ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFOMANOSA...
95
1 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFOMANOSA ISOMERASA EN UN GRUPO CONTROL (n 32) DE 0,6-27 AÑOS DE BOGOTÁ-COLOMBIA. JHOAN ANDRES SAMACÁ MARTÍN UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUÍMICA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR BOGOTÁ D.C 2017
Transcript of ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFOMANOSA...
1
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFOMANOSA ISOMERASA EN UN GRUPO
CONTROL (n 32) DE 0,6-27 AÑOS DE BOGOTÁ-COLOMBIA.
JHOAN ANDRES SAMACÁ MARTÍN
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUÍMICA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
BOGOTÁ D.C
2017
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFOMANOSA ISOMERASA EN UN GRUPO
CONTROL (N 32) DE 0,6-27 AÑOS DE BOGOTÁ-COLOMBIA.
JHOAN ANDRES SAMACÁ MARTÍN
Trabajo de Grado
Para optar al título de Licenciado en Química
Director
ADIS AYALA FAJARDO MsSc. Biología énfasis Bioquímica
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUÍMICA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
BOGOTÁ D.C
2017
NOTA DE ACEPTACIÓN _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________
_______________________________ Jurado
_______________________________ Director
Julio de 2017
_____________________________________________________________________________
INDICE
Resumen del proyecto ....................................................................................................................... 11
1 Introducción. ........................................................................................................................ 1
2 Justificación ......................................................................................................................... 3
3 Antecedentes. ....................................................................................................................... 4
4 Objetivos. ............................................................................................................................. 6
4.1 General. ................................................................................................................................ 6
4.2 Específicos. .......................................................................................................................... 6
5 Marco de referencia. ............................................................................................................ 7
5.1 O-glicosilación. .................................................................................................................... 7
5.2 Mecanismo de O-glicosilación. ........................................................................................... 8
5.2.1 Defecto de O-glicosilación. .......................................................................................... 9
5.3 N-glicosilación. .................................................................................................................... 9
5.4 Síntesis de dolicol .............................................................................................................. 10
5.5 Síntesis del oligosacárido estándar o núcleo. ..................................................................... 15
5.6 Transferencia del oligosacárido estándar a la proteína. ..................................................... 17
5.7 Procesamiento de la cadena N-glicano. ............................................................................. 17
5.8 Defectos congénitos de la glicosilación CDGs. ................................................................. 20
5.9 Defectos en la síntesis de glicanos, CDG-I. ....................................................................... 21
5.10 Defectos de procesamiento de los oligosacáridos ligados a proteínas, CDG II. ................ 21
5.11 Deficiencia de Fosfomanosa isomerasa (E.C. 5. 3. 1. 8) CDG Ib...................................... 22
5.12 Patogénesis clínica de la CDG-Ib. ..................................................................................... 22
5.12.1 Fibrosis hepática. ....................................................................................................... 22
5.12.2 Enteropatía con pérdida proteica. ............................................................................... 23
5.12.3 Coagulopatía. ............................................................................................................. 24
5.13 Diagnóstico diferencial. ..................................................................................................... 25
5.14 Tratamiento. ....................................................................................................................... 25
5.15 Enfermedades espejo. ........................................................................................................ 26
5.15.1 Fibrosis hepática congénita. ....................................................................................... 27
5.15.2 Intolerancia hereditaria a la fructosa (HFI). ............................................................... 27
5.16 Gen MPI y mutaciones. ..................................................................................................... 28
5.17 Fosfomanosa isomerasa (PMI). ......................................................................................... 31
5.17.1 Tipos de PMI. ............................................................................................................. 31
5.17.2 Fosfomanosa isomerasa humana (hPMI). .................................................................. 31
5.17.3 Interacción del complejo hPMI con la M6P. ............................................................. 32
5.17.4 Mecanismo de acción (hPMI, E.C 5.3.1.8). ............................................................... 33
5.17.5 Inhibición de la PMI tipo I. ........................................................................................ 36
5.18 Actividad en fibroblastos y leucocitos. .............................................................................. 36
6 METODOLOGÍA. ............................................................................................................. 37
6.1 Recolección de muestras. ................................................................................................... 37
6.2 Procedimiento para obtención de leucocitos...................................................................... 37
6.2.1 Preparación dextrán-heparina. .................................................................................... 37
6.2.2 Preparación cloruro de sodio 1.7 % (p/v). .................................................................. 37
6.2.3 Obtención de leucocitos de sangre completa. ............................................................ 37
6.3 Lisado de leucocitos........................................................................................................... 38
6.3.1 Cuantificación de proteínas en leucocitos. ................................................................. 38
6.4 Preparación de enzimas: .................................................................................................... 39
6.4.1 Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (Sigma-G6378): ................................................... 39
6.4.2 Fosfoglucoisomerasa (Sigma-P9544): ....................................................................... 40
6.4.3 Cuantificación de PGI y G6PDH mediante el método BCA...................................... 40
6.5 Preparación buffer de lisis. ................................................................................................ 41
6.6 Preparación buffer de reacción. ......................................................................................... 41
6.6.1 Preparación de HEPES 100 mM pH 7,1. ................................................................... 41
6.6.2 Preparación buffer de reacción ensayo 1.................................................................... 42
6.6.3 Preparación buffer de reacción ensayo 2.................................................................... 42
6.6.4 Preparación del sustrato manosa-6-fosfato para los ensayos 1 y 2. ........................... 42
6.7 Preparación de la Fosfomanosa isomerasa para el ensayo enzimático. ............................. 42
6.8 Protocolo para la determinación de la actividad enzimática de la Fosfomanosa isomerasa
(PMI).................................................................................................................................. 42
6.9 Cálculo de actividad enzimática de la enzima Fosfomanosa isomerasa. ........................... 44
6.10 Curva de progreso de actividad enzimática contra el tiempo. ........................................... 45
6.11 Ensayo de estabilidad del buffer de reacción. .................................................................... 45
6.12 Análisis estadístico de la actividad enzimática específica de la fosfomanosa isomerasa del
grupo control. ..................................................................................................................... 45
6.12.1 Análisis estadístico de los valores de la enzima fosfomanosa isomerasa por género. ...
................................................................................................................................... 46
6.12.2 Análisis de la actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa por edad. ............. 46
6.12.3 Determinación de los valores de referencia de actividad de la enzima PMI para el
grupo de control. ........................................................................................................ 48
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ...................................................................................... 48
7.1 Recolección de muestras. ................................................................................................... 48
7.2 Cuantificación de proteínas en leucocitos.......................................................................... 48
7.3 Cuantificación de proteínas de PGI y G6PDH por el método de ácido bicinconínico
(BCA). ............................................................................................................................... 49
7.4 Protocolo para la determinación de la actividad enzimática de la Fosfomanosa isomerasa
(PMI).................................................................................................................................. 50
7.5 Ensayo de actividad enzimática contra el tiempo. ............................................................. 53
7.6 Ensayo de estabilidad del buffer de reacción. .................................................................... 54
7.7 Análisis estadístico de la actividad enzimática específica de la fosfomanosa isomerasa en
el grupo control. ................................................................................................................. 55
7.7.1 Análisis estadístico del grupo de control. .................................................................. 57
7.7.2 Análisis estadístico de los valores de PMI por género ............................................... 62
7.7.3 Determinación de valores de la enzima PMI por edad ............................................... 66
7.7.4 Validación supuestos para ANOVA. ......................................................................... 69
7.7.5 Prueba de normalidad. ................................................................................................ 70
7.7.6 Prueba de homocedasticidad por medio del Test de Breush-Pagan y White ............. 70
7.7.7 Prueba de independencia del Test de Durbin-Watson. .............................................. 71
7.7.8 Test t Student ............................................................................................................. 71
7.7.9 Determinación del valor de referencia para el grupo control. .................................... 72
8 CONCLUSIONES. ............................................................................................................ 75
9 RECOMENDACIONES. ................................................................................................... 76
10 BIBLIOGRAFÍA. .............................................................................................................. 77
11 Anexos ............................................................................................................................... 81
11.1 Anexo 1. Actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa en niños y adultos (n 32). . 81
11.2 Anexo 2. Tabla de valores atípicos determinados por la prueba de Dixon ........................ 82
11.3 Anexo 3. Carta de consentimiento informado para donación de muestra de sangre. ........ 83
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemático de una mucina.. .............................................................................. 8
Figura 2. Enlace predominante en la O-Glicosilación. . .................................................................... 8
Figura 3. Enlace predominante en la N-glicosilación. ........................................................................ 9
Figura 4. Síntesis de dolicol fosfato. ................................................................................................ 14
Figura 5. Síntesis del oligosacárido Glc3Man9GlcNAc2-P-P-Dol. .................................................. 16
Figura 6. Ruta A. Síntesis de glicoproteínas lisosomales. ................................................................. 18
Figura 7. Ruta B. Síntesis de glicoproteínas intracelulares e intermembranales. .............................. 19
Figura 8. A) Secuencia de aminoácidos de la hPMI y B) Estructura tridimencional de la hPMI. ... 32
Figura 9. Representación de la interacción entre la estructura cíclica de la M6P con el sitio activo de
la enzima hPMI. ................................................................................................................. 33
Figura 10. Mecanismos de reacción hipotéticos para la transposición de hidrógenos entre los
carbonos 1 y 2 de la M6P y la F6P en la isomerización catalizada por la hPMI........... ..34
Figura 11. Resumen esquemático de la interacción del sitio activo de la hPMI con M6P. ............... 35
Figura 12. Reacción de acople llevada in-vitro para la cuantificación de la actividad enzimática de
la fosfomanosa isomerasa................................................................................................ 44
Figura 13. Curva de calibración de proteína por el método de Folin-Lowry. ................................... 49
Figura 14. Curva de calibración de proteínas por el método de ácido bicinconínico (BCA). ........... 50
Figura 15. Curva de calibración de NADPH+H+. ............................................................................. 53
Figura 16. Comportamiento de la actividad enzimática de la muestra No 21 durante 10 horas. ...... 54
Figura 17. Dispersión de la actividad enzimática de PMI ................................................................. 57
Figura 18. Test de Dixon. .................................................................................................................. 59
Figura 19. Histograma de Actividad Enzimática de PMI. ................................................................ 60
Figura 20. Histograma de normalidad de actividad enzimática PMI. ............................................... 61
Figura 21. Boxplot de actividad enzimática de la enzima PMI. ........................................................ 62
Figura 22. Histogramas de actividad enzimática por género. ........................................................... 64
Figura 23. Histogramas de normalidad de la actividad enzimática. .................................................. 65
Figura 24. Bloxplot actividad enzimática PMI por género. .............................................................. 66
Figura 25. Histogramas de frecuencias de actividad enzimática por grupo de edad. ........................ 67
Figura 26. Histogramas de normalidad con la densidad de Kernel. .................................................. 68
Figura 27. Bloxplot actividad enzimática por grupos de edad. ......................................................... 69
Figura 28. Gráfica de normalidad de la actividad enzimática. .......................................................... 70
Figura 29. Grafica de homocedasticidad de la actividad enzimática. ............................................... 71
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Genes asociados a las enzimas implicadas en la síntesis de dolicol.................................... 15
Tabla 2. Clasificación de los defectos congénitos de glicosilación................................................... 20
Tabla 3. Cuadro clínico frecuente en pacientes con CDG-Ib. ........................................................... 24
Tabla 4. Tamaño en pb de los exones e intrones del gen MPI .......................................................... 28
Tabla 5. Mutaciones conocidas del gen MPI y manifestaciones clínicas asociadas. ........................ 29
Tabla 6. Secuencia bases nitrogenadas en el cDNA del gen MPI. . ................................................. 30
Tabla 7. Valores de actividad específica en leucocitos . ................................................................... 36
Tabla 8. Curva de calibración de albumina sérica bovina mediante el método de Folin-lowry. ...... 39
Tabla 9. Curva de calibración de albúmina sérica bovina mediante el método de ácido bicinconínico
y cuantificación de las enzimas G6PDH y PGI. ............................................................... 41
Tabla 10. Protocolo para la cuantificación de la actividad enzimática de la PMI. ............................ 43
Tabla 11. Curva de calibración de proteína por el método de Folin-Lowry. .................................... 48
Tabla 12. . Curva de calibración de proteína por el método de BCA. ............................................... 49
Tabla 13. Comparación de las actividades enzimáticas de la Fosfomanosa isomerasa PGI, G6PDH y
del sustrato M6P .............................................................................................................. 51
Tabla 14. Curva de calibración de NADPH+H+. .............................................................................. 52
Tabla 15. Estabilidad del buffer de reacción con un intervalo de tiempo de 58 días. ....................... 55
Tabla 16. Determinación de la actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa en muestras de
leucocitos de individuos de 0-27 años por espectrofotometría UV. ................................ 56
Tabla 17. Análisis estadístico descriptivo para el grupo control. ...................................................... 57
Tabla 18. Tabla de frecuencias absolutas y relativas de la actividad enzimática PMI. ..................... 58
Tabla 19. Frecuencias absolutas y relativas de actividad enzimática para género femenino y
masculino ........................................................................................................................ 63
Tabla 20. Frecuencias absolutas y relativas de actividad enzimática por edad. .............................. 67
Tabla 21. Análisis ANOVA de la actividad enzimática por grupos de edad. ................................... 69
Tabla 22. Ordenamiento ascendente de la actividad enzimática especifica de la PMI. .................... 72
ANEXOS
Anexo 1. Actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa en niños y adultos (n 32)…………...81
Anexo 2. Tabla de valores atípicos determinados por la prueba de Dixon………………………… 82
Anexo 3. Carta de consentimiento informado para donación de muestra de sangre……………….. 83
Resumen del proyecto
Los defectos de glicosilación tipo Ib (CDG-Ib) son de herencia autosómica recesiva y se dan por la
deficiencia de la enzima citoplasmática fosfomanosa isomerasa (PMI, EC 5.3.1.8), que cataliza la
interconversión entre fructosa-6-P y manosa-6-P, controlando la producción endógena de esta
última molécula, indispensable en el mecanismo de N-Glicosilación de proteínas. Esta enfermedad
se caracteriza por fibrosis hepática que conlleva a un fallo hepático, hipoglucemia con
hiperinsulinemia, coagulopatías con trombosis y accidentes cerebro vascular en algunos casos,
hemorragias, enteropatía con pérdida proteica y desnutrición por diarrea intratable. El gen MPI que
codifica para la enzima PMI, se encuentra localizado en el cromosoma 15q24.1, mide
aproximadamente 5 kb, con 8 exones con tamaños de 45-719 pb y 7 intrones, que traducen a una
proteína de aproximadamente 600 aminoácidos. Se han descrito 13 mutaciones que afectan la
proteína originando cambios de un aminoácido o por otro, cambios en la estructura primaria y en el
corte y empalme de ésta.
En Colombia no hay estudios que reporten intervalos de actividad ni laboratorios que realicen la
prueba enzimática diagnóstica para pacientes que presenten deficiencia de esta proteína teniendo
que enviar las muestras a laboratorios de países externos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio
fue determinar valores de referencia de la actividad enzimática específica de la PMI.
Para lo cual se estandarizó un método diagnóstico micro espectrofotométrico, a partir de 32
muestras con edades de 0,6-27 años, 14 de género femenino y 18 de género masculino, de las cuales
se extrajeron los leucocitos por el método dextrán-heparina a partir de sangre completa, luego se
lisaron por sonicación, y se cuantificó el contenido de proteína por el método de Folin-Lowry.
Se encontró una alta estabilidad de las enzimas auxiliares PGI y G6PDH con el amortiguador
utilizado. La actividad enzimática fue medida mediante una reacción acoplada en la cual actividad
específica es directamente proporcional a la producción de NADPH+H+ y el incremento de la
absorbancia por esta coenzima en las muestras fue leído a 340 nm durante 2 horas a 37 °C en un
lector de microplacas VariosKan Flash. Se realizaron para el grupo control análisis estadísticos
descriptivos y de normalidad por género y edad por medio de la extensión del programa Microsoft
Excel XLSTAT. Los análisis estadísticos permitieron corroborar que no existe diferencias
significativas de actividad enzimática por género al encontrar un p-valor 0,3954 con un t-valor
0,8623, como tampoco por edad, al hallar un p-valor 0,6788 con un f-valor 0,3926. Se encontró un
valor de actividad específica en el límite superior mayor a lo reportado con respecto a otras
investigaciones. El estudio permitió concluir que la actividad enzimática específica de la
fosfomanosa isomerasa no está influenciada por la edad ni el género. El valor de referencia de
actividad enzimática determinado en este estudio fue 551-2416nmol/h. mg de proteína y se halló un
intervalo de actividad por el Test t de Student de 1073-1588 nmol/h. mg de proteína con una
actividad media de 1330 nmol/h. mg de proteína bajo un nivel de confianza del 95% media, estos
resultados permiten diagnosticar pacientes con CDG Ib y portadores respectivamente.
Este estudio permitirá iniciar el diagnóstico de pacientes deficientes de PMI en forma temprana y
oportuna, para así evitar las complicaciones relacionadas con esta enfermedad y su muerte en edad
temprana. Esta deficiencia tiene una ventaja comparativa con respecto a otros defectos de
glicosilación porque permite un tratamiento fácil y a un bajo costo, al poder suplementar el sustrato
manosa en forma oral. Adicionalmente, el diagnóstico clínico de éste defecto metabólico
beneficiará al paciente y a su familia mejorando su calidad de vida, como también al sistema de
salud colombiano al generar una relación positiva costo-beneficio, lo que hace que sea una posible
enzima candidata para pruebas de tamizaje neonatal.
1
1 Introducción.
La glicosilación de proteínas es de importancia para el metabolismo humano. Los azucares unidos
covalentemente a las proteínas juegan un papel importante en su conformación del control de
calidad, vida media y hacen parte del sitio activo de la proteína o actúan como reguladores en la
interacción glicoproteína ligando. Existen dos tipos de unión de los glicanos a la proteína: la N-
glicosilación, en donde el átomo de nitrógeno de los residuos de asparagina están unidos
covalentemente al oligosacárido, y la O-glicosilación en la que los glicanos están unidos
covalentemente con el grupo hidroxilo de la serina, treonina o hidroxilisina(1). Se estima que
aproximadamente 500 genes están relacionados con procesos de glicosilación y la mitad de
proteínas de nuestro cuerpo están glicosiladas (2). Los defectos de glicosilación de proteínas se
presentan por deficiencias en enzimas que catalizan la unión del oligosacárido al dolicol fosfato
(Dol-p) en el citosol y/o a la proteína, proceso que ocurre en el retículo endoplasmático rugoso y
que tiene su fase terminal en el aparato de Golgi. En la actualidad, se han descrito cerca de 70
enfermedades autosómicas recesivas que se relacionan con problemas hepáticos, intestinales y en el
sistema nervioso central que se clasifican como Defectos de Glicosilación de Proteínas (CDGs) los
cuales están clasificados en tres grupos; las CDG tipo I, se presentan por fallos enzimáticos en la
síntesis del oligosacárido estándar y su unión al Dol-P de las que se conocen 10 subtipos (CDG Ia,
Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig, Ih y Ij); los CDG tipo II se dan por problemas en la maquinaria enzimática
encargada del procesamiento del oligosacárido una vez unido a la proteína (CDG IIa, IIb, IIc y IId);
los de tipo X se presentan por daños enzimáticos de ambos tipos, siendo los menos estudiados por
su reciente descubrimiento.
El objeto de estudio para este trabajo es la enzima citosólica fosfomanosa isomerasa (E.C.5.3.1.8)
que cataliza la producción endógena de manosa 6 P a partir de fructosa 6 P. Su deficiencia causa
CDG tipo Ib, presentando fallos principalmente en el hígado e intestino; aproximadamente a los tres
meses de vida se presentan los primeros síntomas, como diarreas, vómitos, hepatomegalia debida a
fibrosis hepática, hipoalbuminemia que puede ocasionar retraso pondero estatural, accidentes
trombóticos por coagulopatías, hipoglucemia por hiperinsulinismo y enteropatía con perdida
proteica. En 1986 se estimó que 4 niños de Quebec presentaban este defecto por Pelletier et al, y en
1998 Jaeken et al, confirmó la deficiencia de PMI en dichos pacientes.
En Colombia, no se han realizado estudios que reporten pacientes deficientes de la enzima PMI,
como tampoco valores de referencia que permitan el diagnóstico oportuno de este fallo. Por tanto,
en este estudio se realizó con el objetivo de generar un valor de referencia de la actividad
enzimática en 32 muestras control de leucocitos lisados, de los cuales se cuantificó la concentración
de proteína total por el método de Folin-Lowry, y se observó el crecimiento de NADPH+H+ por
micro espectrofotométrico siguiendo una reacción acoplada con las enzimas auxiliares fosfoglucosa
isomerasa (PGI) y glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PDH), cloruro de magnesio, NADP+ y
manosa 6 fosfato.
2
El estudio de valores de actividad enzimática específica en una muestra de población colombiana
permitirá generar un diagnóstico oportuno y por lo tanto tratamiento a los niños que presenten
deficiencia de PMI, mejorando la calidad de vida de los pacientes y la de su familia.
3
2 Justificación
En el mundo, existe un grupo de enfermedades catalogadas como raras o huérfanas, que se
relacionan en su mayoría con defectos genéticos, tipos de cáncer poco frecuente, enfermedades
autoinmunitarias, tóxicas e infeccionas, entre otras (3). En Colombia, la ley 1392 del 2010
reconoce estas enfermedades como de especial interés y garantiza la protección social por parte del
estado colombiano a la población que las padece (4).
En Colombia, no se han realizado estudios enzimáticos para la detección de pacientes con CDG-Ib
(deficiencia de fosfomanosa isomerasa o PMI por sus siglas en inglés) y actualmente no existen
reportes de este desorden por el ministerio de salud y protección social. Las características clínicas
de los pacientes con estos trastornos incluyen: hipoglucemia con hiperinsulinemia, fibrosis hepática,
enteropatías e hipercoagulabilidad (5). Entre los casos de este desorden reportados se conoce que
los primeros síntomas se manifiestan entre los tres a cuatro meses de vida, presentando cuadros de
diarrea crónica, desnutrición, hepatomegalia y cuando alcanzan los nueve meses de edad se
presentan complicaciones como fibrosis hepática, enteropatía con perdida proteica y coagulopatías
(6). El diagnóstico de CDG-Ib en la primera infancia de pacientes colombianos será de gran
importancia para el sistema de salud de nuestro país, ya que existe un tratamiento eficaz y efectivo
que consiste en la administración de manosa oral y evita en gran medida la mayoría de las
complicaciones descritas anteriormente (5).
Por lo tanto el objetivo de este estudio fue estandarizar un método micro espectrofotométrico para
establecer valores de referencia en individuos controles colombianos, con el fin de que estos sean
utilizados para diagnosticar pacientes con deficiencia de la PMI leucocitaria de forma temprana y
oportuna.
Este estudio también facilitará que el personal médico contribuya a mejorar la calidad de vida tanto
del paciente como de la familia, como también a generar nuevas investigaciones en este grupo de
enfermedades.
4
3 Antecedentes.
Los defectos congénitos de glicosilación (CDGs) son un grupo de enfermedades genéticas
autosómicas recesivas causados por defectos enzimáticos en la síntesis y procesamiento de las
cadenas de oligosacáridos N-ligadas a proteínas. Los CDG tipo I se presentan por problemas en el
ensamble de oligosacáridos unidos al dolicol fosfato (LLO) y su transferencia a la proteína naciente
(7).
El defecto congénito de glicosilación Ib se da por la deficiencia de la enzima citotoplasmática
fosfomanosa isomerasa y es clínicamente distinto a la mayoría de CDGs por ausencia de
enfermedades en el sistema nervioso central. Los síntomas predominantes son diarrea crónica con
falla en el crecimiento, enteropatía con pérdida de proteínas con coagulopatía y fibrosis hepática.
Este defecto puede contrarrestarse eficazmente con suplementos de manosa oral, sin embargo puede
ser mortal si no se trata (8).
Pelletier et al, (1986) reportaron por primera vez este desorden en 4 niños cuyos padres eran
provenientes de la provincia nororiental de Quebec. En este estudio se describieron pacientes con
características clínicas de diarrea secretoria con enteropatía, pérdida proteica, enterocolitis cística
superficial, linfangiectasia y fibrosis hepática congénita (9). Jaeken et al, (1998) sugirió que los
pacientes reportados por Pelletier et al, presentaban CDG Ib.
En 1998, Nihues et al, en un estudio reportaron un niño de 11 meses de edad con diarrea, vómito
que desarrolló enteropatía con pérdida proteica, la biopsia en el intestino delgado mostró una
inclusión de cuerpos lisosomales y dilatación del retículo endoplasmático rugoso con haces
tubulares prominentes. También se hllarón eventos trombóticos recurrentes y sangrado
gastrointestinal grave. Los estudios de laboratorio mostraron hipoproteinemia severa, anemia y
disminución de la antitrombina III. El isoelectroenfoque de transferrina mostró un patrón
consistente con CDG tipo I y debido a que al paciente no se le diagnosticó retraso psicomotor o
mental, se determinó una deficiencia en la enzima fosfomanosa isomerasa, encontrando una
actividad de 7,4 % con respecto a los controles normales en fibroblastos. Sus padres presentaron
una actividad enzimática aproximada al 50 % consistente con un estado heterocigoto. Sus
investigaciones a nivel molecular identificaron una mutación heterocigota en el gen MPI (R219Q).
El paciente presentó mejoría con la administración diaria de manosa oral, con mejorías en el
fenotipo clínico y en la glicosilación de proteínas séricas (10).
De Lonlay et al, en 1999 en una investigación reportaron un caso clínico de una niña de 3 meses de
edad que presentaba hiperinsulinemia con hipoglucemia, vómito y diarrea, fibrosis hepática
congénita, y deficiencias en los factores de coagulación. La paciente fue tratada con manosa oral,
5
mejorando y normalizando las diferentes anormalidades clínicas. En el mismo año, Babovic-
Vuksanovic et al. diagnosticaron una niña de 2,5 años de edad con CDG Ib, la cual tenía una severa
y persistente hipoglucemia y subsecuentemente desarrolló enteropatía con perdida proteica y
enfermedad hepática (11, 12).
En el año 2000, Schollen encontró otra mutación (116insC) en el gen MPI del paciente
diagnosticado con deficiencia de fosfomanosa isomerasa en 1998 por Nihues et al,. En su estudio
también observó una vía alterna para la biosíntesis de manosa 6 fosfato a partir de manosa por
acción catalítica de la hexoquinasa, debido a que la ingesta dietética de manosa no es suficiente para
la glicosilación normal, la suplementación de manosa oral promueve esta vía, siendo un tratamiento
efectivo para varios casos de pacientes con CDG Ib (12, 13). El niño con CDG Ib reportado por
Nihues et al 1997, fue estudiado molecularmente por Vuillaumier-Barrot et al, en el 2002 presentó
la mutación R295H, la cual causa enteropatía con pérdida de proteínas y fibrosis hepática (14).
En el 2014, Janssen et al, publicaron el primer caso de un trasplante hepático exitoso en un paciente
con CDG Ib que presentaba ictericia hemolítica, fibrosis hepática progresiva, disnea severa e
intolerancia al ejercicio por afectación pulmonar, debido a la resistencia al tratamiento con manosa
oral. El pos-trasplante, mostró que la tolerancia al ejercicio, las funciones pulmonares y los
parámetros metabólicos se restauraron completamente y permaneció estable por dos años (15).
6
4 Objetivos.
4.1 General.
Determinar valores de referencia para la enzima Fosfomanosa isomerasa (PMI) en leucocitos en una
muestra control (n 32) de colombianos mediante una técnica micro espectrofotometríca.
4.2 Específicos.
- Realizar el aislamiento de leucocitos de las muestras control.
- Extraer la enzima PMI de leucocitos mediante sonicación y cuantificar las proteínas por el
método Folin-Lowry.
- Determinar la actividad enzimática de la PMI por micro espectrofotometría.
- Analizar las muestras control por medio de un análisis estadístico descriptivo y de
normalidad por género y edad.
- Determinar si la actividad enzimática está influenciada por la edad y por género.
- Establecer el intervalo de actividad y valor de referencia de la enzima PMI en las muestras
control mediante el test t de Student y RStudio determinando los cuartiles 0,025 y 0,975.
7
5 Marco de referencia.
La glicosilación es el proceso en el que cadenas de glicanos se unen covalentemente a proteínas y
lípidos por medio de mecanismos enzimáticos. En las proteínas los azúcares participan en el
control de calidad, conformación, vida media y pueden formar parte del sitio activo de la proteína o
bien actuar como reguladores en la interacción glicoproteína-ligando (6). Los glicanos pueden
unirse covalentemente al átomo de nitrógeno de los residuos de asparagina en el mecanismo de la
N-glicosilación (Figura 3). La O-glicosilación, se da cuando los glicanos forman enlaces covalentes
con el grupo hidroxilo de los residuos de serina, treonina o hidroxilisina (Figura 2) (1). Dada la
diversidad e importancia de las funciones que desempeñan los glicanos en las proteínas los defectos
en la glicosilación pueden representar complicaciones clínicas graves (16). Existe un grupo de
enfermedades relacionadas con la deficiente glicosilación de proteínas conocidas como desordenes
congénitos de glicosilación o CDG (por sus siglas en inglés congenital disorders of glucosilation).
Estas complicaciones se presentan por fallos enzimáticos que pueden ser de dos tipos; los CDG tipo
I que presentan defectos enzimáticos relacionados con la síntesis y trasferencia del oligosacárido a
la proteína y en esta clasificación se conocen 10 subtipos (7). Estos desórdenes, están relacionados
con un déficit de enzimas citosólicas (CDG Ia y CDG Ib) y del Retículo Endoplásmico (CDG Ic,
Id, Ie, If, Ig, Ih, Ii, Ij). En los CDG tipo II se han descrito cuatro subtipos en el que hay un déficit
de enzimas relacionadas con el procesamiento de la cadena del glicano; en los CDG IIa, IIc y IId
este déficit, tiene lugar en las cisternas del aparato del Golgi, mientras que en la CDG IIb se
presenta en los últimos estadios del retículo endoplásmico. Las complicaciones clínicas que
presentan los CDG están relacionadas en su gran mayoría con afecciones en el sistema nervioso
central a excepción del CDG Ib, la cual es objeto de este estudio y se presenta por deficiencia de la
enzima citosólica fosfomanosa isomerasa (PMI) codificada por el gen MPI, esta cataliza la
interconversión de fructosa 6-fosfato a manosa 6-fosfato y está vinculada a enfermedades hepáticas
e intestinales (2, 6).
5.1 O-glicosilación.
En las glicoproteínas O-enlazadas el monosacárido predominante es la GalNAc (N-Acetil
galactosamina) que se une a un residuo de serina (Ser) o Treonina (Tre). En su biosíntesis se
utilizan azúcares nucleótido como UDP-GalNAc (Uridina difosfato-N-Acetil galactosamina), UDP-
Gal (Uridina difosfato-galactosa) y CMP-NeuAc (Citidina monofosfato- Ácido neuramínico). Las
enzimas que catalizan la transferencia de estos azúcares a las proteínas son glicoproteína glucosil
transferasas que están unidas a la membrana (1). Los factores que determinan que residuos de
serina o treonina sean glicosilados no han sido aún establecidos, pero se conoce que están
relacionados con la secuencia peptídica que rodea al sitio de unión. En el caso de las mucinas
existe un sello distintivo que hace referencia a la presencia de tramos de péptidos o aminoácidos
repetitivos llamados “número variable de repeticiones en tándem’’ VNTR (del inglés “variable
number of tandem repeat’’) las cuales son sitios ricos en serina y treonina (Figura 1) (1, 17).
8
Figura 1. Diagrama esquemático de una mucina. La región VNTR (número variable de repetición en
tándem) rica en serina, treonina y prolina es altamente O-glicosilada y el péptido asume la forma de cepillo. Cientos de
glicanos O-GalNAc pueden unirse a residuos de serina o treonina en el dominio VNTR. Las regiones ricas en Cisteína
(Cys rich) en los extremos del péptido están relacionadas con la formación de enlaces disulfuro para formar polímeros de
millones de daltons. Los dominios D también están implicados en la polimerización. Tomado de Varki A. et al 2009 (17).
5.2 Mecanismo de O-glicosilación.
La maquinaria enzimática que se encarga de la O-glicosilación se localiza en el aparato de Golgi,
está dispuesta secuencialmente y determina una serie de reacciones terminales que ocurren en los
compartimentos trans del mismo. Los O-Glicanos presentan estructuras diversas de modo que
pueden estar unidos inicialmente a N-Acetilgalactosamina (para el caso de las mucinas, Figura 2),
Xilosa (glucosaminoglicanos), manosa o N-acetilglucosamina (6).
Figura 2. Enlace predominante en la O-Glicosilación. La GalNAc se une covalentemente al grupo
hidroxilo del residuo de serina en la O-glicosilación. Tomado de King MW 2015 (18).
9
5.2.1 Defecto de O-glicosilación.
Estos se caracterizan por la deficiencia de dos enzimas, la (β-1→4) galactosiltransferasa VII que
está relacionada con el impedimento para la unión de la primera galactosa a la xilosa que ya ha sido
ligada a la proteína. La primera deficiencia ocasiona que los pacientes presenten retraso psicomotor
y progeria (enfermedad genética que involucra envejecimiento brusco y prematuro en la infancia).
La segunda deficiencia es debida a la heparansulfato copolimerasa, cuando hay un defecto en el
gen de esta enzima no se cataliza la polimerización del glucosaminoglicano heparansulfato que son
un grupo de mucopolisacáridos que se encuentran en las membranas citoplasmáticas y funcionan
como receptores de virus en las células; este CDG es el único que muestra una herencia autosómica
dominante. Los pacientes muestran osteocondromas en los extremos de los huesos largos conocido
como síndrome de exostosis múltiple (aparición de masas duras e indoloras en huesos) (6). Se han
identificado algunos defectos en las glicosiltransferasas, que participan en la O-Glicosilación del α-
distroglicano, el cual se encuentra en músculo, nervio, corazón y cerebro generando
distroglicanopatías. Es una proteína receptora de membrana celular muy glicosilada que forma
parte del complejo distrofina-glicoproteinas, y se cree que la mayor parte de sus glicanos están
unidos mediante O-Manosilación. Los defectos que interfieren con la glicosilación del α-
distroglicano pueden provocar una degeneración muscular y una migración neuronal anómala en el
cerebro (6).
5.3 N-glicosilación.
En la N-glicosilación, la cadena del oligosacárido está unido al grupo amino del radical de la
asparagina (Figura 3) (1). Consta de las siguientes etapas: síntesis de dolicol, síntesis del
oligosacárido central o núcleo unido al dolicol, transferencia del oligosacárido estándar a la
asparagina de la proteína naciente y procesamiento de la cadena N-glicano. Las dos primeras etapas
se dan en la parte citosólica de la célula y la última se realiza en el lumen del retículo endoplásmico
y las cisternas del aparato de Golgi (1, 7).
Figura 3. Enlace predominante en la N-glicosilación. La GlcNAc se une covalentemente al
residuo nitrogenado de la asparagina. Tomado de King MW 2015 (18).
10
5.4 Síntesis de dolicol
El dolicol es un lípido poliisoprenoide de membrana, presente en todas las células eucariotas
superiores con aproximadamente 8 genes que regulan su síntesis (Tabla 1). Su función principal es
la de ser el portador del oligosacárido para la glicosilación de proteínas. Las longitudes de cadena
de éste biocompuesto varían de acuerdo a la especie, siendo dos las dominantes; en la levadura S.
cerevisiae, el tamaño está entre las 14 a 18 unidades repetitivas de isopreno (Dol-14 a Dol-18) con
cadenas principales de 16 y 17 unidades. En los vertebrados incluyendo los humanos se ha
observado un dominio de 19 monómeros isoprenoides (1, 19).
Para la síntesis de glucoproteínas es necesario el dolicol fosfato (establecido por Behrens y Leloir)
(19), el cual se produce a partir de dos moléculas de Acetil CoA proveniente de la oxidación de la
glucosa que mediante reacciones sucesivas producen isoprenoides activos de cinco carbonos que
mediante acciones enzimáticas de condensación, fosforilación, isomerización , reducción etc.,
generan el polímero lineal de dolicol, proceso que ocurre en la cara citoplásmisca del RE, donde
tiene lugar la N-glicosilación. Los primeros pasos se comparten con la síntesis de colesterol hasta
la producción enzimática de mevalonato, sufriendo varias modificaciones hasta llegar al
isopentenilo pirofosfato (IPP) y dimetil alil pirofosfato (DMAPP), que después de su condensación
producen FPP (farnesil pirofosfato utilizado también como sustrato en la síntesis de colesterol,
ubiquinona y la prenilización de proteínas), al que se adicionan moléculas cis-cabeza-cola de IPP
por acción enzimática de dehidrodolicol difosfato sintasa, formando poliprenol pirofosfato que es
desfosforilado por una enzima desconocida, luego éste es reducido por la esteroide 5α reductasa 3
completando la síntesis del lípido poliisoprenoide (19). Finalmente, la enzima dolicol cinasa es la
encargada de fosforilar el dolicol con gasto de un CTP formando el Dolicol fosfato o Dol-P,
biomolécula sobre la cual es sintetizado el oligosacárido estándar (1, 19). Una hipótesis alternativa
propone, que en el paso final de la elongación se podría condensar una molécula de isopentenol en
lugar de IPP lo cual evitaría el paso de desfosforilación y reducción (Figura 4) (19).
Se cree que la desfosforilación del dolicol es un paso intermedio entre la elongación y la reducción.
En la levadura (CWH8) se ha identificado una dolicol pirofosfato fosfatasa, enzima implicada en el
reciclaje de dolicol, una vez se ha transferido el oligosacárido a la proteína, ésta cataliza la
eliminación de un grupo fosfato del Dol-PP en el RE. La importancia de este reciclaje, se ve
reflejada en la regulación del dolicol fosfato disponible para las diferentes vías de glicosilación
(19).
11
CoA
O
CH3S
2
CoAS
O
CH3
O
CoA-SH
Tiolasa
HMG-CoA Sintasa
CoA
O
CH3S
CoA-SH
OH
CoAS
O
CH3
O-
O
NADPH
NADP+
CoA-SH
2
2
HMG-CoA Reductasa
CH3
OHO-
O OH
Acetil CoA
Acetoacetil CoA
-Hidroxi -Metilglutaril-CoA
HMG-CoA
Mevalonato
+2 H+
.
12
CH3
OHO-
O OH
Mevalonato 5-fosfotransferasa
ATP
ADP
O
CH3
OHO-
OO P O
-
O-
O
P
O
CH3
OHO-
O O P O
O-
O-
O-
Fosfomevalonato cinasa
ATP
ADP
O
P
O
CH3
OO-
O O P O
O-
O-
O-
O
P O-
O-
Pirofosfomevalonato descarboxilasa
ATP
ADP
Mevalonato
5-Fosfomevalonato
5-Pirofosfomevalonato
3-Fosfo-5-Pirofosfomevalonato
13
CO2
PiPirofosfomevalonato descarboxilasa
O
P
O
CH2
CH3
O P O
O-
O-
O-
O
P
O
CH3
CH3
O P O
O-
O-
O-
Isopentenil Pirofosfato
Dimetilalil Pirofosfato
Isoprenos activos
Isopentenil PirofosfatoDimetilalil Pirofosfato
O
P
O
CH2
CH3
O P O
O-
O-
O-
O
P
O
CH3
CH3
O P O
O-
O-
O-
+
CH3
CH3
CH3
O
O
P
O
P O
O-
O-
O-
Geranil Pirofosfato
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3O
O
P
O
P O
O-
O-
O-
O
P
O
CH2
CH3
O P O
O-
O-
O-
PPi
Prenil transferasa
Prenil transferasa
Condensación cabeza-cola
Condensación cabeza-cola
Farnesil pirofosfato
OCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
P
O
P O
O-
O-
O-n
O
P
O
CH2
CH3
O P O
O-
O-
O-
n
PPi
n
Poliprenol pirofosfato
Dehidrodolicol difosfato sintasa (DHDDS)
14
OHCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
n
Poliprenol
SRD5A3
OHCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
nDolicol
Hipótesis
DOLK/DK1
OCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
P O-
O-n
Esteroide 5 reductasa 3
Dolicol cinasa CTP
CDP
OH2
Dolicol fosfato
OCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
P
O
P O
O-
O-
O-n
Poliprenol pirofosfato?
Figura 4. Síntesis de dolicol fosfato.
15
Tabla 1. Genes asociados a las enzimas implicadas en la síntesis de dolicol.
GEN TAMAÑO (pb) Enzima
HADHAP1-001 2284 3-cetoacilCoA tiolasa
HMGCS1-001 3506 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
sintasa 1
HMGCR-001 4585 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
reductasa
PMVK-001 1280 Fosfomevalonato cinasa
UBIAD1-001 3646 Preniltransferasa
DHDDS-001 3245 Dehidrodolicol difosfato
sintasa
SRD5A3-001
4190 Esteroide-5-α-reductasa 3
DOLK-001 2090 Dolicol cinasa
Tomado de Gabrinska K, et, at, (20).
5.5 Síntesis del oligosacárido estándar o núcleo.
Una vez sintetizado el Dol-P, el primer paso de la biosíntesis del oligosacárido estándar es la
adición de un residuo de GluNAc-P (N-acetilglucosamina fosfato) proveniente del azúcar
nucleótido UDP-GluNAc obteniéndose, GluNac-P-P-Dol y UMP como productos (1). La adición
del segundo residuo de GluNAc se da por una enzima desconocida generando un enlace β (1→4)
para obtener GluNAc2-P-P-Dol, este último es el aceptor del primer residuo de manosa, por acción
de la β(1→4) manosiltransferasa (19). Luego, se adiciona el segundo residuo de manosa, que
forma un enlace α (1→3) por la enzima Manosil transferasa II. Por medio de la Manosil transferasa
III, se cataliza la reacción de adición del tercer residuo de manosa al carbono número 6 de la
primera manosa adicionada, formando un enlace α (1→6), de esta forma la ramificación se inicia en
el extremo no reductor del oligosacárido creciente (1, 19). Las tres manosas anteriores se adicionan
en forma de GDP-Man, este nucleótido-azúcar sirve como donador de dos manosas adicionales que
se unen al residuo de manosa número dos, por acción de las manosiltransferasas IV y V mediante
enlaces α (1→2) quedando el intermediario asimétrico Man5GluNAc2-P-P-Dol, sintetizado en la
cara citosólica del retículo endoplásmico (RE) Posteriormente se introduce a la parte lumenal del
organelo, proceso catalizado por la ATP filipasa bidireccional (19). Posteriormente se utiliza como
sustrato donador Dol-P-Man, el cual transfiere la manosa mediante un enlace α (1→3) (éste sustrato
ha sido sintetizado en la cara citosólica del lumen a partir de GDP-Man por la acción catalítica de la
Man-P-Dol sintasa o Dol-P-Manosiltransferasa). Luego se adiciona la sexta manosa por la α (1→3)
Manosil transferasa VI dependiente de Dol-P-Man al residuo número tres formando un enlace α
(1→6), que elonga la segunda rama del oligomanosil, lo que da lugar al intermediario
Man6GlcNAc2-P-P-Dol (19). El séptimo residuo de manosa se enlaza de forma α 1-2 con el residuo
número seis en una reacción catalizada por la α (1→2) manosil transferasa y se produce el
intermediario Man7GlcNAc2-P-P-Dol, completando la segunda rama del oligomanosil creciente. La
segunda rama ya sintetizada es necesaria para la adición de la octava manosa, que se liga
16
catalíticamente mediante un enlace α (1→6) por una manosiltransferasa al tercer residuo de
manosa, lo que inicia la tercera rama del oligomanosil generando Man8GlcNAc2-P-P-Dol. La
novena manosa se une por la acción enzimática de la manosiltransferasa al último residuo en un
enlace α (1→2), de esta forma se termina la síntesis de la tercera rama del oligomanosil y se
obtiene el intermediario Man9GlcNAc2-P-P-Dol (Figura 5 A y B) (19).
La transferencia efectiva del LLOS (oligosacárido ligado a lípido) nacientes al sitio de glicosilación
es ineficaz sin la adición de tres residuos de α-D- glucosa a la manosa número cinco, dos de estas se
unen con enlace α (1→3) y la última con un enlace α (1→2), que quedan en el extremo no reductor
de la primera rama del oligomanosil. Para la adición de estas glucosas, es necesaria la formación
del Dol-P-Glc como donador del azúcar, éste es sintetizado a partir del UDP-Glc por la Dol-P-Glc
sintasa o Dol-P-Glc transferasa en la cara citosólica del RE. El primer residuo de glucosa es
añadido a la manosa número cinco por una Glucosil transferasa formando un enlace α 1-3; el
segundo residuo se une al primero conformando un enlace α (1→3), reacción catalizada por una
glucosil transferasa; el tercer residuo se adiciona por una α (1→2) glucosiltransferasa al segundo
residuo (Figura 5) (19).
Figura 5. Síntesis del oligosacárido Glc3Man9GlcNAc2-P-P-Dol. A. Síntesis y trasferencia del
oligosacárido estándar a la proteína en la parte citosólica y en el lumen del RER. B. Enlaces presentados en el
oligosacárido estándar. Tomado de Supraha Goreta S, Dabelic S, Dumic J. 2012 y Pamela S. et al 2009 (21).
GlcNAc
Man
A
B
Glc
17
5.6 Transferencia del oligosacárido estándar a la proteína.
La transferencia en bloque del LLOS Glc3Man9GlcNAc2-P-P-Dol desde el Dol-P-P, es catalizado
por el complejo Oligosacaril transferasa (OST) o Dolicil difosfato oligosacárido: proteína
transferasa hasta el aminoácido Asn de la proteína naciente. El enlace terminal α (1→2) de la
glucosa es crucial para transferencia efectiva del LLOS. La enzima DDOST (dolicil
difosfooligosacarido transferasa) reconoce la secuencia de aminoácidos apropiada para la N-
glicosilación (Asn-x-Ser/Tre; donde X puede ser cualquier aminoácido a excepción de prolina). La
enzima OST cataliza la formación del enlace N-glicósido, para finalmente transferir el
oligosacárido común completo más eficazmente a las proteínas nacientes (1, 19).
5.7 Procesamiento de la cadena N-glicano.
El procesamiento de la cadena oligosacárido de los N-glicanos se da después de su transferencia a la
proteína naciente. El residuo de glucosa terminal es eliminado por la α-glucosidasa I. El
rompimiento del segundo residuo de glucosa se da por la α-glucosidasa II, lo que favorece la unión
de la nueva proteína a la calnexina (CNX), una lectina integral de membrana del RE enlazada a la
chaperona y careticulina (CRT). La unión a esta proteína hace que la glicoproteína se pliegue
correctamente y evite la degradación prematura (7).
La glicoproteína naciente pierde el tercer residuo de glucosa por la α-glucosidasa II, luego se separa
del complejo CRX/CRT y sucesivamente pierde el residuo número 7 de manosa por acción de la α-
1,2 manosidasa I del RE, con esto la glicoproteína es transportada a las cisternas del aparato de
Golgi en vesículas llamadas ERGIC (compartimiento intermedio del RE a Golgi). La UDP-glucosa
glicoproteína glucosiltransferasa, que también conforma el complejo chaperona del RE, regula al
glicano para la unión reiterativa a las lectinas aumentando el control de calidad CNX/CRT para
alcanzar la conformación tridimensional apropiada (1).
El procesamiento adicional de las cadenas laterales de Man8GlcNAc2-proteína se da en dos
direcciones. En la ruta A se fosforilan las manosas número 4 y 8 en el carbono 6 (Figura 6). El
mecanismo de fosforilación se logra por medio de la adición de residuos de GlcNAc-1-P
proveniente de UDP- GlcNAc, reacción catalizada por una GlcNAc fosfotransferasa. Luego, los
residuos de GlcNAc son eliminados por una GlcNAc 1 fosfodiesterasa, lo que deja fosforiladas las
manosas mencionadas en la carbono 6 y genera un marcador de reconocimiento de enzimas
lisosomales (19). Este proceso se da en las cisternas Trans del aparato de Golgi. Simultáneamente
los residuos de manosa N 5 y N 9 son liberados por la α (1→2) manosidasa I, dejando expuestas las
Man-6-P quienes se unen a sus receptores, que son proteínas integrales de membrana de algunas
vesículas post Golgi y prelisosomales. Como resultado se obtiene Man5GlcNAc2-proteína en
glicoproteínas lisosomales (1).
18
Figura 6. Ruta A. Síntesis de glicoproteínas lisosomales. Tomado de, Leroy JG 2006 (7).
La segunda vía del procesamiento de la cadena OS es la de recorte enzimático y maduración de las
cadenas N-glicano, donde las glicoproteínas se dirigen a su sitio de función dentro de la membrana
plasmática o para su secreción en el espacio intracelular (Figura 7) (19). El primer paso de esta vía,
se presenta en las cisternas Cis de Golgi, por la eliminación de todos los residuos de manosa α-1,2
enlazadas (manosas: número 5, 9 y 4). De acuerdo con el modelo de “compartimientos estables” de
las cisternas del aparato de Golgi, la glicoproteína es transportada a la cisterna medial por vesículas
unidas a membrana. Se añade un residuo de GlcNAc a la manosa número 2 por la UDP-GlcNAc
transferasa I. Luego, la α (1,3/1,6) manosidasa o α-manosidasa II (o dos α-manosidasas diferentes)
eliminan los residuos de manosa α (1→3) y α (1→6) enlazadas (número 6 y número 8
respectivamente) dejando el intermediario GlcNAcMan3GlcNAc2-proteina (19). La continuación
del proceso se da por la transferencia de un segundo residuo de GlcNAc a la Man número 3
mediado por la UDP-GlcNAc transferasa 2, lo que establece la simetría de los extremos no
reductores. Se añade un residuo de fucosa a la GlcNAc número 1 la cual está unida covalentemente
a la asparagina de la proteína naciente (19).
19
La glicoproteína es transportada en vesículas a las cisternas trans-Golgi. Se añaden un residuo de
Gal y uno de ácido siálico de forma simétrica a cada uno de los extremos no reductores de las
antenas N-glicanos para finalmente completar la síntesis del oligosacárido complejo (1).
Figura 7. Ruta B. Síntesis de glicoproteínas intracelulares e intermembranales. Tomado de Leroy
JG 2006 (7).
20
5.8 Defectos congénitos de la glicosilación CDGs.
Los glucoconjugados, son importantes en el metabolismo de proteínas cumpliendo funciones de
reconocimiento, adhesión, migración celular, resistencia a las proteasas, mecanismos de defensa y
antigenicidad. Dada la cantidad de funciones que presentan en la proteína, se explica el hecho de
que los defectos congénitos de glicosilación (CDG) sean enfermedades multisistémicas. Su
descubrimiento se debe a las observaciones hechas por Jaeken et al en 1980 sobre dos gemelas
univitelinas con retraso mental, quienes presentaban concentración sérica de globulina ligadora de
tiroxina disminuida y actividad sérica de arilsulfatasa A elevada. Al utilizar la técnica de
isoelectroenfoque (IEF) para separar la transferrina (proteína glicosilada) se demostró que las
muestras de los pacientes presentaban un corrimiento hacia el cátodo, indicativo de la deficiencia de
ácido siálico, azúcar terminal en las glucoproteínas que está cargado negativamente (6).
En la actualidad el IEF de transferrinas séricas está reconocida como prueba diagnóstica de las
CDG más efectiva, sin embargo, no todos los tipos pueden ser detectados de esta forma (16). Hasta
el momento se han descrito en el ser humano 14 enfermedades hereditarias relacionadas con la
síntesis de N-glicanos. Los defectos de la N-glicosilación se dividen en dos grupos (CDG I y CDG
II) los distintos defectos enzimáticos se indican con letras minúsculas (Tabla 2). Las CDG I son
todas aquellas en las cuales el principal problema se encuentra en el proceso de ensamble de las
cadenas de oligosacáridos ligados a dolicol fosfato (Dol-P) y en su transferencia a la proteína. Los
defectos enzimáticos de este tipo se localizan en el citosol como es el caso de la CDG Ia y Ib, y en
el RE para las CDG Ic, Id, Ie, If, Ig, Ih, Ii y Ij. Los CDG II están relacionados con los defectos en el
procesamiento del oligosacárido estándar (GlcNAc2Man9Glu3) unido a la proteína, estos pueden
tener lugar ya sea en los últimos estadios del RE como es el caso del CDG IIb o en el aparato de
Golgi para los CDG IIa, IIc y IId (6).
Tabla 2. Clasificación de los defectos congénitos de glicosilación.
Tomado de Vilaseca M, 2004 (6).
21
5.9 Defectos en la síntesis de glicanos, CDG-I.
CDG Ia, deficiencia de fosfomanomutasa: son causados por la deficiencia de fosfomanomutasa 2
(PMM 2) enzima que cataliza la transformación de manosa 6-fosfato en manosa-1-fosfato. El gen
PMM2 está localizado en el cromosoma 16p13 (6). Hasta el momento se han descrito más de 500
pacientes con CDG Ia, siendo estos defectos los más frecuentemente diagnosticados en todo el
mundo (6). Normalmente, los CDG Ia se identifican en el periodo neonatal o en la primera infancia
basándose en características clínicas particulares como los son mamilas invertidas y lipodistrofia,
acompañadas de estrabismo, hipotonía axial, falta de medro, alteraciones de la coagulación y
trasaminasas elevadas (16). El 25% de la población infantil con diagnóstico de CDG Ia muere
principalmente a causa de infecciones graves o fallos cardiacos. En pacientes con mayor edad se
hacen más evidentes las alteraciones neurológicas presentando grados variables de retraso mental,
disfunción cerebelosa y retinitis pigmentosa (6, 16).
CDG Ic (deficiencia de la α (1→3) glucosiltransferasas) y otros CDG I: la enzima α (1→3)
glucosiltransferasas se encuentra en el RE y cataliza la unión de la primera glucosa al oligosacárido
ligado al dolicol (Dol-PP-GlcNAc2Man9). Los CDG-Ic son de descubrimiento reciente; los
síntomas asocian afecciones neurológicas como retraso psicomotor, hipotonía muscular y
convulsiones inconstantes, siendo estos más leves que en la CDG-Ia. Sin embargo, no se han
descrito problemas oftalmológicos, cerebelosos o cutáneos. Estos CDG están probablemente
infradiagnosticados debido a que no presentan signos morfológicos típicos (6, 16). Los demás CDG
I involucran retraso mental, epilepsia, dismorfia, exceptuando los CDG Ih , en los cuales se ha
diagnosticado un único caso que presentó edema, ascitis ocasionada por hipoalbuminemia grave,
enteropatía con perdida proteica y hepatomegalia moderada. Este paciente no mostró dismorfia o
retraso psicomotor. Las enzimas involucradas varían para cada caso (Tabla 1) (16).
5.10 Defectos de procesamiento de los oligosacáridos ligados a proteínas, CDG II.
Los casos comunicados de familias con distintos CDG II son poco frecuentes. La sintomatología es
muy variable e incluye retraso psicomotor, hipotonía, dismorfia facial, microcefalia o macrocefalia,
hepatomegalia, fibrosis hepática, miopatía, entre otras. Se resaltan los CDG IIa por ser los
primeros en ser identificados bioquímicamente, siendo descritos a principios de la década de los 90
en una niña Iraní y un niño Belga. También debe destacarse los CDG IIb por ser los defectos de
glicosilación que presentan un IEF de transferrina normal; este defecto pudo ser detectado por el
análisis de oligosacáridos en orina, el cual mostró la presencia del tetrasacárido Glc α (1→2) Glc α
(1→3) Glc α (1→3) Man; las enzimas implicadas varían para cada caso de deficiencia (Tabla 1) (6,
16).
22
5.11 Deficiencia de Fosfomanosa isomerasa (E.C. 5. 3. 1. 8) CDG Ib.
En la CDG Ib no se presentan síntomas neurológicos, siendo el hígado y el intestino los principales
órganos afectados (22, 23). Los nacimientos ocurren de forma normal; aproximadamente a los 3
meses de vida se presentan los primeros síntomas. Diarreas y vómitos son muy frecuentes
acompañados de hepatomegalia debida a fibrosis hepática (24). En algunos casos se observa
hipoalbuminemia, que en ocasiones conduce a un retraso en la curva ponderal de crecimiento (7).
Se pueden presentar coagulopatías (hemiplejía, accidente cerebral, trombo cardiaco, flebitis), por
niveles anormalmente bajos de los factores de coagulación y anticoagulación e hipoglucemia por
hiperinsulinismo. A nivel intestinal suele presentarse enteropatía con perdida proteica, atrofía
vellositaria yeyunal y cólica y/o enteropatía exudativa (Tabla 3) (6, 7, 16). El fallo enzimático
puede ser debido a mutaciones cerca al sitio activo en donde se remplazan algunos aminoácidos o a
fallos en los promotores o factores de transcripción requeridos para la expresión de la enzima.
Estudios realizados en dos pacientes, mostraron el cambio de serina por treonina en el codón 102
causado por una transición C T en la posición 304 del DNAg. También, se halló un cambio de
leucina por metionina en el codón 138 por una transición de T C en la posición 413 del DNAg,
esta última, afecta la unión catalítica del cofactor Zn2+
(25).
5.12 Patogénesis clínica de la CDG-Ib.
Estos defectos de Glicosilación se caracterizan por:
5.12.1 Fibrosis hepática.
La fibrosis hepática es una acumulación progresiva de fibras de colágeno en el parénquima hepático
que se da como respuesta a un proceso inflamatorio, que a su vez tiene lugar en las enfermedades
del hígado tales como infecciones virales, trastornos metabólicos, déficit congénito de alfa 1
antitripsina, entre otros, y cuyo estadio final es la cirrosis hepática (26). La fibrosis hepática altera
la arquitectura del hígado provocando la invasión de los espacios porta por fibras de colágeno, los
ductos biliares se dilatan obstruyendo la circulación sanguínea al interior del hígado dando como
consecuencia un aumento en la presión portal, cuando esta supera los 10 mmHg se habla de
hipertensión portal (HTP) (26). Los elementos clínicos de la HTP son hemorragia variceral, ascitis
y encefalopatía hepática (27). En los niños puede estar acompañada de anemia, esplenomegalia,
hepatomegalia, coagulopatías e hiperesplenismo (28).
La acumulación de cicatrices fibrosas se da como respuesta al daño tisular producido por lesiones
crónicas de etiología variada que activan en el hígado una respuesta inflamatoria (29, 30). Este
proceso produce la muerte de los hepatocitos, estimulando la liberación de citosinas y factores de
crecimiento por parte de las células de Kuffer, macrófagos encargados de la respuesta inmune a
nivel hepático. Entre los sinusoides hepáticos y los hepatocitos existe un grupo de células
23
conocidas como células ITO o hepatocitos estrellados, que en condiciones normales cumplen una
función de almacenamiento de vitamina A, sin embargo, bajo el estímulo de las sustancias liberadas
por las células de Kuffer se modifican, llegando a sintetizar colágeno, glucoproteínas y
proteoglicanos cuya función es reparar las zonas del hígado afectadas por la necrosis hepática dando
como resultado la fibrosis (31).
En los pacientes con CDG-Ib se ha reportado hipertrasaminasemia, que es frecuente en muchos
casos de daño hepático y se caracteriza por un aumento de las concentraciones sanguíneas de
aspartato aminotransferasa (AST) y de alanina amino transferasa (ALT) (5).
La AST es una enzima propia de mamíferos que se puede encontrar en varios tejidos, especialmente
en corazón, tejido muscular e hígado. Su concentración en sangre se eleva tras la muerte de los
hepatocitos y se puede encontrar en citoplasma y mitocondria. Sin embargo, en casos de infarto
agudo de miocardio y el uso de determinados fármacos puede elevar los valores de AST, por lo que
su determinación suele hacerse en relación con la ALT (AST/ALT) sin que esto sea un dato
determinante para diagnosticar daño hepático. Por otra parte, la ALT es una enzima más específica
de hígado aunque se presenta en menor cantidad en riñón, corazón y musculo. Un aumento en la
concentración de ALT por encima de 33 U/L en mujeres y 50 U/L en hombres podría ser indicativo
de daño hepático sin que sea determinante ya que es liberada tras la muerte de los hepatocitos y
puede encontrarse en el citoplasma.
5.12.2 Enteropatía con pérdida proteica.
En este síndrome, se presentan enfermedades poco frecuentes que tienen en común un catabolismo
de proteínas excesivo en el tracto gastrointestinal. Esto sucede cuando la síntesis proteica no es
suficiente para suplir la pérdida (32, 33).
La pérdida de proteínas está conformada solamente por un pequeño grupo de enfermedades que
están divididas en dos grupos. El primero se da por ulceración en un área de la mucosa
gastrointestinal con exudación de plasma y fluido intersticial, lo que probablemente explica
problemas como gastritis crónica difusa, gastroenteritis aguda, disentería por Shigella, enteritis
granulomatosa regional y colitis ulcerativa. El segundo grupo, relaciona enfermedades asociadas
con la obstrucción de los vasos linfáticos intestinales, lo que resulta en una pérdida de fluidos ricos
en proteínas y linfocitos en el lumen intestinal. Éstas son linfagiectanasia intestinal, enfermedad de
Whipples, fibrosis retroperitoneal y linfomas malignos que afectan los vasos linfáticos mesentéricos
(32).
24
Algunos de los pacientes que tienen deficiencia de PMI presentan hipoglucemia por
hiperinsulinemia en episodios de gastroenteritis. El diagnóstico para la enteropatía con perdida
proteica, se confirma por medio de las altas concentraciones de α-1 antitripsina en las heces, o por
asociaciones clínicas de diarrea, baja albumina sérica y edema o ascitis sin proteinuria (23).
5.12.3 Coagulopatía.
Es la alteración en la capacidad de coagulación de la sangre, aunque en algunas investigaciones el
término también hace referencia a estados de trombosis y debido a la complejidad de la vía de
hemostasia las dos condiciones se pueden presentar al mismo tiempo (34). En pacientes con CDG
tipo Ib se han encontrado concentraciones bajas de factor XI, antitrombina III, proteína S y C (22,
35).
Tabla 3. Cuadro clínico frecuente en pacientes con CDG-Ib.
Tipo de enfermedad Síntomas Observaciones
Enteropatía con perdida
proteica Vómito
Diarrea intratable
Desnutrición
Disminución de la
albumina sérica
Aumento de α-anti
tripsina en heces
Puede asociarse con
atrofia vellositaria
leve.
La biopsia duodenal
puede ser normal.
Los pacientes más
graves pueden requerir
nutrición parenteral.
Enfermedad hepática Hepatomegalia a veces
asociada con edema o
anarsaca.
Fibrosis hepática con
distrofia biliar y
fibrosis portal.
La fibrosis hepática de
la CDG Ib es muy
similar a la presente en
la fibrosis hepática
congénita.
Hiperinsulinismo Es moderado o
frecuentemente
compensado en
pacientes que reciben
nutrición parenteral
por sus síntomas
digestivos.
Suele ser
infradiagnosticada ya
que suele estar
asociada con
hipoglucemia.
Coagulopatía Aumento en el tiempo
de protrombina.
Accidentes
trombóticos.
Ambas condiciones,
aunque contrarías,
pueden presentarse de
forma simultánea.
25
5.13 Diagnóstico diferencial.
Los pacientes con CDG Ia en comparación con los pacientes CDG Ib muestran síntomas
neurológicos, retraso psicomotor, hipoplasia cerebelosa, estrabismo o anomalías en lipocutaneous
en su diagnóstico clínico. Sin embargo, en el síndrome CDG Ia se presentan características
comunes a CDG Ib como hiperinsulinismo asociado con trombosis, insuficiencia hepática y
digestiva. Esto explica la necesidad de realizar un diagnóstico preciso con estudios enzimáticos y
moleculares para confirmar el síndrome a cual grupo pertenece CDG Ia y Ib (22).
En algunos estudios, el diagnóstico diferencial se realiza con la determinación de la estructura de las
cadenas de carbohidratos de las glicoproteínas. Para esto se lleva a cabo la separación de
transferrina sérica por los métodos de isoelectroenfoque y SDS-PAGE, con el que se identifica en la
proteína núcleo la ausencia de las cadenas laterales de carbohidratos, como también sucede en el
diagnóstico de CDG Ia. Para establecer el defecto enzimático de la PMI, se realiza la cuantificación
de la actividad específica de la enzima, esta se lleva a cabo tanto en fibroblastos como en
leucocitos, estas últimas células se recomiendan para determinar el estado heterocigoto de la
enfermedad y en fibroblastos para analizar más detalladamente el fallo a partir de los valores de Km
y Vmax de controles, pacientes y en familiares consanguíneos (10).
Apoyando el análisis enzimático, se realiza la determinación de los defectos moleculares de la PMI,
utilizando la secuencia de cDNA para diseñar los primers y realizar la amplificación por PCR. A
partir del ARNm se amplifica el gen por medio de RT-PCR, usando fibroblastos control o células
de hepatomas del paciente y de sus familiares consanguíneos, para así identificar las mutaciones
que generan la deficiencia enzimática (10).
5.14 Tratamiento.
El diagnóstico de CDG-Ib en la primera infancia es pertinente ya que es el único de los defectos de
glicosilación para el que se ha desarrollado un tratamiento eficaz, el cual consiste en la
administración oral de manosa. La maquinaria enzimática del cuerpo fosforila la manosa exógena
por medio de una hexocinasa convirtiéndola en manosa-6-fosfato, contrarrestando el defecto
enzimático y normalizando la concentración de este compuesto que es fundamental en la N-
glicosilación de proteínas (6).
Distintos estudios han demostrado que la terapia con manosa mejora la condición general y los
síntomas digestivos reportados en todos los pacientes (36-38). Con ella, la hipoglucemia y el
vómito se estabilizan en pocas semanas, el estado general de los pacientes mejora rápidamente y las
26
anormalidades biológicas como la diarrea se normalizan tras el primer año de tratamiento. En
algunos casos la hepatomegalia puede persistir (22, 37).
Martín Hernandez et al describieron en 2008 un tratamiento a base de manosa oral en un paciente
varón, primer hijo de padres no consanguíneos de origen búlgaro, cuyo cuadro clínico inició a los 4
meses con estancamiento en la curva ponderal de peso. A los 6 meses presentó hipoglucemia
sintomática (28 mg/dl) en el curso de un cuadro infeccioso. El examen físico mostró signos de
desnutrición, hoyuelos en la piel y hepatomegalia. En el análisis general se destacaba ALT
(Alanina aminotransferasa) de 251 U/L. El estudio del metabolismo intermediario mostró un
porcentaje de transferrina deficiente de carbohidratos (% CDT) en suero muy alto 42 %. En los
resultados de coagulación se observó un descenso de proteínas S y C, antitrombina III y factor XI.
El tratamiento con manosa se inició al séptimo mes de vida en cuatro dosis de 150 mg/kg diarias,
con lo que se obtuvo un aumento balanceado del peso en los dos meses siguientes. Al noveno mes
se introdujo gluten en la dieta. En el mes 12 se inició una diarrea prolongada con pérdida de peso,
hipoproteinemia e hipoalbuminemia, por lo que se retiró el gluten de la dieta y se suministró la
manosa en dosis bajas, lo que favoreció el aumento de peso y la desaparición de la diarrea. Sin
embargo, una biopsia duodenal mostró una atrofia subtotal de vellosidades intestinales. La dosis de
manosa fue incrementada a 200 mg/kg en 5 dosis (1g/kg/día) y 1 mes después la ALT descendió a
123 U/L. Después de 6 meses la ALT se encontró un descenso a 32 U/L. El estudio de coagulación
fue óptimo y el % CDT fue del 6 % con una evidente mejora del perfil de glicosilación de
transferrina. A los 32 meses de vida se efectuó una segunda biopsia que resultó normal al igual que
el linfograma de la mucosa intestinal. A los 3 años de edad el paciente no presentó síntomas, su
dieta fue libre y su desarrollo físico y psicomotor fueron normales (5).
Un estudio realizado por de Lonlay P. en el 2009, recomendó la suplementación de manosa oral,
debido a su buena absorción en el intestino. El nivel de manosa sérico en individuos normales en
estado pre-prandial es de 46-65 mM. Los pacientes con CDG Ib tienen una concentración menor de
10 mM. Al suplementar este carbohidrato de forma oral como tratamiento el propósito es lograr
obtener una concentración sérica mayor a 100 μmol/L después de una hora de su ingesta. La dosis
de manosa recomendada para pacientes con deficiencia de la fosfomanosa isomerasa es de
0,2g/kg/4h al inicio del tratamiento (22). Dada la alta afinidad de la hemoglobina por la manosa
comparada con la glucosa, es de utilidad el monitoreo de la HbA1C para prevenir una sobredosis de
manosa, porque los niveles de ésta se correlacionan con los de manosa (36).
5.15 Enfermedades espejo.
Todas las enfermedades de los desórdenes del metabolismo presentan características clínicas que
son compartidas con otro tipo de enfermedades. Para el caso de la CDG Ib sus características
clínicas pueden ser confundidas con:
27
5.15.1 Fibrosis hepática congénita.
Es una enfermedad hereditaria, autosómica recesiva y una de las principales causas de la
hepatoplesnomegalia e hipertensión portal. Se detecta principalmente en niños y adultos jóvenes
(39). Se caracteriza por la presencia de espacios porta fibróticos y alargados que contienen
múltiples conductos biliares dilatados comunicados con el árbol biliar. Además, se da la
proliferación de los ductos biliares como uno de los componentes esenciales de la lesión (40, 41).
Aún se desconoce el mecanismo de desarrollo de los múltiples ductos biliares, frente al cual se ha
planteado la hipótesis de una disgenesia o desproporcionado crecimiento del epitelio biliar. La
arquitectura lobular normal del hígado se conserva y la función hepatocelular es buena. En la
mayoría de los casos, puede estar asociada con una ectasia tubular renal anómala (39, 42).
La histopatología de la fibrosis hepática congénita no es uniforme. En algunos pacientes se
caracteriza por el alargamiento de los tractos portales que contienen un número variable de formas
anormales del ducto biliar en la forma focal. En otros pacientes, el hígado muestra bandas de tejido
conectivo con espesor variable unido adyacentemente al tracto portal de forma difusa. Se
reconocen cuatro variables clínicas de la fibrosis hepática congénita: en su forma más común se
presenta la hipertensión portal. Existe una forma en donde la colengitis es el rasgo dominante y la
hipertensión está ausente. En una tercera forma, la fibrosis hepática congénita se puede presentar de
forma mixta con hipertensión portal y colengitis. Finalmente, la cuarta es una forma latente (39).
5.15.2 Intolerancia hereditaria a la fructosa (HFI).
La intolerancia hereditaria a la fructosa HIF (por sus siglas en inglés hereditary fructose
intolerance), es un desorden autosómico recesivo, que se presenta por la deficiencia de la enzima
fructosa 1 fosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) en hígado, corteza renal e intestino delgado (43, 44). Este
desorden, fue reportado por primera vez por Chambers y Prad en 1956 en una mujer adulta de 24
años de edad. Fue tipificado por la descripción de la paciente después de consumir azúcar y
fructosa, ella presentó síntomas fóbicos, desmayos, dolor abdominal, náuseas y no mostró ninguna
sintomatología después de ingerir glucosa (43).
Estudios de HFI en lactantes y niños mostraron un trastorno más alarmante en pacientes que no
pueden evitar el consumo de azucares tóxicos para su organismo, siendo los bebes los más
afectados. Los recién nacidos no presentaban síntomas debido a que solo consumían lactosa
(disacárido compuesto de galactosa y glucosa). Sin embargo, cuando empezaban el consumo de
alimentos sólidos que contenían azúcar añadido (frutas y verduras) aparecían los síntomas
característicos de vómitos, náuseas y sudoración, asociados con hipoglucemia y acidosis metabólica
(43).
28
En la HFI, se presentan daños hepáticos y renales (43, 45). Según la cantidad de fructosa y/o
sacarosa ingerida la presentación clínica puede ser aguda, con vómitos, hemorragias, ascitis y fallo
hepático, o bien una evolución más subaguda con vómitos intermitentes, diarrea crónica y fallo de
medro. Los pacientes presentan desde el punto de vista clínico: hipoglucemia,
hipertransaminasemia, hipofosfatemia, hipericemia, hipermagnesemia y alteraciones de las pruebas
de coagulación vitamina K dependientes (45).
5.16 Gen MPI y mutaciones.
La fosfomanosa isomerasa humana (hPMI) es codificada por el gen MPI localizado sobre el brazo
largo del cromosoma 15, región 2, banda 24 y subbanda 1 (15q24.1) (46). El gen completo tiene un
tamaño de 5 kb, y está conformado por 8 exones con tamaños desde 45 pb hasta 719 pb y 7 intrones
con tamaños que van desde 314 pb a 3 kb (Tabla 4 y 6) (13). El mRNA de la hPMI ha sido
encontrado en todos los tejidos estudiados, sin embargo, se ha visto expresado más notablemente en
corazón, cerebro y músculo esquelético (purification cDNA cloning).
Tabla 4. Tamaño en pb de los exones e intrones del gen MPI.
EXÓN TAMAÑO (pb) INTRÓN TAMAÑO (pb)
1 45 1 442
2 128 2 634
3 201 3 1500
4 142 4 336
5 183 5 3000
6 174 6 690
7 209 7 314
8 719 ---- ----
Tomado de Schollen, E. et al, (13).
Schollen E. et al, (2000) hicieron un estudio de las mutaciones a partir de DNA genómico en
fibroblastos de tres pacientes (A, B y C) homocigotos para las mutaciones M51T (c. 152T > C),
D131N (c. 391 G > A) y R152Q (c.457G > A) respectivamente. Los pacientes A y C provenían de
padres consanguíneos. En el paciente B se encontró una mutación del cambio de un aminoácido
por otro en el exón 5, originada por un cambio de G356A, que produjó en la proteína el cambio
R219C. En este paciente se encontró un desequilibrio en los alelos materno y paterno y al
secuenciar a nivel genómico se encontró una segunda mutación que correspondía a una [166insC] +
[167insC] del exón 3 (47).
29
Se han encontrado diversas mutaciones en el gen MPI (Tabla 5) y se han hallado mutaciones
exónicas que pueden ser localizadas en el cDNA (Tabla 4).
Tabla 5. Mutaciones conocidas del gen MPI y manifestaciones clínicas asociadas.
Cambio de base nitrogenada Cambio de aminoácido Manifestaciones clínicas
c.152T>C
M51T
Fibrosis hepática, retraso
psicomotor leve.
c.166-167insC Frameshift Enteropatía, trombosis.
c.656G>A R219Q Enteropatía, trombosis.
c.391G>A
D131N
Fallo de medro, fibrosis
hepática, enteropatía,
hipoglucemia.
IVS4-1G>C
Aberrant splicing
Hipoglucemia, trombosis,
enteropatía, fibrosis hepática.
c.1252G>A
R418H
Hipoglucemia, trombosis,
enteropatía, fibrosis hepática.
c.457G>A
R152Q
Vómitos, diarrea, fibrosis
hepática.
c.656G>A
R219Q
Enteropatía, fibrosis hepática,
acidosis tubular.
c.748G>A
G250S
Enteropatía, fibrosis hepática,
acidosis tubular.
c.304C>T
S102L
Diarrea, hipoglucemia, fibrosis
hepatica, coagulopatía.
c.413T>C
M138T
Diarrea, hipoglucemia, fibrosis
hepatica, coagulopatía.
c.764A>G
Y255C
Hipoglucemía, coagulopatía,
enteropatía, hepatopatía.
c.1193T>C
I398T
Hipoglucemía, coagulopatía,
enteropatía, hepatopatía.
Tomado de Hernandez et al, y Schollen (5, 13).
30
Tabla 6. Secuencia bases nitrogenadas en el cDNA del gen MPI.
Tomado de ensembl (48).
31
5.17 Fosfomanosa isomerasa (PMI).
La fosfomanosa isomerasa ha sido descrita en eucariontes y procariontes.
5.17.1 Tipos de PMI.
La fosfomanosa isomerasa involucra el catabolismo de manosa y la producción de GDP-D-manosa,
que son necesarios en la manosilación de estructuras tales como exopolisacaridos, lipopolisacáridos
y glicoproteínas. Proudfoot G et al. 1994 define tres tipos de PMI: la tipo I, proveniente de
aspaergillus nidulans, Candida albicans, Eschericia coli, Homo sapiens, Saccharomices cerevisiae
y Sallmonela entérica; la tipo II, es una proteína bifuncional llamada fosfomanosa isomerasa-
guanosina difosfo-D-manosa pirofosforilasa (PMI-GMP) proveniente de Pseudomonas aeruginosa
y Xanthomonas campestris; la tipo III, proviene solamente de Rhizobium meliloti (47).
5.17.2 Fosfomanosa isomerasa humana (hPMI).
La hPMI es un monómero formado por 440 residuos de aminoácidos su sitio catalítico coordina con
el ión Zn++
y agua (13, 49). La purificación de la enzima se ha llevado a cabo tras ser aislada en
placenta con una pureza del 98% y un peso molecular aparente de 43 kDa obtenido por
electroforesis PAGE-SDS (50). Su secuencia de aminoácidos es idéntica en solo un 19% con las
PMI tipo I y III en este grupo conservado, descritas en el párrafo anterior. Sin embargo, en el sitio
activo la secuencia de aminoácidos es común a todas (Figura 8) (13).
32
A)
B)
Figura 8. A) Secuencia de aminoácidos de la hPMI y B) Estructura tridimencional de la
hPMI. A) Los aminoácidos que conforman las α-helices están representados por el color verde y los
aminoácidos de las hojas plegadas-β por el color azul. B) Estructura secundaria tridimensional de la hPMI
determinada por el programa Algoritmo de estimación de enlaces de hidrógeno DSSP (por sus siglas en inglés
hydrogen bond estimation algorithm). Tomado de, Xiao J. et al 2006 (51).
5.17.3 Interacción del complejo hPMI con la M6P.
La hPMI establece complejos de unión con la forma cíclica y lineal de la M6P con formación de
puentes de hidrógeno. En la primera interacción, el fosfato del azúcar está unido al grupo Arg295-
Lys301. El hidroxilo del C3 de la manosa 6 fosfato establece un puente de hidrógeno con el O del
hidróxilo de la Ser108, de igual forma el hidroxilo del C4 lo hace con el nitrógeno de la amina de la
Arg295. El hidroxilo del C2 de la M6P no está en contacto directo con la proteína, pero interactúa
con la Tyr 278 mediante un puente de hidrógeno con una molécula de agua como intermediario. El
hidroxilo de la manosa 6 fosfato del C1 forma un puente de hidrógeno con el nitrógeno de la cadena
lateral de Lys135. El oxígeno del anillo está a poca distancia del enlace de hidrógeno del grupo ε-
amino de la lys135 quien le dona un protón. Este residuo de Lys135 podría ser el responsable de la
apertura del anillo de M6P en la enzima hPMI (Figura 9) (51).
33
Figura 9. Representación de la interacción entre la estructura cíclica de la M6P con el sitio
activo de la enzima hPMI. Tomado de, Xiao J. Et al 2006 (51).
En el caso que el complejo hPMI y la M6P estén en su forma lineal, el grupo fosfato del azúcar
interactúa mediante un puente salino y un puente de hidrógeno con la Arg295, la cual ancla a los C1
y C2 de la M6P en el sitio activo. La unión del Zn2+
con la M6P se da mediante un enlace
coordinado entre este y los átomos O1 y O2 de esta con desplazamiento de dos moléculas de agua,
mientras una tercera permanece unida al ión para estabilizar su carga. Al comparar ambas
interacciones se encuentra que en el complejo hPMI con la forma lineal del sustrato interacciona
mejor con el Zn2+
(Figura 9). Tanto el C1 como C2 de la M6P están en ambos casos localizados
dentro del ambiente hidrofóbico formado por la Tyr278 y la Met287 (51).
5.17.4 Mecanismo de acción (hPMI, E.C 5.3.1.8).
La enzima citosólica fosfomanosa isomerasa (hPMI, E.C 5.3.1.8) tipo I, metal dependiente, que
como ya se mencionó para su actividad catalítica requiere como cofactor un átomo de zinc, es la
responsable de la producción endógena de manosa 6 fosfato a partir de fructosa 6 fosfato (52, 53).
El mecanismo de acción aún no ha sido completamente elucidado, sin embargo los resultados de
algunos estudios argumentan que la reacción de isomerización reversible entre la M6P y la F6P
catalizada por la PMI se da mediante la transferencia de un protón del carbono numero 2 al grupo
carbonilo del carbono número 1 y el segundo, es por una transferencia de hidrógeno de un sustrato
reducido al carbono 1 portador del grupo carbonilo seguido de la transferencia de un protón del
carbono 2 al 1 (híbrido directo) (49). El primer mecanismo ha sido explicado por la formación de
34
un 1,2-cis-enediol como intermediario de alta energía; este mecanismo seria homólogo a la
isomerización catalítica de la fosfoglucosa isomerasa (PGI) (Figura 10A ) (54, 55). En el
mecanismo propuesto número dos, la transferencia podría darse mediante la formación de un
híbrido directo, el cual también ha sido reportado para las reacciones catalizadas por la xilosa
isomerasa (56, 57) y la ramnosa isomerasa (Figura 10B) (58).
Figura 10. Mecanismos de reacción hipotéticos para la transposición de hidrógenos entre los
carbonos 1 y 2 de la M6P y la F6P en la isomerización catalizada por la hPMI. A) Formación del
intermediario de alta energía 1,2-cis-enediol, B) Mecanismo de cambio híbrido directo. Tomado de Berrisford
JM. et al. 2006 (59).
Se debe entender que la interacción entre la enzima hPMI con la M6P en su forma cíclica y lineal
como se muestra en la figura 11 A y B respectivamente, permite una mejor interpretación de la
reacción catalítica, así como comprender que las isomerasas en su sitio activo contienen un ion
metálico y siguen el mecanismo de cambio híbrido (56). En aquellas que no lo presentan, la
reacción se da mediante la formación de un intermediario 1,2-cis-enediol (51). Este mecanismo de
reacción fue propuesto por Gracy y Noltman (53), en donde el zinc coordina con el carbonilo del
carbono 1 y el oxígeno del hidroxilo en el carbono 2, con esto se activa el α-hidrógeno del carbonilo
y es removido por el nitrógeno no protonado de un grupo imidazol para formar un intermediario
enediol transitorio. Según este modelo, la base catalítica involucrada es un residuo de histidina
presente en el sitio activo (52, 53).
35
Figura 11. Resumen esquemático de la interacción del sitio activo de la hPMI con M6P: A) En
su forma cíclica y B) En su forma lineal. Se observa que la enzima presenta mayor afinidad por la
forma cíclica. Sin embargo, la isomerización reversible de la M6P a F6P requiere de la apertura previa del
anillo. Los residuos de aminoácidos más relevantes en la interacción son: Lys99, Ser108, Gln110, His112,
Lys135, Glu137, His276, Tyr278 and Arg295. Tomado de, Xiao J. et al, 2006 (51).
Como se explica en la figura 11, es necesario abrir la molécula cíclica de M6P, lo que podría ser
catalizado por el residuo de Lys135 presente en el sitio activo de la hPMI. En la figura 11 B el zinc
coordina con el carbonilo del C1 y el hidroxilo del C2, esto mediaría la transición del protón entre
los átomos O1 y O2. En las proximidades del C1 y C2 los aminoácidos residuales Lys135, His112,
Lys99 y Glu137 actúan como bases catalíticas sobre el α-hidrógeno de C2 (51).
Los resultados de algunos estudios computacionales basados en simulación del complejo hPMI-
M6P por medio de dinámica molecular, argumentan que debido a las distancias entre el α-hidrógeno
del C2 y los grupos funcionales de los aminoácidos presentes en el sitio activo, ninguno de estos
podría desprotonarlo, lo que hace que el mecanismo de formación del enediol sea poco probable.
Por lo anterior, se favorece el mecanismo de cambio híbrido en el que el Zn2+
sirve como mediador
en el movimiento del hidrógeno entre O1 y O2, mientras que la presencia de la Tyr278 genera un
ambiente hidrofóbico provocando la transferencia de cambio híbrido, los demás aminoácidos
presentes en el centro activo estabilizarían la carga del ión metálico (51).
36
5.17.5 Inhibición de la PMI tipo I.
Estudios realizados sobre la PMI tipo I, han demostrado que agentes como el 8-hidroxiquinolina,
EDTA, o-fenantrolina, α-dipiridil, cisteína y ditiotreitol pueden inhibirla en procesos dependientes
de tiempo (52). La efectividad de estos agentes está dada por su afinidad por el zinc, y puede
evitarse, si se bloquean sus sitios de coordinación con átomos metálicos. De acuerdo a esto y con
estudios de absorción atómica, se demostró que el EDTA genera la apoenzima inactiva por la
captura del zinc (52).
El decrecimiento de la actividad de la enzima, puede deberse a agentes quelantes sin que se deba
necesariamente a su capacidad para capturar metales. La fosfomanosa isomerasa es inhibida por los
agentes mencionados en el párrafo anterior, siguiendo una cinética de primer orden con respecto a
la enzima. Los compuestos que contienen grupos tiol, se caracterizan por sus propiedades
reductoras, sin embargo en los ensayos de inhibición realizados sobre la PMI por Lenz G, Martell
A. en 1964, se determinó que estos compuestos tenían la capacidad para unirse a metales
ocasionando la disminución en la actividad enzimática, como es el caso de la cisteína y el DTT
(ditiotreitol) que forman quelatos bidentados estables con metales de importancia biológica (60), y
son inhibidores considerablemente más efectivos que otros tioles como el glutatión reducido y el
mercaptoetanol que tienen una baja afinidad por los metales (61).
5.18 Actividad en fibroblastos y leucocitos.
Se han reportado estudios del rango actividad enzimática específica de la enzima PMI en leucocitos,
fibroblastos e hígado (Tabla 7) (10, 62).
Tabla 7. Valores de actividad específica reportados en fibroblastos, leucocitos e hígado.
ProtocoloNumero de
individuos
Tejido o
Células
Valores de
referencia
nmol/h. mg de
proteína
Valores de
referencia
nmol/min. mg
de proteína
Actividad
enzimática
media
nmol/h. mg
de proteína
Valores de
referencia
nmol/min.
mg de
proteína
Autor
Fibroblastos 844,030-2043 14,7-34,7 1443,46 24,7
Luecocitos 994,77-1224 16,6-20,04 1086 18,1
Fibroblastos 1370-2500 22,48-41,03 1935 31,75
Higado 1550-1770 25,43-29,049 1670 27,23
Leucocitos 860-1800 14,06-29,54 1270 20,84
Tris-HCl 40 mM pH 7.4, 6mM
MgCl2, 5 mM
Na2HPO4/KH2PO4, 1 mM
NADP+, 100 mU PGI, 500 mU
G6PDH, 1mM M6P, 40 μg
proteína, temperatura ambiente,
2 h
Niehues R.
et.al (1997)
HEPES 50 mM pH 7.1, 6mM
MgCl2, 0.6 mM NADPH,
10μg/mL PGI, 2 μg/mL
G6PDH, 0,5 mM M6P, 40 y 20
μg de proteína, incubación a 37
°C, 1h, La reacción fue parada
con Carbonato/Bicarbontato de
sodio
T. J. de
Koning et.
Al (1998)
12
15
37
6 METODOLOGÍA.
6.1 Recolección de muestras.
Se recolectaron 32 muestras, 22 de niños donadas por la universidad de los Andes 13 de género
masculino y 8 femenino y 10 adultos (5 hombres y 5 mujeres) de diferente género y edad donados
por la universidad Distrital Francisco José de Caldas. Todas las muestras fueron obtenidas
mediante consentimiento informado (Anexo 3). Se extrajo 5mL de sangre venosa con heparina
(tubos de tapa verde) como anticoagulante y se realizó la separación de los leucocitos de inmediato.
Como criterio de exclusión no se tuvieron en cuenta donantes que presentaran hepatomegalia,
fibrosis hepática, enteropatía con pérdida proteica, hipoglucemia con hiperinsulinemia y diabéticos
para las muestras control y como criterios de inclusión que fueran donantes fenotípicamente sanos.
6.2 Procedimiento para obtención de leucocitos.
Para el aislamiento de leucocitos se utilizó el método modificado de Kampine et al 1996 y Shapira
et al 1998 como se describe a continuación.
6.2.1 Preparación dextrán-heparina.
En un balón volumétrico aforado de 100 ml se pesó 5.0 g de dextrán, 0.7 g de cloruro de sodio y se
adicionó un volumen correspondiente a 6000 UI de heparina (Roche Liquemine). Se completó a
volumen final con agua destilada y se almacenó a 4°C.
6.2.2 Preparación cloruro de sodio 1.7 % (p/v).
Se pesó 1.7 g de cloruro de sodio (sigma 98888) en balón aforado y se completó con agua destilada
a 100 mL.
6.2.3 Obtención de leucocitos de sangre completa.
En un tubo de ensayo heparinizado con capacidad para 4 mL se adicionó 4 mL de sangre venosa y
se homogenizó suavemente. La sangre completa fue transferida a un tubo de vidrio con capacidad
para 15 mL, al cual se agregó 2 mL del reactivo dextrán-heparina, la suspensión se mezcló
suavemente por inversión del tubo de ensayo y se dejó en reposo durante 45 min a 4°C. Luego, se
separó el sobrenadante que contenía los leucocitos y se colocó en tubo plástico evitando al máximo
la contaminación con eritrocitos y se centrifugó a 2000 r.p.m. durante 5 min. El sobrenadante fue
descartado y al pellet que contenía los leucocitos se le adicionó 2 ml de agua destilada, agitando con
38
varilla de vidrio durante aproximadamente 30 segundos, las muestras se centrifugaron a 2000 r.p.m,
se eliminó nuevamente el sobrenadante por inversión del tubo y se adicionaron 2 mL de agua
destilada, se agitó con varilla de vidrio por 30 seg. y sobre ésta se agregó 2 mL de cloruro de sodio
1.7 % (p/v), se homogenizó y centrifugó a 20000 r.p.m. durante 3 min. Los lavados se repitieron
hasta que el sedimento de leucocitos no presentó ninguna contaminación con eritrocitos o
hemoglobina y por último se re suspendieron entre 400- 600 μl de agua destilada y se almacenaron
a -20°C.
6.3 Lisado de leucocitos.
Los leucocitos aislados de los donantes fueron lisados, mediante un sonicador ultrasonic Cell
Disrruption W-220, con una salida de 3,5 Hz, con Tune de 20, en baño de hielo, con ciclos de 15
segundos de sonicación y 30 segundos de reposo para liberar la enzima de interés y fueron
almacenadas a -20°C hasta su uso.
6.3.1 Cuantificación de proteínas en leucocitos.
Los leucocitos sonicados fueron descongelados y mantenidos en frío mediante un bloque de gel
refrigerante y las proteínas fueron cuantificadas por el método de Folin-Lowry el cual fue
modificado por Ayala A. 2009 (Tabla 8) (63).
39
Tabla 8. Curva de calibración de albumina sérica bovina mediante el método de Folin-lowry.
BlacoPatrón BSA
25 mg/dL
Patrón BSA
50 mg/dL
Patrón BSA
100 mg/dL
Patrón BSA
200 mg/dL
Muestra con
leucocitos
lisados
H2O 50 μL 43,75 μL 37,5 μL 25 μL -------
Patrón BSA
200 mg/dL------ 6,25 μL 12,25 μL 25 μL 50 μL 37,5 μL
Muestra con
leucocitos
lisados
------ ------ ------ ------ ------ 12,5 μL
SDS 1% 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL
Reactivo Cu 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL
Reactivo
Folin1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Longitud de
onda
Incubar a baño de Maria por 5 minutos a 55°C
Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos
620 nm
6.4 Preparación de enzimas:
Las enzimas auxiliares PGI y G6PDH que se encontraban liofilizadas fueron guardadas a –20 °C
hasta su preparación.
6.4.1 Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (Sigma-G6378):
- 221 U/ mg de proteína
- 173 U/mg de sólido
- 0,6 mg de sólido
- Liofilizada
Una parte de la enzima fue disuelta en 1 mL de HEPES 100 mM pH 7,1 y la cantidad de proteína
fue cuantificada por el método de BCA (Pierce TM
BCA Protein Assay KIT) para determinar la
actividad específica de la enzima y poder obtener concentraciones finales de 0,6 U y 1 U en la
mezcla de reacción enzimática en ensayos independientes. Lo anterior, debido a que el laboratorio
no cuenta con una balanza analítica para pesar una cantidad exacta en el orden de los microgramos.
Una vez diluida fue almacenada a -20 °C.
40
6.4.2 Fosfoglucoisomerasa (Sigma-P9544):
- 384 U/mg de proteína
- 346 U/mg de sólido
- 2,89 mg de sólido
- Liofilizada
Una parte de la enzima fue disuelta en 0.5 mL de HEPES 100 mM pH 7,1 y la cantidad de proteína
fue cuantificada por el método de BCA (Pierce TM
BCA Protein Assay KIT) para calcular la
actividad específica de la enzima y poder obtener concentraciones finales de 0,6 U y 1 U en la
mezcla de reacción enzimática en ensayos independientes. Lo anterior, debido a que el laboratorio
no cuenta con una balanza analítica para pesar una cantidad exacta en el orden de los microgramos.
Una vez diluida fue almacenada a -20 °C.
6.4.3 Cuantificación de PGI y G6PDH mediante el método BCA.
Para la cuantificación de la PGI y la G6PDH se realizó una curva de calibración de BSA (Albúmina
sérica bovina en 0.9 % de solución salina conteniendo 0,05 % de azida de sodio) se preparó una
solución estándar de 2000 μg/mL la cual fue diluida mediante diluciones independientes con agua
destilada en viales de 0,2 mL, para obtener concentraciones de 200 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL,
800 μg/mL, 1000 μg/mL, 1250 μg/mL y 1500 μg/mL. Se trabajó con el KIT Pierce TM
BCA Protein
Assay mediante el cual se preparó en un tubo falcón de 15 mL la solución de trabajo de ácido
bicinconínico al mezclar en proporción 49:1 la solución de trabajo A (carbonato de sodio,
bicarbonato de sodio, ácido bicinconínico en 0.1M NaOH) y la solución de trabajo B (sulfato de
cobre al 4%), la solución fue protegida de la luz con papel aluminio durante todo el ensayo. Las
muestras de las enzimas fueron procesadas por duplicado, como también cada uno de los puntos de
la curva de calibración y la lectura se realizó en un lector de microplacas VariosKan Flash, a una
longitud de onda λ 562 nm (Tabla 9). Finalmente esta fue corregida por mínimos cuadrados.
41
Tabla 9. Curva de calibración de albúmina sérica bovina mediante el método de ácido
bicinconínico y cuantificación de las enzimas G6PDH y PGI.
Muestra
enzima PGI
Muestra
enzima
G6PDH
200 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 800 µg/mL1000
µg/mL
1250
µg/mL
1500
µg/mL
BSA 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL
Enzimas PGI
X mL/0,5 mL5 µL
Enzima G6PDH
X mg/mL5 µL
Solucion de
trabajo 49:1300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL
Tiempo de
incubación
Longitud de
onda
Estándares
30 minutos a 37 °C
562 nm
6.5 Preparación buffer de lisis.
Se preparó 50 mL de solución HEPES 20 mM (Sigma-H3375) en agua Milli-Q tipo I, se ajustó el
pH a 7,1 con NaOH 5 N. Del anterior buffer se tomó una alícuota de 20 mL y se le agregó 25 mM
de KCl, 1 mM de DTT (Sigma-Roche 10197777001), 10 μg/ mL de leupeptina (Sigma-L2884), 10
μg/ mL de antipaina (Sigma-10791), finalmente se completó a volumen final de 50 mL y se
almacenó a -4 °C.
6.6 Preparación buffer de reacción.
Para el ensayo enzimático se prepararon dos mezclas de buffer de reacción con el propósito de
establecer cuál era la mejor concentración de sustrato y enzimas auxiliares.
6.6.1 Preparación de HEPES 100 mM pH 7,1.
Se pesó 2,83 g de HEPES y se diluyó en 60 mL de agua Milli-Q tipo I, se ajustó a pH 7,1 con
NaOH 5 N, fue aforado a 100 mL con agua Milli-Q tipo I y se almacenó a -20°C.
42
6.6.2 Preparación buffer de reacción ensayo 1.
Se realizó el seguimiento de la actividad enzimática de 5 muestras tomadas aleatoriamente. En un
tubo estéril de 15 mL se tomó una alícuota de 4 mL de buffer HEPES 100 mM pH 7,1 conteniendo
11,90 mM de MgCl2, 0,71 mM de NADP+ ( Sigma-N0505), 0,72 U de G6PDH (Sigma-G6378) y
0,72 U de PGI (Sigma-P9544). Esta mezcla se llevó a un volumen final de 9 mL con HEPES 100
mM pH 7,1 y se mantuvo en baño de hielo.
6.6.3 Preparación buffer de reacción ensayo 2.
Para realizar el seguimiento de la actividad enzimática de 32 muestras, se tomó en un tubo estéril de
50 mL una alícuota de 10 mL de buffer HEPES 100 mM pH 7,1 (Sigma-H3375) conteniendo 11,90
mM de MgCl2, 0,71 mM de NADP+ (Sigma-N0505), 1,2 U de PGI (Sigma-P9544) y 1,2 U de
G6PDH (Sigma-G6378). Esta mezcla se llevó a un volumen final de 22.2 mL con buffer HEPES
100 mM pH 7,1 y se mantuvo en baño de hielo.
6.6.4 Preparación del sustrato manosa-6-fosfato para los ensayos 1 y 2.
Para el ensayo 1 se preparó una solución stock 3,6 mM, de manosa 6 fosfato (Sigma-M3655) en
HEPES 100 mM pH 7,1 y para el ensayo 2, una solución stock de manosa 6 fosfato 36 mM. Estas
dos soluciones fueron preparadas en fresco y mantenidas en baño de hielo.
6.7 Preparación de la Fosfomanosa isomerasa para el ensayo enzimático.
Una vez cuantificada la concentración de proteínas de los lisados celulares por el método de Folin-
Lowry para cada una de las muestras, estas fueron diluidas a una concentración de proteína de 40
µg/50 µL con buffer de lisis en un volumen final de 160 µL (aplicando los factores de dilución
correspondientes para cada una de las muestras, (Anexo 1), todos los lisados que contenían la
enzima fueron mantenidos en baño de hielo.
6.8 Protocolo para la determinación de la actividad enzimática de la Fosfomanosa
isomerasa (PMI).
Para la valoración de la actividad enzimática se utilizó un equipo VarioSkan Flash, el cual fue
programado por medio de software SkanIt 2.4.5 de la siguiente manera para realizar un método
cinético y espectrofotométrico simultáneamente con un ancho de banda de 5 nm y un tiempo de
medida de 100 ms. El ensayo se realizó en microplacas Eppendorf de 96 pozos (UV-VIS 96/F).
Todas las muestras fueron procesadas por duplicado para lo cual se adicionó a cada pozo 50 µL del
lisado ajustado previamente a 40 µg de proteína y mediante inyector se le agregó 200 μL de buffer
43
de reacción que contenía 100 mM HEPES pH 7.1, 10 mM MgCl2, 0.6 mM de NADP+, el cual fue
mantenido en baño de hielo durante la dispensación, y se probaron dos concentraciones de las
enzimas auxiliares 0,72 U y 1,2 U tanto para la fosfoglucoisomerasa como para la glucosa-6-P
deshidrogenasa en dos ensayos independientes para que en la mezcla de reacción quedaran en una
concentración final de 0,6 U y 1 U. El equipo fue programado para que esta mezcla de reacción
fuera agitada a 300 rpm por 5 segundos. La reacción fue iniciada por la adición mediante inyector
de 50 µL de manosa 6 P la cual fue probada en concentraciones iniciales de 3,6 mM y 36 mM de
forma respectiva para cada uno de los ensayos. Para el blanco de reactivos se adicionaron todos los
componentes excepto el sustrato, el cual fue reemplazado por 50 µL de buffer de lisis. La reacción
se dejó estabilizar por 7 minutos antes de iniciar la lectura (Figura 12). Las muestras se incubaron a
37°C y la actividad fue leída a 340 nm, determinando el aumento de la concentración de
NADPH+H+ por cada minuto durante 2 horas (Tabla 10). Adicionalmente se corrió una curva de
calibración de NADPH+H+ con concentraciones de 0,075 mM, 0,15mM y 0.3 mM.
Tabla 10. Protocolo para la cuantificación de la actividad enzimática de la PMI.
REACTIVO Blanco Muestra-A Muestra-B
Lisado de leucocitos
ajustado a
40 µg de proteína en
Buffer de Lisis
50 μL 50 μL 50 μL
Buffer de Lisis
conteniendo: 20mM
de HEPES pH 7.1,
25 mM KCl, 1mM
ditiotreitol, 10 μg/ml
leupeptina y 10
μg/ml antipaint
50 μL ---------- ---------
Buffer de reacción
conteniendo: 100
mM HEPES pH 7.1,
11,90 mM MgCl2,
0.72 mM de NADP+,
enzimas auxiliares
0.72 U o 1.2 U,
fosfoglucoisomerasa
y glucosa-6-P
deshidrogenasa*
200 μL 200 200 μL
Manosa 6 fosfato 3,6
mM o 36 mM * -------- 50 μL 50 μL
Incubación a 37°C por 2 horas * Las enzimas auxiliares se probaron en dos concentraciones diferentes en los ensayos 1 y 2 de forma independiente.
* Las man 6 p con concentración inicial de 3,6 mM se utilizó en el ensayo donde el buffer de reacción contenía 0,72 U de
PGI y G6PDG y para el ensayo 2 se utilizó 1U PGI y G6PDH con una concentración inicial de man 6 P 36 mM.
44
Finalmente la actividad enzimática específica de la enzima fue calculada en nmol/h. mg de proteína
y nmol/min. mg de proteína, mediante una reacción acoplada en donde el sustrato manosa 6 P en
presencia de fosfomanosa isomerasa y su cofactor Mg2+
es transformada a fructosa 6 P que a su vez
se isomeriza mediante la acción catalítica de la fosfoglucosa isomerasa en presencia de Mg2+
a
glucosa 6 P, que produce por la acción de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa con su coenzima
NADP+
6 fosfogluco-lactona más NADPH+H+
(figura 12).
Manosa 6 P Fructosa 6 P
Fosfomanosa isomerasa
(PMI)
P
O
OHOH
OH
O
O-
O
O-
OH
O-
O-
O
P O OH
OH
OH
OH
O
Glucosa 6 P
Fosfoglucosa isomerasa
(PGI)
Mg2+
Mg2+
NADP+NADPH+H+
6 fosfogluco lactona
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa
(G6PDH)
P
O
O
OH
OH
OH
O
O-
O
O- P
O
OHOH
OH
OH
O
O-
O
O-
Figura 12. Reacción de acople llevada in vitro para la cuantificación de la actividad enzimática
de la fosfomanosa isomerasa.
6.9 Cálculo de actividad enzimática de la enzima Fosfomanosa isomerasa.
La actividad enzimática de la PMI se expresó en nmol/h. mg de proteína de acuerdo a la siguiente
ecuación:
𝑈
𝑚𝑔=
(𝐴𝑏𝑠 𝑀 − 𝐴𝑏𝑠 𝐵)(𝑣𝑡)(𝑓𝑐)
(𝜀)(𝑡)(𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎)(𝑓𝑑)
45
6.10 Curva de progreso de actividad enzimática contra el tiempo.
Para determinar el tiempo óptimo de lectura de la reacción y establecer el tiempo de actividad
enzimática, se procesó por duplicado la muestra No 21, para lo cual se adicionó 50 µL del lisado
ajustado previamente a 40 µg de proteína y mediante inyector se agregó 200 μL de buffer de
reacción (100 mM HEPES pH 7.1, 11,90 mM MgCl2, 0,72 mM de NADP+, 1,2 U
fosfoglucoisomerasa, 1,2 U glucosa-6-P deshidrogenasa). El equipo fue programado para que la
placa conteniendo el lisado (con la enzima PMI) fuera agitada junto con la mezcla de reacción a 300
rpm por 5 segundos. La reacción fue iniciada por la adición mediante inyector de 50 µL de 36 mM
manosa-6-P. Para el blanco de reactivos se adicionaron todos los componentes excepto el sustrato,
el cual fue reemplazado por 50 µL de buffer de lisis. La reacción se dejó estabilizar por 7 minutos
antes de iniciar la lectura. La muestra se incubó a 37°C y la actividad fue leída a 340 nm en un
lector de multiplacas VariosKan Flash, se determinó el aumento de la concentración de
NADPH+H+ por cada minuto durante 10 horas.
6.11 Ensayo de estabilidad del buffer de reacción.
Para determinar la estabilidad de las enzimas en el buffer de reacción se realizaron dos ensayos de
actividad, con un buffer de reacción recién preparado y un segundo buffer de reacción que tenía 58
días de preparado con toda la mezcla de reacción excepto NADP+ que fue adicionado al momento
del ensayo, este último había sido almacenado a -20°C. El ensayo se realizó con 5 muestras que
fueron tomadas al azar y probadas por duplicado. Se valoró la estabilidad del buffer de reacción
conteniendo una concentración final en la mezcla de reacción de 100 mM HEPES pH 7.1, 10 mM
MgCl2, 0.6 mM de NADP+, 1 U fosfoglucoisomerasa, 1 U glucosa-6-P deshidrogenasa y sustrato
Man 6 P con una concentración final de 6 mM, el cual fue almacenado a -20 °C en el intervalo de
tiempo mencionado. Para el blanco de reactivos se adicionaron todos los componentes excepto el
sustrato, el cual fue reemplazado por 50 µL de buffer de lisis. La reacción se dejó estabilizar por 7
minutos antes de iniciar la lectura. Las muestras se incubaron a 37°C y la actividad fue leída a 340
nm en un lector de multiplacas VariosKan Flash, determinando el aumento de la concentración de
NADPH+H+ por cada minuto durante 2 horas.
6.12 Análisis estadístico de la actividad enzimática específica de la fosfomanosa isomerasa
del grupo control.
Se realizó un análisis estadístico para el grupo control, con el fin de determinar si los datos se
comportaban dentro de una distribución normal, como también se determinó la varianza, valores
atípicos con la prueba de Dixon, coeficiente de variación y desviación estándar.
46
6.12.1 Análisis estadístico de los valores de la enzima fosfomanosa isomerasa por género.
Se distribuyeron las actividades enzimáticas por género para determinar si existían diferencias
significativas en la actividad de la PMI, para lo cual se aplicó un análisis estadístico descriptivo, la
prueba t y la prueba bilateral de Kolmogorov-Smirnov bajo los siguientes sistemas de hipótesis:
Ho No hay diferencias significativas en la media de actividad enzimática específica de ambos
géneros.
H1 Existe una diferencia significativa en las medias de actividad enzimática especifica de ambos
géneros.
Teniendo en cuenta que:
p-valor ≥ α= Se acepta H0
p-valor < α= Se rechaza H0
6.12.2 Análisis de la actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa por edad.
Las actividades fueron divididas en tres grupos de edad (0,6 - 4), (5 - 12), (13 - 27) años, para
determinar si existían diferencias significativas de actividad enzimática de la PMI y si presentaban o
no una distribución normal. Mediante un análisis estadístico se realizaron cuatro pruebas para
confirmar si la actividad enzimática en los tres rangos de edades se comportaba o no como una
distribución normal y para cada grupo se plantearon dos hipótesis:
6.12.2.1 Prueba de normalidad Kolmogorov- Smirnov.
Se utilizó la prueba de Kolmogorov - Smirnov para determinar si los datos cumplían con una
distribución normal, bajo el siguiente sistema de hipótesis.
H0 Los datos cumplen con una distribución normal.
H1 Los datos no cumplen con una distribución normal.
Teniendo en cuenta que:
p-valor ≥ α= Se acepta H0
p-valor < α= Se rechaza H0
47
6.12.2.2 Prueba homocedastidad por medio del Test de Breush-Pagan.
H0 Existe homocedastidicad entre la actividad enzimática y la edad del grupo control.
H1No existe homocedasticidad entre la actividad enzimática y la edad del grupo control.
Teniendo en cuenta que:
p-valor ≥ α= Se acepta H0
p-valor < α= Se rechaza H0
6.12.2.3 Prueba de Independencia del Test de Durbin-Watson.
H0 La actividad enzimática está influenciada por la edad.
H1 La actividad enzimática no está influenciada por la edad.
Teniendo en cuenta que:
p-valor ≥ α= Se acepta H0
p-valor < α= Se rechaza H0
6.12.2.4 Prueba de ANOVA.
Se realizó una prueba ANOVA, para determinar si la edad en estos 3 grupos influía en la actividad
media enzimática de la enzima PMI, para lo cual se plantearon dos hipótesis:
H0 La actividad media de la enzima no presenta diferencias significativas en los tres grupos de edad.
H1 Existe diferencia significativa en el valor de la media de actividad por lo menos en uno de los
grupos de edad.
Teniendo en cuenta que:
p-valor ≥ α= Se acepta H0
p-valor < α= Se rechaza H0
48
6.12.3 Determinación de los valores de referencia de actividad de la enzima PMI para el
grupo de control.
Se establecieron los valores de referencia de la actividad enzimática de la enzima PMI para el grupo
control por medio del programa estadístico RStudio, utilizando los valores de los cuartiles 0,025 y
0,975.
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
7.1 Recolección de muestras.
De las 32 muestras analizadas, 18 de género masculino y 14 de género femenino, se encontraron 22
niños de 0-13 años y 10 adultos de 18-27 años, 5 de género masculino y 5 de género femenino.
7.2 Cuantificación de proteínas en leucocitos.
La curva de calibración para la cuantificación de proteína por el método de Folin- Lowry construida
con patrones de albúmina sérica bovina de 25 mg/dL- 200 mg/dL permitió obtener un coeficiente de
correlación de 0,9916 al ser corregida por mínimos cuadrados y valores de proteínas para todos los
lisados en un rango de 89,7 mg/dL-342,8 mg/dL que correspondían a las muestras número 28 y 13
de género femenino y masculino con edades de 22 años y 8,15 años respectivamente (Tabla 11,
Figura 13 y Anexo 1).
Tabla 11. Curva de calibración de proteína por el método de Folin-Lowry.
Concentración
BSA mg/dLAbs
25 0,114 r^2= 0,9916
50 0,265 B=0,0041
100 0,488 A=0,0429
200 0,852
49
Figura 13. Curva de calibración de proteína por el método de Folin-Lowry.
7.3 Cuantificación de proteínas de PGI y G6PDH por el método de ácido bicinconínico
(BCA).
Para la determinación de la actividad específica de las enzimas PGI y G6PDH se construyó una
curva de calibración con patrones de albúmina sérica bovina de 200 µg/mL- 1500 µg/mL, la cual
fue cuantificada por el método de ácido Bicinconínico, para la que se obtuvo un coeficiente de
correlación de 0.993, esta permitió encontrar un valor de proteína de 637,37 µg/mL para la PGI y
para la G6PDH de 319, 45 µg/mL (Tabla 12 y Figura 14).
Tabla 12. Curva de calibración de proteína por el método de BCA.
Concentración
BSA ug/mLAbs
200 0,061
400 0,153 r^2= 0,997
600 0,229 b=3,695x10 -̂4
800 0,277 a=-6,523x10 -̂3
1000 0,347
1250 0,453
1500 0,559
637,37 0,228 PGI
319,45 0,111 G6PDH
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 50 100 150 200 250
Ab
s
Concentración BSA en mg/dL
50
Figura 14. Curva de calibración de proteínas por el método de ácido bicinconínico (BCA).
7.4 Protocolo para la determinación de la actividad enzimática de la Fosfomanosa
isomerasa (PMI).
Al comparar la actividad enzimática de la muestra n 3 de (190 nmol/h.mg de proteína) al utilizar
una concentración de sustrato final de 0.6 mM (Man 6 P) con la actividad de esta misma muestra al
emplear una concentración final de sustrato 10 X (6 mM), se encontró un aumento de actividad
enzimática especifica del 68% (600 nmol/h. mg de proteína), que muestra que los resultados
observados en este ensayo (Tabla 13) están en concordancia con lo publicado por Bisswanger Hans
2014, en la cual se ha observado que la velocidad de una enzima es directamente proporcional al
grado de saturación y que cuando se utiliza una concentración de sustrato igual al Km solamente el
16,7% de los sitios de unión de la enzima están ocupados, al utilizar 5 veces el valor de la
concentración del Km la enzima solo se encuentra saturada el 83% dejando 17% de sitios no
ocupados, cuando se emplea 10 veces la concentración del km se encuentra un 9% de sitios libres y
91% de saturación, y para una saturación “casi completa” de la enzima, se requiere 100 veces la
concentración del Km para obtener un 99% de los sitios ocupados y el 1% de los sitios se
encuentran no ocupados por el sustrato. Es decir, para este último caso existe un 1% de error
experimental y por lo tanto no se puede realizar del todo una completa saturación de la enzima. Por
lo tanto, en nuestro ensayo este resultado permitió establecer que la concentración del sustrato para
la determinación de la actividad enzimática debería realizarse a una concentración final 6 mM, es
decir, bajo condiciones saturantes (aproximadamente 10 X) y con un aumento de la concentración
de las enzimas auxiliares PGI y G6PDH a 1 U de concentración final respectivamente con estos
parametros, se obtuvo una mayor actividad enzimática específica lo cual está en concordancia con
Bisswanger Hans (2014), que sugiere que al aumentar la concentración de la enzima en la
reacción, ésta puede ser regulada incrementando su velocidad como se encontró en nuestro ensayo
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Ab
s
Concentración BSA (μg/mL)
51
2, al obtener un incremento en la aparición de NADPH+H+ que se reflejó en mayores valores de
absorbancia para las muestras analizadas una vez corregidas con sus respectivos blancos (con un
rango de 0,135 – 0,868 de absorbancia para las 32 muestras, Anexo 1), y para las muestras 3, 4, 5, 6
y 9 se encontró un rango de absorbancia de 0,171-0,827 que permitió hallar un máximo de actividad
de 600-2901 nmol/h. mg de proteína en comparación con el ensayo 1. Los resultados anteriores
permiten inferir valores inferiores de absorbancia para el NADPH+H+ y por lo tanto de actividad
enzimática específica (190-1207 nmol/h. mg de proteína) al emplear concentraciones finales
inferiores de sustrato (0,6 mM) y de enzimas auxiliares (0,6 U), obteniendo un rango de
absorbancia para la producción de esta coenzima de 0,054-0,344, una vez corregidas estas muestras
contra su blanco (Tabla 13). Los anteriores resultados están en concordancia con los valores de
actividad enzimáticas obtenidos por Niehues R. et al 1997 y T. J. de Koning et al. 1998 en donde se
reporta un valor máximo de actividad de 1800 y 1224 nmol/h. mg de proteína respectivamente para
estos estudios (Tabla 7). Por lo anteriormente expuesto se consideró trabajar en condiciones
saturantes de sustrato ya que no se observó ningún tipo de inhibición por éste para la enzima PMI.
Por lo tanto el protocolo estandarizado para la actividad enzimática en nuestro estudio consistió de
50 µL del lisado ajustado previamente a 40 µg de proteína al cual se le adicionó 200 μL de buffer
de reacción que contenía 100 mM HEPES pH 7.1, 11,9 mM MgCl2, 0.72 mM de NADP+, y 1,2 U
de las enzimas auxiliares fosfoglucoisomerasa (PGI), glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y
50 µL de 36 mM de manosa 6 P para obtener una concentración final 6 mM. La absorbancia del
NADPH+H+ producido por la actividad de la PMI en el ensayo fue leída a 340 nm por cada minuto
durante 2 horas, y se calculó la actividad específica de la enzima en nmol/h. mg de proteína.
Tabla 13. Comparación de las actividades enzimáticas de la Fosfomanosa isomerasa PGI,
G6PDH y del sustrato M6P.
52
No de
muestraAbs
Actividad
PMI
(nmol/h. mg
de proteína)
Actividad
PMI
(nmol/min.
mg de
proteína)
Abs
Actividad
PMI
(nmol/h. mg
de proteína)
Actividad
PMI
(nmol/min.
mg de
proteína)
Aumento de
la actividad
enzimática
especícfica
de la
fosfomanosa
isomerasa
(%)
3 0,054 190 3 0,171 600 10 68
4 0,232 813 14 0,446 1565 26 48
5 0,344 1207 20 0,827 2901 48 58
6 0,308 1081 18 0,689 2416 40 55
9 0,214 752 13 0,377 1323 22 43
Ensayo 1 Ensayo 2
Para la determinación de la actividad enzimática se construyó una curva de calibración de
NADPH+H+ con concentraciones de 0.3 mM, 0,15 mM y 0,075 mM que permitió calcular un
coeficiente de correlación de 0,999 y un valor de pendiente que determinó el coeficiente de
extinción en 6.413 L/mmol.cm (Tabla 14 y Figura 14). La pequeña diferencia del coeficiente de
extinción en nuestro ensayo con respecto al reportado para este compuesto 6,22 L/mmol*cm-1
a un
pH > 10 puede ser explicada porque nuestro estándar fue disuelto en un buffer HEPES 100 mM pH
7,1 (64).
Tabla 14. Curva de calibración de NADPH+H+.
Concentración
NADPH+H+
(mM) Abs
0,075 0,479 r^2=0,999
0,15 0,978 B=6,413
0,3 1,945 A=0,006
53
Figura 15. Curva de calibración de NADPH+H+.
7.5 Ensayo de actividad enzimática contra el tiempo.
El seguimiento de la actividad enzimática con la muestra No 21 durante 10 horas permitió
determinar que la actividad enzimática es lineal hasta 3,3 horas. Lo cual está en concordancia por lo
descrito por Bisswanger Hans en el 2014, estudio que resaltan la importancia de la determinación de
la velocidad en la parte lineal de la curva de progreso con el propósito de producir una señal directa
para la conversión de sustrato a producto y no obtener resultados erróneos y que muestren una. Por
lo tanto, en nuestro ensayo las muestras pueden ser leídas en cualquier punto del intervalo de 1- 3
horas, lo que permitió en nuestro ensayo realizar la lectura de todas las muestras en el intervalo
lineal a las 2 horas. Las pequeñas variaciones en actividad se presentaron a los 89 minutos y 234
minutos podrían explicarse a pequeños cambios de voltaje (Figura 16).
Entre los 300-400 min se observó una velocidad asintótica, que puede ser explicada por la
saturación de los centros activos de la enzima con el sustrato. También se halló una disminución en
la actividad después del minuto 400, que puede ser debida a un decrecimiento del sustrato,
disminución de la coenzima en su estado oxidado o inhibición de la actividad de la enzima por
cambio de pH generados por los productos de reacción que pueden afectar la estructura terciaría de
la enzima de una forma irreversible, ya que muy pocas enzimas resisten cambios drásticos de pH
(producción de hidrogeniones). Los resultados observados en la curva de progreso de formación
del producto contra el tiempo están en concordancia con lo descrito por diferentes autores ya que se
observó una región lineal y una no lineal en la curva de progreso. Este último comportamiento
descrito se puede presentar por influencias desestabilizantes en la estructura de la proteína
generadas por cambios en pH, temperatura o tipo de buffer, sin embargo en el experimento se
utilizó temperatura contante (37°C) y como sistema amortiguador HEPES que tiene una capacidad
débil para complejar iones, lo cual permitió que los iones divalentes en la mezcla de reacción
enzimática utilizados como cofactor (MgCl2) estuvieran a disposición tanto para la glucosa 6 fosfato
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
Ab
s
Concentración mM
54
deshidrogenasa como para la fosfomanosa isomerasa como cofactor sustituto del Zn (Figura 16)
(65).
Figura 16. Comportamiento de la actividad enzimática de la muestra No 21 durante 10 horas.
7.6 Ensayo de estabilidad del buffer de reacción.
Para determinar la estabilidad del buffer de reacción se realizaron dos ensayos de actividad con un
intervalo de 58 días de diferencia, utilizando 5 muestras por duplicado tomadas al azar, dónde se
valoró la estabilidad de las enzimas dentro del buffer de reacción (100 mM HEPES pH 7.1, 10 mM
MgCl2, 0.6 mM de NADP+, 1 U fosfoglucoisomerasa, 1 U glucosa-6-P deshidrogenasa) y con
concentración final de sustrato 6 mM de Man6P, el cual fue almacenado a -20°C en el intervalo de
tiempo mencionado contra su respectivo blanco de reactivos . Para el blanco de reactivos se
adicionaron todos los componentes excepto el sustrato, el cual fue reemplazado por 50 µL de buffer
de lisis. La reacción se dejó estabilizar por 7 minutos antes de iniciar la lectura. Las muestras se
incubaron a 37°C y la actividad fue leída a 340 nm, determinando el aumento de la concentración
de NADPH+H+ por cada minuto durante 2 horas. El ensayo de estabilidad del buffer de reacción
mostró una disminución para las 5 muestras de 11-27% en la actividad enzimática (Tabla 15). La
causa de este decrecimiento de la actividad enzimática puede explicarse por procesos de óxido-
reducción, debido a la producción de NADPH+H+
a partir de NADP+, que restringen la
disponibilidad del cofactor o la desestabilización por cambios de pH de la PGI y G6PDH (65). Sin
embargo, las enzimas mostraron un alto grado de estabilidad en comparación con otros estudios, los
cuales sugieren que la PMI disminuye drásticamente su actividad si la suspensión de éstas no se
realiza el mismo día del ensayo, los resultados podrían explicarse a que estas no fueron re
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 100 200 300 400 500 600
Ab
s
Tiempo (min)
55
suspendidas en agua, sino en buffer HEPES 100 mM pH 7,1 el cual le permite conservar su
actividad.
Tabla 15. Estabilidad de las enzimas PGI y G6PDH buffer de reacción.
No
Activididad
enzimática
(nmol/h. mg
de proteína)
Activididad
enzimática
(nmol/min.
mg de
proteína)
Activididad
enzimática
(nmol/h. mg de
proteína)
Activididad
enzimática
(nmol/min.
mg de
proteína)
Disminución de
la actividad
enzimática
específica d ela
fosfomanosa
isomerasa (%)
5 2901 48 2343 39 19
6 2416 40 1790 30 26
8 553 9 452 8 18
18 551 9 492 8 11
25 567 9 415 7 27
Ensayo día 1 Ensayo día 58
7.7 Análisis estadístico de la actividad enzimática específica de la fosfomanosa isomerasa en
el grupo control.
Para determinar los valores de referencia de la enzima PMI, se estudió un grupo control de 32
personas de 0,6 - 27 años de Bogotá, 14 de género masculino y 18 de género femenino. Las
muestras se analizaron en un lector de multiplacas VariosKan Falsh, se encontraron valores de
absorbancia para la producción de NADPH+H+ de 0.135-0.868 para las muestras 16 y 21 una vez
corregido contra su respectivo blanco (Anexo 1).
La enzima fosfomanosa isomerasa presentó un intervalo de actividad de 473 - 3045 nmol/h.mg de
proteína, estos valores pertenecían a dos niños de género masculino de 2,28 años (muestra 16) y a
de 5,3 años (muestra 21) respectivamente. Se encontró una media de actividad de 1330,26 nmol/h.
mg de proteína (Tabla 16).
56
Tabla 16. Determinación de la actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa en muestras
de leucocitos de individuos de 0-27 años por espectrofotometría UV.
No GÉNERO EDAD
Actividad PMI
(nmol/h. mg de
proteína)
Actividad
PMI
(nmol/min.
mg de
proteína)
1 F 24 852 14
2 M 18 648 11
3 M 12,27 600 10
4 F 11,82 1565 26
5 F 2,06 2901 48
6 M 0,6 2416 40
7 F 5,65 1090 18
8 F 13,41 553 9
9 M 2,58 1323 22
10 M 4,44 1393 23
11 F 9,23 1035 17
12 M 3,71 1827 30
13 M 8,15 2001 33
14 M 0,91 1327 22
15 M 13,87 1497 25
16 M 2,28 473 8
17 F 6,29 656 11
18 F 9,46 551 9
19 F 0,99 1524 25
20 M 2,48 913 15
21 M 5,3 3045 51
22 M 8,84 1192 20
23 M 7,32 728 12
24 F 4,38 897 15
25 F 27 567 9
26 M 21 1247 21
27 M 21 1929 32
28 F 22 1498 25
29 F 20 2799 47
30 F 25 603 10
31 M 21 1138 19
32 M 21 1779 30
Valores de referencia enzima PMI
Para las actividades enzimáticas de la PMI encontradas en el grupo de control se estableció una SD
de ± 714.5 nmol/h. mg de proteína, un coeficiente de variación de 0.53, lo que indica que los
valores de la actividad de las muestras analizadas están lejanos a la media (1332 nmol/mg.h), lo
anterior puede ser explicado al pequeño tamaño de la muestra (n 32), y a la carencia de muestras
que cubran todo el rango de edad (Tabla 17).
57
Tabla 17. Análisis estadístico descriptivo para el grupo control.
Gurpo referencia
nmol/h. mg de
proteína
Media 1330,26
Error típico 126,30
Mediana 1219,70
Desviación estándar 714,44
Varianza de la muestra 510420,16
Coeficiente de variacion 0,53
Curtosis 0,30
Coeficiente de asimetría 0,96
Mínimo 473,31
Máximo 3044,81
Suma 42568,25
Nivel de confianza(95,0%) 257,58
7.7.1 Análisis estadístico del grupo de control.
Para observar de manera general como se encontraban distribuidas las actividades en los 32
individuos control, se construyó una gráfica de dispersión Levey-Jenning, la cual mostró una
fluctuación aleatoria de los datos dentro del rango de actividad de 500-2000 nmol/h. mg de
proteína (Figura 17).
Figura 17. Dispersión de la actividad enzimática de PMI, por el Test de Levey-Jenning.
-
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Act
ivid
ad
nm
ol/
mg
.h
Número de individuos
58
Se elaboró un análisis descriptivo que muestra las frecuencias relativas con respecto a los valores de
actividad enzimática para el grupo control, para lo cual se tomaron como rangos abiertos los valores
de actividad de las mismas, lo cual permitió determinar la clase mínima de agrupación de datos de
actividad en 310-620 (nmol/mg.h), y la máxima en 2790-3100 (nmol/h. mg de proteína). De este
modo se logró evidenciar que la mayor frecuencia en el total de las muestras analizadas (n 32) se
encontraba agrupada en la clase 4 (donde se encontraron 7 individuos con rangos de actividad de
1240-1550 nmol/h. mg de proteína), así mismo en esta clase se encontró el valor de la media 1330
nmol/mg.h (Tabla 18).
Tabla 18. Tabla de frecuencias absolutas y relativas de la actividad enzimática PMI.
ClaseLímite
inferior
Límite
superiorFrecuencia
Frecuencia
relativa
Frecuencia
relativa
acumuladaDensidad
%
1 310 620 6 0,194 0,194 0,00062 19%
2 620 930 5 0,161 0,355 0,00052 16%
3 930 1240 4 0,129 0,484 0,00042 13%
4 1240 1550 7 0,226 0,710 0,00073 23%
5 1550 1860 3 0,097 0,807 0,00031 10%
6 1860 2170 2 0,065 0,871 0,00021 6%
7 2170 2480 1 0,032 0,904 0,00010 3%
8 2480 2790 0 0,000 0,904 0,00000 0%
9 2790 3100 3 0,097 1,000 0,00031 10%
De acuerdo con la prueba de Dixon, se determinó que existen tres valores atípicos que se
encuentran en la clase 9, que corresponden a las muestras 5, 29 de género femenino y 21 de género
masculino con edades de 2,06 años, 20 años y 5 años que presentaron actividades específicas de
2901 nmol/h.mg de proteína, 2799 nmol/h.mg de proteína y 3045 nmol/h.mg de proteína
respectivamente (Figura 18, Tabla 18 y Anexo 2).
Los valores atípicos de actividad enzimática encontrados en las muestras 5, 21 y 29
correspondientes a 3045, 2901 y 2799 nmol/h.mg de proteína pueden ser debidos a polimorfismos
presentados en los genes de la enzima PMI, que pueden generar una mayor activad. Por lo cual,
para controles con actividades muy altas se podrían realizar estudios moleculares en el gen
analizado. También, actividades aumentadas se han descrito por varios autores, por ejemplo,
cuando hay deficiencias en una enzima relacionada con una ruta metabólica se ha encontrado que
otro gen puede tener un nivel alto de expresión, como se observó en la adrenoleucodistrofia ALD -
X en la cual la quitiotriocidasa se encuentra elevada en plasma y fluido cerebral si hay un deterioro
progresivo cerebral (66); sin embargo, se descarta en nuestro estudio esta última posibilidad porque
las muestras eran controles normales y se emplearon los criterios de exclusión.
59
Asimismo, un mayor valor de actividad en nuestra población podría explicarse cuando se utilizan
sustratos artificiales en comparación con los naturales como se describió por Van Digglelen O. P.
et. al 2005, para la enfermedad de Niemann Pick A y B en donde encontraron una falsa actividad
normal para la esfingomielinasa en pacientes (67). Otras investigaciones han sustentado valores
aberrantes de actividad enzimática para la hexosaminidasa en pacientes asociados a varias
enfermedades inflamatorias (68). Por último, estudios realizados en Colombia para la enzima
biotinidasa han mostrado valores de actividad superior con respecto a los reportados en población
caucásica (69).
Figura 18. Test de Dixon.
Para determinar la distribución de los datos y así poder establecer las principales características de
los datos (valor máximo, mínimo de actividad y clase de distribución), se graficó un histograma de
frecuencias, el cual halló un coeficiente de asimetría positivo con un valor de 0,96 para las
actividades enzimáticas del grupo control, también se observó que los valores de la actividad están
distribuidos a la derecha de la media (Figura 19).
-3
-2
-1
0
1
2
3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32Z-s
co
re
Observaciones
Z-scores
60
Figura 19. Histograma de Actividad Enzimática de PMI. El histograma de frecuencias fue determinado
por medio de la extensión XLSTAT del programa Microsoft Excel.
Al aplicar la prueba de Kolmogorov-Smirnov se halló que el grupo control cumple con una
distribución normal para los datos de actividad enzimática, obteniendo un p-valor 0,649 bajo un
nivel de significancia α 0,05.
Asimismo, al graficar la densidad de Kernel sobre el histograma de actividad enzimática se
encontró que la distribución de los datos están agrupados en 9 clases, 310-620, 620-930, 930-1240,
1240-1550, 1550-1860, 1860-2170, 2170-2480, 2480-2790, 2790-3100 y presentaron una
distribución normal (Tabla 18), y se halló un punto máximo de densidad de 0,00071 en el cual se
agrupa la clase 4, el cual permitió estimar la media de actividad enzimática específica de 1330,26
nmol/h. mg de proteína en la muestra analizada lo cual está en concordancia con el valor encontrado
en las frecuencias absolutas y relativas (Tabla 18). Se observó una distorsión en la densidad de
Kernel en la gráfica de distribución normal en la clase 9 que agrupa actividades de 2790 nmol/h. mg
de proteína 3100 nmol/h. mg de proteína, los cuales correspondían a los valores atípicos
establecidos mediante la prueba de Dixon (Figura 20 y Figura 18).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,000 500,000 1000,000 1500,000 2000,000 2500,000 3000,000 3500,000
Frecu
en
cia
rela
tiva
Actividad Enzimática (nmol/ mg.h)
61
Figura 20. Histograma de normalidad de actividad enzimática PMI por el Test Kolmogorov –
Smirnov.
Con el fin de establecer las características principales en la distribución de frecuencias del conjunto
de datos se realizó un diagrama de caja, éste mostró tres líneas horizontales que corresponden en
forma ascendente al primer, segundo y tercer cuartil respectivamente, el segundo cuartil representa
la mediana con un valor de 1219 nmol/h.mg de proteína , la línea inferior indicó que el 25% de los
datos de actividad para la enzima PMI fueron menores o iguales a 710 nmol/h. mg de proteína y se
encontró una media de 1330 nmol/h. mg de proteína de actividad. La línea superior demostró que
el 75% de los resultados muestran una actividad enzimática menor o igual a 1618 nmol/h. mg de
proteína, mediante esta prueba se encontraron 2 valores atípicos de actividad enzimática de 3045
nmol/h. mg de proteína, y 473 nmol/h. mg de proteína, que correspondían a las muestras 16 y 21,
ambas de género masculino con edades de 2,28 años y 5,3 años. Se observó que el 95% de los
datos se encontraban dentro del bigote inferior (473 nmol/h. mg de proteína) y el superior (3045
nmol/h. mg de proteína), con una actividad media de 1330,26 nmol/h. mg de proteína (Figura 21)
valor que está de acuerdo con el encontrado al aplicar la densidad de Kernel por el método de
Kolmogorov-Smirnov (Figura 19 y 20).
0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
0,0006
0,0007
0,0008
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Den
sid
ad
Actividad enzimática (nmol/mg.h)
Histogramas
62
Figura 21. Boxplot de actividad enzimática de la enzima PMI.
7.7.2 Análisis estadístico de los valores de PMI por género
Al agrupar las actividades enzimáticas por género y determinar las distribuciones de frecuencias
junto con la prueba bilateral Kolgomov-Smirnov de normalidad, se encontró una diferencia en los
valores de la media de actividad enzimática para el género masculino (n 18), en donde se halló una
mayor de velocidad enzimática (1426,66 nmol/h.mg de proteína), lo cual puede ser explicado a que
se observó una mayor frecuencia relativa con un valor de 0,278 por el número de individuos (n 5)
que se agruparon en la clase 4; en comparación al género femenino (n 14) presentó una media de
actividad menor (1206,21 nmol/h. mg de proteína) la cual se ubicó en la clase 3 con una frecuencia
relativa de 0,143 (Tabla 19 y Figura 22).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca
(n
mo
l/h
. m
g d
e p
ro
teín
a)
32 individuos
63
Tabla 19. Frecuencias absolutas y relativas de actividad enzimática para género femenino y
masculino.
Clase
Límite
inferior
Límite
superior
Frecuencia
género
masculino
Frecuencia
género
femenino
Frecuencia
relativa
género
masculino
Frecuencia
relativa
género
femenino
% género
masculino
% género
femenino
1 310 620 2 3 0,111 0,214 11% 21%
2 620 930 3 4 0,167 0,286 17% 29%
3 930 1240 2 2 0,111 0,143 11% 14%
4 1240 1550 5 1 0,278 0,071 28% 7%
5 1550 1860 2 2 0,111 0,143 11% 14%
6 1860 2170 2 0 0,111 0,000 11% 0%
7 2170 2480 1 0 0,056 0,000 6% 0%
8 2480 2790 0 0 0,000 0,000 0% 0%
9 2790 3100 1 2 0,056 0,143 6% 14%
En el histograma de actividad enzimática por género se observó que no hay representantes para la
actividad enzimática en el género masculino en la clase 8 y que la mayor frecuencia relativa tiene
un valor de 0,278 que corresponde a la clase 4. En comparación para el género femenino, no se
encontraron valores de actividad en la clase 6, 7 y 8 y aunque se halló una frecuencia relativa de
0,286 en la clase 2 la media que correspondía a 1206,21 nmol/h. mg de proteína este último valor se
encontró ubicado en la clase 3, con frecuencias relativas para el género masculino de 0,111 y para el
femenino de 0,143 con un intervalo de actividad de 930-1240 nmol/h. mg de proteína para ambos
géneros (Tabla 19 y Figura 22).
64
Figura 22. Histogramas de actividad enzimática por género.
Al graficar la densidad de Kernel sobre los dos histogramas de género masculino y femenino
respectivamente, se logró establecer diferencias en la distribución de los datos con relación a la
media. Para el género masculino se observó una densidad mayor con respecto a la media de
actividad (0,0006), en comparación para el género femenino en la que se halló una menor densidad
con respecto a la media (0,0005). Sin embargo, se puede concluir que para ambos géneros los
valores de la media de actividad enzimática específica son cercanos y que no hay diferencias
significativas entre géneros, lo cual fue corroborado estadísticamente mediante la prueba bilateral
de Kolmogorov-Smirnov, al encontrar un valor D 0,365 y un p-valor 0,245 bajo un nivel de
significancia α 0,05 (Figura 23).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1000 2000 3000
Fre
cuen
cia
rela
tiv
a
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
A. Género masculino
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1000 2000 3000
Fre
cuen
cia
rela
tiv
a
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
B. Género femenino
65
Figura 23. Histogramas de normalidad de la actividad enzimática.
El análisis de Bloxplot de las actividades enzimáticas específicas por género, mostraron una
pequeña diferencia de actividad específica para el grupo masculino y femenino respectivamente
(1426 nmol/h. mg de proteína y 1206 nmol/ h. mg de proteína). Se observaron dos valores atípicos
para el género masculino correspondientes a actividades enzimáticas de 473 nmol/h. mg de proteína
y 3044 nmol/h. mg de proteína, que correspondían a las muestras 16 y 21 con edad de 2,28 y 5,3
años respectivamente, estos valores fueron ubicados en el bigote inferior y superior del diagrama de
caja. Para el género femenino, se encontraron dos valores aberrantes con actividades de 551
nmol/h. mg de proteína (bigote inferior) y 2901 nmol/h. mg de proteína, pertenecientes a las
muestras 5 y 18 respectivamente de 2,06 y 9,46 años respectivamente, en el bigote superior se halló
un valor de actividad enzimática de 2799 nmol/h. mg de proteína. En comparación, se encontraron
diferencias entre los bigotes superiores e inferiores para ambos géneros, lo cual se puede explicar
porque la muestra tenía un mayor número de individuos para el género masculino (n 18) y un
número menor para el femenino (n 14). Los análisis estadísticos mostraron un mayor rango de
actividad para el género masculino con respecto al femenino (Figura 24).
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,001
0 1000 2000 3000
Den
sid
ad
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
A. Género masculino
0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
0,0006
0,0007
0,0008
0,0009
0,001
0 1000 2000 3000
Den
sid
ad
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
B. Género femenino
66
Figura 24. Bloxplot actividad enzimática PMI por género.
Al comparar la actividad enzimática del grupo control para los dos géneros mediante la prueba t, se
encontró un valor de t 0,8623 con un p-valor 0,3954 bajo un nivel de significancia de α 0,05, que
permitió concluir que no hay diferencias significativas de actividad entre los géneros y que todos
los valores se encontraban dentro de una distribución normal, como también que ninguno estaba por
debajo del límite de significancia.
7.7.3 Determinación de valores de la enzima PMI por edad
Para establecer si la actividad enzimática era afectada según el rango de edad, los 32 individuos se
clasificaron en 3 grupos y 9 clases, el primero de 0-4 años, el segundo 5-12 años y el último de 13-
27 años. Se encontró que el grupo uno y tres presentaban un mayor porcentaje de individuos (40%
y 25% respectivamente) en el rango de actividad enzimática de la clase 4 (1240-1550 nmol/h. mg
de proteína). Para el segundo grupo en esta misma clase la frecuencia fue de cero debido a que no
se encontraron muestras en este rango de actividad (Tabla 20).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500G
ener
o m
asc
uli
no
A. Género masculino
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Gen
ero
fem
enin
o
B. Género femenino
67
Tabla 20. Frecuencias absolutas y relativas de actividad enzimática por edad.
Clase
Límite
inferior
Límite
superior
Frecuencia
0-4 años
Frecuencia
relativa 0-4
años
Frecuenia
5-12 años
Frecuencia
relativa 5-
12 años
Frecuencia
13-27 años
Frecuencia
relativa 13-
27 años % 0-4 años
% 5-12
años
% 13-27
años
1 310 620 1 0,1 2 0,2 3 0,25 10% 20% 25%
2 620 930 2 0,2 2 0,2 2 0,17 20% 20% 17%
3 930 1240 0 0 3 0,3 1 0,08 0% 30% 8%
4 1240 1550 4 0,4 0 0 3 0,25 40% 0% 25%
5 1550 1860 1 0,1 1 0,1 1 0,08 10% 10% 8%
6 1860 2170 0 0 1 0,1 1 0,08 0% 10% 8%
7 2170 2480 1 0,1 0 0 0 0 10% 0% 0%
8 2480 2790 0 0 0 0 0 0 0% 0% 0%
9 2790 3100 1 0,1 1 0,1 1 0,08 10% 10% 8%
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Los diferentes análisis, histogramas por edad, prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y la
densidad de Kernel para los diferentes grupos de edades mostraron que cada uno cumple el patrón
de una distribución normal, al obtener en los diferentes rangos de edades para cada uno de los
grupos analizados valores de valor-p 0,817, 0,602 y 0,908 bajo un nivel de significancia α 0,05
(Figuras 25 y 26).
Figura 25. Histogramas de frecuencias de actividad enzimática por grupo de edad. Se presenta
la distribución de los individuos analizados entre grupos de edad. A) 0-4 años, B) 5-12 años, C) 13-27 años.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 2000
Fre
cuen
cia
rela
tiv
a
Actividad enzimática (nmol/h. mg de proteína)
1) 0-4 años
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1000 2000 3000
Fre
cuen
cia
rela
tiv
a
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
2) 5-12 años
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1000 2000 3000
Fre
cuen
cia
rela
tiv
a
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
3) 13-27 años
68
Figura 26. Histogramas de normalidad con la densidad de Kernel.
Al graficar los resultados mediante el diagrama de cajas de actividad enzimática contra la edad se
observaron diferencias en la dispersión de las frecuencias en los tres grupos de edades; para el
grupo 1 (n 10, con rango de edad de 0-4 años) se halló una actividad media de 1498 nmol/h. mg de
proteína que correspondía a un adulto de 22 años de género femenino. En el bigote inferior se
encontró un valor atípico que pertenece a un individuo de género masculino de 2,28 años de edad,
que presentó actividad de 473 nmol/h. mg de proteína, en el bigote superior se halló una actividad
de 2416 nmol/h. mg de proteína que correspondía a un niño de género masculino de 0,6 años de
edad. Asimismo se halló otro valor atípico correspondiente a una actividad de 2900 nmol/h. mg de
proteína para un control de género femenino de 2,06 años de edad. Para el grupo 2 (n 10, con rango
de edad de 5-12 años) se presentó un valor de actividad media de 1247 nmol/h. mg de proteína que
correspondía a un adulto de 21 años de edad de género masculino, se encontraron valores en los
bigotes inferior y superior de 551 – 2001 nmol/h. mg de proteína respectivamente, asimismo se
hallaron dos valores aberrantes, el primero correspondía al bigote inferior ya mencionado y el
segundo a un valor fuera del bigote superior con una actividad de 3045 nmol/h. mg de proteína,
estas actividades pertenecían a muestras 18 y 21 de género femenino y masculino con edades de
9,46 años y 5,3 años respectivamente. Para el grupo 3 (n 12, con rango de edad de 13-27 años), se
halló una media de actividad de 1259 nmol/h. mg de proteína. Se encontraron dos valores atípicos
que se ubicaron en el rango del bigote inferior y superior con valores de actividad de 553 - 2799
nmol/h. mg de proteína, que correspondían a dos controles de género femenino con edades de 13,41
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,001
0,0012
0 1000 2000 3000
Den
sid
ad
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
1) 0-4 años
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,001
0,0012
0 1000 2000 3000
Den
sid
ad
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
2) 5-12 años
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,001
0,0012
0 1000 2000 3000
Den
sid
ad
Actividad enzimática
(nmol/h. mg de proteína)
3) 13-27 años
69
años y 20 años de edad respectivamente. Los tres grupos no mostraron diferencias significativas
entre los valores de la media de actividad enzimática (Figura 27).
Figura 27. Bloxplot actividad enzimática por grupos de edad.
7.7.4 Validación supuestos para ANOVA.
Para determinar si habían diferencias significativas de actividad enzimática entre los tres rangos de
edades analizados (0-4 años, 5-12 años y 13-27 años), se realizó un análisis ANOVA (Análisis de
Varianza), que mostró que no hay diferencia significativas de las actividades entre los grupos, al
encontrar un valor F 0,3926 y un p-valor 0,6788 bajo un nivel de significancia α 0,05, lo que indica
que todas las variables evaluadas se distribuyen dentro de la campana de Gauss (Tabla 21).
Tabla 21. Análisis ANOVA de la actividad enzimática por grupos de edad.
gl Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F valor p-valor
Grupos de
edad
2 417227
208614
0,3926
P = 0,6788
Residuales 29 1,541e+007
531302
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca
(n
mo
l/h
.mg
de p
ro
teín
a)
1) 0-4 años
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca
2) 5-12 años
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca
3) 13-27 años
70
7.7.5 Prueba de normalidad.
Para determinar si los datos tenían una distribución normal se aplicó la prueba de normalidad
Kolmogorov- Smirnov, la cual mostró que las actividades enzimáticas para la muestra analizada (n
32) presenta una distribución normal, al obtener valores de D 0.122, p-valor 0.699 bajo un nivel de
significancia α 0.05, lo cual fue corroborado al construir una gráfica de normalidad Q-Q plot, en
esta se obtuvo una distribución lineal que demuestra que el 95% de los valores de actividad
enzimática estaban dentro de la campana de Gauss, exceptuando los valores atípicos ya
mencionados hallados en este estudio por medio de la prueba de Dixon, encontrados en los
histogramas de normalidad y diagramas de caja (Figura 28, Figura 18).
Figura 28. Gráfica de normalidad de la actividad enzimática.
7.7.6 Prueba de homocedasticidad por medio del Test de Breush-Pagan y White
Para confirmar que la actividad con respecto a la edad presentaba una comportamiento
homocedastico se analizó el total de la muestra (n 32) aplicando dos pruebas, un test de Breush-
Pagan en el que se halló un p-valor de 0,332, bajo 1 gl y la prueba de White, en esta última se
obtuvo un p-valor 0,558, bajo 2 gl con un nivel de significancia α 0,05. Las dos pruebas
demostraron que la varianza de las actividades analizadas fueron constantes, es decir, que los
valores de la variable dependiente e independiente fueron igualmente dispersos (Figura 29).
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
-500 500 1500 2500 3500
Cu
an
til -
No
rmal (1
346;
709,0
8)
851,673943552159
Q-Q plot
71
Figura 29. Grafica de homocedasticidad de la actividad enzimática (nmol/h. mg de proteína,
variable dependiente) y edad (variable independiente).
7.7.7 Prueba de independencia del Test de Durbin-Watson.
Para establecer si los valores de actividad enzimática de la PMI estaban influenciados por la edad,
se realizó la prueba de independencia de Durbin-Watson donde se encontró que la edad no está
relacionada con los valores de actividad al encontrar un valor U 0,358, p-valor <0,0001 bajo un
nivel de significancia de α 0,05.
7.7.8 Test t Student
Así mismo, al analizar la totalidad de la muestra (n 32) con relación a las anteriores variables
mediante la prueba Test t Student, se encontró un valor de t 10,533, bajo 31 gl. Esta prueba
permitió establecer un intervalo de confianza de 1073 - 1588 nmol/h. mg de proteína y una media
de actividad enzimática de 1330 nmol/h. mg de proteína bajo un nivel de confianza del 95%. Los
resultados encontrados permitieron concluir que se puede tomar este rango como intervalo de
actividad enzimática, debido a que no se hallaron diferencias significativas en los valores de
actividad enzimática para el grupo control por género ni edad en las 32 muestras analizadas y que la
muestra presentó una distribución normal. El intervalo de actividad encontrado en nuestro estudio
con esta prueba (Test t Student) es muy cercano a los valores de referencia de actividad enzimática
(860-1800 nmol/h. mg de proteína) y de actividad media reportados por de Koning T. J. et al, en
1998 (1270 nmol/h. mg de proteína).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15 20 25 30
Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca (
nm
ol/
h. m
g d
e p
rote
ína
)
Edad
Actividad enzimática (nmol/h. mg de proteína) / Edad
72
7.7.9 Determinación del valor de referencia para el grupo control.
Para determinar los límites de referencias en el grupo de individuos analizado, se excluyeron los
valores atípicos de actividad enzimática que fueron determinados por la prueba de Dixon,
correspondientes a 3045, 2901 y 2799 nmol/h.mg de proteína que pertenecían a las muestras 5, 21 y
29 respectivamente (n 29) (Figura 18).
Una vez descartados los valores atípicos mediante la prueba de Dixon se procedió a calcular el valor
de referencia para la enzima fosfomanosa isomerasa con el programa estadístico RStudio, se utilizó
un intervalo de confianza del 95 % tomando los fractíles 0,025 y 0,975, los cuales permitieron
incluir las muestras ubicadas en el rango 2-29 y por lo tanto establecer un intervalo de actividad
enzimática para el grupo control de 551-2416 nmol/h. mg de proteína (9,2-40,3 nmol/min. mg de
proteína), estos valores correspondían a las muestras 18 y 6 de género femenino y masculino de
9,36 y 0,6 años respectivamente (Tabla 22 y Anexo 1).
Tabla 22. Ordenamiento ascendente de la actividad enzimática especifica de la PMI.
Los resultados encontrados en este nuestro estudio muestran un valor más bajo de actividad
enzimática (9,2 nmol/min. mg de proteína) con respecto al límite inferior y más alto (40,3
nmol/min. mg de proteína) con respecto al estudio realizado en Múnich por Niehues R. et. al (1997)
en una muestra de leucocitos (n 12) en el cual se reportó un valor de referencia para la enzima PMI
RangoNo de
muestraEdad
Actividad
enzimática
(nmol/h. mg
de proteína)
Actividad
enzimática
(nmol/min.
mg de
proteína)
1 16 2,28 473 7,9
2 18 9,46 551 9,2
3 8 13,41 553 9,2
4 25 27 567 9,5
5 3 12,27 600 10,0
6 30 25 603 10,0
7 2 18 648 10,8
8 17 6,29 656 10,9
9 23 7,32 728 12,1
10 1 24 852 14,2
11 24 4,38 897 14,9
12 20 2,48 913 15,2
13 11 9,23 1035 17,2
14 7 5,65 1090 18,2
15 31 21 1138 19,0
16 22 8,84 1192 19,9
17 26 21 1247 20,8
18 9 2,58 1323 22,1
19 14 0,91 1327 22,1
20 10 4,44 1393 23,2
21 15 13,87 1497 24,9
22 28 22 1498 25,0
23 19 0,99 1524 25,4
24 4 11,82 1565 26,1
25 32 21 1779 29,7
26 12 3,71 1827 30,5
27 27 21 1929 32,2
28 13 8,15 2001 33,4
29 6 0,6 2416 40,3
73
de 16.6 – 20.04 nmol/min. mg de proteína con una actividad media de 18.1 nmol/min. mg de
proteína. En esta publicación también se reportó el diagnosticó de un paciente con deficiencia de la
enzima PMI que presentó actividad enzimática de 0.6 nmol/min. mg de proteína (36 nmol/h. mg de
proteína) y sus padres portadores con actividades de 9,6 y 6,1 nmol/min. mg de proteína (10). Esta
diferencia en la actividad enzimática especifica con relación a otras investigaciones puede ser
explicada porque las unidades de concentración empleada en nuestro ensayo fueron iguales para las
enzimas auxiliares (1U) y en nuestro estudio la incubación se realizó a 37 °C lo cual disminuye la
energía de activación de las enzimas, permitiendo una mayor velocidad de reacción y por tanto
aparición del producto, en contraste con lo empleado por Niehues R. et. al, quien utilizó 100 mU
para la PGI y 500 mU para la G6PDH y la incubación del ensayo fue realizada a temperatura
ambiente. Sin embargo, nuestro estudio presenta valores cercanos de actividad enzimática
específica al comparar tanto los valores encontrados en el intervalo de confianza (1073-1588
nmol/h.mg de proteína) y el valor de referencia (558-2416 nmol/h.mg de proteína) con respecto a
una investigación realizada en Holanda por T.J. de Koning et. al (1998) en la que se reportó un
valor de referencia 860-1800 nmol/h. mg de proteína en un grupo control (n 15), como también
hallaron actividades específicas de 120, 130 y 180 nmol/ h. mg de proteína para tres hermanos con
deficiencia de PMI y para sus padres portadores de 610 nmol/h. mg de proteína para la madre, 710
nmol/h.mg de proteína para el padre y para un hermano genotípicamente normal una actividad de
1610 nmol/h. mg de proteína (62). Su ensayo utilizó concentraciones diferentes de las enzimas 10
μg/mL de PGI y 2 μg/mL de G6PDH, HEPES 50 mM pH 7.1, 6 mM MgCl2, 0.6 mM NADP+, 0,5
mM M6P y 40 μg de proteína a 37 °C durante una hora. En comparación, en nuestro estudio el
valor del límite superior fue mucho más alto (2416 nmol/h. mg de proteína), lo cual se puede
explicar porque se utilizaron concentraciones saturantes de sustrato 6 mM, es decir
aproximadamente 10 veces más y de coenzima (0,6 mM NADP+)
para que no fueran los
componentes limitantes de la reacción, lo cual está en concordancia con lo sustentado por diferentes
autores que argumentan que concentraciones altas influencian la actividad de la enzima
incrementando su actividad, por lo tanto en nuestro ensayo se utilizaron estas condiciones para
lograr la saturación de la enzima, lo cual está de acuerdo con lo mencionado anteriormente por
Bisswanger Hans (2014) que recomienda se empleen 10 veces la concentración del km para obtener
9 % de sitios libres y 91 % de saturación, aun cuando este valor se desvía de la saturación verdadera
porque en sentido estricto la saturación no puede ser realizada totalmente. También los valores altos
de actividad enzimática en la muestra de estudio pueden ser debidos a que se ha encontrado que la
población latina presenta valores de actividad enzimática superiores en diferentes enzimas, como se
encontró en estudios realizados para la enzima galactosa 1-fosfato uridil transferasa en una muestra
de 106 niños lactantes por Ayala A. et al 2001 y biotinidasa y α-amilasa en una muestra de 106
niños colombianos (69, 70). También, este aumento de actividad podría estar dado por
polimorfismos específicos en este gen.
Se encontró que los resultados del valor de referencia de actividad enzimática de nuestro estudio del
límite inferior (551 nmol/h. mg de proteína) se solapan con las actividades de los portadores de los
estudios mencionados en el párrafo anterior, esto podría deberse a que el número de muestras en
nuestro estudio fue mayor (n 32) y el 50% eran niños menores a 10 años, lo cual amplía el rango de
actividad para nuestro ensayo; la media de actividad enzimática en nuestro estudio (1330 nmol/h.
74
mg de proteína) fue cercana a la reportada por T.J de Koning et. al 1998, el cual halló un valor de
1270 nmol/h. mg de proteína. Sin embargo, al comparar las actividades obtenidas en los 32
controles con las de los pacientes deficientes reportados por Niehues et. al y T.J de Koning et, al, se
concluyó que se puede diagnosticar una deficiencia de la PMI con el valor de actividad obtenido
para el intervalo del límite inferior de este estudio (551 nmol/h. mg de proteína), porque la actividad
enzimática de los pacientes deficientes reportados por T.J. de Koning et al, están por debajo en 21,7
- 32,6 % (120-180 nmol/ h. mg de proteína) con respecto a la actividad enzimática obtenida en
nuestro estudio y en el caso de ser comparada con respecto al intervalo de confianza obtenido
mediante la prueba Test t Student para el total de la muestra analizada (1073-1588 nmol/h.mg de
proteína) los pacientes deficientes solo presentarían un 11,2 - 11,33 % de actividad enzimática
específica.
Este estudio permitirá iniciar el diagnóstico de forma temprana y oportuna de pacientes deficientes
de la PMI, con el propósito de evitar las complicaciones que causa este desorden y para el caso de
haber compromiso de enteropatía con perdida proteica los pacientes podrán ser tratados con
heparina (7500 UI/ día), ya que es una enfermedad que ofrece un tratamiento fácil de realizar y a un
bajo costo, al poder suplementarse manosa en forma oral en dosis de 0,2 g/Kg/ 4h al inicio del
tratamiento y así evitar que fallezca (22, 71). También, este estudio contribuirá con la relación
costo-beneficio a nuestro sistema de salud, y a mejorar la calidad de vida de los pacientes y de su
familia.
75
8 CONCLUSIONES.
1. Los análisis estadísticos permitieron comprobar que no existen diferencias significativas de
actividad enzimática entre los tres grupos de edad de 0-4, 5-12 y 13,27 y género al hallar p-
valores 0,6788 y 0,3955 respectivamente y evaluar estas dos variables bajo un nivel de
significancia α 0,05.
2. Se determinó que la actividad enzimática específica de la fosfomanosa isomerasa no se ve
afectada por la edad, al obtener un p-valor <0,0001 bajo un nivel de significancia α 0.05.
3. Se estableció que los valores de referencia para la enzima fosfomanosa isomerasa se
encuentran entre 551-2416nmol/h. mg de proteína en una muestra de 32 individuos
colombianos de 0-27 años de edad.
4. El valor de referencia obtenido del límite superior fue mayor al publicado con respecto a
otros estudios (2416nmol/h. mg de proteína).
5. Este estudio permitirá diagnosticar en Colombia pacientes con deficiencia de la PMI en
forma temprana.
6. . Las condiciones del buffer de reacción permitieron una alta estabilidad de las enzimas
auxiliares PGI y G6PDH, lo cual disminuye los costos de esta prueba para el diagnostico de
esta enfermedad.
76
9 RECOMENDACIONES.
Se recomienda ampliar el número de adultos y niños controles para la muestra analizada.
Realizar un seguimiento de la actividad enzimática específica contra el tiempo de los
lisados de leucocitos que contienen la PMI en agua contra lisados re-suspendidos en buffer
de lisis, con el propósito de determinar si hay acción de proteasas especificas presentes en
los leucocitos lisados y re-suspendidos en agua que generen un decaimiento de la actividad.
Establecer el tiempo máximo de estabilidad y por tanto de actividad de la enzima PGI una
vez este re suspendida.
Realizar pruebas de estabilidad y por tanto de actividad de la enzimas auxiliares PGI y
G6PDH después de adicionadas al buffer de reacción con intervalos de tiempo inferiores a
58 días.
77
10 BIBLIOGRAFÍA.
1. Murray RK, Rivera Munoz B. Harper. Bioquímica ilustrada. 28 ed: México; 2009. 506-26
p.
2. Jaeken J. Congenital disorders of glycosylation (CDG): It's all in it! Journal of inherited
metabolic disease. 2003;26(2-3):99-118.
3. social Mdsyp. Enfermedades Huerfanas. Colombia3 de mayo del 2015 [cited 2015];
Available from: https://www.minsalud.gov.co/salud/publica/PENT/Paginas/enfermedades-
huerfanas.aspx.
4. Colombia Cd. Ley N° 1392 del 2010. In: D.C AmdB, editor. 2010.
5. Hernández EM, Pajares AV, González BP, Crespo ME, Pérez FL, López-Manzanares JM,
et al., editors. Defecto congénito de glucosilación tipo Ib. Experiencia en el tratamiento con
manosa. Anales de Pediatría; 2008: Elsevier.
6. Vilaseca MA, Artuch R, Briones P. Defectos congénitos de la glucosilación: últimos
avances y experiencia española. Medicina clínica. 2004;122(18):707-16.
7. Leroy JG. Congenital disorders of N-glycosylation including diseases associated with O-as
well as N-glycosylation defects. Pediatric research. 2006;60(6):643-56.
8. Marquardt T, Denecke J. Congenital disorders of glycosylation: review of their molecular
bases, clinical presentations and specific therapies. European journal of pediatrics.
2003;162(6):359-79.
9. Pelletier VA, Galéano N, Brochu P, Morin CL, Weber AM, Roy CC. Secretory diarrhea
with protein-losing enteropathy, enterocolitis cystica superficialis, intestinal lymphangiectasia, and
congenital hepatic fibrosis: a new syndrome. The Journal of pediatrics. 1986;108(1):61-5.
10. Niehues R, Hasilik M, Alton G, Körner C, Schiebe-Sukumar M, Koch HG, et al.
Carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome type Ib. Phosphomannose isomerase deficiency and
mannose therapy. Journal of Clinical Investigation. 1998;101(7):1414.
11. de Lonlay P, Cuer M, Vuillaumier-Barrot S, Beaune G, Castelnau P, Kretz M, et al.
Hyperinsulinemic hypoglycemia as a presenting sign in phosphomannose isomerase deficiency: a
new manifestation of carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome treatable with mannose. The
Journal of pediatrics. 1999;135(3):379-83.
12. Babovic-Vuksanovic D, Patterson MC, Schwenk WF, O’Brien JF, Vockley J, Freeze HH, et
al. Severe hypoglycemia as a presenting symptom of carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome.
The Journal of pediatrics. 1999;135(6):775-81.
13. Schollen E, Dorland L, De Koning T, Van Diggelen O, Huijmans J, Marquardt T, et al.
Genomic organization of the human phosphomannose isomerase (MPI) gene and mutation analysis
in patients with congenital disorders of glycosylation type Ib (CDG-Ib). Human mutation.
2000;16(3):247-52.
14. Vuillaumier-Barrot S, Le Bizec C, De Lonlay P, Barnier A, Mitchell G, Pelletier V, et al.
Protein losing enteropathy-hepatic fibrosis syndrome in Saguenay-Lac St-Jean, Quebec is a
congenital disorder of glycosylation type Ib. Journal of medical genetics. 2002;39(11):849-51.
15. Scott K, Gadomski T, Kozicz T, Morava E. Congenital disorders of glycosylation: new
defects and still counting. Journal of inherited metabolic disease. 2014;37(4):609-17.
16. de Lonlay P, Seta N. Trastornos congénitos de la glucosilación de las glucoproteínas
séricas. EMC-Pediatría. 2009;44(1):1-6.
17. Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, et al. Essentials of
Glycobiology 2009 [cited 2015. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1908/.
18. king MW. Glicoproteinas. 2105; Available from:
http://themedicalbiochemistrypage.org/es/glycoproteins-sp.php.
19. Cantagrel V, Lefeber DJ. From glycosylation disorders to dolichol biosynthesis defects: a
new class of metabolic diseases. Journal of inherited metabolic disease. 2011;34(4):859-67.
78
20. Grabińska K, Palamarczyk G. Dolichol biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae:
an insight into the regulatory role of farnesyl diphosphate synthase. FEMS yeast research.
2002;2(3):259-65.
21. Supraha Goreta S, Dabelic S, Dumic J. Insights into complexity of congenital disorders of
glycosylation. Biochemia medica. 2012;22(2):156-70.
22. De Lonlay P, Seta N. The clinical spectrum of phosphomannose isomerase deficiency, with
an evaluation of mannose treatment for CDG-Ib. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular
Basis of Disease. 2009;1792(9):841-3.
23. Damen G, de Klerk H, Huijmans J, den Hollander J, Sinaasappel M. Gastrointestinal and
other clinical manifestations in 17 children with congenital disorders of glycosylation type Ia, Ib,
and Ic. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 2004;38(3):282-7.
24. Penel-Capelle D, Dobbelaere D, Jaeken J, Klein A, Cartigny M. Congenital disorder of
glycosylation Ib (CDG-Ib) without gastrointestinal symptoms. Journal of inherited metabolic
disease. 2003;26(1):83-5.
25. Jaeken J, Matthijs G, Saudubray J-M, Dionisi-Vici C, Bertini E, de Lonlay P, et al.
Phosphomannose isomerase deficiency: a carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome with
hepatic-intestinal presentation. American journal of human genetics. 1998;62(6):1535.
26. Andrade Ruiseco M, García Pérez W, Silverio García C. Hipertensión portal en niños:
análisis de 20 años de trabajo. Revista Cubana de Pediatría. 2010;82(1):0-.
27. Aller M-A, Arias J-L, Cruz A, Arias J. Theoretical Biology and Medical Modelling.
Theoretical Biology and Medical Modelling. 2007;4:44.
28. Cruz Álvarez I, Martínez E, Del Canto de la Rosa J. Técnica quirúrgica no derivativa para
la hipertensión portal en niños. Informe de casos. 2013.
29. Friedman SL, Bansal MB. Reversal of hepatic fibrosis—fact or fantasy? Hepatology.
2006;43(S1).
30. Zois C, Baltayiannis G, Karayiannis P, Tsianos E. Systematic review: hepatic fibrosis–
regression with therapy. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2008;28(10):1175-87.
31. Franciscus A, Highleyman L, Kukka C, Mazoff C. Guía para Comprender la Hepatitis B.
Hepatitis C Support Project. 2008.
32. Tavill A. Protein-losing enteropathy. Journal of Clinical Pathology. 1971;3(1):45-54.
33. COLON IDY. Concepto y definición. Gastroenterology. 2010;105:43-9.
34. Hunt BJ. Bleeding and coagulopathies in critical care. New England Journal of Medicine.
2014;370(9):847-59.
35. de Koning TJ, Dorland L, van Berge Henegouwen GP. Phosphomannose isomerase
deficiency as a cause of congenital hepatic fibrosis and protein-losing enteropathy. Journal of
hepatology. 1999;31(3):557-60.
36. Harms H, Zimmer KP, Kurnik K, Bertele‐Harms R, Weidinger S, Reiter K. Oral mannose
therapy persistently corrects the severe clinical symptoms and biochemical abnormalities of
phosphomannose isomerase deficiency. Acta paediatrica. 2002;91(10):1065-72.
37. Mention K, Lacaille F, Valayannopoulos V, Romano S, Kuster A, Cretz M, et al.
Development of liver disease despite mannose treatment in two patients with CDG-Ib. Molecular
genetics and metabolism. 2008;93(1):40-3.
38. Mayatepek E, Kohlmüller D. Mannose supplementation in carbohydrate-deficient
glycoprotein syndrome type I and phosphomannomutase deficiency. European journal of pediatrics.
1998;157(7):605-6.
39. Desmet V. What is congenital hepatic fibrosis? Histopathology. 1992;20(6):465-78.
40. D'Agata ID, Jonas MM, Perez-Atayde AR, Guay-Woodford LM, editors. Combined cystic
disease of the liver and kidney. Seminars in liver disease; 1994: © 1994 by Thieme Medical
Publishers, Inc.
79
41. Jamil B, McMahon LP, Savige JA, Wang YY, Walker RG. A study of long-term morbidity
associated with autosomal recessive polycystic kidney disease. Nephrology Dialysis
Transplantation. 1999;14(1):205-9.
42. Harris P, Fodor D, Cavagnaro S, Egidio MD, Duarte GDC, Fava M. Fibrosis Hepática
congénita: un espectro clínico variable: Casos clínicos. Revista médica de Chile. 2004;132(6):733-
41.
43. Ali M, Rellos P, Cox TM. Hereditary fructose intolerance. Journal of medical genetics.
1998;35(5):353-65.
44. Jaeken J, Pirard M, Adamowicz M, Pronicka E, Van Schaftingen E. Inhibition of
phosphomannose isomerase by fructose 1-phosphate: an explanation for defective N-glycosylation
in hereditary fructose intolerance. Pediatric research. 1996;40(5):764-6.
45. Pons MR, López LG, Visus FS, Serra JD, Pardo MM. Manejo de las alteraciones del
metabolismo de los carbohidratos. Protocolos de gastroenterología, hepatología y nutrición(2 a ed),
Ed Ergon. 2010:379-84.
46. Rebhan M, Chalifa-Caspi V, Prilusky J, Lancet D. GeneCards: integrating information
about genes, proteins and diseases. Trends in Genetics. 1997;13(4):163.
47. Jensen SO, Reeves PR. Domain organisation in phosphomannose isomerases (types I and
II). Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology.
1998;1382(1):5-7.
48. ensembl. cDNA gen MPI. Europa2016 [cited 2016]; Available from:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Tools/Blast?db=core;g=ENSG00000178802;r=15:7489000
7-74902219;t=ENST00000352410.
49. Roux C, Bhatt F, Foret J, de Courcy B, Gresh N, Piquemal JP, et al. The reaction
mechanism of type I phosphomannose isomerases: new information from inhibition and polarizable
molecular mechanics studies. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2011;79(1):203-20.
50. PROUDFOOT AE, TURCATTI G, WELLS TN, PAYTON MA, SMITH DJ. Purification
cDNA cloning and heterologous expression of human phosphomannose isomerase. European
Journal of Biochemistry. 1994;219(1‐2):415-23.
51. Xiao J, Guo Z, Guo Y, Chu F, Sun P. Computational study of human phosphomannose
isomerase: Insights from homology modeling and molecular dynamics simulation of enzyme bound
substrate. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 2006;25(3):289-95.
52. Gracy RW, Noltmann EA. Studies on phosphomannose isomerase II. Characterization as a
zinc metalloenzyme. Journal of Biological Chemistry. 1968;243(15):4109-16.
53. Gracy RW, Noltmann EA. Studies on phosphomannose isomerase III. A mechanism for
catalysis and for the role of zinc in the enzymatic and the nonenzymatic isomerization. Journal of
Biological Chemistry. 1968;243(20):5410-9.
54. Topper YJ. On the mechanism of action of phosphoglucose isomerase and phosphomannose
isomerase. Journal of Biological Chemistry. 1957;225(1):419-26.
55. Rose IA, O'Connell EL. Intramolecular hydrogen transfer in the phosphoglucose isomerase
reaction. Journal of Biological Chemistry. 1961;236(12):3086-92.
56. Whitlow M, Howard AJ, Finzel BC, Poulos TL, Winborne E, Gilliland GL. A metal‐
mediated hydride shift mechanism for xylose isomerase based on the 1.6 Å Streptomycs
rubiginosus structure with xylitol and D‐xylose. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics.
1991;9(3):153-73.
57. Fenn TD, Ringe D, Petsko GA. Xylose isomerase in substrate and inhibitor michaelis states:
atomic resolution studies of a metal-mediated hydride shift. Biochemistry. 2004;43(21):6464-74.
58. Korndörfer IP, Fessner W-D, Matthews BW. The structure of rhamnose isomerase from
Escherichia coli and its relation with xylose isomerase illustrates a change between inter and intra-
subunit complementation during evolution. Journal of molecular biology. 2000;300(4):917-33.
80
59. Berrisford JM, Hounslow AM, Akerboom J, Hagen WR, Brouns SJ, van der Oost J, et al.
Evidence supporting a cis-enediol-based mechanism for Pyrococcus furiosus phosphoglucose
isomerase. Journal of molecular biology. 2006;358(5):1353-66.
60. Lenz G, Martell A. Metal Chelates of Some Sulfur-containing Amino Acids*.
Biochemistry. 1964;3(6):745-50.
61. Coombs TL, Felber J-P, Vallee BL. Metallocarboxypeptidases: Mechanism of Inhibition by
Chelating Agents, Mercaptans, and Metal Ions*. Biochemistry. 1962;1(5):899-905.
62. De Koning T, Dorland L, Van Diggelen O, Boonman A, De Jong G, Van Noort W, et al. A
novel disorder of N-glycosylation due to phosphomannose isomerase deficiency. Biochemical and
biophysical research communications. 1998;245(1):38-42.
63. Ayala A. Protocolo para la cuantíficación de proteínas por el método de Folin-Lowry.
Guias de laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular2009.
64. Passonneau JV, Lowry OH. Enzymatic analysis: a practical guide: Springer Science &
Business Media; 1993.
65. Bisswanger H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 2014;1(1):41-55.
66. Orchard PJ, Lund T, Miller W, Rothman SM, Raymond G, Nascene D, et al.
Chitotriosidase as a biomarker of cerebral adrenoleukodystrophy. Journal of neuroinflammation.
2011;8(1):144.
67. Van Diggelen O, Voznyi YV, Keulemans JL, Schoonderwoerd K, Ledvinova J, Mengel E,
et al. A new fluorimetric enzyme assay for the diagnosis of Niemann–Pick A/B, with specificity of
natural sphingomyelinase substrate. Journal of inherited metabolic disease. 2005;28(5):733-41.
68. Wendeler M, Sandhoff K. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate journal.
2009;26(8):945-52.
69. Hidalgo O, Merino A, Ayala A. Valores de referencia de la enzima biotinidasa en una
muestra de 102 niños de 0-11 años en una población colombiana. Bogotá D.C.- Colombia:
Universidad Distrital Francisco José de Caldas; 2014.
70. Alfredo J, María V, Carolina A, Ayala A. Valores de referencia de la Galactosa 1-fosfato
uridil transferasa en glóbulos rojos, por fluorometría en 162 lactantes de 0-1 año 51 niños mayores a
un año de Bogotá. 2001.
71. Bendayan I, Casaldaliga J, Castello F, Miró L. Heparin therapy and reversal of protein-
losing enteropathy in a case with congenital heart disease. Pediatric cardiology. 2000;21(3):267-8.
81
11 Anexos
11.1 Anexo 1. Actividad enzimática de la fosfomanosa isomerasa en niños y adultos (n 32).
No GÉNEROEDAD
(Años)
PROTEÍNA
(mg/dL)
Volumen de
muestra
para 50 uL
Volumen
para el
ensayo para
160 uL
Cantidad
Buffer de
lisis
fd muestrasABS balco
(120minutos)
ABS
muestra
(120
minutos)
Blanco - muestra
Actividad
enzimática
(nmol/h. mg de
proteína)
Actividad
enzimática
(nmol/min.
mg de
proteína)
1 F 24 195,56 21 65 95 2,4 0,093 0,336 0,243 852 14
2 M 18 97,89 42 131 29 1,2 0,133 0,318 0,185 648 11
3 M 12,27 169 24 76 84 2,1 0,138 0,309 0,171 600 10
4 F 11,82 195,2 21 66 94 2,4 0,084 0,530 0,446 1565 26
5 F 2,06 175 24 73 87 2,2 0,109 0,936 0,827 2901 48
6 M 0,6 219,5 19 58 102 2,7 0,129 0,818 0,689 2416 40
7 F 5,65 206,2 20 62 98 2,6 0,103 0,414 0,311 1090 18
8 F 13,41 188,5 22 68 92 2,4 0,060 0,218 0,158 553 9
9 M 2,58 239,8 17 53 107 3,0 0,180 0,558 0,377 1323 22
10 M 4,44 172,1 24 74 86 2,2 0,142 0,539 0,397 1393 23
11 F 9,23 124,6 33 103 57 1,6 0,261 0,556 0,295 1035 17
12 M 3,71 166,4 25 77 83 2,1 0,070 0,591 0,521 1827 30
13 M 8,15 342,8 12 37 123 4,3 0,081 0,651 0,570 2001 33
14 M 0,91 210,8 20 61 99 2,6 0,082 0,460 0,378 1327 22
15 M 13,87 223,1 19 57 103 2,8 0,568 0,995 0,427 1497 25
16 M 2,28 179,4 23 71 89 2,2 0,171 0,306 0,135 473 8
17 F 6,29 184,2 22 69 91 2,3 0,082 0,269 0,187 656 11
18 F 9,46 178,2 23 72 88 2,2 0,192 0,349 0,157 551 9
19 F 0,99 262,7 16 49 111 3,3 0,116 0,550 0,434 1524 25
20 M 2,48 100,5 41 127 33 1,3 0,185 0,445 0,260 913 15
21 M 5,3 272,1 15 47 113 3,4 0,155 1,023 0,868 3045 51
22 M 8,84 264,1 16 48 112 3,3 0,062 0,402 0,340 1192 20
23 M 7,32 132,5 31 97 63 1,7 0,090 0,297 0,208 728 12
24 F 4,38 108,3 38 118 42 1,4 0,126 0,382 0,256 897 15
25 F 27 106,2 39 121 39 1,3 0,053 0,214 0,162 567 9
26 M 21 114,21 36 112 48 1,4 0,060 0,416 0,355 1247 21
27 M 21 94,06 44 136 24 1,2 0,055 0,605 0,550 1929 32
28 F 22 89,7 46 143 17 1,1 0,108 0,535 0,427 1498 25
29 F 20 97,46 42 131 29 1,2 0,069 0,867 0,798 2799 47
30 F 25 134,55 31 95 65 1,7 0,095 0,267 0,172 603 10
31 M 21 97,47 42 131 29 1,2 0,057 0,381 0,324 1138 19
32 M 21 115,65 36 111 49 1,4 0,067 0,574 0,507 1779 30
82
11.2 Anexo 2. Tabla de valores atípicos determinados por la prueba de Dixon
Valor Z-score
851,674 -0,670
648,283 -0,955
599,990 -1,022
1565,432 0,329
2900,904 2,198
2415,948 1,520
1089,527 -0,337
553,248 -1,088
1323,123 -0,010
1392,898 0,088
1034,639 -0,414
1827,483 0,696
2001,374 0,939
1326,991 -0,005
1496,636 0,233
473,310 -1,199
656,258 -0,943
550,910 -1,091
1524,148 0,271
913,041 -0,584
3044,808 2,400
1192,471 -0,193
728,164 -0,843
896,793 -0,607
567,244 -1,068
1246,927 -0,117
1929,056 0,838
1498,452 0,235
2798,504 2,055
602,755 -1,018
1138,041 -0,269
1779,217 0,628
Los valores en negrita
son valores atípicos
83
11.3 Anexo 3. Carta de consentimiento informado para donación de muestra de sangre.
La Universidad Distrital Francisco José de Caldas a través de la línea de investigación en Bioquímica y Biología
Molecular desea estudiar en una muestra de sangre total la enzima Fosfomanosa Isomerasa (PMI). Ésta será aislada de
leucocitos obtenidos en esta muestra. Este estudio aportará información acerca de los valores normales de actividad para
esta enzima, ya que no existen investigaciones de éstos en Colombia que permitan diagnosticar pacientes con deficiencia
de esta enzima. El proyecto que se plantea no pone de ninguna forma en riesgo la salud de la persona donante.
Este estudio será importante en un futuro cercano para diagnosticar pacientes con defecto de PMI, debido a que se ha
encontrado en investigaciones a nivel mundial una fuerte relación entre la baja actividad de esta enzima con hipoglucemia,
hiperinsulinemia, hepatopatías, enteropatías e hipercoagulabilidad que son características clínicas de los defectos
congénitos de Glicosilación Tipo Ib (CDG Ib).
Conozco que el estudio se realizará a través del análisis de sangre total colectada y sus resultados serán usados únicamente
para fines científicos y solamente podrán ser publicados y socializados en eventos académicos y la identidad del donante
guardada en absoluta reserva.
Estoy informado de que el estudio se realizará a través del análisis de sangre total colectada con vacutainer y no
ocasionará ningún efecto secundario, sino una leve irritación en el punto de la toma de la muestra y el volumen de sangre
donada es mínimo. Por lo tanto autorizo la donación de 4 mL de sangre para la extracción de leucocitos al laboratorio de
Bioquímica de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas a fin de que se efectúen los análisis pertinentes.
El proyecto se acoge a las normas vigentes sobre bioseguridad (Decisión 391 Comunidad Andina de Naciones) y decreto
309/900 del Ministerio de medio ambiente. Finalizado el estudio las muestras remanentes de sangre serán inactivadas en
autoclave y descartadas a bolsa roja, la cual será recolectada por la empresa ECOENTORNO que es la encargada del
manejo de residuos químicos y de riesgo biológico y los sobrenadantes de los lisados de leucocitos serán inactivadas con
hipoclorito a 100 ppm y eliminadas en bolsa roja para ser incineradas.
Los resultados obtenidos serán entregados al representante legal (padre si es menor de edad) o al donante vía correo
electrónico en ocho meses.
Actividad Enzimática Fosfomanosa isomerasa: _______ U/L
Fecha: _________________ Tel: __________________
Nombre: ____________________________________________________
Firma: _____________________ C.C. __________________________
Fecha de nacimiento: _________________ Lugar de nacimiento: _____________
Género: M_ F_
Correo electronico:______________________
