M. en C. Sandra Ruiloba de León y FrescasDepartamento de Microbiología

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN

3. Morfología Colonial y Microscópica de los Microorganismos

3. Morfología Colonial y Microscópica de los Microorganismos

• El desarrollo de colonias sobre superficies sólidas permite al microbiólogo identificar las bacterias a partir de una población mixta porque las especies forman a menudo colonias características.

• En general, el crecimiento celular más rápido se produce en el extremo de la colonia siendo más lento en el centro. Esto se debe a gradientes de oxígeno, nutrientes y productos de desecho tóxicos dentro de la colonia. En el extremo de ésta, el oxígeno y los nutrientes son abundantes. El centro de la colonia es, evidentemente más grueso y por ello el oxígeno y los nutrientes no se difunden tan fácilmente

3.1 Características coloniales de algunos grupos de bacterias:Colonia Microbiana

• Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie provenientes de una célula o de un grupo de ellas. Por definición un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permita distinguir y describir la morfología colonial

Descripción de la Morfología Colonial

• 1. Tamaño en milímetros• 2. Color• 3. Forma: puntiforme, circular o

irregular• 4. Bordes: enteros o irregulares

(lóbulos, filamentos, aserrados, enrollados etc.)

• 5. Elevación: plana o elevada (convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada)

• 6. Superficie: lisa, rugosa o granular

• 7. Aspecto: húmedo o seco• 8. Luz reflejada: brillante o mate• 9. Luz transmitida: transparente,

transl-úcida u opaca• 10. Producción de pigmento• 11. Consistencia: dura o suave

(butirosa, mucoide o friable)

Cultivo puro

• Con la experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología colonial constituyen una guía muy útil en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos y también permite corroborar la purezade un cultivo o alertar sobre una posible contaminación.

• El cultivo puro permite la caracterización e identificación correcta de un microorganismo capaz de causar una infección en el hombre los animales o las plantas o bien ser usado en la producción de vacunas, sueros, antibióticos, hormonas, enzimas, colorantes o en productos de interés en la industria alimentaria como vinos, queso, pan, cerveza

Características coloniales de los Actinomicetos

• Son un grupo de bacterias Gram positivas que poseen en su genoma un alto contenido de Guanina Citosina. El nombre proviene de las raíces griegas actinos proyecciones radiales

y mykes hongo.• Las colonias de este grupo bacteriano son en general secas,

duras, mate, lisas o muy ornamentadas, hundidas en el medio de cultivo e hidrofóbicas. Algunas pueden sintetizar pigmentos que son excretados al medio de cultivo.

Colonias de actinomicetos

Colonias de actinomicetos• Colonias de Steptomyces

coelicolor.• Las colonias de color rojo

son productoras de antibiótico.

Características coloniales de los Micoplasmas

• La mayoría de los procariotes no pueden sobrevivir sin pared celular pero existe un grupo de bacterias, denominadas micoplasmas, que

carecen de pared. • Los micoplasmas son protoplastos de vida libre que disponen de

membranas citoplasmáticas muy resistentes (poseen esteroles) o bien viven en medios protegidos osmóticamente.

• Cuando crecen en agar estos microorganismos tienden a incrustarse en el medio y las colonias adoptan un aspecto característico de “huevo frito”, debido a la formación de un núcleo central denso, que penetra en el agar, rodeado de un área circular de dispersión, de color menos intenso.

Colonias de micoplasmas

Características coloniales de las Mixobacterias

• Mixobacterias o Bacterias deslizantes • Las mixobacterias son bacterias Gram negativas y aerobias,

caracterizadas por tener movilidad por deslizamiento, tener un ciclo vital complejo con producción de cuerpos fructíferos, y formar mixosporas.

• En presencia de una fuente de alimento, las mixobacterias migran a lo largo de una superficie sólida, alimentándose y dejando tras de sí un rastro mucoide. Durante esta fase las células suelen constituir un grupo, y se mueven de manera coordinada. Algunas especies se congregan para producir una lámina de células que se desplaza deforma rítmica y genera ondas. Cuando se agota su aporte de nutrientes, las mixobacterias se reúnen y se diferencian en un cuerpo fructífero,

Colonias de Mixobacterias

Bacterias que producen “swarming”• Algunas bacterias móviles no

forman colonias discretas sino que crecen invadiendo toda la caja de Petri.

• Este tipo de crecimiento llamado “swarming” es característico de algunos géneros como Proteus.

• Las células en el extremo de la colonia se mueven mas rápidamente que las que están en el centro, se mueven en masa una corta distancia alejándose de la colonia y luego experimentan una disminución de la movilidad, se detienen y se dividen. Como resultado la colonia madura tiene aspecto de discos concéntricos, con una alternancia de altas y bajas concentraciones de células.

Ejemplos de colonias bacterianas

Diversas colonias bacterianas

Colonias de Bacillus

Morfología colonial de Serratia marcescens

Colonias fluorescentes de Pseudomonas aeruginosa

Microfotografía de colonias bacterianas

3.2 Morfología Microscópica de las Bacterias

• Morfología celular• A la forma de una célula se le denomina morfología celular.• Las bacterias poseen una considerable variedad en su forma, agrupación y

tamaño.• La mayoría de ellas exhiben tres formas generales: cocos, bacilos y espirilas.• Si la célula es esférica se describe como coco pudiendo haber ligeras

variaciones.• A las células cilíndricas se les denomina bacilos y se pueden observar con

extremos diversos (rectos, curvos, bulbosos, ahusados, bifurcados etc.). Los cocobacilos son bacilos cortos y regordetes. Los bacilos ligeramente curvosson vibrios.

• Las bacterias que tienen la forma de un cilindro en forma de espiral rígida se llaman espirilas y las que tienen una forma mas flexible y se asemejan a un

resorte se denominan espiroquetas.• También es posible observar bacterias triangulares, cuadradas, en forma de

estrella de David etc.

Esquema de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Esquema de diversas morfologías microscópicas

Morfología microscópica: esquemas y microfotografías

Morfología microscópica, esquemas y microfotografías

Microfotografías de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Observación microscópica de diversas formas bacterianas

Ejemplos representativos de espiroquetas

Agrupación de las bacterias• Agrupaciones en los cocos

• Las bacterias pueden existir como células individuales, pero se asocian también en agrupaciones características que son útiles frecuentemente para identificarlas.

• Los cocos pueden crecer como células aisladas o bien agruparse en pares dando lugar a los diplococos (Neisseria). Cuando las células permanecen adheridas después de dividirse en un plano, se forman largas cadenas de cocos llamadas estreptococos; este modelo se observa en los géneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus. Las bacterias del género Staphylococcus se dividen en planos aleatorios para generar agrupaciones irregulares en forma de racimos de uvas llamadas estafilococos. Las divisiones en dos o tres planos pueden producir grupos simétricos de cocos. Los miembros del género Micrococcus se dividen a menudo en dos planos para formar grupos cuadrados de cuatro células denominados tetradas. En el género Sarcina, los cocos se dividen en tres planos, formando paquetes cúbicos de ocho células denominados precisamente sarcinas.

Agrupaciones en los cocos

Observaciones microscópicas de cocos en pares (diplococos) y cocos en cadena (estreptococos).

Cocos en tetradas

Agrupación de las bacterias

• Agrupaciones en los bacilos• Aunque muchos bacilos aparecen aislados,

pueden permanecer juntos después de dividirse para formar pares constituyendo los diplobaciloso cadenas de distinta longitud llamados estreptobacilos. Algunos se agrupan formando una especie de valla que se describe como empalizada y otros mas toman agrupaciones irregulares conocidas como “letras chinas”.

Observación microscópica de algunos bacilos

Observación microscópica de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Morfología microscópica de diversas bacterias

Morfología microscópica del actinomicetoPlanomonospora sp.

Morfología microscópica de Escherichia coli

Morfología microscópica de Staphylococcus aureus

Morfología microscópica de Mycoplasma pneumoniae

Morfología microscópica de Helicobacter pylori

Morfología microscópica de Bacillus anthracis

Morfología microscópica de Borrelia burgdorferi agente causal de la enfermedad de Lyme

Morfología microscópica de Campylobacter jejuni

Observación microscópica de Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis

Morfología microscópica de diversas bacterias fotosintéticas

Morfología microscópica de diversas bacterias metanógenas

Morfología microscópica de Caulobacter

Morfología microscópica de algunas halobacterias

Morfología microscópica de Legionella pneumophila causante de la enfermedad

de los legionarios

Morfología microscópica de Leucothrix spp formando

agrupación en rosetas

Morfología microscópica de Streptococcus pneumoniae

Morfología microscópica de diversas bacterias deslizantes

Morfología microscópica de Neisseria gonorrhoeae

Morfología microscópica de Spirillum spp

Pleomorfismo

• Es muy común que células de la misma especie muestren ligeras variaciones en forma y tamaño. Este fenómeno se denomina pleomorfismo y se debe a variaciones individuales en la estructura de la pared celular por diferencias nutricionales o hereditarias. Corynebacterium diphteriae es un bacilo pero en cultivo muestra una amplia variación en su forma observándose curvo, filamentoso, cocoide etc.

• El pleomorfismo alcanza su punto extremo con los micoplasmas que no poseen pared celular y muestran por lo tanto una gran versatilidad en su forma

Pleomorfismo en Corynebacterium diphteriae

• Este género exhibe una gran variedad en formas y tamaños. Además se agrupa de una manera característica llamada empalizada.

Pleomorfismo en los Micoplasmas

• Estas bacterias carecen de pared celular lo que les permite una gran plasticidad de forma.

• La microfotografía corresponde a Mycoplasma pneumoniaeobservada con un microscopio de barrido a 62000X y coloreada artificialmente por computadora .

Tamaño de las bacterias• Las bacterias varían tanto de tamaño como de forma. Las más

pequeñas, miembros del género Mycoplasma miden aproximadamente 0.3 µm de diámetro, casi el tamaño de los virus mayores (poxvirus). Recientemente se han publicado investigaciones sobre células incluso menores. Las nanobacterias o ultramicrobacterias que tienen un diámetro aproximado de entre 0.2 y 0.05 µm.

• Escherichia coli es un bacilo de tamaño medio que mide 1.1-1.5 µm de ancho por 2-6 µm de largo. Algunas bacterias son bastante grandes; ciertas espiroquetas pueden alcanzar a veces una longitud de 500 µm. Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano. Esta bacteria llamada Epulopiscium fishelsoni (80 x 600 µm) tiene un tamaño mayor que el promedio de las céulas eucarióticas.

Una bacteria de tamaño “monstruoso”

• Esta fotografía realizada con un microscopio de campo oscuro, muestra a Epulopiscium fishelsoni(procariote) en la parte central de la fotografía, empequeñeciendo a los paramecios (eucariotes) que aparecen en la parte inferior (x200)

Otro microorganismo gigantesco llamado Thiomargarita namibia

Bibliografía• Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

Prentice Hall, Inc. • Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biología de los

Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.• Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of

Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.• Prescott L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. 1999. Microbiología. 4a. Ed.

McGraw Hill-Interamericana

Características tintoriales. Tamaño, forma, agrupación y presencia de esporas.

• Los microscopios tendrían poca utilidad a menos que los especimenes a observar sean preparados adecuadamente. El poder de resolución y el aumento son cualidades importantes en microscopía, pero igualmente cruciales son el grado de contraste observado entre las estructuras a ser observadas y el entorno, por lo que se han desarrollado técnicas especiales que acentúan las características morfológicas de los microorganismos y que permiten conservarlos para su estudio posterior. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente con un microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar su visibilidad.

Fijación

• Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo mas posible a las células vivas.

• La fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras externas e internas de las células. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología y endurece las estructuras celulares, de manera que no cambien durante la tinción ni la observación. El proceso de fijación mata al microorganismo, coagula sus proteínas y lo adhiere firmemente al portaobjetos.

Tipos de Fijación

• Existen dos tipos de fijación fundamentalmente diferentes:

• 1.- Fijación Física

• 2.- Fijación Química

Fijación Física

• Los bacteriólogos la utilizan rutinariamente fijando al calorfrotis bacterianos. Esto se logra calentando suavemente a la flama del mechero una fina película de bacterias secada previamente al aire. Si el frotis no se ha secado completamente, al pasarlo por el mechero se provoca la ebullición y destrucción del microorganismo.

• Si la fijación es insuficiente, la fina película de bacterias nose pegará al portaobjetos y será fácilmente arrastrada en los pasos subsecuentes. Si se fija en exceso incineraremos a los microorganismos.

Fijación Química

• Se emplea cuando se desea proteger la subestructura fina y la morfología de microorganismos delicados. Los fijadores químicos penetran las células y reaccionan con los componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmóviles. Entre las sustancias comúnmente utilizadas como fijadores químicos se encuentran el etanol, cloruro mercúrico, ácido acético, formaldehído, ácido tánico y glutaraldehído.

Colorantes• Un colorante es cualquier sustancia colorida que al combinarse con

una segunda sustancia, le imparte color. En términos químicos es un compuesto orgánico que posee un grupo cromóforo y un grupo auxócromo unidos a un anillo benceno.

• El grupo cromóforo imparte al compuesto la propiedad de color. El anillo benceno que tiene radicales cromóforo se le conoce como cromógeno. Este compuesto que es colorido no tiñe, es decir no tiene afinidad o capacidad de unirse a fibras o tejidos. El color puede entonces removerse fácilmente por medios mecánicos. Para ser colorante es necesaria la presencia del grupo auxócromo que le imparte al compuesto la propiedad de disociación electrolítica. La función del

auxócromo es la de proporcionar la propiedad de sal al compuesto.

Colorantes usados en Microbiología

• Los numerosos tipos de colorantes empleados para teñir microorganismos poseen dos características en común:

• 1) Todos poseen grupos cromóforos, grupos con enlaces dobles conjugados que dan color al colorante.

• 2) Pueden unirse a las células mediante enlaces iónicos, covalentes o hidrofóbicos.

Clasificación de los colorantes por su carga

• Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases, tomando como base la naturaleza de su grupo cargado.

• Los colorantes básicos como el cristal violeta (violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina básica, verde de malaquita, son catiónicos o tienen grupos cargados positivamente. Estos colorantes se unen a moléculas cargadas negativamente, como ácidos nucleicos ymuchas proteínas. Como las superficies de las células bacterianas están cargadas negativamente.

• Los colorantes ácidos, como la eosina, la fucsina ácida,y el rosa de bengala son aniónicos o poseen grupos cargados negativamente como hidroxilos (-OH) o carboxilos (-COOH). Estos colorantes debido a su

carga, se unen a estructuras cargadas positivamente.

Utilidad de las Tinciones

• Las bacterias son semitransparentes y difíciles de ver sin teñir por lo que se utilizan colorantes que :

• 1.-Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

• 2.-Nos revela su forma y tamaño.• 3.-Muestran la presencia de estructuras internas y externas• 4.-producen reacciones químicas específicas.• Además, la presencia de ciertas estructuras así como su

reacción a determinadas técnicas nos permite CLASIFICAR a las bacterias.

Tinción simple• Los microorganismos se pueden teñir adecuadamente con una tinción

simple, esto es utilizando un solo colorante. El valor de esta clase de tinción radica en su simplicidad y facilidad de empleo. Se cubre el frotis previamente fijado al calor, con un colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se deja secar al aire. La tinción simple se emplea con frecuencia para determinar:

• a) el tamaño• b) la forma• c) la agrupación• d) la presencia de esporas

Tinciones diferenciales

• Los métodos de tinciones diferenciales clasifican a las bacterias en grupos distintos según sus propiedades tintoriales.

• Las tinciones diferenciales mas comúnmente utilizadas son la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción de Gram

• La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción mas ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción diferencial porque divide a las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas (G+) y Gram negativas (G-)

Tinción de Gram

• En el primer paso de esta tinción, el frotis se cubre con el colorante básico cristal violeta llamado colorante primario. Se deja actuar durante un minuto y se enjuaga el exceso con agua corriente, se adiciona posteriormente lugol que es una solución yodada que actúa como mordente. Esto es, el yodo aumenta la interacción entre la célula y el colorante, de forma que la célula se tiñe mas intensamente. Luego se decolora el frotis lavándolo con una mezcla de etanol-acetona. Este es el paso crítico de la tinción, las bacterias G+ retienen el cristal violeta y las G- lo pierden y se decoloran. Finalmente el frotis se tiñe de nuevo con un colorante distinto al cristal violeta. La safraninaes el colorante secundario o de contraste mas común. Y tiñe a las bacterias G- de rosa o rojo dejando a las G+ de color violeta

Tinción de Gram del Bacilo de Döderlein

• Tinción de Gram de Lactobacillus acidophilus, microorganismo predominante en la vagina de las mujeres.

• Los bacilos tienen una longitud de 3-4 um

Técnica de Tinción de Gram

Técnica de Gram por pasos

Fundamento de la técnica de Gram

• La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza de la paredcelular bacteriana.

• Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa pared de peptidoglicana que es capaz de retener al complejo cristal violeta-yodo. Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo dentro de la célula. En cambio en las Gram negativas, la delgada capa de peptidoglicana no puede impedir la salida del complejo colorante-mordente y es entonces fácilmente teñida por el colorante secundario o de contraste.

Tinción de Ziehl-Neelsen

• La tinción de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clínicas de pacientes es otra muy importante tinción diferencial. Algunas especies, particularmente del género Mycobacterium y Nocardia no se tiñen con colorantes comunes y requieren de tratamientos mas drásticos que incluyen calentamiento y el uso de una mezcla de colorante en soluciones alcalinas con una pequeña cantidad de fenol. Una vez que el colorante ha penetrado, las células llamadas ácido alcohol resistentes no son decoloradas por la mezcla alcohol-ácido y permanecen teñidas con el colorante primario. Las no ácido alcohol resistentes son fácilmente decoloradas y toman el colorante secundario o de contraste.

Técnica de tinción de Ziehl-Neelsen

• 1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar al aire y fijarlo al calor.

• 2.-Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada.• 3.-Calentar suavemente con el mechero hasta la

emisión de vapores. El colorante no debe hervir ni secarse, añadir más si es necesario.

• 4.-lavar con agua• 5.-Decolorar exhaustivamente con alcohol-

ácido.• 6.-Lavar con agua.• 7.-Cubrir el frotis con azul de metileno durante

un minuto• 8.-Lavar con agua, escurrir, dejar secar.• 9.-Observar al microscopio con el objetivo de

inmersión. • Las bacterias ZN+ o BAAR se observarán

teñidas intensamente de color rojo.

Fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen

• Los géneros Mycobacterium y Nocardia presentan en su pared celular un alto contenido de ácidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras, ácidos micólicos y nocárdicos, respectivamente.

• Se ha postulado que el alto contenido de ácidos grasos interviene decisivamente en la coloración ya que al calentar la preparación con el colorante primario hasta la emisión de vapores se favorece la fusión de las ceras y se aumenta la energía cinética de las moléculas facilitándose la penetración del colorante a la célula; al suspender el calentamiento y lavar con agua fría se provoca la solidificación de las ceras de modo que el colorante ya no puede salir. También se ha postulado que la mezcla del colorante-fenol es mas soluble en los lípidos bacterianos que en el agente decolorante, lo que contribuye a su permanencia en el interior de la célula.

• Puesto que el proceso de decoloración es muy enérgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes lípidos perderá el colorante primario durante la decoloración y tomará el colorante de contraste.

Importancia de la Técnica de Ziehl-Neelsen

• Las bacterias que resisten la decoloración por alcohol-ácido se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).

• Actualmente la tinción de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis, enfermedad cuya incidencia está aumentando recientemente. Así como en la identificación de Mycobacterium leprae, agente etiológico de la lepra.

Mycobacterium leprae

• Tinción de Ziehl-Neelsen.

• Observe las masas de micobacterias rojas en el interior de las células huésped azul-verdosas.

• Mycobacterium leprae. 400X

Diversos tipos de tinciones

Tinciones selectivas• Las tinciones selectivas tienen por objeto poner de manifiesto las

estructuras de las células aprovechando las propiedades químicas o físicas de algunos de sus componentes o bien, proporcionar información acerca de la naturaleza de ciertas estructuras a través de su comportamiento tintorial. Estas técnicas de tinción se basan en el hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto tiene afinidad mayor por los colorantes utilizados que el resto de la célula.

• Se pueden entonces demostrar estructuras como la pared celular, cápsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depósitos de materiales de reserva de poli-ß-hidroxibutirato, glucógeno y gránulos metacromáticos.

Observación de esporas• Algunas bacterias producen endosporas en un estadio particular de su

ciclo de vida. Las endosporas son las estructuras más resistentes que se conocen a agentes físicos y químicos debido al número y estructura química de las cubiertas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tinción, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo, las endosporas se pueden teñir aplicando calor a la preparación previamente cubierta con una solución de colorante que en la técnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las células vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste permitirá distinguir claramente a las esporas de color verde.

Tinción de esporas• Técnica de Shaeffer y Fulton• 1.-Hacer un frotis con la cepa de

prueba. Dejar secar al aire y fijarlo al calor

• 2.-Cubrir todo el portaobjetos con verde de malaquita y calentar suavemente la preparación a emisión de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe hervir ni secarse, añadir mas si es necesario

• 3.-Lavar la preparación exhaustivamente con agua de la llave.

• 4.-Cubrir la preparación con safranina y dejar actuar durante un minuto.

• 5.-Lavar de nuevo con agua, dejar secar al aire y observar a inmersión.

• Las esporas se observan intensamente teñidas de color verde y la célula vegetativa toma el colorante secundario mostrándose de color rojo.

Observación de esporas con una tinción simple

Observación de endosporas: esquema y microfotografías

Observación de cápsula

• Los colorantes ácidos, que no tiñen a la célula, son a veces útiles para revelar las capas superficiales con bajo índice de refracción, como la cápsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo a los microorganismos.La cápsula puede hacerse visible con una tinción negativacomo el método de rojo Congo, o añadiendo tinta china o nigrosina al medio de suspensión y como las partículas coloidales de carbón o las moléculas del colorante no pueden penetrar a través de la cápsula, esta se observa como una zona clara que rodea a la célula.

Método del Rojo Congo para cápsula

• Tinción de Rojo Congo• 1.-Con el asa estéril tomar un poco

del cultivo de una bacteria capsulada, suspenderlo en una gota de Rojo Congo y hacer un frotis. Dejar secar al aire.

• 2.-Sin fijar al calor, cubrir el frotis con mordente de cápsula y dejarlo actuar durante un minuto. Lavar con agua destilada y dejar secar al aire.

• 3.-Observar la preparación al microscopio. La cápsula se observa como una zona clara alrededor de la bacteria de color rojo en un campo de color azul oscuro.

Método de la tinta china para cápsula

• 1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender.

• 2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y se presiona suavemente evitando que queden burbujas.

• 3.-Observar inmediatamente al microscopio.

• 4.-Desechar la preparación en un recipiente con antiséptico.

• La cápsula se observa como una gran estructura alrededor de la célula delimitada por los pequeños fragmentos de carbón de la tinta china.

Observación de pared

• La pared celular bacteriana puede teñirse por un colorante básico después de aplicar ácido tánico y alumbre de potasio como mordente. Este tratamiento permite observar la pared como una estructura engrosada

Tinción de pared celular

• Técnica de Knaysi• 1.-Hacer un frotis con la cepa de

estudio en la forma usual y fijarlo al calor.

• 2.-Cubrir el frotis con mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos.

• 3.-Lavar con agua destilada.• 4.-Colocar con el asa una gota de

fucsina sobre la preparación.• 5.-Poner un cubreobjetos y observar al

microscopio. La pared se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria cuyo citoplasma se verá de color rosa o rojo tenue.

Observación de gránulos metacromáticos

• Los gránulos metacromáticos, de polimetafosfato o volutina se encuentran en muchas bacterias, hongos, algas y protozoarios, están formados de cúmulos de polimetafosfato y sirven como material de reserva de energía de la célula. Se ponen de manifiesto con el colorante azul de metileno de Löeffler y se tiñen de color rojo violeta en tanto que la célula se observa de color azul tenue.

Tinción de Flagelos

• Los flagelos son estructuras frágiles y termosensibles que requieren de cuidadosas manipulaciones para ser observados. El éxito de las técnicas depende del mordente que debe ser de reciente preparación.

• Los flagelos están por debajo del poder de resolución del microscopio óptico por lo que deben de cubrirse con un mordente que permita engrosarlos. Los métodos de tinción mas utilizados son el de Gray y el de Leifson.

Observación de flagelos

• Algunos apéndices como los flagelos se pueden observar bajo el microscopio óptico después de aplicar la tinción de Leifson

Observación de diversas bacterias flageladas

Tinciones fluorescentes• En microbiología se han diseñado diversos métodos de tinción que

permiten cuantificar a los microorganismos en su habitat. A pesar de que estos métodos revelan poco sobre la fisiología o la composición filogenética, son muy empleados y altamente confiables para obtener información cuantitativa sobre el número total de células en unamuestra natural.

• Se han utilizado ampliamente dos colorantes fluorescentes: el naranjade acridina y el 4´,6-diamido-2-fenil indol (DAPI). Estos colorantes se unen a los ácidos nucleicos. La observación de las células se hace utilizando un microscopio de epifluorescencia.

• En la actualidad, estas técnicas de tinción han tenido importantes aplicaciones y se utilizan en la cuantificación de microorganismos en alimentos, muestras clínicas y del ambiente.

Tinción con Naranja de Acridina

• Esta imagen corresponde a una microfotografía de fluorescencia de una comunidad microbiana natural que se encuentra colonizando las raíces de una planta. La tinción se hizo con naranja de acridina.

Tinción con DAPI

• Células de Escherichia coli teñidas con DAPI se observan de color azul brillante sobre un fondo oscuro.

• Esta técnica se utiliza frecuentemente para hacer cuentas totales

Tinciones Vitales

• Se han desarrollado diversos métodos que permiten diferenciar células vivas de células muertas utilizando colorantes fluorescentes. Esto nos permite tener información no solo del número de microorganismos presentes en una muestra sino que también nos informa sobre su viabilidad. La base de la diferenciación está en la membrana citoplásmica que debe mantenerse intacta. Se utiliza una combinación de dos colorantes el verde penetra todas las células viables y no viables mientras que el colorante rojo que contiene yoduro de propidium se incorpora solo a las células muertas

Tinciones Vitales

• En esta microfotografía se observan células vivas (de color verde) y células muertas (de color rojo) de Micrococcus luteus (coco) y Bacillus cereus (bacilo) teñidas con la técnica de viabilidad que utiliza LIVE/DEAD Bac Light TM

Tinciones por hibridación in situ fluorescente (FISH)

Bibliografía• Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

Prentice Hall, Inc. • Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biología de los

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