ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA

Servei de Microbiologia.

Hospital Universitari Germans Trias i Pujol

Introducción

8 millones de nuevos casos cada año,

el 95% en paises en vías de desarrollo

2 millones de personas mueren anualmente

1/3 de la población mundial está infectada

Relación huésped-parásito

Llegada de M.tuberculosis a los alveolos pulmonares donde es fagocitado por los macrófagos alveolares.

El bacilo es capaz de multiplicarse en el fagosoma y destruir posteriormente al macrófago.

Los macrófagos segregan citocinas que atraen neutrófilos, linfocitos y macrófagos para que fagociten bacilos extracelulares, así como para generar un foco inflamatorio.

Relación huésped-parásito

Los linfocitos T CD4 específicos se transforman en linfocitos Th1 bajo la influencia de IL-12 secretada por los macrófagos.

Th1 segrega TNF- que permiten la llegada de más macrófagos, e IFN- que activa a los que están infectados.

Relación huésped-parásito

Los linfocitos T también segregan IFN- para activar macrófagos e IL-12 para que proliferen Th1.

El macrófago sintetiza IL-12 que estimula a las cél NK que también sintetizan IFN-.

Relación huésped-parásito

El IFN- es la citocina efectora clave en el control de la infección micobacteriana mediante la activación de los macrófagos.

IFN- es la citocina esencial en el desarrollo de la inmunidad protectora contra M. tuberculosis.

En combinación con TNF- consigue unos efectos bactericidas del 90% de la concentración bacilar en los tejidos.

Relación huésped-parásito

Sin embargo, mientras se desencadena esta RI innata, los bacilos se van diseminando hacia los nódulos linfáticos regionales y los vasos sanguíneos.

La RI específica consta no tan sólo de la proliferación de T CD4, sino también del estímulo de una sensibilidad retardada tipo IV (que se pone de manifiesto mediante TST).

Relación huésped-parásito

En un 5% puede originarse una enfermedad primaria.

Pero, en un 95% de los casos suele resolverse el complejo primario, quedando M. tuberculosis en estado latente.

En un 5% de estos casos, puede originarse una enfermedad posprimaria de reactivación durante toda la vida del huésped.

Objetivos propuestos paracontrolar la tuberculosis

Pautas antibióticas más cortas y con menos efectos secundarios

Una vacuna eficaz y accesible a toda la población

Métodos diagnósticos rápidos, sensibles y específicos

Métodos diagnósticos

Un diagnóstico rápido y fiable de la tuberculosis constituye un elemento fundamental en las medidas de control de la enfermedad.

Los métodos microbiológicos de referencia en el diagnóstico de la TB continúan siendo el examen microscópico, cultivo y aislamiento de M. tuberculosis y la detección de sus ácidos nucleicos.

Métodos diagnósticos

Se requiere de métodos diagnósticos para la detección de pacientes con el bacilo latente.

Las personas infectadas con el microorganismo latente representan un peligro potencial de nuevos casos de TB.

La única manera de controlar la TB es interrumpir la cadena de infección.

Tuberculina

La tuberculina (TST) es una prueba de intradermoreacción que permite la detección de individuos infectados:

Evitando el paso de infección a enfermedad. Rompiendo la cadena de transmisión.

Tuberculina

Evalúa la hipersensibilidad retardada que determinados compuestos antigénicos del bacilo provocan en el infectado.

La tuberculina se obtiene del filtrado del cultivo de M. tuberculosis esterilizado y concentrado. Actualmente está constituido por un derivado proteico purificado (PPD).

Respuesta inflamatoria.Infiltración perivascular

linfomonocitaria.

Induraciónvisible y palpable.

Liberación citocinas

Célula T

CPA

Tuberculina

Tuberculina

Inconvenientes Tuberculina

Algunos de los constituyentes proteicos del PPD son compartidos por micobacterias ambientales y por el bacilo vacunal (BCG).

Falta de respuesta en pacientes con alteraciones de la inmunidad celular.

Errores en la administración y subjetividad en la interpretación de los resultados.

Visita de lectura. Conmoción social.

IFN- testNueva estrategia en el diagnóstico de la infección latente

Basándose en el fundamento de la tuberculina se han diseñado nuevas estrategias in vitro para evidenciar la sensibilización de las células T.

Se han empleado diferentes antígenos micobacterianos para la estimulación de las células.

Revelar la sensibilización mediante detección de IFN-.

Fundamento de la tecnología

Fundamento de la tecnología

Determinacíon IFN-

LiberaciónIFN-

Célula T CPA

Estimulaciónantigénica

Principales antígenos evaluados

PPD

ESAT-6 y CFP10

Resultados empleando PPD como antígeno

Autor TST NEG TST POS TBC BCG

Converse.1997

54 89-100 - -

Streeton.1998

98 90 83 -

Pottumarthy.1999 89-81-81 64-67-86 77 -

Katial. 2001 80 80 - -

Mazurek.2001

83 78 43

Bellete.2002

85 - 71 -

67 ADVP. HIV pos y neg.

Mayor concordancia TST y IFN- test en HIV positivos

952 voluntarios

455 individuos.G1: InmigrantesG2: Personal SanitarioG3: TBC activaNo diferencias en extrapulmonar vspulmonar ni si baciloscopia positiva

Personal sanitario.

20 TST +, 20 TST -

1226 adultos.390 TST + / 349 IFN- test +TST + / IFN- test -. 7x en vacunados

253 voluntarios Etiopia.

35% concordancia TST y IFN- test

175 Baltimore.

68 % concordancia TST y IFN- test

ESAT-6 y CFP-10

Early Secretory Antigen Target-6. Culture Filtrate Protein 10. Proteínas secretadas por M.tuberculosis

complex. No está presente en la mayoría de

micobacterias ambientales. No está presente en el bacilo vacunal

(BCG).

Especificidad de ESAT-6 y CFP-10

Micobacterias ambientales

Antígenos

ESAT CFP

M abcessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonii - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M oenavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -

Tuberculosis complex

Antígenos

ESAT CFP

M tuberculosis + +

M africanum + +

M bovis + +

BCG substrain    

gothenburg - -

moreau - -

tice - -

tokyo - -

danish - -

glaxo - -

montreal - -

pasteur - -

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Autores TST NEG TST POS TBC BCG

Ravn.1999

0 65 32’35 6’9

Arend.2000

0 75 92 36

Lalvani.2001

33’8 84 96 1’6

8 péptidos sintéticos de ESAT-6.Células mononucleares. ELISA.Dinamarca.Etiopia.TB: 11/34 (32,5%)Contactos con TB: 14/30 (46’6%)

ESAT 6 recombinante.Células mononucleares. ELISAHª consistente con LTBI en presencia de inmunidad

8 péptidos sínteticos de ESAT-6.Células mononucleares. ELISPOT.En supuestos TST neg: 3 pos/11 (33’8%)

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Pathan A et al. 2001. J. Immunol. 2001. Control no expuesto: 0% Convivientes expuestos: 85% TBC pulmonar: 88-92% La frecuencia de linfocitos T antígeno

específico (ESAT-6) disminuyen con el tratamiento.

Infección Enfermedad TIEMPO

RESPUESTA

IFN-

Carga Micobacteriana

Efecto tratamiento en IFN-

TST

Rx

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Doherty T et al. J. Clin. Microbiol. 2002. Convivientes expuestos (24). Seguimiento de 2 años. Desarrollaron TBC (7):

TST pos (7), IFN- test pos (6)

No desarrollaron TBC (17): TST pos (14), IFN- test pos (3)

Indicador de riesgo de progresión a TBC.

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Arend S. et al. J. Infect. Dis. 2002

Grupo ESAT-6 TST POS

M. marinum 5/7 3/5

M. kansasii 4/5 2/4

Alta exposiciónmicobacteriasambientales

12/18 0/18

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Cardoso F.L. et al. Infect. Immun. 2002. Resultados positivos del IFN- test:

60% TBC 50% Leprosos 60% Pacientes control 59% Vacunados (todos TST pos)

36% de similitud de la ESAT-6 de M.tuberculosis y M.leprae.

Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

Ewer K et al. Lancet. 2003. ESAT-6 recombinante y 12 pools de proteínas

derivadas del ESAT-6 y CFP-10 89% de concordancia con la tuberculina. Correlaciona mejor que la tuberculina con

exposición a M.tuberculosis en términos de tiempo (p=0.007) y proximidad (p=0.03).

No correlación con vacunados con BCG (p=0.44).

Estudios comparativos PPD y ESAT-6

Autores TST NEG TST POS TBC BCG

PPD 3’4 - 63 20’37Johnson.

1999ESAT-6 0 - 58 0

PPD 0 - 78 47Brock.2001

ESAT-6 0 - 78 10’5

Vacuna a 60 estudiantes de Medicina.ESAT-6: Sangre total y ELISA

ESAT-6: Sangre total y ELISA19 Vacunados: 9 + por PPD y 2 + por ESAT-6

Métodos in vitro estandarizados

QuantiFERON-TB Gold

ELISPOT

QuantiFERON-TB Gold

El QuantiFERON- TB Gold (QFN) es un método basado en la estimulación de sangre total mediante ESAT-6 y CFP-10.

Determinación de la síntesis de IFN- por las células T sensibilizadas mediante técnica de ELISA.

Extracción Incubar overnigth a 37oC

Los individuos infectados por TB responden secretando IFN-

Fase 1: Estimulación linfocitos T

ESAT-6 CFP-10 MitogenControl

Transferir sangre total sin diluiren los pocillos de una placa de cultivo y añadir antígenos.

Tiempo límitepara el procesamiento

de la muestra: 12 horas

NilControl

Recoger el plasma del Recoger el plasma del sobrenadante de las células sobrenadante de las células

e incubar 120 min en un e incubar 120 min en un ELISA tipo ‘Sandwich’ELISA tipo ‘Sandwich’

Lavar, añadir Substrato, Lavar, añadir Substrato, incubar 30 minincubar 30 min

y parar la reaccióny parar la reacción

TMBTMB

COLORCOLOR

Fase 2: Determinación de IFN-

Determinación niveles de IFN-Determinación niveles de IFN-

IFN- IU/ml

OD

45

0n

mO

D 4

50

nm

Curva StandardCurva Standard

ELISPOT

Método basado en la estimulación de células monocíticas extraidas de sangre periférica mediante la proteína ESAT-6.

Determinación de la síntesis de IFN- por las células sensibilizadas mediante técnica de ELISPOT.

ELISPOT

Anticuerpos específicos fijados a membrana

Medio de cultivo con células y el antígeno

ELISPOT

24-28 horas a 37ºC. CO2

ELISPOT

- Anticuerpo secundario. 2’5h. TA. Humedad.- Streptavidina-HRP. 2h. TA

ELISPOT

- Añadir sustrato cromogénico.- Incubar 15-70’ a TA.

Lectura de los resultados

Se considera positivo si el pocillo de la muestra contiene una media de 5 spot-forming cells más que el control negativo.

CDC Guidelines para la utilización del QFN

El test de la tuberculina y el QFN no detectan los mismo componentes de la respuesta inmune.

Debe ser utilizado en laboratorios con experiencia en el test.

Grupo depacientes

Población TestResultados

positivos

Sospecha de TBPersonas con sintomas deTB activa

Tuberculina.QFN no

recomendado

5 mm

Contactos frecuentes.RX TB antigua. HIV.Immunosuprimidos

Tuberculina.QFN no

recomendado

5 mm

Elevado riesgode progresiónhacia TB activa

Diabetes, silicosis, Fallorenal crónico. Leucemia.Linfomas. Otras neoplasias.Gastrectomia. Bypassintestinal. Pérdida superioral 10% del peso ideal

Tuberculina.QFN no

recomendado

10 mm

Riesgo elevadode TB latente

Inmigrantes recientes.ADVP. Personal laboral yresidentes de colectivos deriesgo para propagación deTB.

Tuberculina oQFN

10 mm%RT 15

Otras razonesen personas debajo riesgo deTB latente

Sin factores de riesgo paradesarrollar TB nipertenecientes a grupos conalta prevalencia de TB

Tuberculina oQFN

15 mm% RT 30

RecomendacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN

Utilización Personas con elevado riesgo de

infección latente. Personas con bajo riesgo de infección

tuberculosa y sin factores predisponentes.

RecomendacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN

Confirmación del resultado de QFN Bajo riesgo: QFN pos requiere

confirmación por tuberculina. Si TST neg no quimioprofilaxis.

Alto riesgo: QFN pos requiere confirmación por tuberculina. Si TST neg, quimioprofilaxis a juicio clínico.

QFN neg no requiere confirmación.

ContraindicacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN

En personas con sospecha de TB activa. En estudio de contactos de tuberculosos. Niños y jóvenes < 17 a., embarazadas, o

personas con patologías subyacentes que aumenten el riesgo de progresión a TB.

No test confirmatorio de la tuberculina.

Ventajas de esta tecnología

No subjetividad en la interpretación. Posibilidad de repetir determinaciones. Resultados rápidos. Se elimina la visita de lectura. Controles de falta de respuesta inmune. De fácil estandarización. No interferencia con la vacuna BCG.

Antígenos lipídicos y glicolipídicos Ulrichs T. et al. 2003

Se ha descrito un subtipo de cél T dependientes de moléculas CD1. Estas moléculas presentan antigenos lípidos y glicolipídicos. Las T que reconocen estos antígenos también producen IFN-.

Mayor respuesta frente a estos antígenos en individuos TST pos que en TST neg.

Mayor respuesta en tuberculosos a las dos semanas de tratamiento que en el momento del diagnóstico.

Conclusiones finales

La detección de la infección tuberculosa mediante el test de la tuberculina es imperfecta.

Se han realizado esfuerzos para la estandarización de técnicas in vitro basadas en la respuesta inmunológica del huésped frente al patógeno.

Conclusiones finales

Las técnicas actualmente disponibles se muestran como una posible alternativa al test de la tuberculina.

Las investigaciones han de ir encaminadas a identificar nuevos antígenos específicos de M.tuberculosis para desarrollar técnicas in vitro para el diagnóstico de la infección tuberculosa aún más eficaces.

Conclusiones finales

Los nuevos tests no sólo deben discriminar entre individuos sensibilizados de pacientes vacunados con BCG y infectados con micobacterias ambientales, sino también de cualquier potencial nueva vacuna contra la TB.

En el futuro próximo quizás dispongamos de una técnica de laboratorio que sustituya al TST en el control de la TB.