AÑO 5 NO. 1ENERO 2013

EMPRESA CERTIFICADA

INTERNACIONALMENTEEN ISO 9001:2008

REVISTA TRIMESTRAL CIENTÍFICA,PUBLICADA POR EL PROGRAMA DE

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

ENTRE LABORATORIOS

Proveedor de Ensayos de Aptitud acreditado por ema para los alcances indicados en el escrito con número de acreditación PEA-CLI-04. Acreditado a

partir de 2011-05-04.

www.pacal.org Incluída en IMBIOMED, http://www.imbiomed.com

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Editorial Medlab Pacal

Salmonella:Un importante patógenozoonótico.

Trabajo Participante 2do. Congreso: Uso del error total como herramienta de mejora en el control de calidad interno en hormonas.

Correspondencia MEDLABDengue, Linfocitos Reactivos, Citometría Hemática.

Tinción DOMS:Técnica para teñir bacilos esporulados de interés médico.

Año 5 No. 1

Dr. Sergio I. Alva EstradaDirector General

L.A.E. Aimee Alva MartínezDirectora Administrativa y de Planeación.

Dra. en C. Patricia Flores GuzmánEditor

Dra. en C. Patricia Flores GuzmánCaribel Palomar CollCorrector de Estilo

Lic. Armando Esparza GómezPublicidad

D.C.G. Karina Montoya BecerraDiseño Editorial

Consejo EditorialDr. Sergio I. Alva EstradaDr. Sergio Alva MartínezDr. Francisco Durazo QuirozDr. Andrés Romero RojasQFB Carlos Ponce HernándezM. en C. Rosa María Sánchez ManzanoQBP Carlos Aquino SantiagoQBP Mercedes Cabañas CortezDra. en C. Patricia Flores GuzmánM. en C. Vicente de María y Campos OteguíDr. Felipe García Malo Bautista

Esta revista se imprimió en la Ciudad de México en los talleres de: Impresos Villa Florito S.A de C.V. Laguna de Términos No. 528

Col. Anáhuac Del. Miguel Hidalgo C.P. 11320 Tel.: (55) 5260 4010

Directorio En este 2013, la Revista MedLab cumple 5 años de existencia. A lo largo de este

tiempo, he tenido el privilegio de leer todos y cada uno de los texto publicados en

ella, tanto los anteriores como los presentes a mi etapa como editora. También

he podido constatar el crecimiento de nuestra publicación. Ahora resulta menos

difícil, aunque no menos emocionante, leer las cartas de aceptación por parte

de investigadores de primer nivel, para escribir sobre sus trabajos con nosotros.

Durante este lustro, científicos, académicos, técnicos y administrativos, relacionados

de alguna forma con el ámbito de los laboratorios clínicos, que han escrito para

nosotros, lo han hecho con el afán de enriquecer el conocimiento, de compartir sus

observaciones y de permitirnos crecer en nuestra profesión.

Hay quién considera que el paso del tiempo significa envejecer. En lo personal,

prefiero decir que tenemos más experiencia sobre el tipo de temas que tocamos

en la revista. Pero, realmente, el tipo de material que publicamos es derivado de

la invitación permanente que hacemos a todos y cada uno del personal, usuario o

dueño de un laboratorio de análisis clínicos, que tenga la inquietud de comunicar

algo. Siempre serán bienvenidos sus comentarios o sugerencias de algún tema

que les parezca importante. Es por ello, que en este primer número del 2013, que

contiene excelentes textos, hay dos sobre los que quiero llamar primeramente la

atención: el de Correspondencia a MedLab (en este caso, observaciones clínicas,

valiosas, desde mi punto de vista, porque las hace personal involucrado con el

trabajo diario) y uno de los Trabajos Participantes en nuestro 2do. Encuentro

Internacional Sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico. Sobre este último,

fue agradable y emocionante ver la respuesta a participar por el premio al Mejor

Trabajo Libre de todos los que enviaron su resumen. Muchas gracias por dejarnos

saber que hacen cada uno de ustedes en sus centros de trabajo.

Así mismo, siguiendo con el enfoque sobre enfermedades zoonóticas que hemos

manejado en los últimos números, les presentamos una excelente revisión sobre

salmonelosis, realizada por uno de los grupos de investigación más importantes del

país (si no es que el más). Esperamos les sea de utilidad así como el resto de los

trabajos e información publicada en este número.

Les deseamos un excelente inicio de año agradeciendo, nuevamente, el dejarnos ser

parte de la comunidad de los laboratorios clínicos.

ATENTAMENTE

PACAL MedLab.

Proveedor de ensayos de aptitud reconocido por ema para los alcances indicados en el escrito con númeroPEA-CLI-04, a partir de 2011-05-04.

REVISTA PACAL MedLab, Año 5, N° 1 Ene-Feb. 2013, es una publicación trimestral editada por el Programa de Evaluación de la Calidad. Alhelí No. 78, Col. Nueva Sta, María Del. Azcapotzalco, C.P. 02800, Tel. 5341-3014www.pacal.org, informacion@pacal.orgEditor responsable: Dra. en C. Patricia Flores Guz-mán. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo en trámite. ISSN en trámite. Impresa Impresos Villa Florito S.A de C.V. Laguna de Términos No. 528 Col. Anáhuac Del. Miguel Hidalgo C.P. 11320.Tel.: (55) 5260 4010Este número se terminó de imprimir el 10 de Enero del 2013 con un tiraje de 2,500 ejemplares.Las opiniones expresadas por los autores nonecesariamente reflejan la postura del editor de la publicación.Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes de la publicación sin previa autorización del PACAL.

CONTENIDO

4 54 5www.pacal.org www.pacal.org

Introducción

Salmonella es un patógeno zoonótico que se transmite al ser humano por contacto directo con animales infectados

y por consumo de alimentos o productos alimenticios derivados de animales contaminados. Su morfología y características fisiológicas están estrechamente relacionadas con los otros géneros de la familia Enterobacteriaceae, a la que pertenece.

El género Salmonella está constituido por bacilos gram-negativos, no esporulados, que son anaerobios facultativos. Con la excepción de las serovariedades Gallinarum y Pullorum, tienen movilidad gracias a sus flagelos perítricos. Tienen varias características que facilitan su propagación y colonización de nuevos huéspedes. Pueden desarrollarse en un amplio rango de temperatura (7-48°C) y pH (4 a 8), y resistir a la desecación durante un tiempo prolongado, tanto en heces como en alimentos. Asimismo, tienen la capacidad de sobrevivir en alimentos que contienen altas proporciones

de proteínas y grasas. Salmonella coloniza el tracto intestinal de una gran variedad de animales. Tanto los mamíferos como los animales de sangre fría (reptiles, anfibios y peces) pueden ser reservorios de este patógeno. Algunas serovariedades de Salmonella se adaptan mejor a una especie específica, mientras que otras pueden estar ampliamente distribuidas en un diverso rango de especies animales. Excluyendo a la Salmonella Typhi y Paratyphi A y C, todas las otras serovariedades se pueden considerar zoonóticas; es decir, se transmiten de los animales a seres humanos, causando enfermedad.

Nomenclatura y métodos de tipificaciónLa nomenclatura de Salmonella es compleja. Según el sistema vigente, basado en las recomendaciones del Centro Colaborador de Referencia e Investigación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el Instituto Pasteur, el género Salmonella se divide en dos especies: S. entérica y S. bongori. S. entérica, a su vez, está dividida en seis subespecies. Dentro

M. en C. Freddy Campos Tamayo1, M. en C. Mussaret Zaidi Jacobson1, 2

1 Unidad de Investigación de Enfermedades Infecciosas, Hospital Regional de Alta Especialidad de la Península de Yucatán, Mérida, México2 Laboratorio de Investigación en Microbiología, Hospital General O’Horan, Mérida, México

Autor para correspondencia: M. en C. Mussaret Zaidi Jacobson, mbzaidi@prodigy.net.mx

Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9 Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9

de estas subespecies, existen más de 2400 serovariedades o serotipos que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La identificación de las distintas serovariedades se realiza mediante la serotipificación por el esquema de Kauffmann-White. Este es un método de subtipificación fenotípica que utiliza la presencia de antígenos somáticos O, antígenos flagelares H y antígenos capsulares. Para el lector que desee ahondar más en el tema, se recomienda consultar la bibliografía recomendada al final de este artículo.

Los antígenos O están compuestos por cadenas laterales de polisacáridos, presentes en el lipopolisacárido de envoltura que se encuentra en todos los microorganismos gram negativos. La cadena es un polímero de subunidades repetidas de oligosacáridos típicamente compuestos de 4 a 6 azúcares lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determinan la especificidad antigénica somática de la bacteria.

El antígeno H es de naturaleza proteica y está compuesto de subunidades de flagelina. El flagelo está formado por un cuerpo basal, un segmento de unión y un filamento; el cuerpo basal ancla el flagelo a la célula, y el segmento de unión une el cuerpo basal con el filamento. Para la serotipificación solo se usa la especificidad antigénica del filamento. En Salmonella se han encontrado más de 60 antígenos flagelares específicos, cuya diversidad se debe a las variaciones en la estructura primaria (contenido de aminoácidos y orden de ubicación) de las distintas moléculas de flagelina. Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar y se denominan monofásicas, p.ej. S. Enteritidis, pero la gran mayoría tienen dos especificidades en su antígeno flagelar, es decir son difásicas, p. ej., S.Typhimurium y S. Hadar, entre otras. El antígeno capsular Vi se encuentra en solo tres serovariedades de Salmonella: Typhi, Paratyphi C y Dublin.

Métodos de subtipificación molecularCon el advenimiento de las técnicas de biología molecular, se han desarrollado un gran número de técnicas para la tipificación molecular de microorganismos. Las más utilizadas para la subtipificación de Salmonella son la electroforesis de campos pulsados, conocido como PFGE por sus siglas en inglés (Pulse Field Gel Electrophoresis), y la secuenciación de locus múltiples, conocido como MLST por sus siglas en inglés (Multilocus Sequence Typing).

El PFGE es un método de subtipificación que utiliza enzimas de restricción para cortar el DNA cromosómico en fragmentos, los cuales se corren en un gel que se somete a una serie de pulsos eléctricos con voltajes y en tiempos específicos. Las enzimas de restricción utilizadas reconocen alrededor de 20 sitios de restricción; la combinación de los fragmentos genera un patrón que se utiliza como unidad específica para distinguir una cepa de otra. El uso de múltiples pulsos eléctricos permite analizar fragmentos grandes de DNA, hasta 10 Mb, y por esta razón ha demostrado ser altamente discriminatorio en brotes hospitalarios y de comunidad. También es útil para diferenciar cepas provenientes de

animales, alimentos y humanos en infecciones esporádicas y epidémicas por patógenos zoonóticos como Salmonella. Este método, cuando está debidamente estandarizado y con los adecuados controles de calidad, tiene la gran ventaja de poder ser altamente reproducible en diferentes laboratorios. Los resultados pueden ser analizados en los laboratorios que lo generen o pueden ser enviados a una base de datos central para comparar los perfiles de cepas aisladas en otros países y regiones.

El MLST es una técnica diseñada y desarrollada para identificar líneas clonales, fundamentalmente en poblaciones bacterianas. Una clona se define como una célula o grupo de células que descienden y son genéticamente idénticas a una ancestro común. Si un conjunto de cepas ha sido obtenida en forma independiente de una fuente, o de diferentes localizaciones, o en periodos diferentes, pero muestran características fenotípicas y genotípicas muy parecidas, la explicación más lógica para esta similitud es que se originan del mismo ancestro común. La aplicación principal del MLST es en estudios epidemiológicos globales, variaciones de largo plazo, y en estudios filogenéticos o evolutivos. El método se basa en la secuenciación de fragmentos específicos de genes constitutivos que codifican para enzimas necesarias para el metabolismo básico de la célula, que se expresan continuamente. Se utilizan estos genes para la prueba, ya que no son sometidos a presión selectiva y permiten detectar variaciones neutras que definen líneas clonales relativamente estables. Las variaciones en el conjunto de los genes analizados proporcionan un alto grado de discriminación. El esquema del MLST para Salmonella involucra 7 genes. Las secuencias de los genes analizados se comparan con una base de datos pública (www.mlst.net), y de acuerdo a la combinación obtenida, se le asigna una secuencia tipo, o sequence type (ST, por sus siglas en ingles). Los aislamientos que posean alelos idénticos en todos los genes analizados se clasifican como el mismo ST y se consideran como una sola clona.

Un elemento clave para la detección y control de salmonelosis y otras enfermedades transmitidas por alimentos, es la identificación de estos patógenos en humanos, las probables fuentes de contaminación, sus reservorios, y los cambios de clonas específicas a través del tiempo. La importancia de estos nuevos métodos yace en su capacidad para distinguir entre cepas bacterianas con mayor especificidad que los métodos fenotípicos. En el caso de Salmonella, el método de PFGE permite discriminar entre cepas de un mismo serotipo, para identificar la fuente de un brote o confirmar la aparición de una clona con un nuevo patrón de resistencia antimicrobiana. El MLST, por otro lado, puede determinar si cepas de diferentes regiones geográficas derivaron de un precursor común.

Epidemiologia e impacto en salud públicaLas infecciones por Salmonella causan una morbimortalidad importante a nivel mundial. Según datos de Foodnet, la red de vigilancia de enfermedades transmitidas por alimentos en Estados Unidos de América (EUA), la incidencia de infecciones por Salmonella se ha mantenido constante entre 2005 a 2010. Se calcula que en EUA ocurren anualmente entre 2 a

Artículo de Revisión

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Recibido 6 de septiembre de 2012. Aceptado 03 de octubre de 2012.

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4 millones de casos de gastroenteritis por Salmonella, de los cuales 500 fallecen. En la Unión Europea (UE), la incidencia de salmonelosis ha disminuido en los últimos años. Los serotipos más comunes a nivel mundial son S. Enteritidis y S. Typhimurium.

En México, se han realizado pocos estudios sobre Salmonella durante las últimas dos décadas. Algunos factores que contribuyen a la escasez de datos son que el coprocultivo se solicita en una proporción muy pequeña de los casos de diarrea aguda, y que el país carece de un sistema de vigilancia microbiológica. Nuestros estudios epidemiológicos muestran que existen alrededor de unas 70 serovariedades diferentes en cerdos, aves y bovinos a lo largo de la República Mexicana (Tabla 1). Las serovariedades más frecuentes también infectan al humano en forma sintomática o asintomática. Aquellas que tienen afinidad por animales de sangre fría, como S. entérica subsp. salamae, también se aíslan de humanos, durante la edad adulta y la infancia, pero con menor frecuencia que otras serovariedades.

Existe el concepto, erróneo, que solo un pequeño porcentaje de las infecciones diarreicas en México son causadas por bacterias. De 2002 a 2006, una red de vigilancia en cuatro estados de la República Mexicana (Michoacán, San Luís Potosí, Sonora y Yucatán), encontró que Salmonella fue la causa de diarrea en el 12% de los niños que acudían a un centro hospitalario. Las serovariedades más frecuentemente aisladas fueron Typhimurium y Enteritidis, seguido por Agona, Muenchen y Oranienburg, todos presentes también en animales destinados al consumo humano. Interesantemente, se encontró que hasta 11% de los niños

sanos en edad preescolar, cursaban con infección asintomática por Salmonella. En zonas rurales o en áreas con cadenas alimentarias altamente contaminadas, se documentó la colonización hasta en el 30 a 40% de la población. En regiones con altos niveles de pobreza la infección por Salmonella se adquiere por diversos modos de transmisión; además del consumo de alimentos contaminados, se puede adquirir de persona a persona o por el contacto con heces de animales. En conjunto, nuestros resultados muestran que debido a la exposición continua a Salmonella, la población mexicana adquiere inmunidad desde temprana edad que la protege de la enfermedad. Esta es una de las principales razones por las que en nuestro país no se observan grandes brotes como los que se reportan en EUA y Europa.

En un estudio reciente realizado en una comunidad agrícola de Yucatán, demostramos que el impacto de una cadena alimentaria, altamente contaminada con Salmonella, fue relativamente bajo cuando la población recibía educación

sobre lavado de manos, preparación higiénica de los alimentos y manejo apropiado de las excretas. Asimismo, se observó que la incidencia y la severidad de las infecciones por Salmonella en los ancianos mayores de 74 años era mucho menor que la observada en niños menores de 3 años. Estos hallazgos refuerzan la evidencia de una inmunidad protectora frente a la exposición continua, que aparentemente, dura toda la vida. Cuadro clínicoLas infecciones por Salmonella se pueden presentar como casos aislados o en brotes, que afectan a una familia o varios

Humanos enfermos* incluye a 366 aislamientos con infección enterica y 26 aislamientos con infección invasiva. †Los datos de intestinos de animales para consumo humano y su correspondiente carne cruda han sido combinados debido a que las serovariedades fueron similaresTomado de: Zaidi MB, et al. Integrated food chain surveillance system for Salmonella spp. In Mexico. Emerg Infect Dis 2008; 14:429-435.

Tabla 1. Serovariedades de Salmonella en humanos enfermos y su frecuencia en niños asintomáticos y animales destinados al consumo humano, México 2002-2005.

cientos o miles de personas. En el humano, se conocen principalmente tres manifestaciones clínicas: 1) fiebre entérica -también conocida como fiebre tifoidea- y que es causada principalmente por S. Typhi, 2) gastroenteritis, causada por una gran variedad de serovariedades, y 3) septicemia, caracterizada por bacteremia con infecciones en sitios específicos como meningitis y osteomielitis, entre otros. En la gastroenteritis, la infección más común, los síntomas aparecen alrededor de 6 a 48 horas. El cuadro clínico incluye diarrea, dolor abdominal, náuseas y vómito. Generalmente hay fiebre y, en casos severos, el paciente puede llegar a la deshidratación o al choque hipovolémico. Afecta a todos los grupos de edad, con mayor incidencia en menores de 5 años y mayores de 60 años, los grupos más vulnerables. La diarrea puede variar en volumen e intensidad; en la mayoría de los casos son heces blandas de volumen moderado. Puede contener sangre y moco, dependiendo de la serovariedad. En el Hospital General O’Horán, en Yucatán, se ha observado que hasta el 75% de los niños con diarrea por Salmonella Typhimurium (una serovariedad muy virulenta), tienen sangre en las evacuaciones. En el examen microscópico, se pueden encontrar leucocitos polimorfonucleares como consecuencia de la invasividad del microorganismo y el proceso inflamatorio resultante. Es importante destacar que después de resolverse la diarrea, el paciente puede continuar colonizado por Salmonella por semanas o meses, dependiendo de la serovariedad y la edad del paciente. Entre más pequeño el paciente, mayor el periodo de colonización y de excreción del microorganismo.

Resistencia antimicrobianaLa mayoría de las infecciones por Salmonella no Typhi son autolimitadas, por lo que no requieren de tratamiento antimicrobiano. No obstante, en los pacientes inmunocomprometidos o debilitados, así como en lactantes pequeños, es necesario administrar antibióticos, ya sea para evitar el desarrollo de infecciones sistémicas, o para curar infecciones severas. La primera línea de antimicrobianos recomendados para gastroenteritis incluye ampicilina, cloranfenicol y trimetoprim/sulfametoxazol. Para infecciones más graves se prefiere el uso de cefalosporinas de tercera generación (también conocidos como cefalosporinas de espectro extendido o CEE) y fluoroquinolonas. La azitromicina también es otra excelente opción terapéutica.

En los últimos 20 años, se ha registrado un aumento progresivo en la resistencia antimicrobiana en Salmonella. Esta resistencia se atribuye, en gran medida, al uso desmesurado de antibióticos en la producción pecuaria. La resistencia se puede desarrollar por el uso del mismo antibiótico que se utiliza en medicina humana, pero también por antibióticos de la misma clase, con una estructura molecular común, fenómeno denominado “resistencia cruzada”. Como ejemplo del primer fenómeno, tendríamos que el uso de ampicilina y

trimetoprim-sulfametoxazol en animales, selecciona cepas de Salmonella resistentes a estos mismos antibióticos. Un ejemplo de la resistencia cruzada es cuando los animales reciben un antibiótico de uso exclusivo en medicina veterinaria, como enrofloxacina (una fluoroquinolona) o ceftiofur (una CEE). Debido a que la estructura molecular de estos compuestos es muy parecida a los compuestos homólogos utilizados en medicina humana, las cepas resistentes a enrofloxacina también son resistentes a ciprofloxacina, y las cepas resistentes a ceftiofur presentan resistencia cruzada a ceftriaxona y cefotaxima. El uso de antibióticos en animales lleva a la selección de microorganismos resistentes en el intestino del animal que lo recibe. Al sacrificar a los animales, el contenido intestinal puede contaminar la carne. Si la bacteria no se elimina al momento de la cocción, o contamina otros alimentos durante su preparación, esta cepa de Salmonella resistente puede ser ingerida por una persona y desarrollar la enfermedad. Si requiere un antibiótico y se le administra alguno de los que ya tiene resistencia la cepa, no se logrará la cura deseada. La falla terapéutica frecuentemente conlleva a una mayor duración del episodio diarreico, prolongación de la estancia intrahospitalaria y, en ocasiones, a la muerte.

Los primeros reportes mundiales de resistencia antimicrobiana en Salmonella se publicaron hace mas de 50 años. Desde entonces, la resistencia antimicrobiana se ha incrementado progresivamente a nivel mundial. Los años 90 se caracterizaron por la aparición de una cepa multi-resistente de S. Typhimurium, que causó brotes severos en la Unión Europea y los Estados Unidos. Esta cepa pertenece al fagotipo DT104 y contiene un cassette con genes que confieren resistencia a ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfisoxazol y tetraciclina. Desde su aparición se diseminó a Canadá, Irlanda, Dinamarca, Alemania, Austria, Francia, Italia y Suiza. Con el paso del tiempo S. Typhimurium (DT104 y las no DT104) adquirió resistencia a otros antibióticos como trimetoprim sulfametoxazol, CEE, aminoglucósidos y fluoroquinolonas.

Los datos de nuestra red de vigilancia mostraron que, en México, tanto las cepas provenientes de humanos como de

Salmonella: Un importante patógeno zoonótico.

Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9 Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9

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Figura 1. Se determinaron los patrones de electroforesis de campos pulsados a cepas de Salmonella Typhimurium multiresistentes productoras de betalactamasa cmy-2 procedentes de humanos, carnes crudas y animales destinados al consumo humano aisladas en el estado de Yucatán de 2002 a 2005. Los aislamientos se recolectaron de niños con infecciones sistémicas (HS), gastroenteritis (HE), o infecciones asintomáticas (HA), asi como de carne de pollo (CM), carne de cerdo (PM), carne de res (BM) e intestino de cerdo (SI) de 30 ciudades del estado. La resistencia a diversos antimicrobianos se denota por un cuadro negro. AMP: ampicilina, FOX: cefoxitina, CRO: ceftriaxona, CHL: cloranfenicol, GEN: gentamicina, KAN: kanamicina, NAL: ácido nalidíxico, STR: estreptomicina, SSS: sulfisoxazol, TET: tetraciclina, SXT: trimetoprim-sulfametoxazol y TIO: ceftiofur. Los conglomerados A-H (rectángulos) muestran cepas de humanos y carne y/o animales con patrones indistinguibles. Casi todos los conglomerados contienen aislamientos de las mismas ciudades o ciudades vecinas. Reproducido de: Zaidi MB, et.al. Rapid and widespread dissemination of multidrug-resistant blaCMY-2 Salmonella Typhimiurium in Mexico. J. Antimicrob. Chemother. 2007; 60:398-401.

8 9 www.pacal.orgwww.pacal.org

animales, eran frecuentemente resistentes a los antibióticos. De particular importancia fue la detección de cepas de S. Typhimurium resistentes hasta a once antibióticos, incluyendo los CEE. En el estado de Yucatán, estas cepas multiresistentes se asociaron con una mayor frecuencia de diarrea prolongada, infecciones sistémicas y mortalidad. En todas las cepas, la resistencia a CEE era conferida por el gen cmy-2, que se localizaba en plásmidos de diversos tamaños. Los estudios de MLST demostraron que estas cepas

pertenecían a una nueva secuencia tipo, denominada ST213, que habría reemplazado a la ST19, la clona predominante antes del 2002. Las cepas de S. Typhimurium se aislaron únicamente del intestino de cerdos, pero no de bovinos o aves. Asimismo, los perfiles de antibiograma y PFGE de muchas de las cepas aisladas de cerdo eran indistinguibles de las cepas aisladas de los niños enfermos, lo que permitió identificar al cerdo como el principal reservorio de estas cepas virulentas y multiresistentes (Figura 1).

Conclusiones Salmonella es un patógeno que causa morbimortalidad importante a nivel mundial. En los países industrializados se han implementado sistemas muy estrictos de control para estos patógenos, los cuales requieren de infraestructura costosa y compleja. En México existe una exposición continúa a Salmonella desde edades tempranas que favorece la adquisición de inmunidad protectora. Encontrar el equilibrio entre la exposición y el desarrollo subsecuente de inmunidad protectora por un lado y una población saludable, por el otro, es uno de los grandes retos de la investigación futura. El control de la Salmonella en México requiere del establecimiento de un sistema multidisciplinario de vigilancia epidemiológica con la colaboración activa de los sectores médico, veterinario y pecuario. Solo así se podrán implementar intervenciones específicas que respondan a las necesidades y realidades del panorama nacional.

Bibliografía recomendada1. Achtman M, et al. Multilocus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica. Plos Pathog 2012; 8 (6): e1002776.2. Centers for Disease Control and Preventions. Vital signs: Incidence and trends of infection with pathogens transmitted commonly trough food-foodborne disease active surveillance network, 10 U.S. sites, 1996-2010. MMWR 2011; 60: 749-55.3. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control; The European Union Summary Report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2010. EFSA Journal 2012; 10(3):2598 4. Grimont PAD, Weill FX. 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur.5. Lukinmaa S, et al. Application of molecular methods in diagnostics and epidemiology of food-borne bacterial pathogens. APMIS; 2004; 112: 908-29.6. Pui CF, et al. Salmonella: A foodborne pathogen 2011; 18: 465-73.7. Riley LW. 2004. Molecular epidemiology of Infectious Diseases: Principles and Practices. Washington D.C. American Society for Microbiology Press. 8. Threlfall EJ. Epidemic Salmonella Typhimurium DT104-A. Truly international multiresistant clone. J Antimicrob Chemother 2000; 46:7-10.9. Wiesner M, et al. Association of virulence plasmid and antibiotic resistance determinants with chromosomal multilocus genotypes in mexican Salmonella enterica serovar Typhimurium strains. BMC Microbiology 2009; 9:131.10. Zaidi MB, et al. Nontyphoidal Salmonella from human clinical cases, asymptomatic children, and raw retail meats in Yucatan, Mexico. Clin Infect Dis 2006; 42: 21- 28.11. Zaidi MB, et al. Rapid and widespread dissemination of multidrug-resistant blaCMY-2 Salmonella Typhimiurium in Mexico. J Antimicrob Chemother 2007; 60:398-401.12. Zaidi MB, et al. Integrated food chain surveillance system for Salmonella spp. In Mexico. Emerg Infect Dis 2008; 14:429-435.13. Zaidi MB, et al. Burden and transmission of zoonotic foodborne disease in a rural community in Mexico. Clin Infect Dis 2012; 55:51-60.

Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9 Campos-Tamayo F y Zaidi-Jacobson M. MedLab 2013; Año 5 (1): 4-9

1110www.pacal.org Domínguez-González KG, et al. MedLab 2013; Año 5 (1): 10-14 Domínguez-González KG, et al. MedLab 2013; Año 5 (1): 10-14

RESUMEN La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas, generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las cuales son patógenas por naturaleza. Sin embargo, debido a su resistencia característica, en muchos casos las endosporas bacterianas resisten la coloración, dificultando la percepción de las mismas. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto que produce una modificación, aplicada en el laboratorio de microbiología de la facultad de Químico Farmacobiología-UMSNH, a la técnica original de tinción de esporas, tomando en cuenta la edad de los bacilos. Se efectuó la comparación entre la técnica de tinción de esporas bacterianas según Schaeffer-Fulton y con modificaciones de la misma, aumentando el tiempo de exposición a verde de malaquita y disminuyendo la concentración de safranina. Para ello se realizaron tinciones de cultivos de 24 y 48 horas de 8 cepas de bacilos gram positivos esporulados incubadas a 37ºC, para determinar la eficiencia de las modificaciones frente a la técnica original. Como resultado a estas modificaciones, se observó de manera clara, una respuesta positiva de hasta un 80% sobre los cultivos de 24 horas, mientras que en cultivos de 48 horas la eficiencia de la técnica original aumento

hasta un valor de 90%. Con las modificaciones introducidas a la técnica original de Schaeffer-Fulton, se facilitó la identificación de los bacilos esporulados de interés médico, al observar correctamente la posición y la forma de la espora al microscopio.

INTRODUCCIÓN Las endosporas fueron observadas y reportadas por numerosos científicos como Perty en 1852, Pasteur en 1869, Koch en 1876 y, en 1872, por Cohn. Estas estructuras fueron descritas solamente como cuerpos refringentes debido a que no podían ser teñidas utilizando los compuestos acuosos típicos, como el azul de metileno, safranina, violeta de genciana, entre otros, que eran aplicados en los procedimientos básicos de tinción, debido a su impermeabilidad a estos1, 4, 6.

Una vez que fue descubierto que las endosporas eran una forma bacteriana latente, que demostraban una resistencia única en los tratamientos con calor, los resultados de las investigaciones hicieron hincapié en el control de las endosporas bacterianas, consiguiendo mejorar las técnicas de esterilización y la prevención de infecciones5.

En 1922, se publica el primer método para la tinción de endosporas bacterianas. Esta técnica empleaba una etapa prolongada de calentamiento, lo que dio como resultado una tinción diferencial entre endosporas y células vegetativas en la misma muestra, mostrando tanto endosporas como esporas libres, que aparecían de color verde o azul, en contraste con el tinte rojo obtenido por las células vegetativas2.

El método de Schaeffer y Fulton modificó el método de Dorner en 1933, con el propósito de hacer el proceso más rápido, pero el calentamiento con un mechero Bunsen todavía resultaba ser un problema10. Actualmente, se han realizado modificaciones a los métodos de Dorner y Schaeffer-Fulton con el propósito de que la tinción y la visualización de las esporas, se produzca con mayor rapidez, menores complicaciones y mejor contraste.

Durante muchos años, sólo identificar la presencia de endosporas o esporas libres resultaba suficiente. Frecuentemente, la refractibilidad de las esporas se puso de manifiesto por medio de tinción simple o tinción de Gram y la caracterización e identificación del organismo podía realizarse con otros criterios. Incluso hoy en día, la tinción de esporas se aplica en las primeras etapas de identificación bacteriana3.

En la actualidad, la tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, utilizando verde de malaquita (VM) a una concentración de 10% (p/V) y safranina (S) a una concentración de 0.5% (p/V), es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas, principalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las cuales son patógenas por naturaleza5,8. Sin embargo, debido a su resistencia característica, en muchos casos las endosporas requieren ser observadas en cultivos de 48 horas o posteriores, obstaculizando la apreciación de las mismas al microscopio9.

MATERIALES Y METODOSEn este trabajo se evaluó el efecto que produjo una modificación hecha en el laboratorio de microbiología, de la facultad de Químico Farmacobiología-UMSNH, a la técnica original de tinción de esporas sobre bacilos esporulados de diferente edad.

Se efectuó una comparación entre la técnica de tinción de esporas bacterianas según Schaeffer & Fulton (1933) y 2 modificaciones de la misma, utilizando para ello verde de malaquita (Sigma-Aldrich) a una concentración del 10%, como colorante primario. Como colorante secundario se utilizó Safranina (Sigma-Aldrich), a una concentración de 0.05%. Se realizaron tinciones de cultivos de 24 y 48 horas, de 6 cepas de bacilos gram positivos esporulados (B. subtilis ATCC 6633, B. megaterium, B. cereus, B. mycoides, B. coagulans, B. subtilis, Paenibacillus alvei) incubadas a 37ºC.

Para determinar la eficiencia de las modificaciones, se realizaron tres técnicas de la tinción:

a)Técnica original de Schaeffer-Fulton, la cual utiliza VM al 10% durante 3´ y safranina al 0.5% por 1´.

b) Técnica VMS, la cual utiliza VM al 10% durante 5´ y Safranina al 0.5% por 1´.

c) Técnica DOMS la cual utiliza VM al 10% durante 3´y safranina al 0.05% por 15´´.

RESULTADOS Las modificaciones realizadas sobre la técnica original, provocaron una respuesta positiva de hasta un 80% sobre los cultivos de 24 horas, mientras que, en cultivos de 48 horas, la eficiencia sobre la técnica original aumento hasta un valor de 72% y 90% (Cuadro 1).

Tinción DOMSTécnica para teñir bacilos esporulados de interés médico.

Domínguez González K. G., Soria Herrera R. J., Sistos Chávez A., Molano Galdamez D. E., Hernández Ramón J. K.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA, FACULTAD DE QUÍMICO FARMACOBIOLOGÍA-UMSNH; Depto. Microbiología. Tzintzuntzan 173, Col. Matamoros, CP: 58240, Morelia Mich., Tel: (443) 3142809. Ext. 214. Fax: (443) 3142152.

Autor para correspondencia: K. Domínguez González, qfb.karla@gmail.com

Recibido 14 de agosto de 2012. Aceptado 20 de noviembre de 2012.

También es posible notar que en cultivos de 24 horas, la técnica tradicional de tinción de esporas no mostró ser muy efectiva, puesto que el colorante primario sólo penetró en las esporas del 22% de las tinciones efectuadas (Cuadro 1). En las figuras 1 a 4 se muestran los resultados de algunas de las preparaciones, con las distintas modificaciones a la técnica.

Cuadro 1. Porcentaje de preparaciones con correcta fijación tintorial, realizada con diversas condiciones.

VM: Verde Malaquita 10%; S: Safranina

Artículo Original

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Figura 1: Resultados de la tinción de Schaeffer-Fulton en cepas teñidas después de 24 horas de incubación y observadas a 100 X: A) Bacillus subtilis ATCC 6633, B) Bacillus cereus, C) Bacillus megaterium, D) Bacillus mycoides, E) Bacillus subtilis, F) Bacillus coagulans.

Figura 2: Resultados de la tinción de Schaeffer-Fulton en cepas teñidas después de 48 horas de incubación y observadas a 100 X: A) Bacillus subtilis ATCC 6633, B) Bacillus cereus, C) Bacillus megaterium, D) Bacillus mycoides, E) Bacillus subtilis, F) Bacillus coagulans.

2.- Cepas teñidas con 48 horas de incubación:

Técnica DOMS 1.- Cepas teñidas con 24 horas de incubación:

Figura 3: Resultados de la tinción de DOMS en cepas teñidas después de 24 horas de incubación y observadas a 100 X: A) Bacillus subtilis ATCC 6633, B) Bacillus cereus, C) Bacillus megaterium, D) Bacillus mycoides, E) Bacillus subtilis, F) Bacillus coagulans.

Figura 4: Resultados de la tinción de DOMS en cepas teñidas después de 48 horas de incubación y observadas a 100 X: A) Bacillus subtilis ATCC 6633, B) Bacillus cereus, C) Bacillus megaterium, D) Bacillus mycoides, E) Bacillus subtilis, F) Bacillus coagulans.

2.- Cepas teñidas con 48 horas de incubación:

A B C

D E F

A B C

D E F

A B C

D E F

Técnica Schaeffer-Fulton1.- Cepas teñidas con 24 horas de incubación:

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DISCUSIÓN Como observamos en el cuadro 1 y en las Figuras 1 y 2, la tinción original de Schaeffer-Fulton, aunque es una técnica que durante mucho tiempo sirvió como método de identificación de bacterias generadoras de esporas, tiene sus desventajas al utilizarla, como lo es los tratamientos prolongados con calor 6.

En cepas jóvenes, la técnica original de Schaeffer-Fulton, comúnmente no tiñe las endosporas, esto se pudo observar al utilizar esta técnica en las cepas seleccionadas para este trabajo, mientras que utilizando la técnica modificada como se observa en las figuras 3 y 4 se obtuvieron mejores resultados, tiñendo las endosporas de cualquiera de las especies ensayadas probando la eficiencia de la modificación sobre la técnica original7.

CONCLUSIÓN La técnica original de Schaeffer-Fulton está ampliamente difundida y empleada, sin embargo presenta limitaciones concernientes a la capacidad del colorante primario para penetrar en la espora bacteriana.

Una de las modificaciones realizadas a la técnica original demostró ser adecuada para utilizarse en la identificación y visualización de endosporas en cultivos jóvenes, lo cual agiliza el procesamiento de muestras clínicas sospechosas de infección por bacilos Gram positivos esporulados8.

REFERENCIAS1. Beck RW. A chronology of microbiology in historical context. Washington, DC, USA: ASM Press; 2000. 2. Dorner W. 1926. Un procédé simple pour la colouration des spores. Le Lait 6:8-12.3. Hussey MA, Zayaitz A. Endospore stain protocol. American Society for Microbiology 2007; Disponible en URL: www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3112-endospore-stain-protocol. Consultado Agosto 01, 2012.4. Knaysi G. The endospore of bacteria. Bacteriol Rev 1948; 12 (1):19–77.5. Koneman E, et al. 2008 Bacteriologia médica: taxonomia, morfologia, fisiologia y virulencia. En: Koneman diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color. Argentina: Ed. Med. Panamericana; p. 161-203. 6. Lechtman MD, et al. Rapid methods of staining bacterial spores at room temperature. J Bact 1965; 89: 848–854. 7. May HO. A safe spore stain for class use. Stain Technol 1926; 1:105–1068. Mehrotra RS, Sumbali G. 2009. Principles Of Microbiology. New Delhi, India: McGraw Hill; p. 51-54. 9. Mormak D, Casida L. Study of Bacillus subtilis Endospores in Soil by Use of a Modified Endospore Stain. Appl Environ Microbiol 1985; 49 (6): 1356-1360. 10. Ragazzo JA, et al. Selección de cepas de Bacillus spp. productoras de antibióticos aisladas de frutos tropicales. Rev Chapingo Serie Horticultura 2011; 17 (Especial 1): 5-11. 11. Schaeffer AB, Fulton M. A simplified method of staining endospores. Science. 1933; 77: 194. 12. Swamy PM. 2008. Laboratory Manual on Biotechnology. India: Rastogi; p.231.

Carrillo-Romero AM y Capelini-Rodríguez F. MedLab 2013; Año 5 (1): 15-28

RESUMENEl control de calidad analítico en el laboratorio es fundamental para poder emitir resultados de pacientes y es necesario conocer las variables del método en estudio: error sistemático o sesgo (ES) y error aleatorio o imprecisión (EA). La integración de estos tipos de error genera el error total del método (ET). Además de conocer el ET debemos establecer el error total permisible (ETp), que es la tasa de error que puede ser permitida en un método analítico sin invalidar la utilidad clínica del resultado, considerando que el ET < ETp. Es importante conocer el desempeño analítico de las pruebas realizadas en el laboratorio clínico para destinar acciones correctivas y de mejora que nos ayuden a eficientar dicho desempeño y a mantener un control de calidad que asegure la confiabilidad de los resultados emitidos. El uso del Error total para complementar el análisis estadístico de los datos del control de calidad es una herramienta que nos ayuda a mejorar la evaluación del mismo, así como orientar futuras acciones para eliminar las variables que afectan este proceso. Al usar los requerimientos de calidad aseguramos la utilidad clínica de los resultados emitidos (1).

INTRODUCCIONEl control de calidad analítico en el laboratorio es una actividad que realizan la mayoría de los laboratorios como parte de su rutina diaria y es fundamental para poder emitir resultados de pacientes; en los últimos años, la gestión de calidad total en el laboratorio ha incorporado el aseguramiento de la calidad, que tiene como una de sus principales funciones establecer estándares de calidad para el correcto desempeño de las diversas pruebas de laboratorio. Sin embargo las mediciones analíticas se encuentran influenciadas por errores que pueden ser inherentes al método en estudio: error sistemático o sesgo (ES) y los que no lo son, error aleatorio o imprecisión (EA) (2). La integración de estos dos tipos de error genera el error total del método (ET), el cual es el primer paso para conocer si los resultados que se emiten en un laboratorio tienen utilidad clínica. El modelo que sigue la mayoría de los laboratorios clínicos en Estados Unidos es el de las 3 desviaciones estándar y que se alinea con las recomendaciones de Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA); en este modelo se obtiene el ET= ES + 3(EA), consiguiendo un tasa de error de 1,350 errores por millón. Además de conocer el ET, debemos establecer requerimientos de calidad o error total permisible (ETp), que es la tasa de error que puede ser permitida en un método analítico sin invalidar la utilidad clínica del resultado, considerando que el ET < ETp. El ET debe ser lo suficientemente pequeño para minimizar la liberación de resultados

Uso del error total como herramienta de mejora en el control de calidad interno en hormonas.Autores:Q.B.P. Adriana M. Carrillo Romero (*), Dr. Francisco Capelini RodríguezDepartamento de Pruebas especiales Laboratorio Quest Diagnostics México, México D.F.(*) Autor para correspondencia: manou579@hotmail.com

Palabras clave: Error total, calidad, hormonas.

Trabajo Participante2do Encuentro Internacional sobreControl de Calidad en el Laboratorio Clínico.

Domínguez-González KG, et al. MedLab 2013; Año 5 (1): 10-14

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inexactos y el ETp debe ser lo suficientemente grande para ser alcanzable analíticamente sin devengar un costo excesivo al laboratorio para mantener el proceso bajo control (3).

MATERIAL Y METODOSSe realizó el análisis retrospectivo de 6 meses del desempeño analítico (coeficientes de variación (CV) y sesgo) de 13 hormonas en suero. Los datos fueron obtenidos de un analizador DXI-800 de la marca Beckman Coulter que utiliza la metodología de quimioluminiscencia y se transcribieron en una hoja de cálculo Microsoft© Excel 2003.

Se analizaron los datos de 12 hormonas, las cuales fueron: cortisol (CORT), hormona estimulante de la tiroides (TSH), tiroxina total (T4), tiroxina libre (T4L), triyodotironina total (T3), triyodotironina libre (T3L), hormona luteinizante (LH), hormona folículo estimulante (FSH), prolactina (PRL), testosterona (TEST), insulina (INS) y hormona de crecimiento (HG).

El material empleado para el proceso del control de calidad interno fue: Liquicheck™ Immunoassay Plus Control, niveles 1, 2 y 3, lotes 40760 y 40780 de la marca BIO-RAD y como estimación de la media verdadera se utilizó la media mensual del grupo de consenso de los reportes interlaboratorio de Unity Real Time™ de BIO-RAD.

Con la información obtenida se cuantificó el ET a un intervalo de confianza del 95%, con la fórmula ET= sesgo + 1.65*CV. Los ETp fueron seleccionados del documento Access® Immunoassay Systems Defining Performance Goals V 1.7 Nov 2011 (4). Adicional al cálculo del ET se analizó la influencia de la imprecisión y del sesgo en el ET mediante el cálculo del índice de desviación estándar (IDS) y el coeficiente de variación relativa (CVR), para poder definir y establecer acciones correctivas. El IDS se calculó mediante la fórmula IDS= (media mensual –media de consenso)/desviación estándar del consenso, y utilizamos para el CVR= (CV mensual/CV de consenso). Se tomaron los siguientes criterios para definir IDS y CVR aceptables (5):

Valor del IDS InterpretaciónAceptableDe aceptable a posicionamiento marginal.Puede ser necesario realizar investigaciones.Desempeño marginal.Se recomienda realizar investigacionesDesempeño inaceptable.Es necesario tomar medidas que lo subsanen.

Valor del CVR Interpretación

AceptableDesempeño marginalInaceptable

RESULTADOSEn las tablas 1 a la 6 (páginas siguientes) se puede observar el desempeño mensual de los analitos seleccionados en base

al % ET obtenido, además de verificar que fue menor al ETp propuesto a lo largo de los 6 meses consecutivos en los que se ha realizado el análisis.

Los resultados de desempeño mensual en base a IDS y CVR se graficaron usando los criterios establecidos, encontrando para el IDS que, un 97% de los resultados se encuentran clasificados como desempeño aceptable, mientras que un 2% se posiciona como resultados con desempeño aceptable a marginal y solamente un 1% es clasificado como desempeño marginal (Gráfico 1).

Para el caso del CVR, se tiene que en el 78% de los analitos se consigue un desempeño aceptable, mientras que el 22% se encuentra en un desempeño de aceptable a marginal y no se obtiene ningún analito en desempeño inaceptable (Gráfico 2).

Gráfico 1. Clasificación de analitos en base a su IDS

Gráfico 2. Clasificación de analitos en base a su CVR≤ 1.251.25 – 1.49

1.5 – 1.99

≥2.0

0.0 - 0.991.0 - 1.99≥ 2.0

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Esta información se complementa con los resultados para el sesgo o porcentaje de error sistemático y el porcentaje de error aleatorio obtenidos durante el período de prueba, Enero-Junio del 2012 (Tablas 7, 8 y 9) para comenzar a diferenciar los analitos que tienen imprecisión de los que presentan inexactitud.

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Gráfico 3. Error total en el nivel 1 de control Ene-Jun 2012

Gráfico 4. Error total en el nivel 2 de control Ene-Jun 2012

En los gráficos 3, 4 y 5 se presentan los resultados de ET a lo largo del período de prueba para los analitos probados en los 3 niveles de control. Se observa que el 100% de los analitos se encuentra por debajo del ETp seleccionado, aunque algunos analitos se acercan demasiado al límite (Ejemplo: T4L en mayo, T3T en mayo).

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DISCUSIONEn base a los resultados analizados se puede determinar que el tipo de error que afecta en mayor cantidad al porcentaje de ET es el error de tipo aleatorio, que a su vez se encuentra relacionado con la imprecisión. Esta imprecisión en la prueba puede deberse a múltiples causas como son: la misma naturaleza del analito, el tipo de metodología usada, estado de las pipetas o pipetores, factores inherentes al personal como son manejo del control, manejo de reactivos, calibraciones, capacitación en el uso de equipos e insumos, incluso al conocimiento de conceptos relacionados con el control de calidad y la toma de acciones correctivas en tiempo y forma. El presente trabajo permitió conocer el desempeño acumulado de diversos analitos en base a la imprecisión e inexactitud que presentan, sin embargo aunque conocemos muchos de los factores que pueden originar la imprecisión hace falta investigar uno por uno para determinar si son los causantes de este comportamiento, y para proceder a tomar las acciones pertinentes que nos permitan minimizar el impacto de los mismos en la obtención del error total; sin embargo, la estandarización de los procesos (sobre todo los inherentes al operador y al manejo de materiales) nos han permitido observar mejorías en el desempeño. Sin embargo, a pesar de encontrar imprecisión en algunas pruebas el error total permitido nunca fue rebasado lo que nos consiente asegurar la confiabilidad de nuestros resultados.

Es importante analizar los datos de un control de calidad interno mes a mes, debido a que la información que proporciona esta práctica nos permite visualizar globalmente el comportamiento de los analitos, así como la necesidad de tomar acciones correctivas o de mejora basándonos en qué tipo de error afecta más a nuestro proceso.

Aunado a esto, el uso del error total junto con el error total permitido de cada prueba nos permite saber si estamos cumpliendo con el principal objetivo de todo laboratorio clínico que es: emitir resultados confiables que ayuden al médico a establecer un diagnóstico, brindar seguimiento o reorientar una terapia.

REFERENCIAS(1) Brooks ZC. Performance Driven Quality Control. 2001 AACC Press USA(2) Westgard JO. ¿Cómo hacer el control de calidad correcto de la manera correcta? Prácticas básicas de control de la calidad. 2010, 3ª. Ed. Capítulo 20(3) Rhoads, DG. Validation, verification of Method comparison. Quality management andthe role of performance standards are explored. Advance/Laboratory July 2012. www.advanceweb.com. Consultada en octubre 2012.(4) Access® Immunoassay Systems Defining Performance Goals V 1.7 Nov 2011. Beckman Coulter(5) Manual de usuario Unity Real Time 2.0. Bio-Rad

Pérez-Norica G y Pérez-Castro RG. MedLab 2013; Año 5 (1): 29-30

El diagnóstico temprano del dengue es muy importante en el control del paciente, así como en el control epidemiológico. Los métodos para el diagnóstico de esta enfermedad viral, varían de acuerdo al equipamiento de cada laboratorio.

a) Inmunocromatográficos. b) ELISA.c) Métodos de biología molecular.d) Aislamiento viral.

Sólo los métodos Inmunocromatográficos son accesibles a cualquier Laboratorio de rutina y, en todo caso, costosos para el paciente. Por ello, el costo en el diagnóstico de ésta enfermedad, es el motivo principal de éste trabajo.

En nuestro Laboratorio, a partir de una Citología Hemática de rutina hemos estado haciendo observaciones en pacientes sospechosos de dengue clásico, desde el año 2007. Cabe mencionar que Martínez de la torre Ver., se encuentra en una zona endémica para esta enfermedad. Estas observaciones se han hecho en el extendido sanguíneo donde se hace el recuento celular en laminillas teñidas por el método de Wright.

Marco TeóricoAl penetrar un antígeno en el organismo se desencadena una respuesta inmune que lleva a la producción de células efectoras, que conlleva cambios morfológicos en los linfocitos. Esto se traduce en la formación de precursores de células plasmáticas sintetizadoras de Inmunoglobulinas, que al final terminan en sangre periférica2.

El resultado de la activación son Células de aspecto inmaduro4, que a través de la linfa llegan a sangre periférica, se conocen desde hace muchos años y se asocian a enfermedades virales, se conocen como virocitos. En épocas más recientes, diferentes autores las han llamado como: linfocitos activados,

linfocitos transformados, linfocitos variantes3, linfocitos atípicos, linfocitos monocitoides (éste nombre es el más generalizado, por asociarse a la Mononucleosis Infecciosa). Y sigue, también se les llama linfocitos irritativos y linfocitos reactivos - algunos de estos nombres provienen de la práctica- Esta multiplicidad de nombres ha creado una verdadera confusión para el Médico que interpreta el reporte de los diferentes Laboratorios. Lo peor de todo es que no existe (¿?) una manera de llamarlos por su propia identidad inmunológica, tal vez, una denominación CD.

DescripciónDe acuerdo a nuestras observaciones, en muchas muestras en el trabajo rutinario, efectuadas en una simple extensión de sangre, sin anticoagulante, para evitar deterioro celular, y teñido por el método de Wrigth, determinamos que la población resultante de la activación antígenica, aparece como células de aspecto inmaduro, de citoplasma intensamente basófilo, grandes -aunque también las hay de tamaño normal-, algunas con vacuolas en el citoplasma. El núcleo celular se presenta, en la mayoría de los casos, excéntrico y con un halo claro perinuclear; se puede observar un nucléolo. El citoplasma suele prolongarse y acomodarse entre los eritrocitos circundantes, como si se volviera frágil3. Podemos distinguir dos variedades:

a) Con citoplasma hiperbasófilo, que son los que más se observan y, según algunos autores, serían linfocitos B activados, tal vez plasmocitos, precursores de células sintetizadoras de inmunoglobulinas (células plasmáticas).

b) De citoplasma hialino, que serían linfocitos de estirpe T, destinadas a ser células cooperadoras y citotóxicas. Éstas son más pleomórficas que las primeras, las cuales varían muy poco en su patrón morfológico, ya descrito. No se observan gránulos en el citoplasma de ambas poblaciones.

T.L.Guillermo Pérez Norica.L.Q.C. Ruth Gabriela Perez Castro.Laboratorio De BioanálisisMartínez De La Torre Ver.

Autor para correspondencia: T.L. Guillermo Pérez Norica, Memoyotzin@hotmail.com

Gráfico 5. Error total en el nivel 3 de control Ene-Jun 2012

Carrillo-Romero AM y Capelini-Rodríguez F. MedLab 2013; Año 5 (1): 15-28

Correspondencia a MEDLAB

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Estas observaciones se han hecho en condiciones de rutina, con un Microscopio Zeiss modelo Axiostar, usando el objetivo de inmersión y un ocular 10x. Las laminillas se tiñeron con colorante de la casa Merck. Pero es conveniente hacer notar que, los contadores automatizados las detectan con alarmas que se disparan3. En el caso del Advia 60, de Bayer, es la alarma M2 la que aparece; otros, de mayor tecnología, como el Advia 120, los reporta como linfocitos atípicos.

Y aquí otra observación: Cuando se maneja este tipo de instrumentos de alta o muy alta tecnología, puede ocurrir un exceso de confianza por parte del operador. Es muy común que suceda así y que se reporte el resultado sin practicar la observación microscópica de la muestra, lo que nos priva de examinar las poblaciones celulares teñidas, pasando por alto a estos linfocitos característicos, que aún no sabemos cómo llamar. Y que, como dijimos anteriormente, han sido asociadas a virosis, pero no al Dengue. Al menos nosotros no lo encontramos en nuestra escasa literatura. Y es aquí donde puede tener importancia su determinación.

Las pruebas rutinarias para el diagnóstico en cualquier Laboratorio, son aceptables, pero caras. Una citometría tiene un bajo costo y si se practica de manera automatizada, los datos obtenidos son muy confiables. Pero como se dijo antes, por exceso de confianza muchas veces no se observa el frotis teñido; esto significa no enterarse de la presencia de estas células. Es pues una buena práctica de laboratorio hacer y teñir una laminilla, necesario para observar a los linfocitos reactivos (como nosotros los llamamos), para anexarlo en el algoritmo de diagnóstico del virus del dengue. En el caso de los contadores automáticos, es clave saber interpretar correctamente las alarmas que los diferentes instrumentos disparan y, en caso que se disparen, se deberá hacer una tinción de Wright. Y claro, observarla al microscopio.

Es entendido que los datos aportados por el análisis de Laboratorio en Dengue, pueden ser: Hemoconcentración, Trombocitopenia, Leucopenia, y/o Bandemia. Entonces, ¿podríamos incluir Linfocitos Reactivos? O mejor, ¿su nombre CD?

Es claro que faltan muchas cosas por hacer, pero eso ya no está al alcance de éste Laboratorio. Las observaciones presentadas en este trabajo, producto de pruebas rutinarias, se dan a conocer con el fin de que se establezca la identidad inmunológica de Los “Linfocitos reactivos” que, por otro lado, casi todos los Laboratorios conocen y reportan, aunque cada cual, de diferente forma.

Alcanzar consensos acerca de la identidad de estas células, podría servir:

a) Para que el personal del Laboratorio Clínico reconozca de manera adecuada a dichas células.

b) Para que el Médico relacione a los “Linfocitos Reactivos” (o cual sea su nombre), con dengue, de acuerdo a la historia clínica de cada paciente, integrándolos con los demás parámetros alterados, que pueden ser todos o solo algunos de ellos. Es decir, emplear las observaciones morfológicas como ayuda diagnóstica.

La detección de estas células, por supuesto, no sustituye a otras pruebas de laboratorio, que son necesarias para el diagnóstico definitivo. Pero aumentan el arsenal diagnóstico, a bajo costo.

Conclusión (qué más bien es un comentario de lo que nos sucedió en la práctica, cuando empezamos a ver estás células).

Falta mucho por saber de estas células; lo expuesto se desprende de nuestras observaciones. Cuando empezamos a detectar este tipo celular, nos alarmamos, pensamos más allá. Pero no podía ser posible que 6 u 8 pacientes recibidos el mismo día, tuvieran problemas medulares, además que los demás parámetros, no coincidían. Pero el aspecto inmaduro de estos linfocitos, alarma. Entonces, nos dimos cuenta que esos paciente llegaban con sospecha de Dengue por parte del médico. Revisamos bibliografía y en ninguna de ellas se relaciona a estas células con el Dengue. Entonces fue cuestión de observación y seguimiento a pacientes conocidos, incluso de nuestra familia. Coincidían. Luego, otro hallazgo: Cuando hay Dengue, 3 a 5 días después del comienzo de las manifestaciones clínicas, aparecen los “Linfocitos Reactivos”. Por ello, empezamos a guardar laminillas teñidas, recopilando entre 50 a 60, las más representativas del año 2007. Actualmente, algunos Laboratorios locales reportan estas células. Sin embargo, unos les ponen un nombre y otros, otro. De ahí que, primero, es indispensable que alguien, con los suficientes conocimientos y el equipo necesario, caracterice inmunofenotípicamente a estas confusas células azules. Esto aclara la biología de estas células además de determinar si existe correlación con nuestras apreciaciones, de acuerdo con los mecanismos biológicos de la respuesta inmune, llegando quizá a la conclusión de que estas células son resultado de dicha respuesta. Y por lo tanto, específicas de un cuadro de Dengue.

BIBLIOGRAFÍA.1.- Balcells A.1997. El Laboratorio y la Clínica. 17 edición. Masson. Pag. 626.2.- Roitt I.1997. Inmunología, fundamentos. Pag. 26-197.3.- Gil JL. 2003. Hematología sin Microscopio. Pags. 184-1854.- Heckner/Freund. 1997. Atlas de Hematología. 9na edición. Marban SL. Pag. 33 fig. 27 c.

Pérez-Norica G y Pérez-Castro RG. MedLab 2013; Año 5 (1): 29-30

Las presentaciones se harán en forma de conferencias, ponencias orales y carteles.Los autores deben indicar la forma preferida de presentación pero el Comité Científico se reserva el derecho de tomar una decisión final.

• Normas para la preparación del Resumen:

• Se aceptan resúmenes en español o inglés.

• El formato de páginas es Carta (Letter), con márgenes superior e inferior, derecho e izquierdo de 20 mm.

• El título se escribirá comenzando a partir de la cuarta línea, alineado a la izquierda, en negritas, tamaño 14 puntos.El texto estará justificado, tamaño 12 puntos a un espacio. La fuente a emplear será Times New Roman.

• El nombre de los autores se ubicará en la segunda línea después del título, justificado a la izquierda, subrayando el nombre del autor principal.

• Las afiliaciones y direcciones de correos, se escribirán en la segunda línea, después de los autores, con margen justificado a la izquierda. Se debe incluir la dirección de correo electrónico. El resumen tendrá como máximo 250 palabras y se podrán incluir ecuaciones, figuras y referencias actualizadas.

• La Fecha límite para el envío del resumen y del Formulario de Solicitud de Participación será el 8 de Febrero del 2013. El envío del texto del trabajo completo se establecerá por el Comité Científico en la próxima circular del evento, siendo de conocimiento por todos los participantes.

• El autor recibirá un mensaje por correo electrónico confirmando la recepción del Resumen y del Formulario de Solicitud de Participación así como será notificado acerca de la aceptación final de su trabajo.

Importante:El Formulario de Solicitud de Participación en el Evento sin el resumen o viceversa no se considerará.Por favor, use solamente la vía del e-mail para el envío del resumen y de los trabajos.

OTRAS INFORMACIONES

Colegiatura para profesionales y para estudiantesEl precio de inscripción para delegados será de 200 CUC y para estudiantes* será de 130 CUC.*Postgrado en Cuba con previa presentación de docu-mentación que lo acredite como tal.Para presentaciones de pósters electrónicos sin la pre-sencia del autor, 80 CUC.

Actividades colaterales (cursos pre-eventos)Durante el desarrollo del Simposio se impartirán cursos pre-eventos por importantes y renombrados especialistas en las temáticas afines del evento.

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V S I M P O S I O I N T E R N A C I O N A L D E

Q U I M I C A ( S I Q ’ 1 3 )

P R I M E R A C I R C U L A R

INVITACIÓNLa Facultad de Química - Farmacia de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las de Villas y demás instituciones organizadoras le invitan cordialmente a asistir al Quinto Simposio Internacional de Química, que se efectuará del 4 al 7 de junio del 2013, en el Hotel Husa Cayo Santa María, en el centro de la isla de Cuba.

ALCANCECualquier tema relevante de la Química Pura y Aplicada, las Ciencias Farmacéuticas, la Ingeniería Química y el Medio Ambiente son importantes tópicos a tratar en este Quinto Simposio Internacional de Química. Se aceptan, además, otras investigacio-nes que interrelacionen estas ciencias.

COMITÉ ORGANIZADORPresidente:Dra. C. Neibys L. Casdelo GutiérrezDecana de la Facultad de Química y FarmaciaSecretaria Ejecutiva:Dra. C. Leisy Nieto ReyesVicedecano de Investigación y Postgrado:Dr. C. Luis R. Bravo Sánchez

COMITÉ ASESOR INTERNACIONALEl Simposio posee un Comité Asesor Internacional que se constituye previo a la misma, integrado por importantes personalidades del mundo científico y académico vinculado con estas ciencias. Este Comité Asesor Internacional está integrado por especialistas de América Latina, Europa y de nuestro propio país.

ORGANIZADORES DEL EVENTOSecretaria ejecutiva del Evento:Dra. C. Leisy Nieto Reyes / E-mail: lnieto@uclv.edu.cuPresidente de la Sociedad de Química Villa ClaraDr. C. Luis R. Bravo Sánchez / E-mail: lbravo@uclv.edu.cuOficina de Gestión de EventosYldelisa Pérez González / Teléfonos: 53 42 281528 / E-mail: yldelisa@uclv.edu.cu

Facultad de Química y Farmacia, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas.Carretera a Camajuaní Km.5 ½ Santa Clara, Villa Clara C.P. 54830Teléfonos: 53 42 281164, 53 42 211825, 53 42 211826 y Fax: 53 42 281449