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16/06/2015
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Anlisis de grupos terminales
Secuenciacin del pptido
N-terminal C-terminal
Degradacin de Edman.
Mtodo de Sanger Carboxipeptidasa
Mtodo de Sanger
3. Identificar las N-terminales.
El reactivo clave utilizado en el mtodo de Sanger para identificar le N-terminal es el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno.
1-Fluoro-2,4-dinitrobenceno es muy reactivo ante la sustitucin nucleoflica aromtica.
N+
O
-ON+
O
O-
F El nuclefilo ataca aqu desplazando al F.
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Mtodo de Sanger
3. Identificar las N-terminales. El 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno reacciona con el nitrgeno del grupo amino del aminocido de la N-
terminal.
La hidrlisis cida rompe todos los enlaces peptdicos dejando una mezcla
de aminocidos, solo uno de ellos (el N-
terminal) porta un grupo 2,4-DNP.
Degradacin de Edman
3. Identificar las N-terminales.
1. Mtodo para determinar la N-terminal.
2. Puede ser realizado secuencialmente un residuo a la vez en la
misma muestra. Usualmente se puede determinar los
primeros 20 aminocidos a partir de la N-terminal por este
mtodo.
3. 10-10 g de muestra es suficiente.
4. Ha sido automatizado.
5. El reactivo clave es el fenilisotiocianato.
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Degradacin de Edman
3. Identificar las N-terminales.
fenilisotiocianato
pptido
pptido
pptido pptido
calor
Una feniltiourea
Calor
H+
Una tiazolona Feniltiohidantoina
Carboxipeptidasa
protena H3NCHC
O
R
+ NHCHCO
O
R
C
O
La Carboxipeptidasa es selectiva para la ruptura del enlace peptdico del aminocido
C-terminal.
3. Identificar las C-terminales.
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4. Organizar la informacin de las secuencias
de los fragmentos menores que pueden
revelar la secuencia entera.
Sntesis de pptidos
Sntesis en fase slida Sntesis en solucin
La formacin de una amida no es tan sencilla con los aminocidos ya que el grupo carboxlico puede reaccionar con su
propio grupo amino.
La conectividad de los AA deben realizarse en la secuencia correcta. La formacin aleatoria del enlace peptdico con una
mezcla de fenilalanina y glicina puede dar por ej. 4 dipptidos:
PhePhe GlyGly PheGly GlyPhe.
Algunos AA tiene cadenas que podran interferir con la formacin del dipptido. Como resultado, la sntesis de pptidos siempre
implica la activacin de ambos reactivos para formar los enlaces
peptdicos correctas y proteger grupos para bloquear la formacin
de enlaces incorrectos
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1. Limitar el nmero de posibilidades protegiendo el nitrogeno de un AA y el grupo carboxilico del otro.
N-Protegido
fenilalanina
C-Protegido
glicina
NHCHCOH
CH2C6H5
O
X H2NCH2C
O
Y
Estrategia general Sntesis de pptidos
2. Enlazar los dos AA protegidos.
NHCH2C
O
Y NHCHC
CH2C6H5
O
X
NHCHCOH
CH2C6H5
O
X H2NCH2C
O
Y
Estrategia general Sntesis de pptidos
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3. Desproteger el grupo amino de la N-terminal y el grupo
carboxlico de C-terminal
NHCH2CO
O
H3NCHC
CH2C6H5
O +
Phe-Gly
NHCH2C
O
Y NHCHC
CH2C6H5
O
X
Estrategia general Sntesis de pptidos
Sntesis de pptido en solucin Paso preliminar: Proteccin de la N-terminal con Z
Paso 1: Activar al grupo carboxlico con cloroformiato de etilo
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Paso 2: Formacin del enlace peptdico para acoplarse al prximo AA.
Paso 3: Activar al grupo carboxlico del dipptido con cloroformiato de etilo
Sntesis de pptido en solucin
Paso 4: Formar el tripptido
Paso 5: desproteccin del extremo N-terminal del pptido completo.
Sntesis de pptido en solucin
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Sntesis de pptido en fase slida
Resina de Merrifield
Sntesis de pptido en fase slida por el mtodo
Merrifield
Dipptido
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Estructura de las protenas
Estructura primaria
Esta definida por la secuencia de aminocidos junto con los
puentes disulfuro. Todas las propiedades de la protena se
determinan, directa o indirectamente, por la estructura primaria.
Estructura secundaria
Es el plegamiento regular local entre residuos de AA cercanos
de la cadena polipeptdica. Este tipo de estructura se adopta
gracias a la formacin de puentes de hidrgenos entre los
grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos
involucrados en las uniones peptdicas de AA cercanos en la
cadena.
Estructura terciaria
La estructura terciaria de una protena es su completa
conformacin tridimensional. La estructura terciaria
incluye toda la estructura secundaria y todos los dobleces y
pliegues en el medio.
Estructura cuaternaria
se refiere a la asociacin de dos o ms cadenas de pptidos
para completar la protena
Estructura secundaria de las protenas
N
N
O
C b
H
H
H
O
Y N
N
O
C b
H
H
H
O
f
N
N
O
C b
H
H
H
O
C b
C b O
w
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a-hlice
f = -58 y = -47
ngulos tpicos de a-hlice
w = 180
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puentes H en la a-hlice
Hoja plegada b
antiparalelo
paralelo
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Disposicin espacial de una hoja b
f = 180
y = 180
Estructura terciaria Estructura cuaternaria
Estructura secundaria
Estructura primaria
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Estructura terciaria Estructura cuaternaria
Estructura secundaria
Estructura primaria
Pequeos cambios en la medio ambiente puede causar un cambio qumico o conformacional de la
protena que resulta en la desnaturalizacin
Desnaturalizacin: Alteracin de la estructura normal y la prdida de la actividad biolgica de una
protena. Muchos factores que pueden favorecer a la desnaturalizacin, pero los ms comunes son el
calor y pH.
Desnaturalizacin de las protenas
Al cambiar el pH, las cargas de los aminocidos cambian haciendo que partes que se atraian no lo hagan ms o que grupos que no interaccionaban se repelan
Un aumento de temperatura puede aumentar la movilidad rompiendo puentes H y otras interacciones dbiles
Los enlaces covalentes no se afectan
al desnaturalizarse:
Las enzimas pierden su actividad cataltica
La solubilidad disminuye drsticamente
En algunos casos puede revertirse