Post on 22-Jan-2016
La Técnica histológicaLa Técnica histológica Es el conjunto de Es el conjunto de
procedimientos que se procedimientos que se realizan en el laboratorio para realizan en el laboratorio para el estudio de la estructura del el estudio de la estructura del material biológico, desde el material biológico, desde el punto de vista microscópico.punto de vista microscópico.
Finalidad del estudio Finalidad del estudio microscópicomicroscópico
Conocimiento de la estructura Conocimiento de la estructura del organismo para del organismo para comprender los procesos comprender los procesos bioquímicos y fisiológicos bioquímicos y fisiológicos que en él tienen lugar. que en él tienen lugar.
Diagnóstico de procesos Diagnóstico de procesos patológicos.patológicos.
OrganismoOrganismo
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
CongelaciónCongelación
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
TTééccnniiccaa
HHiissttoollóóggiiccaa
OtrosOtros
Finalidad de la FijaciónFinalidad de la Fijación
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
Detiene la dinámica funcional y los procesos enzimáticos del organismo.
Evita los procesos de autolisis (degradación por enzimas propios) y putrefacción (degradación bacteriana).
Conservar las estructuras de la manera más fidedigna posible al estado vivo.
Modifica la reactividad de los tejidos a los colorantes.
Protege de efectos traumáticos y evita la retracción de los tejidos.
Tipos de fijadoresTipos de fijadores
Físicos: Calor.Calor.
Químicos: Aldehídos. Mercurio. Alcoholes. Agentes oxidantes. Ácido pícrico y derivados.
Moléculas objeto de la fijaciónMoléculas objeto de la fijación
•Proteínas.
•Grasas.
•Hidratos de carbono.
Fijación de proteínasFijación de proteínas Coagulación: Alcohol. Actúa Coagulación: Alcohol. Actúa
extrayendo la capa de agua y como extrayendo la capa de agua y como consecuencia precipitan las proteínas.consecuencia precipitan las proteínas.
Desnaturalización: calor, agentes Desnaturalización: calor, agentes oxidantes. Consiste en un cambio de la oxidantes. Consiste en un cambio de la conformación de la proteína. conformación de la proteína.
Reticularización: Aldehídos. Forma Reticularización: Aldehídos. Forma puentes cruzados con las proteínas, puentes cruzados con las proteínas, adquiriendo éstas una configuración adquiriendo éstas una configuración rígida.rígida.
Fijación de lípidosFijación de lípidos
Tiene lugar a través de una cambio de la constitución
química de las moléculas. Se basa en un
endurecimiento, con lo cual se vuelven menos
solubles. Esto se consigue mediante:
Oxidación específica de lípidos.
Formación de sales insolubles.
Fijación de hidratos de carbonoFijación de hidratos de carbono La fijación de hidratos de carbono es La fijación de hidratos de carbono es
difícil. La mayoría de los difícil. La mayoría de los procedimientos se basan en procedimientos se basan en reacciones de precipitación, pero reacciones de precipitación, pero cuando los tejidos se introducen en cuando los tejidos se introducen en otros líquidos, los hidratos de otros líquidos, los hidratos de carbono se vuelven solubles. Es por carbono se vuelven solubles. Es por ello que hay que evitar que ello que hay que evitar que permanezcan durante mucho tiempo permanezcan durante mucho tiempo en soluciones acuosas.en soluciones acuosas.
Fijadores químicos más utilizadosFijadores químicos más utilizados
M. ópticaM. óptica M. electrónicaM. electrónica Paraformaldehido. Paraformaldehido. Glutaraldehido. Glutaraldehido. Tetróxido de osmio.Tetróxido de osmio. FormolFormol
Características de una buena fijaciónCaracterísticas de una buena fijación
Rapidez. Rapidez. Penetración. Penetración. Volumen de fijador. Volumen de fijador. Tiempo de fijación. Tiempo de fijación. Presión osmótica. Presión osmótica. pH óptimo. pH óptimo. Temperatura. Temperatura. Manipulación adecuada. Manipulación adecuada. Tamaño de la pieza.Tamaño de la pieza.
RapidezRapidez
Es importante que transcurra el Es importante que transcurra el mínimo tiempo posible entre la mínimo tiempo posible entre la muerte del animal y la fijación. muerte del animal y la fijación.
Hay que evitar que el tejido se Hay que evitar que el tejido se seque para evitar artefactos. seque para evitar artefactos.
Depende del tamaño de la Depende del tamaño de la pieza.pieza.
Fijación por inmersiónFijación por inmersión
Se introduce la pieza en un recipiente que contiene el fijador.
Fijación por perfusión
Se introduce el fijador en el árbol vascular del animal vivo y anestesiado.
El tiempo que transcurre entre la muerte y la fijación es mínimo. Es el mejor método para fijar tejido nervioso y muestras para Microscopía electrónica.
Penetración del fijadorPenetración del fijador
Depende de la difusibilidad de cada fijador individual, la cual es constante para cada uno de ellos. Para evitar este problema se puede cortar la pieza en secciones de 2 a 3 mm.
Los más rápidos son el formol y el alcohol. El más lento el glutaraldehido.
Volumen del fijadorVolumen del fijador
Debe estar en una proporción de al menos
10:1 entre fijador y tejido.
Si esto no se puede conseguir, se puede
solucionar el problema cambiando el fijador
a de terminados intervalos.
La agitación mejora la penetración del
fijador.
Tiempo de fijaciónTiempo de fijación
No deben permanecer los No deben permanecer los tejidos en el fijador durante tejidos en el fijador durante mucho tiempo. mucho tiempo.
Para Microscopía óptica, un Para Microscopía óptica, un tiempo adecuado puede ser tiempo adecuado puede ser entre 24 horas y algunos días. entre 24 horas y algunos días.
En Microscopía electrónica, 12-En Microscopía electrónica, 12-18 horas es suficiente.18 horas es suficiente.
pH óptimopH óptimo
Se debe utilizar el fijador a un Se debe utilizar el fijador a un pH neutro, en el rango de 6 a 8, pH neutro, en el rango de 6 a 8, para lo cual se tampona el para lo cual se tampona el fijador, con un buffer a pH 7.fijador, con un buffer a pH 7.
TemperaturaTemperatura
El aumento de la temperatura El aumento de la temperatura favorece las reacciones favorece las reacciones químicas de autolisis, y también químicas de autolisis, y también incrementa la velocidad de la incrementa la velocidad de la fijación. fijación.
Para evitar la autolisis se puede Para evitar la autolisis se puede realizar la fijación a 4ºC.realizar la fijación a 4ºC.
OsmolaridadOsmolaridad
Es importante la concentración del fijador teniendo en
cuenta la osmolaridad de los tejidos, con el fin de que
no se produzca ni retracción ni hinchazón de los
mismos.
Para ajustar la osmolaridad del fijador se suele
emplear sacarosa.
Preparación para Preparación para microtomíamicrotomía
Congelación. Congelación. Inclusión.Inclusión.
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
CongelaciónCongelación
CongelaciónCongelación
En caso de que sea necesario un diagnóstico rápido de un proceso patológico.
Realización de inmunocitoquímica.
La pieza se corta en un criostatoLa pieza se corta en un criostato
CongelaciónCongelación
Para evitar la formación de cristales de hielo
durante la congelación se realiza una
crioprotección mediante inmersión del tejido en
sacarosa al 30 % antes de la misma.
Las piezas deben congelarse rápidamente por
inmersión en isopentano sumergido a su vez en
nitrógeno líquido (-195 °C).
InclusiónInclusión
Consiste en sustituir el agua de Consiste en sustituir el agua de los tejidos por otra sustancia los tejidos por otra sustancia líquida que penetra en el tejido y líquida que penetra en el tejido y los rodea. Así, los tejidos se los rodea. Así, los tejidos se endurecen para formar un endurecen para formar un bloque sólido que pueda ser bloque sólido que pueda ser cortado.cortado.
InclusiónInclusión
Lavado.
Deshidratación.
Diafanización.
Infiltración.
Confección bloque.
Lavado.
Deshidratación.
Diafanización.
Infiltración.
Confección bloque.
AutotecnicónAutotecnicón
LavadoLavado
Se realiza para retirar el exceso del fijador, ya que éste
puede tener un efecto nocivo impidiendo el buen desarrollo
de la inclusión o de la coloración.
Estos inconvenientes se pueden eludir lavando las piezas
después de la fijación con el tampón en el cual ha sido
preparado el fijador.
DeshidrataciónDeshidratación
Como el tejido fijado se halla en Como el tejido fijado se halla en solución acuosa y el medio de inclusión solución acuosa y el medio de inclusión no es soluble en agua, no puede ser no es soluble en agua, no puede ser infiltrado directamente con el agente de infiltrado directamente con el agente de inclusión. inclusión.
Por ello se deshidrata en una serie de Por ello se deshidrata en una serie de alcoholes crecientes desde el alcohol alcoholes crecientes desde el alcohol de 70% al de 100% en que se elimina de 70% al de 100% en que se elimina totalmente el agua del tejido. totalmente el agua del tejido.
Con ella se endurecen las piezas.Con ella se endurecen las piezas.
Diafanización o aclaramientoDiafanización o aclaramiento
Consiste en la eliminación del Consiste en la eliminación del agente de deshidratación con agente de deshidratación con una sustancia miscible en el una sustancia miscible en el agente de inclusión. agente de inclusión.
Microscopía ópticaMicroscopía óptica Microscopía electrónicaMicroscopía electrónica XilolXilol Óxido de PropilenoÓxido de Propileno
Medios de inclusiónMedios de inclusión
M. ópticaM. ópticaM. ópticaM. óptica
M. electrónicaM. electrónicaM. electrónicaM. electrónica
Parafina. Parafina. Celodina.Celodina.
Parafina. Parafina. Celodina.Celodina.
Metacrilato. Metacrilato. Lowicryl. Lowicryl. Epon. Epon. Araldita.Araldita.
Metacrilato. Metacrilato. Lowicryl. Lowicryl. Epon. Epon. Araldita.Araldita.
InfiltraciónInfiltración
Finalmente, el tejido es
infiltrado en el agente de
inclusión.
Resumen del proceso de inclusión
Medios de inclusión: resinasMedios de inclusión: resinas
Los agentes inclusores más utilizados en microscopia
electrónica son la Araldita y el Epon.
Polimerizan en la estufa a 60 °C en 48 horas.
Metacrilato.
Lowicryl: polimeriza a bajas temperaturas (-20ºC o con
luz UV), por lo que se utiliza cuando el tejido no puede
someterse a altas temperaturas.
Medios de inclusión: ParafinaMedios de inclusión: Parafina
Son químicamente cadenas de Son químicamente cadenas de hidrocarburos saturadas de entre 22 hidrocarburos saturadas de entre 22 a 28 átomos de carbono. a 28 átomos de carbono.
Sus puntos de fusión dependen de Sus puntos de fusión dependen de la longitud de la cadena; cuanto más la longitud de la cadena; cuanto más larga, mayor será su punto de larga, mayor será su punto de fusión. fusión.
Las parafinas utilizadas en la Las parafinas utilizadas en la técnica histológica poseen puntos de técnica histológica poseen puntos de fusión entre 45 y 60 °C. fusión entre 45 y 60 °C.
Confección del bloqueConfección del bloque
Microscopía óptica:
enfriamiento.
M. electrónica:
polimerización.
CorteCorteLos tejidos deben ser cortados en finas secciones que serándepositadas sobre la superficie de un portaobjetos.
El grosor de la sección dependerá del tipo de microtomo elegido, según el microscopio en el que se vaya a observar.
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
CongelaciónCongelación
Tipos de micrótomosTipos de micrótomos
Micrótomo de parafina: 7-10
micras. Criostato: 7-10 micras. M. de congelación: 10-25 micras.
Vibratomo: secciones gruesas de 50
micras. Ultramicrotomo:secciones semifinas de 1 micra y secciones ultrafinas de 60-90 nanometros para observar en microscopía electrónica de transmisión.
Corte para microscopía ópticaCorte para microscopía óptica
Los cortes se recogen en
portaobjetos para su
observación en el
microscopio óptico.
Corte de secciones incluidas en Corte de secciones incluidas en parafinaparafina
Las secciones se dejan flotar en un baño de agua caliente a 37ºC, que elimina las posibles arrugas.
A continuación se recogen en un portaobjetos.
Corte por congelaciónCorte por congelación
Los cortes realizados en un criostato (todo el proceso se realiza en una cámara a -20ºC), o en un micrótomo de congelación.
Se recogen directamente en un portaobjetos.
Corte en ultra micrótomoCorte en ultra micrótomo
Los cortes se recogen en
rejillas metálicas que sirven
de soporte para su
observación en el
microscopio electrónico.
TinciónTinción
Para lograr contraste suficiente entre los distintos componentes de las células y poderlos diferenciar con el microscopio óptico, se emplean diversos colorantes.
Cuando un componente absorbe abundante colorante, aumenta la densidad óptica y disminuye la amplitud de las ondas luminosas que lo atraviesan.
Tiene aspecto más oscuro que los componentes que absorben poco colorante. El colorante absorbido imparte su color a la luz que sale del componente que lo absorbió.
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
TinciónTinción
Utiliza varios colorantes con
diferente capacidad para teñir
diversos componentes
celulares.
Es necesario desparafinar e
hidratar los cortes invirtiendo
el orden de la inclusión en
parafina.
MontajeMontaje
La sección teñida debe cubrirse con un cubreobjetos para proteger el tejido y poderlo observar durante años.
FijaciónFijación
InclusiónInclusión
CorteCorte
TinciónTinción
MontajeMontaje
Material de estudioMaterial de estudio
ObservaciónObservación
MontajeMontaje
Previamente a la colocación del cubreobjetos se cubre con una resina inmiscible en agua.
Ejemplos:
•Eukitt. •Bálsamo de Canadá. •Permount.
•Entellán.