m)

He (0,50 mL min-1)

CG/DIC

Tecido de peixe51

(50%-cianopropil)-metilpolisiloxano

(60 m x 0,25 mm x 0,25 m)

He (1,00 mL min-1)

CG/EM e CG/DIC

Leite bovino52


(100 m x 0,25 mm x 0,20 m)

He (1,00 mL min-1)

CG/EM

leo de girassol, sebo e leo de fgado de

bacalhau53


(50 m x 0,25 mm x 0,20 m)

He (1,00 mL min-1)

CG/EM e CG/DIC

4.4. Teores do ALC cis-9, trans-11 em leites reportados em diferentes pases

O teor de ALC em leite geralmente reportado como um valor percentual em relao quantidade total de lipdios que compe a amostra. Desse modo, reduz-se a ocorrncia de erros que levariam a valores absolutos equivocados, e elimina-se a necessidade de ajustar a metodologia para que se obtenha uma recuperao mxima do cido graxo, como usualmente deve ser feito para outros analitos.

Na Figura 4, esto reportados os teores do cis-9, trans-11 ALC em leites UHT (Ultra Heat Treatment ou Temperatura Ultra-Alta de Pasteurizao) obtidos em diversos pases.16,54

O leite UHT o tipo de leite mais comercializado e usado no mundo inteiro. Este produto considerado comercialmente

estril, ou seja, um produto que no contm micro-organismos capazes de se desenvolverem nas condies normais de estocagem e comercializao. O processo de pasteurizao pode causar variaes nos nveis de ALC encontrados nos diferentes tipos de leite (cru, pasteurizado e ultra pasteurizado - UHT).16,55

Este fato foi comprovado por Leite e colaboradores16, os quais investigaram o efeito do processo de pasteurizao, determinando o teor de ALC em amostras de leite cru, pasteurizado e UHT, que foram respectivamente: 1,56 0,05 %; 1,40 0,04 % e 1,26 0,04 %. As altas temperaturas utilizadas no processo foram consideradas a principal causa da degradao ou isomerizao dos ALC no leite UHT.

Como exposto anteriormente, a concentrao de ALC presente no leite depende de diversos fatores, que podem

Gouva, M. M. et al


estar relacionados tanto ao modo de criao do gado, quanto a fatores geogrficos do local da coleta.56 Em relao criao do gado, variveis como alimentao (pastoral, rao, celeiro, mista), gentipo do animal e fase de lactao devem ser consideradas. Para os fatores geogrficos, estao do ano, localizao geogrfica e perfil climtico do local da coleta do leite so pontos relevantes.56

Os dados apresentados na Figura 7 expem claramente a relao entre os fatores descritos acima e o teor de ALC encontrado no leite UHT nos diferentes locais de coleta. Deste modo, podemos concluir que as pequenas variaes observadas entre os teores de ALC nas diferentes localidades

so reflexo dos fatores geogrficos e dos diferentes modos de criao adotados em cada local. De qualquer modo, o percentual mdio de ALC no leite UHT corresponde a 0,87% na poro lipdica do leite.

No Brasil, os resultados obtidos em um trabalho realizado por Gouva e colaboradores54, com amostras de leite UHT comercializadas nos supermercados das cidades de Niteri e Rio de Janeiro, indicaram uma percentagem mdia de 0,66 % de ALC em relao quantidade total de lipdio do leite UHT.54 Este valor superior ao encontrado nos Estados Unidos (0,45 %), contudo um pouco inferior aos encontrados em outros pases (Figura 7).

Figura 7. Percentuais relativos do cis-9, trans-11 ALC em relao quantidade total de lipdio de leites provenientes de diversos pases (dados retirados do trabalho de Leite e

colaboradores16 e Gouva e colaboradores54)

6. Concluses

A maior parte das publicaes parece ser pouco conclusiva em relao s reais influncias (positivas) que os ALC exercem

sobre a sade humana, pois os resultados obtidos so divergentes. Os bons resultados obtidos com animais de laboratrio no conseguem ser reproduzidos quando aplicados nos ensaios clnicos com humanos.

Os autores destes trabalhos convergem na opinio de que as metodologias dos estudos devem ser revisadas e melhoradas, e que

Gouva, M. M. et al


novos estudos devem ser realizados com prazo de execuo mais estendidos para que concluses definitivas possam ser tiradas em relao ao consumo de ALC como um suplemento benfico sade humana.

Embora haja metodologias bem estabelecidas para extrao e transesterificao de cidos graxos, a determinao e a quantificao exata e precisa destes cidos em amostras de alimentos, especialmente no leite, exige um controle mais severo destas metodologias, o que torna o procedimento mais complexo.

Desse modo, h uma grande necessidade de se realizar trabalhos relevantes nessa rea, que possam proporcionar determinaes mais simples, rpidas e baratas, mas que ao mesmo tempo sejam sensveis, seletivas e no degradem os cidos linoleicos conjugados.

O teor do ismero cis-9, trans-11 ALC em leites UHT reportado em diferentes localidades diferem muito pouco entre si, tendo um percentual mdio de 0,87 % na poro lipdica do leite. As pequenas variaes observadas entre os teores de ALC nos diferentes pases podem ser reflexo dos fatores geogrficos e dos diferentes modos de criao adotados em cada local.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, PROPPi-UFF (auxlio pesquisa na modalidade Jovens Pesquisadores), FAPERJ (processo E-26/111.794/2010) e MAPA (processo 578782-2008-1) pelo apoio financeiro. Agradecimentos tambm para o CNPq e a FAPERJ pelas bolsas concedidas.

Referncias Bibliogrficas

1 Silva, M. H. L.; Dissertao de Mestrado, Universidade Federal de Viosa, Brasil, 2001.

2 Stio da Associao Brasileira de Produtores de Leite. Instruo Normativa n 51, de 18 de setembro de 2002 (MAPA) Regulamento tcnico de identidade e qualidade de leite pasteurizado. Disponvel em: . Acesso em: 22/11/2012. 3 Park, S. J.; Park, C. W.; Kim, S. J.; Kim, J. K.; Kim, Y. R.; Park, K. A.; Kim, J. O.; Ha, Y. L. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 989. [CrossRef] [PubMed] 4 Chilliard, Y.; Ferlay, A.; Doreau, M. Livest Prod Sci. 2001, 70, 31. [CrossRef] 5 Kritchevsky, D.; Tepper, S,A.; Wright, S.; Czarnecki, S. K.; Wilson, T. A.; Nicolosi, R. J. Lipids 2004, 39, 611. [CrossRef] [PubMed] 6 Whigham, L. D.; Cook, M. E.; Atkinson, R. L. Pharm. Res. 2000, 42, 503. [CrossRef] [PubMed] 7 Fernandes, S. A. A.; Tese de Doutorado, Escola Superior de Agricultura, Brasil, 2004. 8 Ha, Y. L.; Grimm, N. K.; Pariza, M. W. Carcinogenesis 1987, 8, 1881. [CrossRef] [PubMed] 9 Ip, C.; Briggs, S. P.; Haegele, A.D.; Thompson, H. J.; Storkson, J.; Scimeca, J. A. Carcinogenesis 1996, 17, 1045. [CrossRef] [PubMed] 10 Miller, C. C.; Park, Y.; Pariza, M. W.; Cook, M. E. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 198, 1107. [CrossRef] [PubMed] 11 Cook, M. E.; Pariza, M. Int. Dairy J. 1998, 8, 459. [CrossRef] 12 Biondi L.; Valvo M. A.; Di Gloria, M.; Tenghi, E. S.; Galofaro V.; Priolo A. Small Ruminant Research. 2008, 75, 17. [CrossRef] 13 Chin, S. F.; Liu, W.; Storkson, J. M.; Ha, Y. L.; Pariza, M. W. J. Food. Compos. Anal. 1992, 5, 185. [CrossRef] 14 Lock A. L.; Garnsworthy P. C. Livest Prod Sci. 2003, 79, 47. [CrossRef] 15 Griinari, J. M.; Corl, B. A.; Lacy, S. H.; Chouinard, P. Y.; Nurmela, K. V. V.; Bauman, D. E. J. Nutr. 2000, 130, 2285. [PubMed] 16 Leite, J.; Lima, E.; Baptista, J. Lait 2007, 87, 167. [CrossRef] 17 Costa, E.; Queiroga, R. C. R. E.; Pereira, R. A. G. R. Bras. Zootec. 2006, 35 (supl.), 1829. [CrossRef] 18 Fernie C. E. Em Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition; Frank D. G., ed.;

Gouva, M. M. et al


Scottish Crop Research Institute: Reino Unido, 2003, 1581. [CrossRef] 19 Shultz, T. D.; Chew, B. P.; Seaman, W. R. Anticancer Res. 1992, 12, 2143. [PubMed] 20 Ip, C.; Singh, M.; Thompson, H. J. Cancer Res. 1994, 54, 1212. [PubMed] 21 Ip, C.; Chin, S. F.; Scimeca, J. A. Cancer Res. 1991, 51, 6118. [PubMed] 22 Cesano, A.; Visonneau, S.; Scimeca, J. A.; Kritchevsky, D.; Santoli, D. Anticancer Res. 1998, 18, 1429. [PubMed] 23 Kelley, N. S.; Hubbard, N. E. Erickson, K. L. J. Nutr. 2007, 137, 2599. [PubMed] 24 Larsson, S. C.; Bergkvist, L.; Wolk, A. Am. J. Clin. Nutr. 2009, 90, 556. [CrossRef] [PubMed] 25 Stio da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA. Resoluo RE N 833, de 28 de maro de 2007. Disponvel em: . Acesso em: 08 janeiro 2012. 26 Racine, N. M.; Watras, A. C.; Carrel, A. L. Am. J. Clin. Nutr. 2010, 91, 1157. [CrossRef] [PubMed] 27 Onakpoya, I. J.; Posadzki, P. P.; Watson, L. K.; Davies, L. A.; Ernst, E. Eur. J. Nutr. 2012, 51, 127. [PubMed] 28 Whigham, L. D.; Watras, A. C.; Schoeller, D. A. Am. J. Clin. Nutr. 2007, 85, 1203. [PubMed] 29 Navarro, V.; Fernndez-Quintela, A.; Churruca, I.; Portillo, M. P. J. Physiol. Biochem. 2006, 62, 137. [CrossRef] [PubMed] 30 Raff, M.; Tholstrup, T.; Basu, S.; Nonboe, P.; Srensen, M. T.; Straarup, E. M. J. Nutr. 2008, 138, 509. [PubMed] 31 Moloney, F.; Toomey, S.; Noone, E.; Nugent, A.; Allan, B.; Loscher, C. E.; Roche, H. M. Diabetes 2007, 56, 574. [CrossRef] [PubMed] 32 Poirier, H.; Shapiro, J. S.; Kim, R. J.; Lazar, M. A. Diabetes 2006, 55, 1634. [CrossRef] [PubMed] 33 Ramrez-Santana, C.; Castellote, C.; Castell, M.; Rivero, M.; Rodrguez-Palmero, M.; Franch, A.; Prez-Cano, F. J. J. Nutr. 2009, 139, 76. [PubMed] 34 Sugano, M.; Tsujita, A.; Yamasaki, M.; Yamada, K.; Ikeda, I.; Kritchevsky, D. Nutr. Biochem. 1997, 8, 38. [CrossRef]

35 Yamasaki, M.; Kishihara, K.; Mansho, K.; Ogino, Y.; Kasai, M.; Sugano, M.; Tachibana, H.; Yamada, K. Biosci., Biotechnol., Biochem. 2000, 64, 2159. [CrossRef] [PubMed] 36 Tonial, I. B.; Matsushita, M.; Souza, N. E.; Perini, J. A. L.; Morais, D. R.; Bani, F. A.; Visentainer, J. V. Arch. Latinoam. Nutr. 2009, 59, 78. [PubMed] 37 Folch, J.; Lees, M.; Sloane Stanley, G. H. Biol. Chem. 1957, 226, 497. [PubMed] 38 ISO 2001 International Standard ISO 14156-IDF 172:2001. 39 Christie, W. W., The AOCS Lipid Library

Page. Disponvel em: . Acesso em: 23 abril 2012. 40 Ruiz-Sambls, C.; Cuadros-Rodrgues, L.; Gonzlez-Casado, A.; Rodrgues-Garca, F. P. Anal. Methods. 2012, 4, 753. [CrossRef] 41 Fasciotti, M.; Pereira Netto, A. D. Talanta 2010, 81, 1116. [CrossRef] 42 Geris, R.; Santos, N. A. C.; Amaral, B. A.; Maia, I. S.; Castro, V. D.; Carvalho, J. R. M. Quim. Nova 2007, 5, 1369. [CrossRef] 43 Ma, F.; Hanna, M. A. Bioresour. Technol. 1999, 70, 1. [CrossRef] 44 Shuchardt, U.; Sercheli, R.; Vargas, R.M.; J. Braz. Chem. Soc. 1998, 9, 199. [CrossRef] 45 Nunes, J. C.; Torres, A. G. J. Food Compos. Anal. 2010, 23, 782. [CrossRef] 46 ISO 2002 International Organization for Standarization. ISO 15304:2002. 47 Simionato, J. I.; Garcia, J. C.; dos Santos, G. T.; Oliveira, C. C.; Visentainer, J. V.; de Souza, N. E. J. Braz. Chem. Soc. 2010, 21, 520. [CrossRef] 48 Molt-Puigmart, C.; Castellote, A. I.; Lpez-Sabater, M. C. Anal. Chim. Acta. 2007, 602, 122. [CrossRef] [PubMed] 49 O'Fallon, J. V.; Busboom, J. R.; Nelson, M. L.; Gaskins, C. T. J. Anim. Sci. 2007, 85, 1511. [PubMed] 50 Luna, P.; Jurez, M.; Fuente, M. A. J. Chromatogr. A. 2008, 1204, 110. [CrossRef] [PubMed] 51 Dodds, E. D.; McCoy, M. R.; Rea, L. D.; Kennish, J. M. Lipids 2005, 40, 419. [CrossRef] [PubMed]

Gouva, M. M. et al


52 He, S.; Ma, Y.; Wang, J.; Li, Q.; Yang, X.; Tang, S.; Li, H. J. Food Compos. 2011, 24, 223. [CrossRef] 53 Thurnhofer, S.; Vetter, W. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 8896. [CrossRef] [PubMed] 54 Gouva, M. M; Franco, C. F. J; Marques, F. F. de C; Pereira Netto, A. D. Resumos do 16

Encontro Nacional de Qumica Analtica, Campos do Jordo, Brasil, 2011. 55 Precht, D.; MolKentin, J. Milchwissenschaft. 2000, 55, 687. [CrossRef] 56 Vera, L. G. D; Dissertao de Mestrado, Universidade de Aores, Portugal, 2010.

Artigo CLA Publicado - RVQ

Documents

Transcript of Artigo CLA Publicado - RVQ