Técnica Histológica y microscopica

1. GENERALIDADES DE LAS TCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGA El objetivo de un curso de histologa es conducir al estudiante a comprender la microanatoma de las clulas, los tejidos y los rganos y a correlacionar la estructura con la funcin Las tcnicas utilizadas por los histlogos son diversas en extremo. La mayor parte de los contenidos de un curso de histologa se puede formular en los trminos de la microscopia ptica, que los estudiantes manejan en las prcticas de laboratorio, pero la interpretacin ms detallada de la microanatoma se fundamenta en la microscopia electrnica (ME), tanto con el microscopio electrnico de transmisin (MET) como con el microscopio electrnico de barrido (MEB). La ME, dado su aumento ms til y su resolucin mayor, suele ser el ltimo paso en la adquisicin de datos al que se recu- rre entre las muchas tcnicas auxiliares de la biologa celular y molecular. Estas tcnicas auxiliares incluyen: 1 11Tcnica histolgica y microscopia GENERALIDADES DE LAS TCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGA | 1 PREPARACIN DEL TEJIDO | 2 Tincin con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina | 2 Otros fijadores | 3 Otras tcnicas de tincin | 5 HISTOQUMICA Y CITOQUMICA | 5 Composicin qumica de las muestras histolgicas | 5 Fundamentos qumicos de la coloracin | 6 Colorantes cidos y bsicos | 6 Metacromasia | 7 Grupos aldehdo y el reactivo de Schiff | 7 Digestin enzimtica | 8 Histoqumica enzimtica | 9 Inmunocitoqumica | 9 Tcnicas de hibridacin | 12 Radioautografa | 13 MICROSCOPIA | 13 Microscopia ptica | 13 Examen de un preparado histolgico con el microscopio ptico | 15 Otros sistemas pticos | 19 Microscopia electrnica | 21 Microscopia de fuerza atmica | 24 Recuadro 1.1 Correlacin clnica: biopsias por congelacin | 4 Recuadro 1.2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometra de Feulgen | 8 Recuadro 1.3 Correlacin clnica: anticuerpos monoclonales en medicina | 10 Recuadro 1.4 Uso correcto del microscopio ptico | 16 Recuadro 1.5 Consideraciones funcionales: desarrollo de la microscopia electrnica | 23 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 1 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 2. Histoqumica y citoqumica. Inmunocitoqumica y tcnicas de hibridacin. Radioautografa. Cultivo de tejidos y rganos. Separacin de clulas y orgnulos por centrifugacin diferencial. Microscopios y tcnicas microscpicas especializadas. Es posible que los estudiantes se sientan distantes de estas tcnicas y procedimientos experimentales porque los programas actuales de la asignatura no suelen con- templar una experiencia directa con ellos. Sin embargo, es importante saber algo acerca de los procedimientos especializados y los datos que proporcionan. En este cap- tulo se presenta un panorama general de estas tcnicas y una explicacin de la forma en que los datos aportados por ellas pueden ayudar al estudiante a comprender mejor la estructura y la funcin de las clulas, los tejidos y los rganos. Uno de los problemas que enfrentan los estudiantes en histologa es comprender la naturaleza de la imagen bidimensional de un preparado histolgico o una microfotografa electrnica y la forma en que esta se relaciona con la estructura tridimensional de la cual proviene. Para salvar esta brecha conceptual primero tenemos que presentar una breve descripcin de las tcnicas utilizadas para preparar los cortes histolgicos tanto de la microscopia ptica como de la microscopia electrnica. PREPARACIN DEL TEJIDO Tincin con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina El corte de rutina teido con hematoxilina y eosina es la muestra que ms frecuentemente se estudia La caja de preparados que se entrega a cada estudiante para que examine bajo el microscopio ptico contiene principalmente especmenes fijados en formalina, incluidos en parafina y coloreados con hematoxilina y eosina (H-E). Casi todas las microfotografas pti- cas que se presentan en las secciones del atlas de este libro son de preparados de estas mismas cajas. Adems, la mayora de las microfotografas utilizadas para ilus- trar tejidos y rganos en las clases tericas de histologa y en conferencias se obtienen de estos preparados. A veces se usan otras tcnicas para demostrar componentes especficos de las clulas y los tejidos; varias de estas tcnicas se describen ms adelante. El primer paso en la preparacin de una muestra de tejido u rgano es la fijacin para conservar la estructura La fijacin, en general obtenida mediante el empleo de sustancias qumicas individuales o mezclas de estas sustancias, conserva la estructura del tejido en forma permanente para permitir el tratamiento ulterior. Las muestras tienen que sumergirse en el fijador inmedia- tamente despus de extraerse del organismo. La fijacin se utiliza para: Abolir el metabolismo celular. Impedir la degradacin enzimtica de las clulas y los tejidos por autlisis (autodigestin). Destruir los microorganismos patgenos como las bacterias, los hongos o los virus. Endurecer el tejido como consecuencia de la formacin de enlaces cruzados o la desnaturalizacin de las molculas proteicas. El fijador de uso ms comn es la formalina, una solucin acuosa de formaldehdo al 37%, en diluciones variadas y en combinacin con otras sustancias qumicas y amortiguadores (buffers). El formaldehdo preserva la estructura general de la clula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las protenas (con mucha frecuencia forma enlaces cruzados entre residuos de lisina). Dado que el formaldehdo no altera en forma significativa su estructura tridimensional, las protenas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos especficos. Esta propiedad es importante en los mtodos de tincin inmunocitoqumica (vase p. 9). La solucin comercial estndar de formaldehdo amortiguado con fosfatos (pH 7) acta con bastante lentitud pero penetra bien en el tejido. Sin embargo, el formaldehdo no reacciona con los lpidos y, por lo tanto, es un mal fijador de las membranas. En el segundo paso la muestra se dispone para su inclusin en parafina con el fin de permitir su corte Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de inclusin que permita realizar cortes muy delgados, tpicamente de 5 a 15 m (1 micrmetro [m] equivale a la milsima parte de un milmetro; vase cuadro 1.1). Luego de la fijacin la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones alcohlicas de concentracin creciente hasta alcanzar alcohol al 100%. En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgnicos como xileno o tolueno, que son mis- cibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Preparacindeltejido 2 Equivalencias en las medidas de longitud CUADRO 1.1 1 picmetro = 0,01 angstroms () 1 angstrom = 0,1 nanmetro (nm) 10 angstroms = 1,0 nanmetro 1 nanmetro = 1 000 picmetros 1 000 nanmetros = 1,0 micrmetro (m) 1 000 micrmetros = 1,0 milmetro (mm) 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 2 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 3. el alcohol al 100% antes de la infiltracin de la muestra con parafina fundida. Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endu- recido se empareja para formar un bloque de tamao adecuado. Este bloque, llamado taco, se coloca entonces en una mquina cortadora especial, el micrtomo, que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Luego los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio a los que antes se les habr aadi- do una pequea cantidad de albmina para que sirva de adhesivo. En el tercer paso, la muestra se tie para permitir su examen Dado que los cortes en parafina son incoloros, la muestra todava no est lista para su examen bajo el microscopio ptico. Para colorear o teir los cortes histolgicos la parafina debe disolverse y extraerse, de nuevo con xileno o tolueno, y los tejidos deben rehi- dratarse mediante el uso de una serie de alcoholes de concentracin decreciente. Luego el tejido colocado sobre los portaobjetos se tie con hematoxilina en agua. Como el colorante de contraste, eosina, es ms soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra en soluciones alcohlicas de concentracin creciente y despus se tie con eosina en alcohol. Los resultados de la tincin con hematoxilina sola, con eosina sola y con ambos colorantes se muestran en la figura 1.1. Luego de la coloracin la muestra se hace pasar por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un preparado permanente. Otros fijadores La formalina no preserva todos los componentes de las clulas y los tejidos Aunque los cortes de muestras fijadas en formalina teidos con H-E son convenientes porque permiten ver bien las caractersticas estructurales generales, no son especficos para dilucidar la composicin qumica de los elementos constitutivos de las clulas. Adems, muchos componentes se pierden durante la preparacin de la muestra. Para conservar estos componentes y estructuras hay que utilizar otros mtodos de fijacin. Estos mtodos se fundamentan en un conocimiento slido de la qumica. Por ejemplo, los alcoholes y los solventes orgnicos que se usan en los preparados de rutina diluyen los lpidos neutros. Para conservar los lpidos neutros, como los de las clulas adiposas, deben utilizarse cortes por congelacin de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuel- van en las grasas; para conservar estructuras de la membrana hay que usar fijadores especiales con metales pesados, como permanganato y osmio, que se unan a los fosfolpidos. El empleo de rutina de tetrxido de osmio como fijador en la microscopia electrnica es la razn principal del excelente estado de conservacin de las membranas en las microfotografas electrnicas. Preparacin del tejido Preparacindeltejido 1 3 a b ca b ca b ca b ca b c FIGURA 1.1. Coloracin con hematoxilina y eosina (H-E). Las tres imgenes que se presentan aqu corresponden a cortes de pncreas seriados (adyacentes) para demostrar el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas o combinadas. a. En esta microfotografa se ve una coloracin con hematoxilina sola. Si bien hay una tincin general de la muestra, los componentes y estructuras con gran afinidad por el colorante se tien con una intensidad mucho mayor, por ejemplo, DNA nuclear y RNA citoplasmtico. b. De manera similar la eosina (colorante de contraste), cuando se usa sola, consigue una tincin general de los tejidos, como puede verse en esta microfotografa. Sin embargo, obsrvese que los ncleos son menos conspicuos que en la muestra teida slo con hematoxilina. Despus de colorear la muestra con hematoxilina y de prepararla para su tincin con eosina en solucin alcohlica, la hematoxilina que no estaba unida con firme- za se lava y entonces la eosina tie los componentes con los que tiene gran afinidad. c. En esta microfotografa pueden verse los efectos tintoriales combinados de ambos colorantes (H-E). 480 . 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 3 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 4. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Preparacindeltejido 4 A veces el patlogo necesita evaluar de inmediato el tejido obtenido durante el acto quirrgico, en especial cuando el diagnstico anatomopatolgico instantneo puede determinar el paso siguiente en la ciruga. Hay varias indicaciones para realizar este tipo de evaluacin, que se conoce como biopsia por congelacin. Es muy frecuente que un cirujano solicite una biopsia por congelacin en el quirfano cuando no cuenta con un diagnstico preoperatorio o debe identificar hallazgos intraopera- torios inesperados. Adems, es posible que el cirujano quiera saber si se ha extirpado toda la masa patolgica dentro del limite del tejido sano y si el borde de la resec- cin quirrgica est libre de tejido enfermo. Las biopsias por congelacin tambin se realizan en combinacin con otros procedimientos, como la endoscopia o la biopsia con aguja fina, para confirmar si el material bipsico obtenido ser til en estudios anatomopatolgicos adicionales. Para realizar una biopsia por congelacin se siguen tres pasos principales: Congelacin de la muestra de tejido. Se congelan muestras de tejido de tamao pequeo mediante el uso de anhdrido carbnico comprimido o la inmersin en un lquido fro (isopentano) a una temperatura de 50 C. El congelamiento, que puede lograrse en una cmara refrigeradora muy eficiente, endurece el tejido y permite el corte con un micrtomo. Corte del tejido congelado. El corte suele realizarse dentro de un cristato, una cmara refrigerada que contiene un micrtomo. Dado que el tejido est congelado y duro, puede cortarse en rebanadas muy finas (5 a 10 m). Luego los cortes se montan sobre un portaobjetos de vidrio. Tincin de los cortes. La tincin se realiza para diferenciar los ncleos celulares del resto de las estructuras del tejido. Los tinciones de uso ms frecuente para las biopsias por congelacin son H-E, azul de metileno (fig. 1.2) y PAS. Todo el proceso de preparacin y evaluacin de las biopsias por congelacin puede tardar unos 10 minutos en completarse. El tiempo total que transcurre hasta la obtencin de resultados depende sobre todo del tiempo de transporte del tejido desde el quirfano hasta el laboratorio de anatomopatologa, de la tcnica histopatolgi- ca utilizada y de la experiencia del patlogo. Los hallazgos se comunican directamente al cirujano que est esperan- do en el quirfano. Recuadro 1.1 Correlacin clnica: biopsias por congelacin aaaaa bbbbb FIGURA 1.2. Evaluacin de una muestra obtenida durante el acto quirrgico y preparada mediante la tcnica de congelacin. a. En esta microfotografa se ve una muestra obtenida del intestino grueso que se prepar mediante la tcnica de congelacin y se ti con azul de metileno (biopsia por congelacin). 160 . b. Parte de la muestra se fij en formalina y se proces con una tcnica de rutina que comprende la coloracin con H-E (biopsia dife- rida). El examen de la biopsia por congelacin permiti comprobar que el tejido era normal. El diagnstico se confirm despus mediante el examen del preparado de rutina teido con H-E. 180 . (Gentileza del Dr. Daniel W. Visscher.) 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 4 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 5. Otras tcnicas de tincin La hematoxilina y la eosina se utilizan en histologa principalmente para poner en evidencia las caractersticas estructurales A pesar de los mritos de la tincin con H-E, este procedimiento no permite ver en forma adecuada ciertos componentes estructurales de los cortes histolgicos, a saber, elastina, fibras reticulares, membranas basales y lpidos. Cuando se desea estudiar estos componentes pueden utilizarse otros mtodos de tincin, en su mayora selectivos, que incluyen la coloracin con orcena y fucsina-resorcina para el material elstico y la impregnacin argntica para las fibras reticulares y las membranas basales. Pese a que el fundamento qumico de muchos no siempre se comprende, estos procedimientos sirven. En cualquier caso, es ms importante saber lo que el mtodo permite observar que conocer su mecanismo ntimo de accin. HISTOQUMICA Y CITOQUMICA Los procedimientos qumicos especficos pueden proveer informacin detallada acerca de la funcin de las clulas y los componentes extracelulares de los tejidos Los mtodos histoqumicos y citoqumicos pueden tener su fundamento en la unin especfica de un colorante, el uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente dirigidos contra un componente celular en particular o la actividad enzimtica inherente de un elemento constitutivo de las clulas. Adems, muchas macromolculas presentes en las clulas pueden detectarse por medio de la radioautografa, en la cual precursores moleculares marcados radiactivamente se incor- poran a las clulas y los tejidos antes de la fijacin. Muchos de estos procedimientos pueden usarse en preparados tanto para la microscopia ptica como para la microscopia electrnica. Antes de comentar la qumica de las tinciones de rutina y de las tcnicas histoqumicas y citoqumicas conviene describir brevemente la ndole de un corte histolgico comn. Composicin qumica de las muestras histolgicas La composicin qumica de un tejido listo para una coloracin de rutina es muy diferente de la del tejido vivo Los componentes que perduran luego de la fijacin son principalmente molculas grandes que no se disuelven con facilidad, en especial despus de aplicar el fijador. Estas molculas grandes, en particular las que reaccionan con otras molculas semejantes para formar complejos macromoleculares, son las que suelen conservarse en un corte histolgico. Los siguientes son ejemplos de estos complejos macromoleculares grandes: Nucleoprotenas, formadas por cidos nucleicos uni- dos a protenas. Protenas intracelulares del citoesqueleto en complejo con otras protenas. Protenas extracelulares en grandes aglomeraciones insolubles, en las que molculas vecinas semejantes se unen a travs de enlaces cruzados, como ocurre en la formacin de las fibras colgenas. Complejos de fosfolpidos y protenas (o carbohidratos) en las membranas. En su mayor parte estas molculas constituyen la estructura de las clulas y los tejidos, dado que son los elementos morfognicos hsticos. Constituyen la base de la organizacin de los tejidos visible con el microscopio. En muchos casos un elemento estructural es al mismo tiempo una unidad funcional. Por ejemplo, en el caso de las protenas que forman los filamentos con- trctiles de las clulas musculares, estos filamentos son los componentes estructurales visibles y adems participan en el proceso de contraccin. El RNA del citoplasma aparece como parte de un componente estructural (ergastoplasma de las clulas glandulares, sustancia de Nissl de las neuronas) y al mismo tiempo es un participante activo en la sntesis de protenas. Muchos componentes de los tejidos desaparecen durante la preparacin de los cortes teidos con H-E A pesar de que la mayor parte de los cidos nucleicos, las protenas y los fosfolpidos se conservan en los cortes histolgicos, muchos tambin se pierden. Las protenas pequeas y los cidos nucleicos pequeos, como los RNA de transferencia, en general se pierden durante la preparacin del tejido. Como se mencion antes, los solventes orgnicos utilizados durante la tcnica histolgica suelen disolver los lpidos neutros. Tambin pueden perderse otras molculas grandes, por ejemplo al ser hidrolizadas como consecuencia del pH desfavorable de las soluciones fijadoras. Los que siguen son ejemplos de macromolculas que se pierden durante la fijacin de rutina en fijadores acuosos: Glucgeno (carbohidrato de almacenamiento intracelular comn en el hgado y las clulas musculares). Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (carbohidratos complejos extracelulares hallados en el tejido conjuntivo). Sin embargo, estas molculas pueden conservarse si se utilizan fijadores no acuosos para el glucgeno o si Histoqumica y citoqumica Histoqumicaycitoqumica 1 5 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 5 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 6. a la solucin fijadora se le aaden agentes ligadores especiales que preserven las molculas extracelulares con carbohidratos abundantes. Adems, como ya se coment, durante la preparacin de rutina tambin suelen perderse los lpidos neutros porque los solventes orgnicos los disuelven. Los componentes solubles, los iones y las molculas pequeas tambin desaparecen durante la preparacin de las muestras incluidas en parafina Durante la preparacin de las muestras de rutina que se incluyen en parafina y luego se tien con H-E se pierden metabolitos intermedios, glucosa, sodio, cloro y sustancias similares. Muchas de estas sustancias pueden estudiarse en preparados especiales, en ocasio- nes con una prdida considerable de la integridad estructural. Estos iones y pequeas molculas solubles no constituyen elementos morfognicos hsticos sino que participan en los procesos de sntesis o en las reacciones celulares. Cuando se conservan y pueden detectarse por mtodos especficos aportan informacin valiossima sobre el metabolismo, el transporte activo y otros procesos vitales de las clulas. El agua, una molcula muy verstil, participa en estas reacciones y procesos y contribuye a la estabilizacin de la estructura macromolecular a travs de enlaces de hidrgeno. Fundamentos qumicos de la coloracin Colorantes cidos y bsicos La hematoxilina y la eosina son los colorantes de uso ms frecuente en la histologa Un colorante cido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte coloreada y se describe con la frmula general (Na+ anilina). Un colorante bsico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada y se describe con la frmula general (anilina+Cl). Desde el punto de vista estructural la hematoxilina no es un colorante bsico, pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las de las anilinas bsicas. El color de una anilina no se relaciona con el hecho de que sea cida o bsica, como lo demuestran los ejemplos que se presentan en el cuadro 1.2. Los colorantes bsicos reaccionan con los componentes aninicos de las clulas y los tejidos (componentes que tienen una carga neta negativa) Entre los componentes aninicos se encuentran los grupos fosfato de los cidos nucleicos, los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las protenas. La capacidad de estos grupos aninicos de reaccionar con una anilina o colorante bsico se denomina basofilia (gr. basis + philein, amar, es decir que tiene afinidad por lo bsico). Los componentes del tejido que se tien con la hematoxilina tambin exhiben basofilia. La reaccin de los grupos aninicos vara segn el pH. As: Con un pH alto (de cerca de 10) los tres grupos se ionizan y quedan disponibles para la reaccin con el colorante bsico por medio de uniones electrostticas. Con un pH ligeramente cido a neutro (de 5 a 7) se ionizan los grupos fosfato y sulfato y quedan disponibles para reaccionar con la anilina bsica a travs de uniones electrostticas. Con un pH bajo (inferior a 4) slo se mantienen ionizados los grupos sulfato para reaccionar con los colorantes bsicos. En consecuencia, la tincin con colorantes bsicos en un pH determinado puede utilizarse para centrar el estudio en grupos aninicos especficos y como estos aniones especficos predominan en ciertas macromolculas, la tincin sirve como indicador de estas macromolculas. Como ya se mencion, la hematoxilina no es un colorante bsico en sentido estricto. Se usa con un mordiente (es decir un intermediario entre el componente del tejido y la anilina) y es por la accin del mordiente que la coloracin con hematoxilina se parece a la tincin que produce un colorante bsico. La unin en el complejo tejido-mordiente-hematoxilina no consiste en un simple enlace electrosttico y cuando la hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido. Por eso la hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que es seguida por soluciones acuosas de colorantes cidos. Los colorantes bsicos verdade- ros, a diferencia de la hematoxilina, no suelen usarse en secuencias en las que la anilina bsica es seguida por una anilina cida. Entonces la anilina bsica tiende a disociarse del tejido durante los lavados en soluciones acuosas que se realizan entre la aplicacin de ambas soluciones colorantes. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Histoqumicaycitoqumica 6 Algunos colorantes bsicos y cidosCUADRO 1.2 Colorante Colorantes bsicos Verde de metilo Azul de metileno Pironina G Azul de toluidina Colorantes cidos Fucsina cida Azul de anilina Eosina Naranja G Color Verde Azul Rojo Azul Rojo Azul Rojo Naranja 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 6 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 7. Los colorantes cidos reaccionan con los grupos catinicos de las clulas y los tejidos, en particular con los grupos amino ionizados de las protenas La reaccin de los grupos catinicos con un colorante cido recibe el nombre de acidofilia (lat. acidus + gr. philein, amar, o sea que tiene afinidad por lo cido). Las reacciones de los componentes celulares e hsticos con los colorantes cidos no son tan especficas ni tan pre- cisas como las reacciones con los colorantes bsicos. Aunque el enlace electrosttico es el factor principal en la unin primaria de un colorante cido con el tejido, no es el nico; debido a ello, los colorantes cidos a veces se utilizan combinados para teir en forma selectiva distintos componentes de los tejidos. Por ejemplo, en la tcnica tricrmica de Mallory se usan tres colorantes cidos: azul de anilina, fucsina cida y naranja G. Estos colorantes tien con selectividad el colgeno, el citoplasma en general y los eritrocitos, respectivamente. La fucsina cida tambin tie los ncleos. En otras tcnicas con anilinas cidas mltiples se emplea la hematoxilina para teir primero los ncleos y luego se aplican los colorantes cidos con el fin de teir selectivamente el citoplasma y las fibras extracelulares. La tincin selectiva de los componentes de los tejidos por los colorantes cidos se debe a factores relativos, como el tamao y el grado de acumulacin de las molculas del colorante y la permeabilidad y densidad del tejido. Los colorantes bsicos tambin pueden utilizarse combinados o secuencialmente (p. ej., verde de metilo y pironina para estudiar la sntesis y la secrecin de protenas), pero estas combinaciones no son de uso tan difundido como las de los colorantes cidos. Una cantidad limitada de sustancias dentro de las clulas y en la matriz extracelular presenta basofilia Entre estas sustancias figuran: Heterocromatina y nuclolos del ncleo (principalmente por los grupos fosfato ionizados en los cidos nucleicos de ambos). Componentes citoplasmticos como el ergastoplasma (tambin por los grupos fosfato ionizados en el RNA ribosmico). Material extracelular como los carbohidratos complejos de la matriz cartilaginosa (por los grupos sulfato ionizados). La tincin con colorantes cidos es menos especfica pero ms sustancias dentro de las clulas y en la matriz extracelular presentan acidofilia Estas sustancias incluyen: La mayora de los filamentos citoplasmticos, en especial los de las clulas musculares. La mayora de los componentes membranosos intracelulares y gran parte del citoplasma no especializado de otro modo. La mayora de las fibras extracelulares (principalmente por los grupos amino ionizados). Metacromasia Ciertos colorantes bsicos reaccionan con componentes hsticos que hacen cambiar su color normal del azul al rojo o al prpura; esta modificacin de la absorbancia se denomina metacromasia El mecanismo bsico de la metacromasia es la pre- sencia de polianiones en el tejido. Cuando estos tejidos se tien con una solucin colorante bsica con- centrada, como la de azul de toluidina, las molculas de la anilina estn lo suficientemente cerca como para formar aglomeraciones dimricas y polimricas. Las propiedades de absorcin de estas aglomeraciones son diferentes de las de las molculas de colorante individuales no aglomeradas. Las estructuras de las clulas y los tejidos con una alta concentracin de grupos sulfato y fosfato ionizados, como la sustancia fundamental del cartlago, los grnulos de heparina de los mastocitos y el retculo endoplasmtico rugoso de los plasmocitos, muestran metacromasia. En consecuencia, el azul de toluidina se ver prpura o rojo cuando tia estos componentes. Grupos aldehdo y el reactivo de Schiff La capacidad de la fucsina bsica decolorada (reactivo de Schiff) de reaccionar con los grupos aldehdo da como resultado la aparicin de un color rojo distintivo y es la base de las reacciones del PAS (cido perydico-reactivo de Schiff) y de Feulgen La reaccin del PAS (cido perydico-reactivo de Schiff ) tie carbohidratos y macromolculas con abundancia de carbohidratos. Se usa para detectar glucgeno en las clulas, moco en varios tipos de clulas y tejidos, la membrana basal que se encuentra debajo de los epitelios y las fibras reticulares del tejido conjuntivo. La reaccin de Feulgen, que incluye una hidrlisis cida dbil con HCl, se utiliza para teir DNA. Los fundamentos de la reaccin del PAS son los siguientes: Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno de ellos con un grupo hidroxilo (OH). Las hexosaminas de los glucosaminoglucanos tam- Histoqumica y citoqumica Histoqumicaycitoqumica 1 7 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 7 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 8. bin poseen carbonos adyacentes, pero con alternan- cia de grupos hidroxilo (OH) y grupos amino (NH2). El cido perydico rompe la unin entre estos tomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehdo. Estos grupos aldehdo reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color prpura intenso distintivo. La tincin con PAS de la membrana basal (fig. 1.3) y las fibras reticulares tiene su fundamento en el contenido o la asociacin de proteoglucanos (carbohidratos complejos asociados con un centro de protena). Esta tincin es una alternativa de las tcnicas de impregnacin argntica, que tambin tienen como base la reaccin con las molculas de sacridos de los proteoglucanos. La reaccin de Feulgen separa las purinas de las desoxirribosas del DNA por medio de una hidrlisis cida dbil; entonces se abren los anillos de monosa- crido y se forman grupos aldehdo. De nuevo, son los grupos aldehdo de formacin reciente los que reaccionan con el reactivo de Schiff para dar el color rojo prpura caracterstico. La reaccin del reactivo de Schiff con el DNA es estequiomtrica y por lo tanto, puede usarse en mtodos espectrofotomtricos para cuantificar el DNA en el ncleo de una clula. El RNA no se tie con el reactivo de Schiff porque no tiene desoxirribosa. Digestin enzimtica La digestin enzimtica de un corte adyacente a otro teido para identificar un componente especfico, como glucgeno, DNA o RNA, puede ser til para confirmar la identidad del material que se tie El material intracelular que se tie con la reaccin del PAS puede identificarse como glucgeno mediante TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Histoqumicaycitoqumica 8 T T T T T C C BC T T T T T C C BC T T T T T C C BC T T T T T C C BC T T T T T C C BC FIGURA 1.3. Microfotografa de tejido renal teido con la tcnica del PAS. Esta tcnica histoqumica sirve para demostrar y localizar carbohidratos y macromolculas con carbohidratos abundantes. Las membranas basales son PAS positivas, como es obvio por su coloracin rojo prpura intensa. Los tbulos renales (T) se encuentran bien delineados por la membrana basal teida que los rodea. Los capilares glomerulares (C) y el epitelio de la cpsula de Bowman (BC) tambin poseen membranas basales PAS positivas. 360 . La microespectrofotometra de Feulgen es una tcnica que fue ideada para el estudio de los aumentos del DNA en las clulas en desarrollo y para analizar la ploida, es decir la cantidad de veces que est multiplicado el contenido normal de DNA en una clula (se dice que una clula somtica normal que no se est dividiendo es diploide; en cambio, los espermatozoi- des y los vulos son haploides). Para cuantificar el DNA nuclear se utilizan dos tcnicas, la citometra esttica para cortes de tejido y la citometra de flujo para clulas aisladas. La tcnica de la citometra esttica de cortes de tumores teidos con el mtodo de Feulgen se vale de la microespectrofotometra acopla- da con un sistema de visualizacin digital para cuantificar la absorcin de luz con una longitud de onda de 560 nm por parte de las clulas y las aglomeraciones celulares. En cambio, la tcnica de la citometra de flujo se basa en el empleo de instrumentos capaces de rastrear slo clulas individuales que fluyen ante un detector en un medio lquido. Esta tcnica permite el anlisis cuantitativo rpido de una clula individual sobre la base de la medicin de la luz fluorescente emitida. En la actualidad la microespectrofotometra de Feulgen se utiliza para estudiar los cambios del contenido de DNA de las clulas en divisin que se estn diferenciando. Adems, se la emplea en la prctica clnica para analizar la cantidad anormal de cromosomas (es decir los patrones de ploida) en las clulas malignas. Se dice que las clulas malignas con un patrn mayoritariamente diploide estn bien diferenciadas y que los tumores con estos tipos de clulas tienen un pronstico ms favorable que los mismos tumores con clulas aneuploides (con mltiplos no enteros de la cantidad haploide de DNA) o tetraploides. La microespectrofotometra de Feulgen ha sido de particular utilidad en estudios de adenocarcinomas especficos (tumores del epitelio glandular), cncer de mama, cncer de rin, cnceres de colon y de otras partes del tubo digestivo, cncer del endometrio (mucosa del tero) y cncer ovrico. Es una de las herramientas ms valiosas que los patlogos utilizan para evaluar la potencialidad metastsica de estos tumores y para tomar decisiones pronsticas o teraputicas. Recuadro 1.2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometra de Feulgen 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 8 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 9. el tratamiento previo de los cortes con diastasa o ami- lasa. La falta de tincin despus de este tratamiento identifica con positividad que el material teido es glucgeno. De modo similar, el pretratamiento de los cortes histolgicos con desoxirribonucleasa (DNAsa) evitar la tincin con la reaccin de Feulgen en esos cortes y el tratamiento de muestras de epitelios secretores de protenas con ribonucleasa (RNAsa) impedir la tincin del ergastoplasma con los colorantes bsicos. Histoqumica enzimtica Las tcnicas histoqumicas tambin se utilizan para identificar y localizar enzimas en clulas y tejidos Para localizar enzimas en los cortes histolgicos debe tenerse especial cuidado durante la fijacin para que se preserve la actividad enzimtica. La fijacin aldehdica dbil suele ser el mtodo preferido. En estos procedimientos se detecta el producto de la reaccin de la actividad enzimtica y no la enzima pro- piamente dicha. En general se usa un reactivo de cap- tura, que puede ser un colorante o un metal pesado, para atrapar o fijar el producto de la reaccin de la enzima mediante precipitacin en el sitio de la reaccin. En una reaccin tpica para detectar una enzima hidroltica, el corte histolgico se coloca en una solucin que contiene un sustrato (AB) y un agente de atra- pamiento (T) que precipitar uno de los productos como sigue: enzima AB + T AT + B en donde AT es el producto final atrapado y B es el sustrato hidrolizado. Mediante el uso de este tipo de tcnicas se pudo equiparar el lisosoma, identificado por primera vez en estudios celulares de centrifugacin diferencial, con un componente vacuolar visible en las microfotografas electrnicas. En los tejidos sometidos a una fijacin dbil las hidrolasas cidas y las esterasas contenidas en los lisosomas reaccionan con un sustrato adecuado. La mezcla reactiva tambin contiene iones de plomo para precipitar, por ejemplo, fosfato de plomo derivado de la accin de la fosfatasa cida. Luego el producto de reaccin precipitado puede verse tanto con microscopia ptica como con microscopia electrnica. Se han desarrollado procedimientos histoqumicos similares para microscopia ptica y electrnica con el fin de demostrar fosfatasa alcalina, adenosina trifosfa- tasas (ATPasas) de varios tipos (incluida la NA+/K+- ATPasa que es el fundamento enzimtico de la bomba de sodio en clulas y tejidos), diversas esterasas y muchas enzimas respiratorias (fig. 1.4). Inmunocitoqumica El fundamento de la inmunocitoqumica es la especificidad de la reaccin entre un antgeno y un anticuerpo Los anticuerpos, tambin llamados inmunoglobuli- nas, son glucoprotenas producidas por clulas especficas del sistema inmunitario en respuesta a una protena extraa o antgeno. En el laboratorio los anticuerpos pueden purificarse de la sangre y conjugarse (asociar- se) con un colorante fluorescente. En general los colorantes fluorescentes (fluorocromos) son sustancias qumicas que absorben luz de longitudes de onda diferentes (p. ej., luz ultravioleta) y luego emiten luz visible de una longitud de onda especfica (p. ej., verde, amarillo, rojo). La fluorescena, el colorante de uso ms frecuente, absorbe la luz ultravioleta y emite luz verde. Los anticuerpos conjugados con fluorescena pueden aplicarse a cortes de tejido (tanto obtenidos por congelacin como provenientes de muestras sometidas a una fijacin leve) sobre portaobjetos de vidrio para localizar Histoqumica y citoqumica Histoqumicaycitoqumica 1 9 FIGURA 1.4. Procedimiento histoqumico para la localizacin de ATPasa en la membrana de clulas epiteliales de vescula biliar de conejo en la microscopia electrnica. Las regiones oscuras que se ven en la microfotografa electrnica sealan la localizacin de la enzima ATPasa. Esta enzima se detecta en la membrana plasmtica de las regiones laterales de las clulas epiteliales, lo cual concuerda con la ubicacin de las bombas de sodio. Estas clulas epiteliales realizan un transporte activo de molculas a travs de la membrana plasmtica. 26 000 . 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 9 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 10. un antgeno en las clulas y los tejidos. Luego la reaccin del anticuerpo con el antgeno puede examinarse y fotografiarse con un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal que produce una reconstruccin tridimensional del tejido examinado (fig. 1.5). En la inmunocitoqumica se utilizan dos tipos de anticuerpos: anticuerpos policlonales producidos por animales inmunizados y anticuerpos monoclonales producidos por lneas celulares productoras de anticuerpos inmortalizadas (de duplicacin continua) En un procedimiento tpico una protena especfica, como por ejemplo la actina, se asla de las clulas musculares de una especie (p. ej., rata) y se inyecta en la circulacin de otra especie (p. ej., conejo). En el conejo inmunizado el sistema inmunitario reconoce como antgenos extraos las molculas de actina de la rata. Este reconocimiento desencadena una cascada de reacciones inmunolgicas que comprende muchos grupos (clones) de clulas inmunitarias llamadas linfocitos B. La clonacin de los linfocitos B conduce finalmente a la produccin de anticuerpos antiactina. En conjunto, estos anticuerpos policlonales son mezclas de anticuerpos diferentes producidos por muchos clones de linfocitos B en las que cada clon reconoce una regin diferente de la molcula de actina. Luego estos anticuerpos se extraen de la sangre, se purifican y se conjugan con un colorante fluorescente, despus de lo cual pueden usarse para la deteccin de molculas de actina en los tejidos o las clulas de rata. Si hay actina en una clula o en un tejido, por ejemplo en un fibroblasto del tejido conjuntivo, el anticuerpo marcado con fluorescena se le une y la reaccin puede verse con el microscopio de fluorescencia. Los anticuerpos monoclonales son los sintetizados por una lnea celular productora de anticuerpos com- puesta por un solo grupo (clon) de linfocitos B idnticos. El clon individual que se convierte en una lnea celular se obtiene de un sujeto con mieloma mltiple, un tumor derivado de un solo plasmocito productor de anticuerpos. Los sujetos con mieloma mltiple producen una poblacin grande de anticuerpos homogneos idnticos con una especificidad idntica contra un antgeno. Para producir anticuerpos monoclonales contra un antgeno especfico se inmuniza con ese antgeno a un ratn o a una rata. Luego se aslan del tejido linftico (bazo o ganglios linfticos) del animal los linfocitos B activados y se fusionan con la lnea celular de mieloma. Esta fusin produce un hibridoma, una lnea celular secretora de un anticuerpo individual inmortalizada. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Histoqumicaycitoqumica 10 FIGURA 1.5. Imagen de microscopia confocal de una clula muscular cardaca de rata. Esta imagen se obtuvo con el microscopio confocal mediante el uso de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta. Se utilizaron dos anticuerpos primarios. El primer anticuerpo primario reconoce un transportador de lactato especfico (MCT1) y se detecta con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina (rojo). El segundo anticuerpo primario est dirigido contra la protena transmembrana CD147, que tiene una asociacin estrecha con el MCT1. Este anticuerpo se detect mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescena (verde). El color amarillo aparece en los sitios en los que los dos anticuerpos secundarios marcados tienen exactamente la misma localizacin (es decir, se colocalizan) dentro de la clula muscular cardaca. Esta imagen tridimensional muestra que ambas protenas estn distribuidas en la superficie de la clula muscular, mientras que el transportador de lactato solo (color rojo) aparece en una ubicacin profunda con respecto a la membrana plasmtica. (Gentileza de los doctores Andrew P. Halestrap y Catherine Heddle.) En la actualidad los anticuerpos monoclonales se utilizan mucho en las tcnicas de inmunocitoqumica y tambin tienen muchas aplicaciones clnicas. Los anticuerpos monoclonales conjugados con compues- tos radiactivos se utilizan para detectar y diagnosticar metstasis tumorales en patologa, para diferenciar subtipos de tumores y sus etapas de diferenciacin y, en el diagnstico de las enfermedades infecciosas, para identificar los microorganismos en la sangre y en los lquidos hsticos. En estudios clnicos recientes, se han usado anticuerpos monoclonales conjugados con inmunotoxinas, agentes quimioterpicos y radioisto- pos para hacer llegar agentes teraputicos a clulas tumorales especficas del organismo. Recuadro 1.3 Correlacin clnica: anticuerpos monoclonales en medicina 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 10 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 11. Para obtener anticuerpos monoclonales contra molculas de actina de rata, por ejemplo los linfocitos B de los rganos linfticos de conejos inmunizados tienen que fusionarse con clulas de mieloma. Para localizar un antgeno diana en clulas y tejidos se utilizan mtodos inmunocitoqumicos tanto directos como indirectos La tcnica de inmunocitoqumica ms antigua que se utiliza para identificar la distribucin de un antgeno dentro de las clulas y los tejidos se conoce como inmunofluorescencia directa. Esta tcnica se vale de un anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) marcado con fluorocromo que reacciona con el antgeno dentro de la muestra (fig. 1.6a). Es un procedimiento de un solo paso y comprende un solo anticuerpo marcado. La visualizacin de las estructuras no es ideal a causa de la poca intensidad de la emisin de la seal. Dada la sensibilidad subptima, los mtodos de inmunofluorescencia directa estn siendo reemplazados cada vez ms por los mtodos indirectos. La inmunofluorescencia indirecta tiene una sensibilidad mucho mayor que los mtodos directos y con frecuencia recibe el nombre de tcnica del emparedado o de la capa doble. En vez de conjugar un fluorocromo con un anticuerpo (primario) especfico dirigido contra el antgeno de inters (p. ej., una molcula de actina de rata), el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario (p. ej., anticuerpo de cabra antirrata; fig. 1.6b). Por lo tanto, cuando la fluorescena se conjuga directamente con el anticuerpo primario especfico el mtodo es directo y cuando la fluorescena se conjuga con un anticuerpo secundario el mtodo es indirecto. El mtodo indirecto aumenta en forma considerable la seal fluorescente emitida por el tejido. Una ventaja adicional del mtodo de marcacin indirecta es que un solo anticuerpo secundario puede usarse para localizar la unin his- toespecfica de varios anticuerpos primarios diferentes (fig. 1.7). Para los estudios microscpicos el anticuerpo secundario puede conjugarse con colorantes fluorescentes distintos de modo que en el mismo corte de tejido aparezcan marcas mltiples (vase fig. 1.5). Las desven- tajas de la inmunofluorescencia indirecta son que es cara, que requiere mucho trabajo y que no se adapta con facilidad a los procedimientos automatizados. Tambin es posible conjugar anticuerpos policlonales o monoclonales con otras sustancias, como enzimas (p. ej., peroxidasa de rbano), que convierten sustratos incoloros en un producto insoluble de un color especfico que se precipita en el sitio de la reaccin enzimtica. La tincin resultante de este mtodo de inmunope- roxidasa puede verse en el microscopio ptico con tcnicas inmunocitoqumicas directas o indirectas. En otra variante, con la molcula de anticuerpo puede conjugarse oro coloidal o ferritina (una molcula que con- Histoqumica y citoqumica Histoqumicaycitoqumica 1 11 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Antgeno Anticuerpo Anticuerpo primario Anticuerpo secundario fluorescente INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA a b FIGURA 1.6. Inmunofluorescencia directa e indirecta. a. En la inmunofluorescencia directa un anticuerpo primario marcado con un fluorocromo reacciona con un antgeno especfico dentro de la muestra de tejido. Luego las estructuras marcadas se examinan con el microscopio de fluorescencia, en el cual una longitud de onda excitadora (por lo general, luz ultravioleta) desencadena la emisin de otra longitud de onda. Esta longitud de onda depende de la ndole del fluorocromo utilizado para marcar el anticuerpo. b. El mtodo indirecto comprende dos procesos. Primero, los anticuerpos primarios especficos reaccionan con el antgeno de inters. Segundo, los anticuerpos secundarios, que estn marcados con fluorocromo, reaccionan con los anticuerpos primarios. La apariencia de las estructuras marcadas dentro del tejido es la misma en ambos mtodos y para verlas se necesita un microscopio de fluorescencia. 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 11 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 12. tiene hierro). Estos marcadores pueden verse directamente con el microscopio electrnico. Tcnicas de hibridacin La hibridacin es un mtodo para localizar mRNA o DNA mediante la hibridacin de la secuencia de inters con una sonda de nucletidos de secuencia complementaria En general el trmino hibridacin describe la capacidad de las molculas monocatenarias de DNA o RNA de interaccionar (hibridarse) con secuencias complementarias. En el laboratorio la hibridacin requiere el aislamiento del DNA o del RNA, que luego se mezcla con una secuencia de nucletidos complementaria (llamada sonda de nucletidos). Con mucha frecuencia los hbridos se detectan mediante el uso de una marca radiactiva adherida a uno de los componentes del hbrido. La unin de la sonda y la secuencia puede ocurrir en una solucin o en una membrana de nitrocelulosa. En la hibridacin in situ la unin de la sonda de nucletidos con la secuencia de DNA o RNA de inters se produce dentro de las clulas o los tejidos, como clulas de cultivo o embriones enteros. Esta tcnica permite la localizacin de secuencias de nucletidos especficas tan pequeas como 10 o 20 copias de mRNA o DNA por clula. En la hibridacin in situ se utilizan varias sondas de nucletidos. Las sondas de oligonucletidos pueden tener entre 20 y 40 nucletidos como mnimo. Las sondas de DNA monocatenario o bicatenario son mucho ms largas y pueden contener hasta 1 000 nucletidos. Para la localizacin especfica de mRNA se utilizan sondas de RNA complementarias. Estas sondas se marcan con istopos radiactivos (p. ej., 32P, 35S, 3H), un nucletido modificado en forma especfica (digoxigenina) o biotina (un marcador multipropsito covalente usado con mucha frecuencia). Las sondas radiactivas pueden detectarse y visualizarse mediante la radioautografa. La digoxigenina y la biotina se detectan con mtodos inmunocitoqumicos y citoqumicos, respectivamente. La fuerza de los enlaces entre la sonda y la secuencia complementaria depende del tipo de cido nucleico en las dos cadenas. El enlace ms fuerte se forma entre una sonda de DNA y una cadena de DNA complementaria y el ms dbil entre una sonda de RNA y una cadena de RNA complementaria. Si se espera que una muestra de tejido contenga una cantidad muy pequea de mRNA o un transcrito viral, puede usarse la ampli- ficacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para el DNA o la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para el RNA. Los transcritos amplificados que se obtienen durante estos procedimientos suelen detectarse mediante el uso de sondas de nucletidos complementarias marcadas en tcnicas de hibridacin in situ estndares. Recientemente se han combinado colorantes fluorescentes con sondas de nucletidos, lo que posibilit la visualizacin de muchas sondas al mismo tiempo (fig. 1.8). Esta tcnica, llamada tcnica FISH (hibridacin in situ con fluorescencia), tiene un uso muy difundido en clnica para las pruebas genticas. Por ejemplo, la hibridacin de una sonda con cromosomas en metafase puede usarse para identificar la posicin cromosmica de un gen. La tcnica FISH se utiliza para examinar simultneamente los cromosomas, la expresin gnica y la distribucin de los productos gnicos, como protenas anormales o patolgicas. En la actualidad estn disponibles en el mercado muchas sondas fluorescentes especficas que se utilizan en la prctica clnica para los procedimientos de deteccin del cncer de cuello ute- rino y para la deteccin de clulas infectadas por HIV. La tcnica FISH tambin puede usarse para examinar los cromosomas de los linfocitos de los astronautas con TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Histoqumicaycitoqumica 12 FIGURA 1.7. Microtbulos vistos con tcnicas inmunocitoqumicas. El comportamiento de los microtbulos (elementos del citoesqueleto) obtenidos de clulas de tumores mamarios humanos puede estudiarse in vitro mediante la cuantificacin de su actividad de nucleacin, que es iniciada por el centrosoma. Esta imagen se obtuvo con el microscopio de fluorescencia. Mediante el uso de tcnicas de inmunofluorescencia indirecta se marcaron los microtbulos con una mezcla de anticuerpos monoclonales anti--tubulina y anti--tubulina (anticuerpos primarios) y se hicieron visibles por la accin de anticuerpos secundarios conjugados con el colorante fluorescena (inmunoglobulina G de cabra antirratn unida a isotiocianato de fluorescena). La reaccin antgeno-anticuerpo realizada directamente sobre el cubreobjetos de vidrio permiti ver las molculas de tubulina responsables de la formacin de los ms de 120 microtbulos que aparecen en esta imagen. Estos microtbulos se originan en el centrolo y se extienden hacia fuera de l unos 20 a 25 m para adquirir una distribucin radial uniforme. 1 400 . (La microfotografa es gentileza de la Dra. Wilma L. Lingle y la Sra. Vivian A. Negron.) 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 12 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 13. el fin de calcular la dosis de radiacin absorbida por ellos durante su estada en el espacio. La frecuencia de las translocaciones cromosmicas en los linfocitos es proporcional a la dosis de radiacin absorbida. Radioautografa En la radioautografa se utiliza una emulsin fotogrfica colocada sobre un corte histolgico para localizar material radiactivo en los tejidos Muchos precursores moleculares pequeos de molculas ms grandes, como los aminocidos que integran las protenas y los nucletidos que forman los cidos nucleicos, pueden marcarse mediante la incorporacin de uno o varios tomos radiactivos a su estructura molecular. Luego se investiga la radiactividad para detectar las molculas ms grandes en las clulas y los tejidos. Las molculas precursoras marcadas pueden inyectarse en animales vivos o introducirse en clulas u rganos de cultivo. De este modo se han estudiado la sntesis del DNA y la ulterior divisin celular, la sntesis y secrecin de las protenas por las clulas y la ubicacin de los productos de sntesis dentro de las clulas y en la matriz extracelular. Los cortes de las muestras que han incorporado el material radiactivo se montan en portaobjetos. En la oscuridad el portaobjetos suele sumergirse brevemente en una emulsin fotogrfica fundida de manera que se forme una delgada pelcula fotogrfica sobre su superficie. Luego de la exposicin adecuada en una cmara oscura, en general durante un perodo de das a semanas, la emulsin expuesta se revela con las tcnicas fotogrficas comunes y el portaobjetos con la muestra se preserva siempre sellndolo con un cubreobjetos. Los preparados se pueden teir antes de la exposicin y el revelado o despus. Mediante este procedimiento se exponen y revelan los grnulos de plata en la emulsin sobre las molculas marcadas con material radiactivo; los grnulos aparecen como puntos oscuros en el sitio de emisin radiactiva cuando la muestra se examina con el microscopio ptico (fig. 1.9a). Estos grnulos pueden usarse sencillamente como indicadores de la localizacin de una sustancia pero tambin pueden contarse para obtener informacin semicuantitativa acerca de la cantidad de una sustancia dada en un sitio especfico. Por ejemplo, despus de inyectarle timidina tritiada a un animal las clulas que hayan incorporado este nucletido en su DNA antes de dividirse pero que todava no hayan sufrido la mitosis tendrn alrededor del doble de grnulos de plata sobre sus ncleos que las clulas que se hayan dividido despus de incorporar el nucletido marcado. La radioautografa tambin puede practicarse sobre cortes finos de material incluido en plstico para su observacin con el microscopio electrnico. En esencia se usan las mismas tcnicas pero, como ocurre con todos los mtodos de preparacin para el MET, los procedimientos son mucho ms delicados y difciles; no obstante, tambin permiten lograr una resolucin mucho mayor y una deteccin ms precisa (fig. 1.9b). MICROSCOPIA Microscopia ptica Un microscopio, sea simple (una sola lente) o com- puesto (lentes mltiples), es un instrumento que aumenta el tamao de una imagen y permite ver ms detalles que los que sera posible visualizar a simple vista. El microscopio ms sencillo es una lupa o un par de gafas o anteojos para leer. El poder de resolucin del ojo humano, o sea la distancia que debe haber entre dos objetos para que se vean separados y no parezcan uno solo (0,2 mm), est determinado por el espacio que hay entre las clulas fotorreceptoras contiguas de la retina. La funcin de un microscopio es ampliar una imagen hasta un grado en el cual la retina pueda resolver la informacin que de otro modo estara por debajo de su lmite de resolucin. En el cuadro 1.3 se compara la resolucin del ojo humano con la de microscopios diversos. Microscopia Microscopia 1 13 FIGURA 1.8. Ejemplo de la tcnica de hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) utilizada en una prueba de deteccin prenatal. Se hibridaron ncleos en interfase de clulas obtenidas de muestras de lquido amnitico con dos sondas de DNA especficas. La sonda de color naranja (LSI 21) es especfica de locus para el cromosoma 21 y la sonda de color verde (LSI 13) es especfica de locus para el cromosoma 13. El ncleo de la derecha proviene de una muestra de lquido amnitico normal y exhibe dos seales verdes y dos naranjas, lo que indica que hay dos copias de los cromosomas 13 y 21, respectivamente. El ncleo de la izquierda posee tres seales de color naranja, lo que indica una trisoma del cromosoma 21 (sn- drome de Down). El DNA se ha teido de azul con un colorante de contraste inespecfico (DAPI) para tornar visible el ncleo. 1 250 . (Gentileza del Dr. Robert B. Jenkins.) 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 13 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 14. El poder de resolucin es la capacidad de una lente o sistema ptico del microscopio de producir imgenes separadas de objetos que estn muy cerca uno de otro La resolucin no depende slo del sistema ptico sino tambin de la longitud de onda de la luz y de otros factores, como por ejemplo el espesor de la muestra, la calidad de su fijacin y la intensidad con la que est teida. Con una luz cuya longitud de onda fuera de 540 nm (vase cuadro 1.1), una luz proveniente de un filtro verde a la cual el ojo es muy sensible, y con lentes objetivo y condensadora adecuadas, la mxima resolucin alcanza- ble sera de 0,2 m (en la pgina 17 se describe el mtodo para calcularla). Esta es la resolucin terica y, como ya se mencion, depende de que todas las condiciones sean ptimas. La lente ocular aumenta la imagen producida por la lente objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Microscopia 14 a ba ba ba ba b inv tub inv tub inv tub inv tub inv tub FIGURA 1.9. Ejemplos de radioautografa en microscopia ptica y electrnica. a. Microfotografa de un corte de ganglio linftico de un animal al que se le administr timidina tritiada (3H). En algunas de las clulas se ven aglomeraciones de grnulos de plata metlica con el aspecto de pequeas partculas negras (flechas). Estas clulas han sinteti- zado DNA en preparacin para la divisin celular y han incorporado la [3H]timidina en el DNA recin formado. Con el tiempo las partculas radiactivas de baja energa emitidas por la [3H]timidina chocan contra los cristales de haluro de plata de una emulsin fotogrfica que cubre la muestra (exposicin) y crean una imagen latente (como hace la luz al incidir sobre la pelcula de una cmara fotogrfica). Durante el revelado del portaobjetos cubierto con la emulsin la imagen latente, que no es otra cosa que el haluro de plata activado, se torna visible porque la sal se reduce a plata metlica, la que aparece como grnulos negros en el examen microscpico. 1 200 . (El preparado original es gentileza del Dr. Ernst Kallenbach.) b. Radioautografa microscpica electrnica de la regin apical de una clula absortiva intestinal. Para realizar este estudio se le inyect a un animal 125I unido a factor de crecimiento nervioso (NGF) y 1 hora despus se extrajo la muestra de tejido, que luego se prepar de manera semejante a la que se utiliza para la microscopia ptica. El tamao relativamente pequeo de los grnulos de plata contribuye a la localizacin precisa de los complejos 125I-NGF. Obsrvese que los grnulos de plata se concentran en las invaginaciones apicales (inv) y en las siluetas tubulares endosmicas tempranas (tub). 32 000 . (La microfotografa electrnica es gentileza de la Dra. Marian R. Neutra.) Resolucin del ojo en comparacin con la de los microscopios CUADRO 1.3 Distancia entre los puntos que se resuelven Ojo humano Microscopio ptico de campo claro MEB MET En la teora En la prctica Microscopio de fuerza atmica 0,2 mm 0,2 m 2,5 nm 0,05 nm 1,0 nm 50 pm 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 14 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 15. En la investigacin biolgica moderna se dispone de diversos microscopios pticos para el uso general o especializado. Sus diferencias radican principalmente en factores como la longitud de onda con que se ilumina la muestra, la alteracin fsica de la luz que llega a la muestra o que emana de ella y los procesos analticos especficos que puedan aplicarse a la imagen final. A continuacin se presenta una breve descripcin de estos instrumentos y sus aplicaciones. El microscopio utilizado por la mayora de los estudiantes e investigadores es el microscopio de campo claro El microscopio de campo claro es el descendiente directo de los microscopios que se usaban en el siglo XIX y que inauguraron la primera gran era de investigacin histolgica. En esencia, los componentes del microscopio de campo claro (fig. 1.10) son los siguientes: Fuente luminosa para la iluminacin de la muestra, por ejemplo, una lmpara en la subplatina. Lente condensadora para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra. Platina sobre la que se coloca el portaobjetos. Lente objetivo para recoger la luz que ha atravesado la muestra. Lente ocular (o un par de lentes oculares en los microscopios binoculares, que son de uso ms comn) a travs de la cual se puede examinar directamente la imagen formada por la lente objetivo. Para que la muestra pueda verse con el microscopio ptico de campo claro tiene que ser lo suficientemente fina para que la luz pase a travs de ella. Aunque cierta cantidad de luz es absorbida al atravesar la muestra, el sistema ptico del microscopio de campo claro no produce un grado de contraste til en los cortes no teidos. Por este motivo se utilizan las diversas tcnicas de coloracin ya comentadas. Examen de un preparado histolgico con el microscopio ptico Los rganos son tridimensionales, mientras que los cortes histolgicos tienen slo dos dimensiones Como se coment en la seccin sobre Preparacin del tejido, toda muestra tisular preparada para su examen con el microscopio ptico tiene que ser cortada en lminas muy finas. En consecuencia, de una muestra de tejido originalmente tridimensional se obtienen cortes bidimensionales. Uno de los mayores desafos que Microscopia Microscopia 1 15 Fuente luminosa Lente condensadora Muestra Lente objetivo Lente de proyeccin Lente ocular Imagen en la retina del ojo MICROSCOPIO PTICO MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO Ctodo nodo Lente condensadora Solenoide de barrido Haz de barrido Detector de electrones Imagen en la pantalla de visin Muestra Amplificado electrnico Pantalla de televisin FIGURA 1.10. Diagramas comparativos de la formacin de la imagen en diferentes tipos de microscopios. El microscopio ptico (a la izquierda) se presenta como si estuviera invertido; el microscopio electrnico de transmisin (MET) aparece en el medio y el microscopio electrnico de barrido (MEB) se ilustra a la derecha. Las flechas rojas representan la muestra y sus imgenes aumentadas. 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 15 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 16. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Microscopia 16 Esta breve introduccin al uso correcto del microscopio ptico est dirigida a los estudiantes que usarn el microscopio para el examen de rutina de preparados histolgicos. Si el comentario siguiente parece elemental slo se debe a que con mucha frecuencia las personas que usan el microscopio no aprovechan todas sus venta- jas. A pesar del equipo sofisticado disponible en la actualidad y de su uso muy difundido, en muchos casos se carece de la instruccin formal necesaria sobre cmo debe emplearse el microscopio ptico. Los sistemas pticos costosos y muy corregidos slo pueden funcionar en forma ptima cuando los trayectos de los haces de iluminacin y de observacin estn cen- trados y tienen un ajuste correcto. El uso de ajustes y ali- neamientos adecuados contribuir sustancialmente al reconocimiento de detalles muy diminutos de la muestra y a la manifestacin fidedigna de los colores para la visin directa o la microfotografa. La iluminacin Khler es una de las claves de la buena microscopia y est incorporada al diseo de casi todos los microscopios modernos que se usan en laboratorios o para la investigacin. En la figura adjunta se ilustran los dos trayectos de los rayos luminosos y todos los controles de ajuste de un microscopio moderno y esta deber emplearse como gua al seguir las instrucciones que se dan a continuacin para obtener una iluminacin adecuada en el microscopio. Los ajustes necesarios para conseguir una buena iluminacin Khler son pocos y sencillos: Se enfoca la muestra. Se cierra el diafragma de campo. Se enfoca el condensador movindolo hacia arriba o hacia abajo hasta que el contorno de su diafragma de campo aparezca bien ntido (en foco). Se centra el diafragma de campo con los controles de centrado de la subplatina (donde est el condensador). Luego se abre el diafragma de campo hasta que el haz luminoso cubra todo el campo observado. Se retira el ocular (o se usa un telescopio de centrado o un accesorio telescpico de fase, si se dispone de ellos) y se observa la pupila de salida del objetivo. As se ver un campo circular iluminado cuyo radio ser directamente proporcional a la apertura numrica del objetivo. A medida que se cierre el diafragma del condensador su contorno aparecer dentro de este campo circular. Para la mayor parte de los preparados teidos el diafragma del condensador deber cerrarse hasta cubrir aproximadamen- te dos tercios de la apertura del objetivo. El resultado de este ajuste es la avenencia mxima entre resolucin y contraste (que no es ms que la diferencia de intensidades entres las regiones claras y oscuras de la muestra). Recuadro 1.4 Uso correcto del microscopio ptico Diagrama de un microscopio ptico tpico. Este dibujo muestra un corte transversal del microscopio, sus componentes funcionales y el trayecto de la luz. (Gentileza de Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY, EE.UU.) 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 16 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 17. enfrentan los estudiantes que utilizan el microscopio para estudiar la histologa es la posibilidad de reconstruir mentalmente la tercera dimensin faltante. Por ejemplo, en la figura 1.11a se ilustran cortes en planos diferentes a travs de una naranja. Obsrvese que cada superficie de corte (indicada por una lnea de puntos) de la naranja entera exhibe tamaos y mode- los estructurales diferentes segn la orientacin del corte. Por lo tanto, al examinar un corte dado a travs de la naranja es importante ser capaz de reconstruir mentalmente la organizacin de la estructura y de sus partes constitutivas. En la figura 1.11b se muestra un ejemplo de una estructura histolgica, en este caso un corpsculo renal, segn aparece en planos de cortes Microscopia Microscopia 1 17 Si se ponen en prctica estos cinco consejos simples la imagen obtenida ser la mejor que permita la ptica del microscopio. Ahora veamos por qu. Primero, por qu ajustamos el diafragma de campo para cubrir slo el campo observado? Iluminar un campo ms grande que el que el sistema ptico puede ver slo conduce a reflexiones internas o a una prdida de luz, lo cual da como resultado ms ruido o una disminucin del contraste de la imagen. Segundo, por qu se pone nfasis en el ajuste del diafragma del condensador o, en otras palabras, la apertura de iluminacin? Este diafragma ejerce gran influencia sobre la resolucin y el contraste con los que se pueden observar ciertos detalles de la muestra. Para la mayora de las aplicaciones prcticas la resolucin est determinada por la ecuacin d = ANobjetivo + ANcondensador en donde d = distancia entre los puntos del detalle resuelto (en nm), = longitud de onda de la luz utilizada (verde = 540 nm), AN = apertura numrica o seno de la mitad del ngulo limitado por los rayos ms perifricos que, partien- do de un punto cualquiera del objeto, penetran en el objetivo (o condensador) y contribuyen a la formacin de la imagen, multiplicado por el ndice de refraccin del medio interpuesto entre el objetivo (o condensador) y la muestra. De qu manera la longitud de onda y la apertura numrica ejercen influencia directa sobre la resolucin? Las estructuras de la muestra refractan la luz. El ngulo de refraccin es directamente proporcional a la longitud de onda e inversamente proporcional al espaciado entre las estructuras. Segn Ernst Abb, un espaciado estructural dado slo puede resolverse cuando el sistema ptico de observacin (objetivo) puede ver cierta cantidad de la luz refractada producida por el espaciado. Cuanto mayor es la apertura del objetivo mayor es la cantidad de luz refractada que participa en la formacin de la imagen, con lo que se resuelven detalles menores y las imgenes son ms ntidas. Sin embargo, nuestra frmula sencilla, demuestra que la apertura del condensador es tan importante como la apertura del objetivo. Y esto es lgico si se considera el ngulo de refraccin de un haz oblicuo o uno de apertura mayor. Este ngulo se mantiene esencialmente constante pero se le presenta al objetivo de manera tal que puede ser captado con facilidad. Cmo afecta el contraste el ajuste de la apertura? En teora lo ms cercano a la transferencia real de contraste entre la muestra y la imagen se obtendra por la interaccin (interferencia) entre los rayos no refractados y todos los refractados. Para la transferencia de contraste entre transmisin total y absorcin completa en una muestra la relacin de intensidad entre la luz refractada y la no refractada tendra que ser de 1:1 para obtener una interferencia destructiva total (negro) o una interferencia constructiva total (blanco). Cuando la apertura del condensador es igual a la apertura del objetivo, la luz no refractada penetra en el objetivo con intensidad completa, pero la luz refractada slo puede hacerlo parcialmente, lo que produce una disminucin del contraste. En otras palabras, si se cierra la apertura del condensador hasta los dos tercios de la apertura del objetivo se consigue una relacin de intensidad entre la luz refractada y la no refractada que se acerca a 1:1 y, en consecuencia, opti- miza el contraste. Si se cierra la apertura del condensador (o se baja el condensador) y se pierde este equilibrio se producirn fenmenos de interferencia o artefactos de la imagen, como anillos de refraccin o lneas alrededor de las distintas estructuras de la muestra. La mayor parte de las tcnicas microscpicas empleadas para aumentar el contraste (p. ej., campo oscuro, iluminacin oblicua, contraste de fase, modulacin del contraste) tienen su fundamento en el mismo principio, es decir que suprimen o reducen la intensidad de la luz no refractada para mejorar un contraste intrnsecamente bajo de la muestra. Si se siguen los pasos descritos y se mantienen limpias las lentes, la calidad y la fidelidad de las imgenes obser- vadas slo variarn de acuerdo con la capacidad de fun- cionamiento del sistema ptico. Uso correcto del microscopio ptico 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 17 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 18. TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Microscopia 18 FIGURA 1.11. Ejemplo de cortes de una naranja y de un corpsculo renal. Las lneas de puntos dibujadas sobre la naranja entera indican el plano del corte que est en relacin con cada una de las superficies seccionadas. De modo similar, los cortes diferentes a travs de un corpsculo renal, que tambin es una estructura esferoidal, muestran diferencias en cuanto a su aspecto. El tamao y el aspecto de la estructura interna son un reflejo del plano del corte. 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 18 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 19. diferentes. Obsrvense las grandes diferencias en cada corte del corpsculo renal. Mediante el examen de varios de estos cortes bidimensionales es posible ima- ginar la configuracin tridimensional de la estructura examinada. En todas las etapas de la preparacin de los tejidos pueden generarse artefactos en los preparados histolgicos Para la realizacin de un preparado histolgico es necesario seguir una serie de pasos que comienza con la recoleccin de la muestra y termina con la colocacin del cubreobjetos. En cada paso puede introducirse un artefacto (un error en el proceso de preparacin). Por lo general los artefactos que aparecen en el preparado terminado estn vinculados con la metodologa, el equipo o los reactivos usados durante la preparacin. La poca pureza de las sustancias qumicas y los reactivos utilizados en el proceso (fijadores, reactivos y colorantes), las imperfecciones en la ejecucin de la metodologa (intervalos de fijacin, deshidratacin, inclusin y coloracin demasiado cortos o demasiado largos o descuidos en el montaje o la colocacin del cubreobjetos) o el equipo inadecuado (un micrtomo con una cuchilla desafilada) pueden producir artefactos en el preparado final. Es importante que los estudiantes adviertan que no todos los preparados de su coleccin son perfectos y que estn familiarizados con los artefactos ms frecuentes. Otros sistemas pticos Adems del microscopio de campo claro, que se usa habitualmente para el examen de rutina de los preparados histolgicos, en los laboratorios clnicos y de investigacin se aplican otros sistemas pticos que se describirn a continuacin. Algunos se utilizan para aumentar el contraste sin necesidad de teir (como el microscopio de contraste de fase); otros estn disea- dos para ver las estructuras mediante el uso de tcnicas especiales como la inmunofluorescencia (microscopios de fluorescencia y confocal). El microscopio de contraste de fase permite el examen de clulas y tejidos no teidos y es de especial utilidad para estudiar clulas vivas El microscopio de contraste de fase aprovecha las pequeas diferencias en el ndice de refraccin que hay en diferentes partes de una muestra de clulas o tejidos. La luz que atraviesa regiones de ndice de refraccin mayor (regiones ms densas) se refracta y queda fuera de fase con respecto al haz luminoso principal. El microscopio de contraste de fase aade otras longitudes de onda cuya salida de fase se ha inducido mediante una serie de anillos pticos en las lentes condensadora y objetivo, con lo que en esencia se cancela la amplitud de la porcin del haz refractada inicialmente y se produce contraste en la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las regiones densas de la muestra mientras que las partes claras corresponden a regiones menos densas. Por lo tanto, el microscopio de contraste de fase sirve para examinar clulas y tejidos vivos, como los de cultivo, y tambin se usa mucho para estudiar cortes semifinos no teidos (de alrededor de 0,5 m) de material incluido en plstico. Dos modificaciones del microscopio de contraste de fase son el microscopio de interferencia, que tambin permite cuantificar masa hstica, y el microscopio de interferencia diferencial (con ptica de Nomarski), que es de especial utilidad para evaluar las propiedades de la superficie de las clulas y otras muestras biolgicas. En la microscopia de campo oscuro la lente objetivo no capta luz directa proveniente de la fuente luminosa En el microscopio de campo oscuro slo los rayos de luz refractados por las estructuras de la muestra penetran en el objetivo. Para lograr esto el microscopio est provisto de un condensador especial que ilumina el preparado con mucha intensidad y en forma muy oblicua. As, el campo se ve oscuro y sobre l se destacan pequeas partculas de la muestra que reflejan parte de la luz y aparecen brillantes. El efecto es similar al que producen las partculas de polvo en el haz luminoso de un proyector de diaposi- tivas cuando la habitacin est oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo alcanza la retina del ojo y eso permite verlas como puntos brillantes. La resolucin del microscopio de campo oscuro no puede ser mejor que la del microscopio de campo claro, dado que ambos usan luz de la misma longitud de onda. No obstante, como consecuencia del mayor contraste obtenido, en las imgenes de campo oscuro pueden detectarse partculas ms pequeas. En la investigacin este microscopio se utiliza para examinar preparados radioautogrficos, en los cuales los grnulos de plata revelados aparecen blancos sobre un fondo oscuro. En cambio, en la prctica clnica es til para la deteccin de cristales (p. ej., de oxalato o cido rico) en la orina, y para la identificacin de espi- roquetas, en particular Treponema pallidum, el microor- ganismo causante de la sfilis, una enfermedad de transmisin sexual. El microscopio de fluorescencia aprovecha la capacidad de ciertas molculas de fluorescer bajo la luz ultravioleta Una molcula que fluorece emite luz de longitudes de onda dentro del espectro visible cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta (UV). El microscopio de fluorescencia se utiliza para la deteccin de molculas con fluorescencia natural (autofluorescencia), como Microscopia Microscopia 1 19 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 19 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 20. la vitamina A y algunos neurotransmisores. Sin embargo, dado que las molculas autofluorescentes no son muchas, la aplicacin principal de este microscopio consiste en estudiar la fluorescencia secundaria, como cuando se quieren detectar antgenos o anticuerpos en las tcnicas de inmunocitoqumica (vase fig. 1.7). Las molculas fluorescentes especficas tambin pueden inyectarse en un animal o directamente en las clulas y luego usarse como marcadores. Estos mtodos han resultado tiles en el estudio de las uniones intercelulares (del tipo de los nexos), en la investigacin del trayecto de las fibras nerviosas en neurobiologa y en la deteccin de marcadores fluorescentes del crecimiento de los tejidos mineralizados. Entre la fuente luminosa UV y la muestra se colocan varios filtros para producir luz monocromtica (de una sola longitud de onda) o casi monocromtica (longitud de onda de banda estrecha). Un segundo conjunto de filtros colocados entre la muestra y el objetivo permite que slo la estrecha banda de longitud de onda de la fluorescencia llegue al ojo, a una emulsin fotogrfica o a otro procesador analtico. El microscopio confocal de barrido combina componentes de un microcopio ptico de campo claro con un sistema de barrido para disecar pticamente una muestra El microscopio confocal de barrido permite la visualizacin de una muestra biolgica en tres dimensiones. Las dos lentes del microscopio confocal (objetivo y fototubo) estn alineadas en forma perfecta para enfocar la luz proveniente del punto focal de una lente en el punto focal de la otra lente. La diferencia principal entre un microscopio convencional y uno confocal es la adicin de una apertura de detector (orificio puntiforme) que est en conjuncin con el punto focal de la lente; por lo tanto es confocal. Este orificio de posicin precisa slo permite que pase la luz en foco hacia el interior del dispositivo fotomultiplicador (detector), mientras que la luz fuera de foco tiene bloqueado el paso hacia el detector (fig. 1.12). Este sistema tiene la capacidad de obtener una resolucin (0,2 a 0,5 m) y una claridad excepcionales de un corte fino de una muestra biolgica simplemente por el rechazo de la luz fuera de foco. El sistema de iluminacin lser que utiliza es fuertemente convergente y en consecuencia produce una luz excitadora de gran intensidad en la forma de un punto de barrido muy superficial. Un sistema de espejos mueve el haz lser sobre la muestra de manera que se ilumine un solo punto a la vez (fig. 1.13). Se exploran muchos puntos individuales en el mismo plano focal y un programa informtico reconstruye la imagen a partir de los datos registrados durante la exploracin. En este aspecto, la microscopia confocal se parece a la tomografa com- putarizada (TC). Por otra parte, al usar slo la profundidad escasa de TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Microscopia 20 a Detector Apertura del detector (orificio puntiforme) Orificio puntiforme Lente objetivo Lente del fototubo Fuente luminosa Espejo separador de haces b Plano del foco Muestra EN FOCO FUERA DE FOCO FIGURA 1.12. Diagrama de la luz emitida en foco y fuera de foco en el microscopio confocal. a. Este diagrama muestra el trayecto del haz lser y de la luz emitida cuando la estructura formadora de imgenes est directamente en el foco de la lente. La pantalla con un orificio puntiforme al otro lado del sistema ptico del microscopio confocal permite que la luz de la estructura en foco atraviese el orificio. Luego programas informticos traducen la luz en una imagen. Dado que el punto focal de la lente objetivo del microscopio forma una imagen ntida a la altura en la que est el orificio puntiforme, estos dos puntos reciben el nombre de puntos confocales. b. Este diagrama muestra el trayecto del haz lser y de la luz emitida, que est fuera de foco en relacin con el orificio puntiforme. En consecuencia, la luz de la muestra bloqueada por el orificio nunca se detecta. 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 20 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 21. la imagen en foco es posible crear imgenes mltiples de distintas profundidades de la muestra. Por ejemplo, literalmente se puede as disecar capa por capa todo el espesor de la muestra. Tambin es posible utilizar el ordenador para realizar reconstrucciones tridimensionales de una serie de estas imgenes. Dado que cada imagen individual de profundidades especficas dentro de la muestra es muy ntida, la imagen tridimensional resultante tiene iguales caractersticas de nitidez. Adems, una vez que el ordenador ha armado cada una de las imgenes de los cortes, la reconstruccin tridimensional puede rotarse y verse desde cualquier ngulo que se desee (vase fig. 1.5). El microcopio de luz ultravioleta utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta En el microscopio de luz ultravioleta (UV) la imagen depende de la absorcin de la luz UV por las molculas de la muestra. La fuente UV tiene una longitud de onda aproximada de 200 nm, por lo que este microscopio puede alcanzar una resolucin de 0,1 m. En principio la microscopia UV tiene un funciona- miento semejante al de un espectrofotmetro, pero los resultados se registran en una placa fotogrfica. La muestra no puede inspeccionarse en forma directa a travs del ocular porque la luz UV no es visible y lesio- na el ojo. La microscopia de luz UV es til para detectar cidos nucleicos, en especial las purinas y las pirimidi- nas que son las bases nitrogenadas de los nucletidos. Tambin es til para detectar las protenas que contienen ciertos aminocidos. Con una iluminacin con longitudes de onda especficas habitualmente se realizan procedimientos espectrofotomtricos a travs del microscopio UV para determinar la cantidad de DNA y RNA en clulas individuales. Como se descri- bi en la pgina 8, este mtodo se utiliza en la prctica clnica para evaluar el grado de ploida (mltiplos de la cantidad normal de DNA) en cortes de tumores. El microscopio de polarizacin tiene su fundamento en el hecho de que las molculas o los conjuntos de molculas muy bien ordenadas pueden rotar el ngulo del plano en que vibra la luz polarizada El microscopio de polarizacin o de luz polarizada es una simple modificacin del microscopio ptico de campo claro en la que se coloca un filtro de polarizacin llamado polarizador, entre la fuente luminosa y la muestra y se instala un segundo filtro, llamado el analizador, entre la lente objetivo y el observador. Tanto el polarizador como el analizador pueden rotarse; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se utiliza para determinar el grado en el que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad de los cristales o las sustancias paracristalinas de rotar el plano de la luz polarizada recibe el nombre de birrefringencia (refraccin doble). El msculo estriado y las inclusiones cristaloides en las clulas intersticiales (de Leydig) del testculo, entre otras estructuras comunes, exhiben birrefringencia. Microscopia electrnica Hay dos tipos de microscopios electrnicos que proporcionan datos morfolgicos y analticos de clulas y tejidos: el microscopio electrnico de transmisin (MET) y el microscopio electrnico de barrido (MEB). El ade- lanto principal de la microscopia electrnica respecto de la microscopia ptica es que la longitud de onda del haz de electrones es unas 2 000 veces menor que la del haz de luz, con lo que aumenta la resolucin por un factor de 103. Microscopia Microscopia 1 21 Haz lser Apertura del detector (orificio puntiforme) Fotomultiplicador Separador de haces dicroico Fototubo Ocular Deslizador de reflexin Microscopio Objetivo Muestra Espejos de barrido FIGURA 1.13. Estructura del microscopio confocal y diagrama del trayecto de los rayos. La fuente luminosa del microscopio confocal es un generador lser. El haz lser (lnea roja) que se dirige hacia la muestra de tejido atraviesa un separador de haces dicroico y luego pasa por dos espejos de barrido mviles; estos espejos barren el haz lser por la muestra en las coordenadas x e y. Por ltimo, el haz lser entra en el microscopio y atraviesa su sistema ptico para iluminar la muestra de tejido que se desea examinar. La luz emitida por la muestra de tejido ilu- minada (lnea azul) retorna por el sistema ptico del microscopio, pasa por ambos espejos de barrido, atraviesa el separador de haces y se enfoca en el orificio puntiforme. La luz que atraviesa este orificio es captada y registrada por el dispositivo detector conectado a un ordenador que forma la imagen, un pixel a la vez. 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 21 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 22. El MET utiliza la interaccin de un haz de electrones con la muestra para producir una imagen En principio la ptica del MET es similar a la del microscopio ptico (vase fig. 1.10), excepto que el MET utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. El principio del microscopio es el siguiente: Una fuente, como es un filamento de tungsteno calentado, emite electrones (ctodo). Los electrones son atrados hacia un nodo. Una diferencia elctrica entre el ctodo y el nodo imparte un voltaje de aceleracin de entre 20 000 y 200 000 voltios a los electrones, con lo que se gene- ra un haz. Este haz de electrones atraviesa luego una serie de lentes electromagnticas que cumplen la misma funcin que las lentes de cristal de un microscopio ptico. La lente condensadora da forma al haz de electrones que alcanza el plano de la muestra y cambia su dime- tro. Entonces el haz que ha atravesado la muestra es enfocado y aumentado por una lente objetivo para despus volver a ser aumentado por una lente proyectora o ms de ellas. La imagen final se mira en una pantalla fosforescente. Las partes de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen claras; las partes que han absorbido y dispersado los electrones a causa de su densidad inherente o de la adicin de metales pesados durante la preparacin aparecen oscuras. Por arriba o por debajo de la pantalla visora se puede colocar una placa fotogrfica o un detector de vdeo para registrar la imagen de la pantalla de modo permanente. La preparacin de las muestras para la microscopia electrnica de transmisin es similar a la de la microscopia ptica excepto por la necesidad de mtodos ms refinados Los principios utilizados en la preparacin de los cortes para su examen con el MET son esencialmente los mismos que los que se emplean para la microscopia ptica con la restriccin de que en cada paso se debe trabajar con muestras 3 a 4 veces ms pequeas o ms delgadas que las habituales para la microscopia ptica. El MET, cuyo haz de electrones tiene una longitud de onda de alrededor de 0,1 nm, posee una resolucin terica de 0,05 nm. Dada la excepcional resolucin del MET, la calidad de la fijacin, es decir el grado de conservacin de la estructura subcelular, tiene que ser la mejor que se pueda conseguir. La preparacin de rutina de las muestras para la microscopia electrnica de transmisin comienza con la fijacin en glutaraldehdo seguida por un enjuague en una solucin amortiguadora (buffer) y la fijacin con tetrxido de osmio El glutaraldehdo, un dialdehdo, preserva las protenas al establecer enlaces cruzados entre ellas; el tetrxido de osmio reacciona con los lpidos, en particular los fosfolpidos. El osmio tambin imparte densidad electrnica a las estructuras celulares e hsticas porque es un metal pesado, lo cual mejora la formacin ulterior de la imagen en el MET. Lo ideal sera que los tejidos se perfundieran con glutaraldehdo amortiguado antes de extirparse del animal. Pero lo ms comn es que para el MET se fijen piezas de no ms de 1 mm3 (muy pequeas si se las compara con las piezas para el microscopio ptico, que pueden medirse en centmetros). El proceso de deshidratacin es el mismo que para la microscopia ptica y el tejido se infiltra con una resina monomrica, en general una resina epoxi, que luego se polimeriza. El tejido incluido en plstico se corta en micrtomos de diseo especial que poseen cuchillas de diamante Dado el poder de penetracin limitado de los electrones, el espesor de los cortes para la MET de rutina oscila entre 50 nm y no ms de 150 nm. Adems, como los abrasivos utilizados para afilar las cuchillas de acero dejan rayas inaceptables en los cortes para el MET, en lugar de estas se usan cuchillas de diamante con un afilado casi perfecto. Los cortes obtenidos con la cuchilla de diamante son demasiado finos como para manipularlos; se los hace flotar desde el borde de la cuchilla hacia la superficie de una cubeta llena de lquido y se los recoge sobre rejillas de cobre revestido en plstico. Las rejillas o grillas poseen 50 a 400 orificios por pulgada o ranuras especiales para ver cortes seriados. El haz de electrones atraviesa primero los orificios de la rejilla de cobre y despus la muestra y luego la imagen se enfoca en la pantalla visora o en pelcula fotogrfica. La tincin de rutina de los cortes para la microscopia electrnica de transmisin es necesaria para aumentar el contraste inherente de manera que los detalles de la estructura celular sean fciles de ver y fotografiar En general los cortes para la MET se tien mediante la adicin a la muestra de materiales de gran densidad, como los iones de metales pesados. Los iones de metales pesados pueden unirse a los tejidos durante la fijacin o la deshidratacin o por la inmersin de los cortes, una vez realizados, en soluciones de estos iones. El tetrxido de osmio, usado de rutina como TCNICA HISTOLGICA Y MICROSCOPIA1 Microscopia 22 92453-01.qxd 4/22/10 2:07 PM Page 22 Histologa 2012. Editorial Mdica Panamericana 23. fijador, se une a los componentes fosfolipdicos de las membranas, con lo que estas adquieren una densidad adicional. Con frecuencia se aade nitrato de uranilo a las soluciones alcohlicas usadas en la deshidratacin para aumentar la densidad de los componentes de las uniones intercelulares y de otros sitios. La inmersin secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa de rutina para teir los cortes antes de verlos con el MET y para obtener microfotografas electrnicas de mayor contraste y mejor resolucin. A veces se necesitan tinciones especiales para visualizar los resultados de las reacciones histoqumicas o inmunocitoqumicas con el

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