Daniel Ramón VidalUniversitat de València-IATA (CSIC)

LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS

EL AROMA DEL VINO

Terciario

Primario

Secundario

PARED CELULAR VEGETAL: UNA DIANA ENZIMÁTICA

CelulosaHemicelulosa

Pectina

CelulosaHemicelulosaPectinasas

UNA CUESTIÓN ENZIMÁTICAG Ar

G R

G Ar

G R

G Ap

G ApG Ar

G ApG Ar

G Ar

G Ap

G Ar

G RG R

AROMA AFRUTADO

Alcoholes superiores

Ésteres

Terpenos

TERPENOS DE RELEVANCIA ENOLÓGICA

Linalol Nerol Geraniol

CH3

CH2OH

CH2

CH2

HC

HC

C

C

CH3

CH3

CH3

CH2

CH2

CH2

HC

HC

C

C

CH3

CH3HO

CH3

CH2OH

CH2

CH2

C

HC

C

C

CH3

CH3

H

T G A Terpenos ligados (sin aroma)

T Terpenos libres (aroma)

USO DE ENZIMAS PARA INCREMENTAR EL AROMA AFRUTADO

O O

OCH2O

HOOH

OH

CH2OH

OH OHApiofuranosil-glucósido

Arabinofuranosil-glucósido

O O

OCH2O

HOOH

OHHOH2C

OH

OH

O

OCH2O

O

HOOH

OHOH OH

CH3

HO

Ramnopiranosil-glucósido

TT

T

MICROORGANISMO ENZIMA GEN

Aspergillus aculeatus Ramnosidasa A rhaARamnosidasa B rhaB

Aspergillus nidulans α-L-Arabinofuranosidasa abfBRamnosidasa NCXilanasa X22 xlnAXilanasa X24 xlnBXilanasa X34 xlnCβ-xilosidasa xlnD

Aspergillus niger α-L-Arabinofuranosidasa B abfBAspergillus terreus α-L-Arabinofuranosidasa A NC

α-L-Arabinofuranosidasa B NCα-L-Arabinofuranosidasa C NC

Ramnosidasa NCCandida molischiana β-glucosidasa bglNFusarium solani Pectato liasa pelATrichoderma longibrachiatum β-(1,4)-endoglucanasa egl1

RAMNOSIDASAS DE Aspergillus aculeatus

CARACTERÍSTICAS Rha A Rha B

Mw 92 kDa 85 kDa

Glicosilación 24% 15%

pH 4,5-5 4,5-5

Km 2,8 mM 0,3 mM

Vmax 24 U/mg 14 U/mg

Rha A/rhaARha B/rhaB

CEPAS DE LABORATORIO CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA

cDNA rhaAGPDp PGKt

pG1 W303-1A

TRP+

pNP-R+

muF-R+

PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RhaA

Mw 70 kDapH 4,5-5

Km 2,8 mMVmax 24 U/mg

EtOH 15% (45%)EtOH 20% (35%)

SO2 (150 mg/l) (100%)Glc (0,15 M) (41%)Glc (0,5 M) (16%)

Glc (1 M) (7 %)YR6

Intercambio catiónico

48 µg/ml of rRhaA liberan 46 nmoles de L-ramnosa

CONSTRUCCIÓN DE CEPAS DE T73 CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA

cDNA rhaAGPDp PGKt

YEpCR21 T73

CHXr

pNP-R+

muF-R+

T73T73/YEpCR21

T73::bglNT73::rhaA

T73::bglN + T73::rhaAYR8

YR6 (100 mU/ml) vs YR8 (600 mU/ml)

LIBERACIÓN DE TERPENOS

CONSTRUCCIÓN DE CEPAS T73 GRAS CON ACTIVIDAD RAMNOSIDASA

cDNA rhaAGPDp PGKtURA3L URA3RKANrloxP loxP

T73

KANr

URA+

KANspNP-R+

muF-R+ YR58YEp351-cre-CYH

PROPIEDADES DE LA CEPA YR58

Una copia del cDNA del gen rhaA en el locus URA3Mejor crecimiento que la cepa YR8 La mitad de la actividad RhaA¿Cual es la situación en el vino?

LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS GRAS

T73::abfBT73::bglNT73::egl1T73::pelAT73::ramAT73::xlnAT73::xlnBT73::xlnC

ACT1p xlnA

0,3

0,4

0,5

Lina

lol(

ppm

)

YR13wt Rha Bgl Rha/Bgl

INCREMENTO DE RESVERATROL

OH

OH

OH

AnticolesterémicoAntitumoral

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

t-piceido c-piceido t-resveratrol c-resveratrol

T73 abfB bglN abfB+bglN

¿ES POSIBLE COMERCIALIZAR VINOSPRODUCIDOS POR LEVADURAS TRANSGÉNICAS?

Evaluación sanitaria

Evaluación ambiental

Aceptación por el consumidor

Glándulassalivares

Hígado

Pulmón

Riñón

Hoy no hay mercado para los vinos

transgénicos, pero...

Australian Institutefor Wine Research

INRA-Montpellier

IATA-UVEGValencia

University ofStellenbosch

SITUACIÓN LEGAL

Reglamento CE 1830/2003Reglamento CE 65/2004

GMO

GMO

Ingeniería genética

Ingeniería genética

Ingeniería genética

http://europe.eu.int/comm/dgs/health_consumer/library/press/press298_en.pdf

EL COMPLEJO XILANOLÍTICO DE A. nidulans

X34

X24

X22

XIlano

β-xilosidasaXilosa

X22

X24

X34

β-xilosidasa

xlnA

xlnB

xlnC

xlnD

Vino

Panadería

Piensos

Vino

ENZIMA GEN APLICACIÓN

...VUELTA A LOS HONGOS

Conocimiento básico

Planta Piloto

Glucosa pH (H+/OH- )

CreA

Xilosa

+XlnR

PacC+/-

Xilosa

-xln

Sistema xilanolíticoXilano

Glucosa pH (H+/OH- )

CreA

Xilosa

+XlnR

PacC+/-

Xilosa

-xln

Xilano Sistema xilanolítico

EL GEN xlnR DE A. nidulans

Región rica en P Dominio

centralMotivo

RRRNLS

NH2 COOH

DominioZn(II)2Cys6

A C1 D Q C2 N Q L RT K C3 D G Q N P C4 A H C5I E F G L T C6

TRANSFORMANTES SOBREPRODUCTORES

acnA

xlnB

rRNA

xlnC

xlnA

xlnD

acnA

rRNA

F F1 1 1 1 1 14 4 4 4 4 4

X XG G X XG G

(gpdAp::xlnR)(xlnRp::xlnR)

Glucosa pH (H+/OH- )

CreA

Xilosa

+XlnR

PacC+/-

Xilosa

-xln

Xiylano Sistema xilanolítico

REPRESIÓN POR CATABOLITO

Cepa silvestre creAd30

xlnAxlnBxlnCxlnDacnA

F F1 12 24 46 6

Xilosa + glucosa (inducción + represión)Xilosa (inducción)FructosaF

MUTACIONES PUNTUALES EN xlnAp

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivid

ad G

OX

rela

tiva

X XG

sVAL0

39

sVAL0

39-m

C2

sVAL0

39-m

C1

sVAL0

39-m

C2mC1

GTGGagG CTGGgG

aa-mC1-mC2

sVAL0

39

sVAL0

39-m

C2

sVAL0

39-m

C1

sVAL0

39-m

C2mC1

ATG

GOX

CEPA

sVAL039

sVAL039-mC2

sVAL039-mC1

sVAL039-mC2mC1

5.05

5.5

2.14

2.09

X/XG

C3 C2 C1- 660

Glucosa pH (H+/OH- )

CreA

Xilosa

+XlnR

PacC+/-

Xilosa

-xln

Xilano Sistema xilanolítico

REGULACIÓN POR pH DE LA EXPRESIÓN DE GENES xln

pH

F 4 6 8 4 6 8 4 6 8 4 6 8

1 2 4 6

xlnAxlnBxlnCxlnD

acnA

MUTANTES DE pH Y REGULACIÓN DELA EXPRESIÓN DE GENES xln

F F F F1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6

silvestre pacCc14 palA1pacC+/-

20205

xlnA

xlnB

xlnC

xlnD

acnA

Glucosa pH (H+/OH- )

CreA

Xilosa

+XlnR

PacC+/-

Xilosa

-xln

Xilano Sistema xilanolítico

H

Glucosa

L

? SorA

CreB

CreC

CreA

PREDICCIÓN DE ESTRUCTURAS DELAS PROTEÍNAS Mst

PRODUCCIÓN ESPECÍFICA DE LA XILANASA X22

xlnA

XlnR

+

CreA

PacCGlucosa

XIlanoXilosa

-+

pH ácido

xlnAp*

X22

Biopolis S.L.

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José María CentenoMichel FlipphiMaría Enrique

Josep Vicent FormentSalvador GenovésJosé Vicente GilOscar HerreroEncarna Ibañez

Andrew MacCabePaloma Manzanares

Marga OrejasPepa Ortiz

Juan Antonio Tamayo Luisa VenturaDaniel Ramón

Salvador VallésAdela Villanueva

Marian Vila