INSTITUTO POLITECNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

Investigacin sobre Produccin, Purificacin e Inmovilizacin de la enzima D-Xilosa Isomerasa.

Materia: Ingeniera Enzimtica.

Profesor: Csar A. Jimnez Sierra.

Grupo: 4BM1..

Equipo:Figueroa Romero Jorge Luis.Gordillo Alfonso Jos Pablo.Pealoza Figueroa Mara Victoria.Sosa Martnez Eduardo.

Fecha de entrega: 27 de mayo del 2014.

D Xilosa Isomerasa: Produccin, purificacin e inmovilizacin.El primer reporte de la actividad de una glucosa isomerasa (D Xilosa Isomerasa, Figura 1) apareci en un artculo en 1957 de Marshall y Kooi, donde se demostraba que la D Xilosa Isomerasa de Pseudomonas hydrophila, contrario a reportes anteriores, poda convertir glucosa a fructosa. La afinidad de la enzima por la glucosa fue mucho menor que por la xilosa (Km = 0.5 y 3*10-3 M, respectivamente). La Xilosa Isomerasa (D- Xilosa Cetoisomerasa), relativamente una enzima nueva en ese tiempo, mostr que poda estar presente en extractos de Pseudomona hydrophila, Lactobacillus pentosus y Pastoteurella pestis. As mismo, Marshall y Kooi sealaron que, cuando el arseniato era usado en la isomerizacin, se observaba una mayor eficiencia en la conversin de glucosa a fructosa. Tambin observaron que la produccin de Xilosa Isomerasa era absolutamente dependiente de la presencia de Xilosa en el medio de crecimiento, as como un pH ptimo de 8.5 y temperatura ptima de 42 -43 C. Tanto Richard Marshall como Earl Kooi fueron dos qumicos que, mientras trabajaban en Agricultural Experiment Station, Oklahoma, Estados Unidos; descubrieron como usar la D-Xilosa Isomerasa para convertir glucosa a fructosa, patentando este proceso en Estados Unidos, en 1960.La D-Xilosa Isomerasa, en general es una enzima termoestable, capaz de reaccionar dentro de un rango de temperaturas de 45 65 C, adems la reaccin no requiere de algn factor de regeneracin tal como NAD+ o ATP. Los dos factores mencionado anteriormente hacen que esta enzima sea adecuada para la explotacin comercial, ya que la ausencia de cofactores de regeneracin hacen que la reaccin sea sencilla, y que la estabilidad a altas temperaturas permite el control de contaminacin microbiana, por lo tanto ofrece una operacin comercial potencialmente factible. Adems, su peso molecular ronda entre los 165,000 a 191,000 Da, y as mismo tiene requerimientos de iones metlicos como Co+2, Mn+2, Mg+2, o bien Cr+2. Figura 1. Estructura molecular de la enzima D Xilosa Isomerasa.

Fuente de la enzima Xilosa Isomerasa.La D - Xilosa Isomerasa es ampliamente distribuida. Es producida en la mayora de los microorganismos capaces de crecer en medios con Xilosa. En 1970, Wiermeyer report que en respuesta a la induccin de Xilosa, tres enzimas eran producida en Escherichia coli: D-Xilosa Permeasa, D-Xilosa Isomerasa y D-Xilulocinasa. La glucosa isomerasa est ampliamente distribuida en procariotas. Despus de su descubrimiento en Psudomonas hydrophila, un gran nmero de bacterias y actinomicetos se ha encontrado que producen glucosa isomerasa que se activa en ausencia de arseniato. Entre las bacterias cidos heterolcticas, el Lactobacillus brevis produjo el mayor rendimiento de enzima. Informes sobre la excrecin extracelular de la glucosa isomerasa no es comn, pero puede ser producida por Streptomyces glaucescens, S. flavogriseus y S. flavovirens, por lo que la liberacin de la enzima de las clulas se atribuy a la permeabilidad de la pared celular y la lisis parcial de las clulas.Alguna de los microorganismos productores de D-Xilosa Isomerasa se encuentran en la siguiente tabla.Tabla 1. Microorganismos productores de la enzima D Xilosa Isomerasa. Gnero.Especie.

Streptomyces.bobilai, flavovirens, echinatus, achromogenes, phaeochromogenes, fradiae, roseochromogenes, olivaceus, californicas, venuceus, virginal, olivochromogenes, venezulae, wedmorensis, griseoleus, glaucescens, bikiniensis, albus, rubiginosus.

Lactibacillusbrevis, manniftopocus, pentoaceticus, gayonii, plantarum.

Brevibacteriumpentoso aminoacidicum, imperiale, incertum

Pseudomonashydrophila

Leuconostocmesenteroides

Aerobacteraerorigenes, levanicum

Bacilluscoagulans, stearothermophilis

Escherichiacoli

Aspergillusoryzae

Mycobacteriumsp.

Nocardiaasteroides, dassonvellei, corallia

Microellobosporaflavea

Arthbactersp.

Actinoplanesmissouriensis

Thermopolysporasp.

Pseudonocardiasp.

Streptosporangiumalbus, vulgare

Curtobacteriumsp.

Flavobacteriumdevorans

As mismo, se ha reportado que la fuente de la enzima puede provenir de plantas, malta de cebada o bien germen de trigo. Produccin de D Xilosa Isomerasa.La exitosa comercializacin de la D- Xilosa Isomerasa, comnmente llamada Glucosa Isomerasa, requiere de una produccin econmica de la enzima. En la Tabla 1 se ha mostrado una larga lista de microorganismos que han mostrado ser productores de la Glucosa Isomerasa. El incremento de la produccin de la enzima ha resultado de la mutacin de los microorganismos y de las tcnicas de aislamiento, por ejemplo, Bengston y Lamm (1972) sometieron a clulas de Streptomyces ATCCC 21175 a la accin txica de etilenimina para destruir cerca del 95% de los microorganismos. Los microorganismos sobrevivientes de este tratamiento, cuando se cultivaron, incrementaron en un 60% el rendimiento de produccin de la enzima isomerasa. Otro ejemplo se obtuvo en el tratamiento de las esporas de Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114 con suficiente luz UV para eliminar al 97% de los microorganismos. Algunos de las cepas mutantes aisladas producto de este tratamiento, tuvieron una actividad productora del 50% ms alta. (Armbruster et al., 1974).La Glucosa Isomerasa es generalmente producida por fermentacin airada sumergida. La mayora de los microorganismos productores de esta enzima requiere de D-Xilosa como un componente importante en el medio de fermentacin, para inducir la produccin de la Glucosa Isomerasa. Tambin se ha observado que cierto tipo de Streptomyces, crecen y producen de manera adecuada la enzima en un medio con presencia de Xilano. Este polisacrido no se encuentra en forma pura, por lo que se usa salvado de trigo, as como mazorcas y cscaras de maz como buenas fuentes de Xilano para producir de manera satisfactoria la Glucosa Isomerasa. Dado que la D-Xilosa es un azcar relativamente cara, para usos comerciales e industriales se usan cepas de microorganismos como Arthrobacter, Actinoplanes, Bacillus coagulans o Streptomyces olivochromogenes ,que no requieren a la D-Xilosa como inductor, ya que requieren de slo glucosa para producir la Glucosa Isomerasa.Otros requerimientos importantes son la presencia de cationes, por ejemplo para Streptomyces es necesario tener iones de Co+2 para estimular la produccin de isomerasa, as como Bacillus coagulans requiere de Mn+2 para estimular igualmente la produccin de la enzima. As mismo se requieren medios con adecuadas fuentes de nitrgeno, pH y temperatura adecuada. La fuente de nitrgeno es un factor crtico que puede ser sometido para cada fuente de enzima, y la exigencia de la fuente de nitrgeno difiere de un microorganismo a otro, la peptona, el extracto de levadura o sales de amonio pueden ser utilizados. La temperatura adecuada es de aproximadamente 30 C, y un pH de 6.5 a 8.5, sin embargo igualmente se puede producir a temperaturas ms altas en microorganismos termfilos, ya que Glucosa Isomerasa es una enzima termoestables altas temperaturas 45 - 65 C. Adems, la adicin de otros aditivos como sorbitol y glicina incrementa la produccin de glucosa isomerasa, y pueden servir como inductores sustitutos en lugar de D-Xilosa. Purificacin de D Xilosa Isomerasa.La mayora de los microorganismos comerciales producen glucosa isomerasa de manera intracelular. As, la Glucosa Isomerasa puede ser recuperada de dos formas: recuperacin de los microorganismos con la enzima atrapada en la masa celular, o bien recuperacin de la enzima en forma soluble despus de la lisis celular. A continuacin se describen algunos de los pasos en el proceso de obtencin y purificacin de la D-Xilosa Isomerasa.*Ruptura celular. El primer paso previo a la purificacin de la D-Xilosa Isomerasa es el rompimiento de las clulas. Para la recuperacin de la enzima soluble, generalmente se produce a travs de la ruptura celular usando uno o ms de los siguientes mtodos:1) Accin de lisozimas. Su accin cataltica consiste en la rotura del enlace glicosdico 1-4 caracterstico de los peptidoglicanos bacterianos, cuyo disacrido constitutivo es N-acetil glucosamina-N-acetil murmico. La lisozima es activa sobre todo frente a las bacterias gram-positivas, siendo menor su actividad frente a las bacterias gram-negativas.

2) Homogenizacin. La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de las clulas. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por: mbolos, cuchillas, pistones, etc.

3) Tratamiento con detergentes. Es uno de los mtodos no-mecnico rompimiento de clulas ms utilizado. Los detergentes tienen una zona hidroflica y otra hidrofbica, por esta razn pueden interactuar tanto conel aguacomo con los lpidos. Su habilidad se basa en la solubilizacin de los lpidos de la pared celular. Los detergentes ms utilizados son de tres tipos: detergente aninico, detergente catinico, detergente no-inico y polidispersante.

4) Sonificacin. Se utilizan frecuencias de 20 Khz que producen vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin. Se producen zonas de baja presin en el lquido, el cual se transforma engasformndose pequeas burbujas. Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.

Los anteriores tratamientos, son los ms suaves en el mercado, y si son aplicados con precaucin, proveen buena recuperacin de enzima activa. La prdida de enzima activa ronda en 10% o menos.

*Separacin de material intracelular (lquido/slido). La separacin lquido/slido es generalmente requerida para el inicio de la separacin masa celular, la eliminacin de restos celulares posterior a la rotura celular y la recoleccin de precipitados. Lo anterior se puede conseguir por filtracin, centrifugacin o particin bifsica acuosa. En general, la filtracin o los sistemas bifsicos acuosos son usados para remover clulas no deseadas o restos celulares, mientras la centrifugacin es el mtodo preferido para la recoleccin de material slido requerido. As mismo, estos mtodos son usados para remover algunas de las protenas no requeridas de la citoplasma de la clula, y algunas macromolculas adicionales, cofactores y nutrientes.

*Remocin de cidos Nucleicos. Posteriormente a la separacin de restos celulares, se procede a la separacin de cidos nucleicos. Los cidos nucleicos en el extracto crudo pueden ser removidos por precipitacin de agregados formados con sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina.*Remocin de protenas y obtencin de la enzima pura. Ahora se procede a la purificacin de la enzima la cual se realiza a travs de la formacin de precipitados, que es usualmente hecha usando sulfato de amonio como sal. Este mtodo consiste en la precipitacin de diferentes protenas a distintas concentraciones de sulfato de amonio. En general las protenas con alto peso molecular precipitarn a bajas concentraciones de sulfato de amonio. La precipitacin con una sal, por lo general no conducen a una protena altamente purificada, pero puede ayudar en la eliminacin de algunas protenas no deseadas en la mezcla y concentrar la muestra. Las sales en la solucin se eliminan luego por dilisis a travs de la tubera porosa de celulosa, filtracin, o cromatografa de exclusin en gel, completando as la purificacin de la protena. Por ltimo el precipitado es recogido por centrifugacin. En el siguiente diagrama de purificacin se pueden visualizar los anteriores pasos del mtodo de purificacin de la D-Xilosa Isomerasa.Figura 2. Diagrama de Purificacin de enzima D-Xilosa Isomerasa.

Inmovilizacin de D Xilosa Isomerasa.Muchos mtodos de inmovilizacin de enzimas han sido evaluados. El uso ms importante y sobresaliente a nivel industrial y comercial de esta enzima radica en la produccin de jarabe de alta fructosa, por lo que es importante tomar en cuenta la formacin o uso de componentes potencialmente txicos a la hora de inmovilizar la D-Xilosa Isomerasa. El mtodo ms importante para lograr el inmovilizado de la enzima es el entrecruzamiento con ayuda de agentes bi- o multifuncionales. Investigaciones realizadas por Branner y Jorgensen en 1977, indicaron que slo la simple formacin de una base de Schiff es vlida como el paso inicial en el entrecruzamiento de protenas con glutaraldehdo.

Figura 3. Reaccin de entrecruzamiento entre enzimas y glutaraldehdo.Durante inmovilizacin por entrecruzamiento, la enzima forma enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. Varios mtodos de dar forma a la enzima inmovilizada han sido diseados. El congelado de la enzima inmovilizada, seguida del descongelamiento y secado, da altura a la orientacin de la estructura en la matriz, dndole al producto el aspecto de hojuelas. Una simple granulacin hmeda, produce un polvo fino como grnulos, mientras la extrusin en una extrusora axial da partculas que asemejan cilindros.

Los anteriores mtodos son importantes en la inmovilizacin y manufactura de la enzima D-Xilosa Isomerasa inmovilizada, cuyo nombre comercial se conoce como Sweetzyme Type A, un producto de Novozyme Corp, siendo la ms usada en el mercado. A continuacin en la Figura 5, se muestra el proceso de produccin y formacin de partculas inmovilizadas de esta enzima.Figura 4. Estructura y presentacin comercial del glutaraldehdo.

Figura 5. Diagrama de preparacin e inmovilizacin de la enzima comercial Sweetzyme.

La enzima inmovilizada comercial Sweetzyme, es usualmente usada en distintos tipos de reactores, pero son cuatro reactores los ms usados y recomendados para el uso de la enzima inmovilizada por entrecruzamiento, y son las siguientes: Reactores en lote con recirculacin. Reactor de lecho fluidizado. Reactor de lecho fijo.Existen otros mtodos de inmovilizacin de la Glucosa Isomerasa, las cuales se mencionara y describirn a continuacin.1) Inmovilizacin en clulas bacterianas.La inmovilizacin en clulas bacterianas es una de las tcnicas ms simples de inmovilizacin, la cual produce enzimas inmovilizadas que exhiben una amplia proporcin de actividad nativa de glucosa isomerasa. La tcnica de inmovilizacin de enzimas de uso comercial ms antigua fue la fijacin de clulas por calor. Por ejemplo las clulas de varias especies de Streptomyces fueron tratadas por periodos cortos de tiempo a altas temperaturas (60 80 C). La inmovilizacin se atribuye a la destruccin selectiva de las enzimas lticas, las cuales disuelven la estructura de la pared celular durante la autolisis. Otra manera de poder inmovilizar a las clulas es a travs del tratamiento de una suspensin celular con varias clulas inorgnicas en concentraciones debajo de 0.1 M. De manera similar las clulas pueden ser tratadas con soluciones de citrato con un pH de 6 aproximadamente. Tambin puede ser inmovilizada a travs de agregados que han sido producidos por la adicin de poli electrolitos sintticos al caldo de fermentacin.2) Inmovilizacin de isomerasa celular o libre de clulas adsorbidas en matrices insolubles.La glucosa Isomerasa ha sido adsorbido en celulosa de intercambio aninico, resinas de intercambio aninico y Sephadex de intercambio aninico. Generalmente, las condiciones de baja fuerza inica y un pH en el cual no ocurra la elusin de la enzima, son requeridas para usar este tipo de inmovilizacin. Una interesante variante de esta tcnica es el uso de una resina de intercambio catinico saturada de iones de magnesio para la inmovilizacin de esta enzima. La Glucosa Isomerasa tambin puede ser inmovilizada en otros materiales como pelculas protenicas de colgeno o zena, o bien en compuestos polimricos coordinados activados por sales de T, Zr, Zn o Fe. Adems cuerpos cermicos porosos, partculas porosas de aluminio y mezclas de MgO-Al2O3 con poros cuyo tamao rondan de 100-1000 han sido usados para adsorber la Glucosa Isomerasa.3) Inmovilizacin de isomerasa celular o libre de clulas atrapadas en matrices insolubles.La tcnica de inmovilizacin usada en esta categora incluida algunos de los ms simples donde se mezclan las clulas o enzimas con agentes envolventes producen un material el cual puede ser granulado. Uno de esos mtodos es la floculacin de la isomerasa libre de clulas extradas de diversas fuentes en la presencia de un coadyuvante de filtracin y un agente floculante sinttico poli inico. Otro procedimiento utiliza el glutaraldehdo para el entrecruzamiento de clulas lisadas. El material entrecruzado es granulado y secado para su uso comercial, como es el caso de Sweetzyme, ya comentado previamente. Otros procedimientos ms complejos son el atrapamiento de Glucosa Isomerasa en fibras de triacetato de celulosa, o bien la adsorcin de glucosa isomerasa en pelculas de colgeno seguido del curtido de la pelcula. Tambin han sido atrapadas en gelatina, seguida por el entrecruzamiento con glutaraldehdo.

4) Inmovilizacin de isomerasa celular unida covalentemente a materiales celulares.Preparaciones de glucosa isomerasa unida covalentemente generalmente envuelve procedimientos ms complicados. Se han reportado uniones covalentes a materiales como vidrio, cermicas porosas, resinas de intercambio aninico y membranas sintticas para varios agentes bifuncionales.A continuacin se muestra en la Figura 6, los mtodos ms importantes de inmovilizacin usadas por empresas importantes en la produccin de Glucosa Isomerasa.Figura 6. Mtodos de inmovilizacin de D-Xilosa Isomerasa.

Proceso cataltico de la D Xilosa Isomerasa Inmovilizada.La reaccin que cataliza esta enzima como se ha mencionado anteriormente es la conversin de D - glucosa a D fructosa, como muestra la siguiente figura. Figura 7. Reaccin de isomerizacin mediada por la enzima D-Xilosa Isomerasa.

La reaccin de isomerizacin es una reaccin reversible de primer orden. El equilibrio de las concentraciones de fructosa ronda en 42.5 % a 25 C, 47.9 % a 40 C, 53.5 % a 60 C y 56.5 % a 70 C. La reaccin es altamente endotrmica con un calor de reaccin de +2220 cal/mol.Al pasar de la enzima soluble con catlisis homognea para la enzima inmovilizada con catlisis heterognea implica demasiadas complicaciones, cuando uno de los intentos para describir el comportamiento de la enzima se hace en trminos de constantes y ecuaciones. En la prctica industrial diaria, se restringe la observacin de los efectos de particin y resistencia difusiva en el volumen de la solucin, adems se minimizan las reacciones ocurridas en los microambientes de la enzima. Para la reaccin reversible de primer orden, como es el caso de la isomerizacin (glucosa/fructosa), se tiene lo siguiente:

Donde E es la enzima, G es la glucosa y F es la fructosa, y donde adems la actividad est dada por:

Y suponiendo un flujo de tapn y ausencia de efectos de particin y difusin, se puede emplear la siguiente expresin para la actividad igualmente:

Donde B, C y k son constantes.Estudios de cintica enzimtica indicaron, sin embargo, que la enzima inmovilizada en el proceso de isomerizacin tiene restricciones difusionales, los cuales influyen en la tasa de efectividad de la reaccin. Por lo tanto, se confa en la siguiente ecuacin emprica y tablas que determinan la tasa de efectividad de la reaccin.

Donde los factores determinados empricamente, a para la concentracin del sustrato, b para el grado de conversin y m para la temperatura de reaccin, se pueden encontrar en tablas.Los factores a tomar en cuenta en el proceso cataltico de la reaccin a la hora de inmovilizar la enzima son los siguientes: Temperatura ptima: La productividad de la enzima, con estabilidad y actividad integral, es de alrededor de mximo 60 C. Dependencia del pH: El perfil de actividad PH de la enzima inmovilizada fue establecida en laboratorios en experimentos de columna, empleando cortos tiempos de residencia para minimizar la interferencia del pH. Una variacin del pH ptimo gira al lado alcalino. La variacin puede estar relacionada a efectos electrostticos y probablemente tambin a propiedades difusionales de la enzima inmovilizada. Activacin Ion Metal: Las columnas de enzima inmovilizada requieren pequeas cantidades de Mg+2 (4*10-3 M), y no es necesario el uso de cobalto en el sustrato. As, por ejemplo en reactores de columna de flujo continuo, slo las sales de magnesio son agregadas a la alimentacin.Resumiendo todos estos factores necesarios para el proceso cataltico de la enzima, en seguida se presentarn las condiciones adecuadas para optimizar la reaccin de la D-Xilosa Isomerasa inmovilizada: Temperatura (C): 65 Tipo de Reactor: En columna. Espacio tiempo: 5-10 minutos. Sustrato: 40% peso/peso. Co+2 (M): -- Mg+2 (M): 4*10-3.La reaccin en una enzima inmovilizada como es el caso de Sweetzyme, se da de la siguiente manera:*El rendimiento de esta enzima comercial se ve afectado por los efectos del transporte de masa.*La cintica de una enzima que es atrapada en poros de tamao mediano puede ser afectada por el transporte externo y, frecuentemente y en mayor medida por las resistencia internas de transporte.*El transporte externo juega un papel importante si la actividad aparente de la enzima depende de la eficiencia de la mezcla del volumen de solucin, o bien de la tasa de flujo que atraviesa el reactor.*Las limitaciones internas de transporte pueden ser detectadas por la comparacin de la actividad aparente de partculas de diferente tamao.* Se ha encontrado que el transporte externo no tiene tan importancia prctica, como el transporte interno, donde los efectos de difusin interna tienen una importancia significativa en la tasa de efectividad de la reaccin. Ventajas de la inmovilizacin de la D-Xilosa Isomerasa.La D-Xilosa Isomerasa es actualmente una de las ms visibles y ms importantes enzimas inmovilizadas a escala industrial. Su aplicacin ms importante de esta enzima radica en la produccin de millones de toneladas anuales de jarabe de maz de alta fructosa. El bajo costo que ahora significa inmovilizar a la enzima, ha hecho que la produccin del jarabe se econmicamente viable. El sistema inmovilizado de esta Glucosa Isomerasa se prefiere por factores como:*Costo relativamente menor a comparacin a otros sistemas de inmovilizacin enzimtica como el usado para la Glucoamilasa.*Estabilidad de la enzima en estos sistemas a altas temperaturas, ya que para procesos continuos para alimentos temperaturas en el rango de 60 C son fuertemente preferidos ya que minimizan los problemas de crecimiento microbiano.*As mismo este sistema goza de una buena eficiencia en la conversin del sustrato, es decir el sistema de enzima inmovilizada produce el producto final requerido a atractivos costos.A diferencia de la enzima soluble o libre, se prefiere el uso de esta enzima de manera inmovilizada, debido a que la enzima en forma libre acarrea problemas como:*Se tienen que agregar forzosamente sales de cobalto a la mezcla reactiva y removerla de manera cuantitativa con resina de intercambio inico, despus de la isomerizacin, incrementando los costos.* Las clulas que contienen isomerasa se autolisan durante la reaccin, liberando as su contenido de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes celulares dentro del caldo de fermentacin, dificultando as su purificacin.*Los anteriores materiales tienden a precipitarse durante la subsecuente purificacin mediante intercambio inico, ensuciando este tipo de columnas y dificultando su regeneracin y hacindola cara.Los anteriores problemas son solucionados con la inmovilizacin de la enzima, adems el costo de produccin de la Glucosa Isomerasa se reduce, se puede reutilizar la enzima de manera eficiente y varias veces. Adems la enzima inmovilizada compensa el valor alto del Km por la glucosa, al poder usar mucha enzima en poco espacio y con la posibilidad de reutilizarla de manera eficiente.

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