Dpto. Parasitología y MicologíaCEFA

Dpto. Parasitología y MicologíaCEFA

En medicina general: grupo de pruebas diseñadas para la detección de anticuerpos específicos (Acs dirigidos contra una Ag conocido), reacciones de hipersensibilidad, producción de linfoquinas, entre otras, en respuesta a diversas patologías.

En parasitología clínica: cualquier técnica que se utilice para la detección de Acs específicos Acs específicos contra parásitos y hongos, contra parásitos y hongos, constituyendo el diagnóstico serológicodiagnóstico serológico..

SEROLOGÍA

La detección de anticuerpos circulantes específicos se realiza en el Suero del Paciente.

Númerosas técnicas de laboratorio se han implementado para realizar pruebas serológicas.

En la Práctica Clínica el estudio se solicitica como Serología para……citomegalvirus, toxoplasmosis, leptosprosis, ….etc.

Identificar problemas de salud.Determinación de la distribución de una

enfermedad.Determinar la incidencia y la prevalencia de una

enfermedad.Medición de la inmunidad materna específica.Calendarios de vacunación.Evaluación de programas y/o campañas de

vacunación.

Diagnostico etiológico. Diagnostico etiológico.

Establecer diagnósticos diferenciales entre diferentes Establecer diagnósticos diferenciales entre diferentes patologías infecciosas : parasitarias, fúngicas, patologías infecciosas : parasitarias, fúngicas, bacterianas.bacterianas.

Elección de la mejor conducta terapéutica .Elección de la mejor conducta terapéutica .

Estimar reactividad . Estimar reactividad .

Establecer políticas sanitarias de prevención. Establecer políticas sanitarias de prevención.

Estudios epidemiológicos. Estudios epidemiológicos.

UTILIDAD EN PARASITOLOGÍA y MICOLOGÍA

Las técnicas serológicas son útiles y prácticas en las parasitosis hemotesiduales y en las micosis profundas.

La propiedad de unión de las Igs a un Ag, que dicga unión sea específica y que pueda ser visualizable, hacen que sean las más utilizadas

AgenteMecanismo de transmisiónEpidemiologíaMecanismos inmunológicosMétodos de estudioLa buena práctica médica requiere de

interconsultas.

Los parásitos son mosaicos antigénicos, siendo un Los parásitos son mosaicos antigénicos, siendo un estímulo poderoso para el sistema inmunológico estímulo poderoso para el sistema inmunológico del hospedero.del hospedero.

ANTANTÍÍGENOS PARASITARIOSGENOS PARASITARIOS

Somáticos o estructurales: superficie, Somáticos o estructurales: superficie, citoplasmáticoscitoplasmáticos

Metabólicos: productos de la actividad Metabólicos: productos de la actividad fisiológica, Ags de secrecifisiológica, Ags de secrecióón-excrecin-excrecióón .n . proteproteíínas, glicoproteínas, polisacnas, glicoproteínas, polisacááridos, lipridos, lipíídos.dos.

I. SEROCONVERSIÓN

El aumento del título o concentración de anticuerpos cuatro veces o más, observado en dos muestras separadas por un intervalo de tiempo de 15 a 21 días.

Pasaje de no reactivo a reactivo.

II. SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la técnica para detectar la menor concentración de Acs buscados.

III. ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de la técnica para diferenciar los Acs específicos de otros presentes en el suero problema.

IV.IV. REACTIVIDAD CRUZADA:REACTIVIDAD CRUZADA: Acs diferentes al que se Acs diferentes al que se busca, y que busca, y que reaccionan con los Ags, cuando comparten epítopes idénticos o muy similares.

1. CUALITATIVOS: reactivo o no reactivo2. CUANTITATIVOS: miden la concentración de Acs a

estudiar. - TÍTULO:- TÍTULO: máxima dilución del suero problema que

arroja un resultado positivo ( Ej: 1/1024 ) - UNIDADES PREDETERMINADAS: el valor obtenido de la

concentración de Acs se compara con un patrón preestablecido de densidad óptica, fluorescencia , luminiscencia, que llamamos punto de corte, el cual permite diferenciar los positivos de los negativos. El valor se expresa en UI/ml, etc.

3. TAMIZAJE: Son utilizadas para estudio de grandes poblaciones.

4. CONFIRMATORIAS: Para establecer el diagnóstico de forma específica.

InformaciónSolicitudObtenciónde la muestra :

6 hrs de ayuno, extracción de sangre venosa, tubo seco sin anticoagulante, ….)

Transporte (separada, refrigerada…)

Conservación (4ºC, -20ºC)

TÉCNICAS

Floculación Aglutinación Precipitación Fluorescencia Inmunoenzimoanálisis Radioinmunoanálisis Otras

Técnicas de aglutinación: Cuando el Ag se encuentra unido o formando parte de células, parásitos o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado formado.  

Técnicas de fluorescencia: Para la realización de estas

técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

Inmunoprecipitación e inmunoblotting: Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos.

Sencillas.Sencillas.Dependen de la fijación inicial de antígenos Dependen de la fijación inicial de antígenos

específicos sobre eritrocitos o partículas. específicos sobre eritrocitos o partículas. Luego se incuban con el suero y las partículas Luego se incuban con el suero y las partículas

aglutinan si el Ac se encuentra presente. aglutinan si el Ac se encuentra presente. Detectan Acs totales de tipo IgG e IgM.Detectan Acs totales de tipo IgG e IgM.En general deben ser confirmadas por medio de En general deben ser confirmadas por medio de

otras, debido a que puede haber reacciones otras, debido a que puede haber reacciones inespecíficas.inespecíficas.

En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los Acs cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex.

Y

• Aglutinación directaSuspensiones de parásitos enteros Suspensiones de parásitos enteros son enfrentadas a sueros de pacientes. son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac (Y) presentes aglutinan los Los Ac (Y) presentes aglutinan los parásitos, formando acúmulos parásitos, formando acúmulos consistentes.consistentes.

•Aglutinación de partículas látex, carbón, etc látex, carbón, etc Suspensiones de partículas inertes, con su Suspensiones de partículas inertes, con su superficie cubiertas de Ag parasitarios, superficie cubiertas de Ag parasitarios, son enfrentadas a sueros de pacientes. son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac presentes aglutinan estas Los Ac presentes aglutinan estas partículas, formando acúmulos.partículas, formando acúmulos.

Y Y Y

Y

Y

Y Y

Y Y

YY

PositivoPositivo NegativoNegativo

+-

Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio adecuado en el que sea posible la precipitación de los inmunocomplejos.

Existen diferentes modalidades: - Técnica de precipitación en gel o difusión simple. - Técnica de difusión radial de Ouchterlony. - Técnica de inmunoelectroforesis. - Otras.

TTÉÉCNICAS DE PRECIPITACICNICAS DE PRECIPITACIÓÓNN

Es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y

posteriormente el Ag que se desea detectar se hace reaccionar con un Ac específico colocado en un pocillo lateral.

Por difusión llegan a encontrarse los Ags y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar 3.

Separación de moléculas por campo eléctrico

INMUNOELECTROFORESIS (IEF)

La identificación de Acs en una muestra de suero problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico).

El marcado de la reacción se hace mediante el empleo anti-Igs marcadas con una enzima (peroxidasa) lo que se conoce con el nombre de conjugado.

Los anticuerpos conjugados suelen ser monoclonales o anti-Igs especificas.

Se les llama sistemas competitivos. Se establece competencia por los sitos de unión

disponibles entre el reactivo conocido, (Ag) añadido al ensayo a concentración limitada, y el elemento a investigar Ac.

La identificación de Acs en una muestra de suero problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico).

El marcado de la reacción para que sea visible y detectable, se hace mediante el empleo anti-Igs marcada con una enzima (peroxidasa) lo que se conoce con el nombre de conjugado.

Ag en pocilloAg en pocillo

lavadolavado

Ac específicoAc específicoen muestraen muestra

enzima conjugada (E)enzima conjugada (E)

lavadolavado lavadolavado

Sustrato (S)Sustrato (S)

11 22 33 44

EnzimáticosEnzimáticos Fluorescentes Fluorescentes

(Fluoroinmunoensayo)(Fluoroinmunoensayo) Ligandos (biotina, Avidina)Ligandos (biotina, Avidina) Luminiscentes Luminiscentes

(Luminoinmunoensayo)(Luminoinmunoensayo)

EspectrofotometríaEspectrofotometría FluorescenciaFluorescencia QuimioluminiscenciaQuimioluminiscencia Electro-químicaElectro-química

11

1/21/2

1/161/16

1/321/32

1/641/64

1/1281/128

1/41/4

1/81/8

BUFF

ER

BUFF

ER

CUANTITATIVOCUANTITATIVOCUANTITATIVOCUANTITATIVO

11

DILUCIÓNDILUCIÓNDILUCIÓNDILUCIÓN

11

1/21/2

1/161/16

1/321/32

1/641/64

1/1281/128

1/41/4

1/81/8

++

-

++

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++

++

++

RESULTADORESULTADORESULTADORESULTADO

AUTOMATIZACIAUTOMATIZACIÓÓNN

Existen equipos electrónicos, que permiten la Existen equipos electrónicos, que permiten la automatización de los procedimientos y el análisis automatización de los procedimientos y el análisis computacional de los resultados. computacional de los resultados.

La lectura y medida de la [ Acs-Ag ] se hace mediante La lectura y medida de la [ Acs-Ag ] se hace mediante colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc., colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc.,

Facilitando la padronización y reproducibilidad de las Facilitando la padronización y reproducibilidad de las técnicas, mayor precisión y registro de resultados, técnicas, mayor precisión y registro de resultados, mejor cuantificación y valoración de los mismos. mejor cuantificación y valoración de los mismos.

Disminuye los errores y permite un mejor control de Disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.calidad.

370 nm

370 nm

450 nm450 nm

photodiodophotodiodo

TiraTira

Cono fase sólida y pipeteoCono fase sólida y pipeteo

Buffer lavadoBuffer lavado SubstratoSubstrato

MuestraMuestra DiluyenteDiluyente ConjugadoConjugado

REACCION INMUNOLOGICAREACCION INMUNOLOGICA REACCION ENZIMATICAREACCION ENZIMATICA

INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.I)

Se basa en la unión de Acs presentes en el suero , a los Ags parasitarios de membrana, que han sido fijados a un portaobjeto de vidrio.

Se incuba el suero del paciente con el Ag.

Lavado con PBS.

Posteriormente se agrega un Ac anti IgG o IgM humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

Esta sustancia se vuelve fluorescente al ser expuesta a la luz ultravioleta , emitiendo una luz verde .

Fluorescencia en el citoplasma del parásito.

Toxoplasma gondii

Echinococcus granulosus

Trypanosoma cuzi