0.11

QII

0.11

j

~ .. 0.11

0.1J ~ 0.00

BJ8IlO c.._,,!. c.IuIos. Poj.

So...,

Figura 16. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 Y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.

Actividad de Glucosidasa

En todos los tratamientos analizados se observó actividad ~ - glucosidasa cuyos

valores presentaron una distribución normal. La máxima actividad ~ - glucosidasas

se registró a pH = 6.0 Y temperatura de 50 oC. A pH 6 Y 40°C, se observaron

actividades enzimáticas similares entre paja y celulosa las cuales fueron

significativamente mayores que las de Bagazo mientras que a 50°C y pH 6.5, la

celulosa cristalina presentó mayor actividad enzimática que paja y esta a su vez

fue mayor que las de Bagazo. Estas diferencias fueron corroboradas por el

análisis estadístico.

53

I 12

10

8 /\:J 6 , \

E

4 ~---+----. 2

o +-----.-----.-----.-----.-----,,----~ 4 5 6 7 8 9 10

-+-- Celulosa p~ Bagazo 1 I Paja cascaU

Figura 17. Efecto del pH sobre la actividad f3,-glucosidasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en

celulosa cristalina y tres residuos de cosecha .

=

j• j

Figura 18. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.

54

12 ~---------------

10

8

~~ 20 30 40 50 60 70

Temperatura - oc

-+-- Celulosa - Bagazo Paja ~ Cascarilla ~==~---~-----=~

Figura 19. Efecto de la temperatura sobre la actividad ~-glucosidasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha.

no

70

~.o

s......

Figura 20. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH ..6-.(acri ba} V. 50°C oc (aba~ en los diferentes sustratos evaluados.

55

5.4. Estabilidad de extracto enzimático con la temperatura

Las tres actividades enzimáticas se conservaron a temperatura entre O-5°C, sin

embargo, a 40°C, el 50% de las actividades enzimáticas disminuyó

aproximadamente a las 48 horas (exoglucanasa) y 50 horas (endoglucanasa y

B-glucosidasa) y en solo 12 horas a 50°C.

Endoglucanasa

20

15 E

10 :::l

E 5

O

O 24 48 72 96

Horas

-+- Celulasa-:')O°C _ Celulasa-4Q°C Celulasa 0-5°C

Exoglucanasa

0,2

0,15

E- 0,1

:::l 0.05

O

O 24 48 72 96

Horas

[-+-CMc-asa 50°C _ CMC-asa 4Q°C I CMC-asa 0-5°C

B-Glucanasa

12

10 E 8

::::1 4E 2 o

o 24 48 72 96

Horas

-+- b-Glucosi.50°C - b-GIUCOS_i. 4Q°C J b-Glucosi. 0-5°C

Figura Estabilidad de los extractos enzimáticos celulolíticos con la temperatura.

56

DISCUSiÓN

Aislamiento de hongos anaerobios

Las metodologías previamente descritas resultaron útiles para el aislamiento,

purificación y mantenimiento de cultivos de hongos anaerobios de ganado

criollo BON , con pocas modificaciones.

La inspección visual de la masa fúngica , mostró que los repiques de los

cultivos deben hacerse entre el cuarto y sexto día, además de la toma de

porciones de la periferia, porque son más jóvenes y viables . Los repiques

que se realizaron a partir de medios de cultivo más viejos perdieron

viabilidad o simplemente no crecieron. Estas observaciones están apoyados

por los datos derivados de las curvas de crecimiento en los diferentes

sustratos en donde se evidenció que la fase estacionaria se alcanzó entre el

tercer y cuarto días, excepto en el caso de la celulosa cristalina en donde la

fase estacionaria se alcanzó al quinto día .

Estos resultados son congruentes con los trabajos de Bauchop 1991;

Teunissen M.J . et al 1992; Lowe S. E. Et al 1987 quienes reportan repiques

entre 3-6 días, para diferentes hongos ruminales cultivados en medios

suplementados con salvado de trigo, fibras de sisal , tiras de papel, entre

otros.

En este trabajo también se encontró que la agitación en algunos periodos del

día estimuló el crecimiento fúngico tal vez porque la agitación puede generar

disrupción de la masa fúngica y facilitar la reproducción por fragmentación

miceliar. Resultados similares fueron reportados por Ha Y. W. y Bauchop T.

(1991).

Los aislados mantenidos por repiques sucesivos entre 5 y 6 días

conservaron su viabilidad durante un año, tiempo tras el cual se observó una

57

pérdida de su capacidad para realizar esporangiogénesis y

zoosporogénesis. Esto sugiere la necesidad de utilizar métodos tales como

criopreservación, para mantener intactas las características fisiológicas del

hongo incluyendo la capacidad celulolítica .

Los aislamientos de hongos mostraron no solo variaciones morfológicas

marcadas sino también un comportamiento replicativo diferente en el medio

de mantenimiento utilizado en este trabajo. Solo cinco colonias fueron

analizadas para evaluar su capacidad de hacer esporangiogénesis y

zoosporogénesis en medios suplementados en residuos de cosecha y solo a

uno de ellos se les evaluó la capacidad celulolítica en estos medios.

Esporangiogénesis

De los cinco hongos utilizados para la inducción de esporangiogénesis en

diferentes sustratos, solo tres desarrollaron esporangios después de una

preincubación de 4 o 5 días en el medio de mantenimiento (paja o glucosa) y

repique en medio fresco. Debido a que la esporangiogénesis no se presentó

en cultivos que no fueron repicados a medio fresco, es probable que los

nutrientes del medio se hayan agotado durante este período de incubación.

Otra explicación probable es que se acumulen productos 'flnales de la

fermentación, reprimiéndose el desarrollo del microorganismo, de tal manera

que la transferencia a un medio fresco facilita el desarrollo de esporangios.

Ambas ideas están apoyadas por la observación de que el hongo HAR­

HARBR-1 alcanza la fase estacionaria hacia el cuarto día cuando se cultiva

en medio suplementado con glucosa/celobiosa (figura 7) .

58

En este trabajo, la glucosa resultó ser un buen inductor de

esporangiogénesis en contraste con la Celobiosa. Esto puede deberse a la

biodisponibilidad de este azúcar soluble, el cual puede ser utilizado

rápidamente en la glicólisis, mientras que el disacárido celobiosa debe

hidrolizar su enlace ~1-4 antes de ingresar a las vías metabólicas.

Sin embargo, teniendo en cuenta que en la mezcla Glucosa/Celobiosa, la

esporangiogénesis es también menor que en el medio suplementado

únicamente con Glucosa, es posible que la glucosa juegue un papel inductor

más que nutricional en la esporangiogénesis, aún cuando no puede

descartarse la posibilidad de que haya competencia en el transporte

intracelular de estos dos metabolitos.

El hongo HARBR-1 tiene la habilidad de realizar esporangiogénesis y

zoosporogénesis en los medios de Paja de Arroz y Bagazo de Caña . Estos

resultados sugieren que la composición química de estos dos residuos de

cosecha debe jugar un papel importante en el desarrollo de esporangios y la

liberación de zoosporas. Algunos reportes han propuesto que la sílice, el cual

es un componente común en estos dos sustratos, incrementa la digestibilidad

de los tejidos lignificados y probablemente esto explica la habilidad de los

hongos estudiados para crecer en estos medios de cultivo. Además ambos

sustratos presentan un contenido de proteínas que serían una de las fuentes

de compuestos nitrogenados, requeridos para la síntesis proteica del hongo.

A pesar de lo anterior, el bagazo de caña no resulta ser un buen medio para

inducir esporangiogénesis en 4 de los hongos evaluados, mientas que en la

Paja de Arroz, fue posible lograr la esporangiogénesis en 3 de los

aislamientos analizados cuando los hongos venían creciendo en paja de

Arroz y solo en dos cuando crecieron previamente en Glucosa.

59

La composición de los medios de cultivos, no parece ser el único factor

importante en la inducción de la esporangiogénesis y la zoosporogénesis,

sino también la capacidad del hongo para responder a sus componentes.

Esta idea está apoyada por la observación de que algunos hongos fueron

incapaces de liberar zoosporas en medios que contenían hemina, la cual es

considerada como un potente inductor de zoosporogénesis.

La implicación de la biología del hongo en la inducción de la zoosporogénesis

también fue encontrada por Ho y Bauchop en 1991, quienes observaron que

los hongos policéntricos pueden propagarse principalmente por hifas, en

ausencia de zoosporas, a diferencia de las especies monocéntricas.

En relación con la morfología de los esporangios, el aislamiento HARBR-2

presenta formas características de la especie Piromyces communis mientras

que los aislamientos HARBR-1 y HARBR-3 son más compatibles con la

especie monocéntrica Neocalimasfix fronfalis. Sin embargo, la ausencia de

zoosporogénesis de HARBR-3 en los medios hasta ahora evaluados no

descartan la posibilidad de que pueda corresponder a otro género.

En efecto, se requieren estudios morfológicos adicionales con microscopia

electrónica que permitan analizar la presencia de otras características

morfológicas de interés taxonómico y establecer sus relaciones filogenéticas

con otros hongos ruminales mediante el análisis de secuencias de DNA.

A pesar de lo anterior, algunas observaciones como la formación regular y

abundante de esporangios, la existencia de varios flagelos en las zoosporas

de HARBR-1, la zoosporogenesis regular, la forma y tamaño de las

zoosporas, la forma y tamaño de las colonias fúngicas y el aspecto

filamentoso de sus rizoides, sugieren que el aislado HARBR-1 pertenece al

género Neocallimastix, especie frontalis (Ho Y. W . and Bauchop T. 1991; Ho

y. W. and Barr S. J. 1995). Desafortunadamente, en el presente trabajo, no

60

61

se obtuvo DNA fúngico con los protocolos de extracción utilizados y por tal

razón no fue posible hacer una aproximación desde la identificación

molecular.

Aislamiento de DNA, diseño y evaluación de cebadores

Ninguno de los protocolos evaluados fue realmente efectivo para el

aislamiento de DNA. La mayoría de trabajos desarrollados hasta la fecha

utilizan protocolos que incluyen bolitas de zirconio para la extracción de DNA.

En este trabajo se ensayaron metodologías alternativas para el rompimiento

de pared celular pero ninguno de los 9 protocolos (y sus modificaciones)

evaluados para la extracción de DNA (Anexo), resultaron útiles en nuestros

aislados nativos. De hecho, de los protocolos analizados, solo uno permitió la

obtención no reproducible de DNA, el cual no resultó útil para la obtención de

amplificados por peR.

Al parecer, el carácter refractario de estos microorganismos no solo dependel¡ de la habilidad de los protocolos para romper la pared celular, sino también

de una gran cantidad de polisacáridos presentes en estos organismos. Lo

anterior sugiere el uso de protocolos de extracción que tengan en cuenta

estos dos aspectos en estudios posteriores.

Una dificultad adicional en la parte experimental, es que no logramos (.

encontrar cepas de referencia de estos hongos en diferentes casas

comerciales, lo cual limitó seriamente la estandarización de técnicas de

aislamiento de DNA y los ensayos de amplificación.

En cuanto al diseño de cebadores, se encontró que de los géneros

analizados, solo Piromyces presenta una región diagnóstica en la secuencia

bajo estudio. Este resultado contrasta con el trabajo de Brookman et al.,

62

2000, en el que se publicó una región diagnóstica para Neocallimastix en la

secuencia ITS 1.

Los análisis Blast realizados en este trabajo, demostraron que la secuencia J de Brookman et al., en el 2000, estaba también presente en secuencias ITS1

de los géneros ruminales Anaeromyces y Caecomyces (Fliegerova, et al

2003), las cuales fueron incluidas en la base de datos en los últimos tres

años (Anexo 4). Estos resultados indican que la secuencia de Brookman et

al., 2000, no constituye en la actualidad una región diagnóstica para el

género Neocallimastix y sugiere la revisión constante de secuencias que

están continuamente actualizándose en las bases de datos.

Teniendo en cuenta lo anterior, la mejor manera de establecer la identidad

de aislamientos nativos de hongos anaerobios ruminales probablemente sea

a través del secuenciamiento de la región ITS-1, 5.8S e ITS-2 y posterior

determinación de su relación filogenética con las secuencias previamente

reportadas en las bases de datos. La secuenciación de los fragmentos de

interés puede realizarse con los cebadores (5«-TGTACACACCGCCCGTC­

3« y GM2: 5«-CTGCGTTCTTCATCGAT-3«) y condiciones de amplificación

reportados por Li y Heath (1992).

Método de evaluación de la cinética proliferativa del hongo HAR­

HARBR-1

Entre los métodos evaluados para medir el crecimiento fúngico, el que

presentó mayor sensibilidad y exactitud fue la cuanti'ficación de la

concentración de formiato. Aun cuando, la medición del gas total formado, es

también una excelente forma de evaluar el crecimiento fúngico, la utilización

de una jeringa para la medición del volumen, no es recomendable, por

63

constituirse en un procedimiento semicuantitativo muy susceptible de errores

especialmente en las primeras horas del crecimiento.

Sin embargo, el uso de un dispositivo medidor de presión (paralelo a la

medición del volumen desalojado), genera resultados cuantitativos en un

tiempo mínimo y reproducibles, además que es de bajo costo y puede ser

adquirido por laboratorios microbiológicos, que en general no cuentan con el

recurso de la cromatografía (Theodorou M. K. et al 1995).

A pesar de que el método de medición de la masa fúngica mostró cambios

en la cinética de crecimiento, no resultó ser tan preciso debido a las

dificultades para discriminar entre la pérdida aparente de sustrato complejo y

el pequeño aumento de la masa fúngica. Este método probablemente es

más útil en experimentos realizados en volúmenes mayores en donde los

cambios de peso en la masa fúngica son también mayores.

Cinética de crecimiento del hongo HARBR-1 en diferentes sustratos

El mayor crecimiento de HARBR-1 se alcanzó en la celulosa cristalina,

seguida de bagazo de caña y paja de arroz, mientras que en la cascarilla de

café la cinética de crecimiento fue bastante lenta. Es importante anotar que

en ninguno de los medios ensayados hubo degradación significativa del

sustrato, excepto en el caso de tirillas de papel Whatman utilizadas en las

primeras etapas de la investigación como sustratos de mantenimiento, las

cuales no son tan recalcitrantes como los otros sustratos evaluados.

Tres situaciones podrían explicar los resultados anteriores:

(1) La accesibilidad de estos sustratos a los complejos enzimáticos. A pesar

de su carácter refractario, la celulosa cristalina presenta una estructura

relativamente homogénea en comparación con los sustratos complejos en

64

donde los componentes de las paredes celulares están imbricados en redes

tridimensionales de menor accesibilidad a la hidrólisis enzimática. Esta idea

fue sugerida previamente por Percival Zhang Yi-Heng and Lynd Lee R.,

(2004).

(2) Presencia de sustancias inhibitorias del crecimiento en los sustratos

complejos evaluados. A diferencia de la celulosa cristalina, los sustratos

complejos poseen además de la celulosa nativa, sustancias fenólicas u otras

sustancias cuyo metabolismo puede dar lugar a compuestos fenólicos las

cuales presentan efecto inhibitorio del crecimiento fúngico (Fujii Simone, et

al. 2004; Weimer Paul J. et al. 1993; Palmqvist E. and Han-hagerdal B.

2000). Esta situación es especialmente importante para la cascarilla de café,

un sustrato en el cual se ha reportado la presencia de compuestos

polifenólicos como los taninos.

(3) Concentración de celulosa en el sustrato complejo. Para hacer

comparables los tratamientos, en el presente trabajo se utilizaron las mismas

concentraciones de los residuos de cosecha que de celulosa cristalina. Sin

embargo, considerando que las paredes celulares son matrices complejas

en donde la celulosa es solo un componente, es factible pensar que su

concentración en las paredes es menor que la de la celulosa cristalina pura.

Actividad enzimática

Las actividades exoglucanasa y endoglucanasa no presentaron diferencias

estadísticamente significativas entre los filtrados del hongo cultivado en paja

de arroz, bagazo de caña y celulosa cristalina. Estos resultados sugieren

que la paja de arroz y el bagazo de caña son buenos inductores de las

actividades enzimáticas evaluadas, las cuales se requieren para que el

~---.

65

microorganismo pueda utilizar estos sustratos complejos como fuentes de

carbono.

Las actividades p-glucosidasa por el contrario, presentaron diferencias

significativas dependiendo de la temperatura y el pH. Por ejemplo, a 40°C y

pH 6.0, las actividades enzimáticas de la p-glucosidasa detectadas en la

paja de arroz, fueron similares a las encontradas en celulosa cristalina,

mientras que a 50°C y pH 6.5, se encontraron diferencias significativas entre

estos dos sustratos siendo mayor en celulosa cristalina. Estos resultados

reflejan la necesidad de adelantar estudios de optimización de medios de

cultivo.

Tanto en paja de arroz como en celulosa cristalina se presentaron

actividades p-glucosidasa mayores que en bagazo de caña. Las diferencias

en estas actividades podrían marcar diferencias en la escogencia de medios

de cultivo económicos.; sin embargo, es importante resaltar que el medio de

mantenimiento del aislado HARBR-1 estaba suplementado con paja de

arroz, lo que podría conferirle ventajas como consecuencia de su adaptación

a este medio de cultivo. En tal sentido es necesario ensayar la actividad

celulolítica a partir de zoosporas liberadas por el hongo cultivado y adaptado

a cada sustrato de ensayo.

En paja de arroz, la actividad exoglucanasa obtenida en el presente estudio

(0.025 Ullml) fue mayor que la reportada por Lowe en 1997 para

Neocallimastix cultivado en paja de trigo (0.01 Ullml). Sin embargo, la

actividad endoglucanasa fue ligeramente menor y la p-glucosidasa bastante

menor, en comparación con el mismo trabajo. Un comportamiento similar se

observó en bagazo de caña, aun cuando en este caso los valores de

actividad enzimática fueron ligeramente menores excepto en el caso de la p­