Post on 07-Jan-2017
Aplicación de los Marcadores
moleculares en el área pecuaria:
avances, retos y perspectivas
Dra. Ana M. Sifuentes Rincón
Lab. de Biotecnología Animal
Centro de Biotecnología Genómica-IPN
¿Qué es la Biotecnología?
El desarrollo de bienestar y
servicios a partir del
conocimiento de los
genomas
Combinar los organismos vivos
o partes de éstos con tecnología
para producir o mejorar
productos.
Aplicaciones de la Biotecnología Animal
*Mejorar la productividad de los animales *Aplicaciones medicas para, producir proteinas valiosas en la leche, sangre u orina de los animales. *Desarrollar modelos animales de enfermedades del humano
- Desarrollo de Animales transgenicos para:
- Mejoramiento Genetico Asistido por marcadores
¿Porqué DNA?
Food Economics and Consumer Choice (Jeff Simmons, 2008)
• Prácticas: Hacerlas mejor
• Productos: Usar herramientas y tecnologías nuevas e innovadoras
• Genética: Incrementar los rasgos deseados en plantas y animales
La Genómica en los animales de importancia pecuaria
La industria pecuaria representa del 30–40% de las actividades agropecuarias
Los animales de granja representan una de las principales fuentes de proteina en
la dieta de los humanos
Desde el 2005 se iniciaron diferentes proyectos de secuenciación de los genomas de
los principales animales de granja que incluyen a los cerdos, bovinos, ovejas y pollos
Estrategias para el Mejoramiento
Genético
Registros
(Gen. y Prod).
Estimación
de Parám. Selección
EPD’s
Apareamientos
Técnicas
Reproductivas
Objetivos
de Selección
Kinghorn, B.P., Van der Werf, J. and Ryan, M. 2000
Mejoramiento
Animal
Tecnologías
moleculares
Bioinformática
Estructura
de
Población
¿Qué es un genoma? • El término “genoma” se usa para denotar la
totalidad de genes y cromosomas que se encuentran en el núcleo de una célula .
Análisis de genomas de especies
Uno de los principales objetivos del análisis de
los genomas de especies de interés pecuario es
encontrar aquellas variaciones en la secuencia
de ADN que explique los cambios fenotípicos.
El genoma del bovino
Tipos de variación en la secuencia de
DNA
- Diferencias en el número de copias de secuencias repetitivas
Secuencias de DNA repetido en tandem:
DNA minisatélite (VNTRs)
Microsatélites (repeticiónes cortas de di-,tri-, tetra-
nucleotidos)
- Inserciónes/Deleciones
- Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
MARCADORES DE ADN
A G A A T C T G A A T.T G A A C A C T C
A G A A T G T G A A T.T G A A C A T T C
Variantes alélicas o
génicas
Es una región especifica del DNA donde se han
encontrado variaciones que se asocian con efectos
positivos o negativos en una característica de interés.
Dura suave dura suave
G
|
T
C
|
C
316
4751
G
|
T
C
|
C
316
4751
316 4751
Es un análisis en el que por medio
de marcadores de ADN se determina
en un animal , de cual o cuales
variantes génicas es portador
Pruebas de ADN
Las pruebas de ADN en animales, tienen una amplia gama de aplicaciones y específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para: Identificación de individuos Diagnóstico de enfermedades genéticas reconstrucción de linajes estimaciones de consanguinidad Casos forenses Estudios de trazabilidad
Diagnóstico molecular en ganado bovino
IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS
Las pruebas de paternidad es un análisis que han tenido
mucho impacto en la industria pecuaria.
Específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para:
Determinación de paternidad cuando un animal cambia o
intercambia su progenie con otra madre
En la determinación de paternidad cuando una hembra
se aparea por empadre múltiple
verificación de registros de hato
Pruebas de paternidad
Durante las últimas dos décadas los marcadores microsatélites han sido los
marcadores de elección para los análisis de paternidad/identidad y
trazabilidad en animales y humanos, sin embargo, los resultados obtenidos
con estos marcadores entre los diferentes laboratorios no son siempre
comparables debido a las dificultades técnicas para su análisis,
principalmente los errores en la determinación de los tamaños alélicos.
Pruebas de paternidad
Los SNPs son el tipo más común de variación genética y son los marcadores mas populares para los diferentes estudios de
genómica en bovinos
Los SNPs son mutaciones de un solo par de bases en un locus específico, por lo general constan de dos alelos donde la
frecuencia del alelo mas raro es ≥ 1% (MAF).
Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
Aunque en términos de informatividad los SNPs podrían ser
considerados no tan óptimos (son bialélicos) comparados con los
microsatelites, presenta las siguientes características:
Amplia abundancia
Estabilidad en mamíferos, baja tasa de mutación (108) en
comparación con los microsatelites (103)
nomenclatura mas simple,
posibilidades de automatización del proceso de tipificación y de
interpretación de los datos.
Los SNPs son también ampliamente usados para el descubrimiento
de QTLs y en los estudios de asociación de genes con rasgos
productivos específicos
Ventajas de los SNPs como marcadores para pruebas de paternidad
Un paso esencial en las estrategias de
mejoramiento genético es la selección de los
animales con mayor mérito genético.
¿Porqué verificar el pedigrí de los
hatos?
Actualmente los valores genéticos son expresados en
forma de Diferencia Esperada en la Progenie y es la forma
más exacta de analizar la productividad de un animal
y/o un hato y por lo tanto es utilizada como una
herramienta muy útil en las desiciones de selección
Los productores consideran el pedigrí del animal como
un indicador muy importante de su valor genético,
tomando en cuenta a sus progenitores como ejemplo del
potencial racial que adquieren e invirtiendo grandes
sumas de dinero por aquellos que lo ameritan
Importancia de las Pruebas de paternidad Los errores de paternidad desvían los valores estimados de heredabilidad, valores genéticos, parámetros genéticos, predicciones de ganancia genética y por ende deprimen la tasa de progreso genético dada la selección errónea de los animales superiores. Ventajas:
* Certificación genética.
Evaluación de germoplasma y animales de
pie de cría, producto de inseminación artificial.
* Control genético.
Caracterización genética precisa del pedigrí de los animales
de registro en las Asociaciones Ganaderas
* Mejoramiento genético.
Determinación precisa del valor genético de los animales
dentro de un hato.
ASIGNACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PATERNIDAD
EN UN HATO DE GANADO CHAROLAIS
32 familias
3 Padres candidatos
Inseminación Artificial
Genotipificación con
10 microsatelites
27
38-H 3-02
233
285
129
210
301
231
145
80
140
148
132
149
291
42-02
66-02
39-02
27-02
17-02
210
32-02
36-02
37-02
29-02
74-01
45-02
16-01
75-01
24-02
294
43-9
72-02
207
231
253
18
17-02
141
73-02
94-02 60-01
21-02
250-I 209
60-02
154
22-02 23-02 65-02
Linajes encontrados en un hato de ganado Charolais
PATERNIDAD %
38-H 65%
43-99 22 %
250-I 13 %
I. A. 3 EXCLUSIONES X
38-H
OBSERVACIONES:
Dominancia del semental 38-H
Verificación de paternidad por inseminación
artificial
38-H
231
145
80
140
148
132
149
291
66-02
39-02
27-02
17-02
37-02
16-01
75-01
24-02
En un reciente análisis asignando paternidad con un panel de SNP’s, se encontró un 33% de error en la asignación de paternidad en toda la población estudiada. Para los hatos de Nuevo León los porcentajes de error en la verificación de paternidad fueron del 0 al 19%, en Sonora del 11% y en Tamaulipas del 37%. Para poner en contexto este resultado se ha reportado que en bovinos de leche (donde la inseminación artificial es el principal método reproductivo) los porcentajes de error en la asignación de la paternidad de los individuos pueden alcanzar el 11.7% siendo las principales causas, errores en la identificación de las pajillas de semen así como errores humanos en el registro del semen utilizado durante la inseminación.
Verificación de maternidad y paternidad
En México han existido diferentes iniciativas para la implementación de programas de verificación de paternidad, sin embargo es hasta este inicio del 2014 que se ha modificado el estatus de estas verificaciones y ahora son un requisito de registro de los animales. Esta nueva normativa es un gran paso para la ganadería en México, ya que el uso de las herramientas moleculares deberá ser de ahora en adelante no solo un requisito para la obtención de apoyos, sino también debería ser, si se dirige de manera ordenada y basada en los estándares internacionales (como por ejemplo iniciar con sistemas de identificación basados en SNPs mas que en microsatélites), una oportunidad para aterrizar y hacer uso de las ventajas de incluir estas tecnologías como apoyo de las estrategias de mejoramiento genético de los hatos de esta raza.
Perspectivas de la prueba en México
Diagnóstico Molecular de
enfermedades genéticas
En animales domésticos, actualmente, se conocen las
bases moleculares de un número creciente de
enfermedades hereditarias monogénicas, lo que hace
posible la detección molecular directa de los individuos
portadores.
Ibeagha-Awemu E et al.,2008
La detección de portadores hace posible su exclusión o
manejo adecuado dentro del hato y/o razas de ganado, de
tal manera que se logra mantener la salud y productividad
del mismo.
Artrogriposis Múltiple en el ganado Angus o síndrome de becerro contraído,
es una rara enfermedad congénita que causa múltiples contracturas y se
caracteriza por debilidad muscular y la fibrosis. En 2008, la asociación
Angus hizo un llamado de alerta ya que se detectó que sementales elite
eran portadores del gen asociado a este síndrome.
Diagnóstico molecular de portadores
El gen Miostatina como marcador de ADN
La “doble musculatura” o hipertrofia
muscular es una anomalía genética que ha
sido reconocida y seleccionada por los
criadores desde 1807.
DOBLE MÚSCULO
El fenotipo “doble-musculatura” se debe a un crecimiento
anormal del tejido muscular, que es causado enteramente por
un aumento del tamaño de las células existentes.
El crecimiento anormal en la hipertrofia muscular bovina
produce un aumento de la masa muscular en
aproximadamente un 20%.
Menor Fertilidad (dificultad
reproductiva)
Mayor Incidencia de distocia
(dificultades en parto)
Mayor Susceptibilidad a enf.
Respiratorias
Desventajas cardiovasculares
Fenotipo DM
selección positiva selección negativa Mayor masa muscular con menos
grasa
Reducción en el alimento ingerido
Aumento en conversión
alimenticia
Doble musculatura Normal
Arthur, 1995
Identificación del gen mh
McPherron et al., 1997, usando la técnica de "knock out" inactivaron el gen de la miostatina y en ratones de laboratorio (MSTN_GMO), obteniendo animales con un fenotipo similar a la doble musculatura bovina.
Esto permitió postular a la miostatina como el gen candidato para mh en bovinos
Conservación del gen MSTN en vertebrados
Raza de perros whippet
He mas rápidos que Ho
Oveja Texel
-Miostatina se ha analizado en más de 30 razas
bovinas.
Importancia de MSTN en la especie Bos
taurus
-Mutación o polimorfismo: hipertrofia, hiperplasia muscular, doble musculatura
- Productividad: Calidad y cantidad de musculatura
Diversidad alelica de MSTN Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura
Descripción Tipo de mutación Raza
inserción/deleción en la posición
418
Corrimiento en el marco
de lectura
Belgian blue,
Asturianas, Rubia
Gallega, Aubrac
transición C T en la posición
610
Sin sentido - terminación
prematura de la proteína Charoláis
transversión G T en la
posición 676
Sin sentido - terminación
prematura de la proteína
Maine-Anjou,
Parthenais
Deleción de 11 pb desde la
posición 821 hasta la 831
Corrimiento en el marco
de lectura - terminación
prematura de la proteína
Belgian blue,
Limousine, South
Devon, Asturiana de los
Valles
transición G A en la posición
938
Transversión consentido.
Cys Tyr en la proteina Piemontese, Gascon
Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales
transversión C A en la
posición 282
Mutación consentido. Phe
Leu en la proteina
Limousine, Aubrac,
Devon, Pirenaica
transición C T en la posición
414
Transición silente – sin
cambio en la proteína
Ampliamente
distribuida
Impacto de MSTN en el mercado de
carne
Gracias a un gen específico – una forma de
miostatina – natural en la raza Piedmontes, puedes
tener todos los beneficios nutricionales y el sabor
que es saludable, bajo en grasa, bajo en colesterol y
suave, siempre…
La Raza Charolais en México
Se rechaza la característica
de DM
Para manejar este problema,
se pueden utilizar estrategias
para identificar los portadores
del gen.
Detección de portadores de alelos asociados al
fenotipo mh
Homocigoto mh/mh Homocigoto +/+
Heterocigoto mh/+
Se ha realizado la prueba para detectar las variantes
del alelo Q204X en 44 muestras de semen
comercializado por la Asociación HerdBook de
México.
Se ha encontrado que la frecuencia del alelo Q204X
en 44 sementales que es del 17%.
Evaluación de la prevalencia del alelo
Q204X en ganado Charolais de México
Frecuencia del Alelo Q204X en hatos de registro
En un estudio realizado en dos hatos del estado de Jalisco, se ha encontrado
una frecuencia de 22.9% de portadores mh/+ (CT) y de homocigotos mh/mh
del 4.16% (TT).
El origen del material genético con el que se
mejoran los hatos se relaciona con su frecuencia.
*Crías probadas/hatos, Asociación Charolais HerdBook de México (2009)
IDENTIFICACIÓN DE LAS VIAS DE DISEMINACION
DEL ALELO Q204X
+/+
+/+
+/+
+/+
mh/+
+/+
+/+
+/+
+/+
NECESSAIRE mh/+
mh/+
+/+
+/+
MELLARD mh/+
+/+
+/+
+/+
mh/+
+/+
+/+
+/+
+/+
IMPERIAL +/+
mh/+
+/+
+/+
+/+ mh/+
+/+
ICARE mh/+
mh/+
+/+
IJOUFFLU
*221/12 *125/23
*496/65
*513/37
*58/4
mh/+
+/+
ICARE mh/+
+/+
+/+
mh/+
+/+
*496/65
Identificación de variantes génicas
asociadas a características
productivas
Es una herramienta que utiliza las pruebas de DNA para ajustar los valores genéticos (DEPs) de los animales medidos y genotipificados para un rasgo en particular para posteriormente usarlos en la selección
.
Selección asistida por marcadores (MAS)
(Van Eenennaam, 2007).
• Es aplicable para caracteres que:
• Tienen índice de herencia bajo (ej., resistencia a
enfermedades y reproducción)
• Son difíciles o costosos de medir
• El animal tiene que ser sacrificado para cuantificarlo
(canal, suavidad de la carne)
(Van Eenennaam, 2012).
Selección asistida por marcadores
(SAM)
Suavidad: SNPs del sistema proteolítico de la calpaína (CAPN1) y
calpastatina (CAST) sobre la suavidad de la carne de ganado Bos
taurus1 , ganado Bos indicus y sus cruzas.
(Page et al., 2002, 2004Casas et al., 2005; White et al., 2005).
Marcadores de ADN asociados a calidad de la carne
Marmoleo: SNP ubicado en la región 5’ no traducible del gen
tiroglobulina (a -521 pb) y se denomina marcador TG5.
Los rasgos de calidad como la suavidad, marmoleo, crecimiento, reproducción, etc. son muy complejos,
difícilmente son explicados por la variación en uno
o varios genes y por lo tanto el uso de pocos
marcadores no cubre el concepto de SAM.
Problemas en el uso de pocos marcadores Para SAM
Distribución de la varianza de los
factores que influyen en el FENOTIPO
Se han desarrollado “chips” de ADN que
permiten hacer pruebas de ADN no con uno
o varios marcadores sino con miles de ellos.
Con los “chips” se acelera el descubrimiento de
mutaciones causales que explican la variación genética entre razas
La selección Genómica Genomic selection (GS) es
un método para estimar los valores genéticos con
base a la tipificación del animal con un gran
número de marcadores moleculares.
Esto significa que a los métodos tradicionales que
incluyen la información del pedigrí y fenotipo de
un animal se le puede adicionar información que
permite estimar valores de cría basados y
ajustados con la información molecular.
Selección Genómica (SAM-
genómica)
3. Estimacion de EPDs para los rasgos nuevos (eficiencia, sanidad de del producto final, susceptibilidad a enfermedades)
¿Cuál es el valor de la integración de la información genómica en las Evaluaciones Genéticas?
La inclusión de información sobre los marcadores en los cálculos EPDs tiene los siguientes beneficios :
1. Una mayor precisión en la selección de los animales jóvenes
2. Acortamiento del Intervalo generacional
Van Eenennaam GeneSeek 9/12/2012
2003
• Un marcador/un rasgo
• Adopción limitada
2008 • Pruebas con diferentes
marcadores reportadas en diferentes formatos
• ningún vínculo entre los resultados de las pruebas de ADN y las asociaciones nacionales de evaluación genética o raza
2020
• presentación perfecta de los datos de genotipo a las asociaciones nacionales de evaluación genética / raza Información sobre el ADN utilizado para la trazabilidad, parentesco, defectos genéticos, selección, gestión asistida por marcadores, la diferenciación de productos
Modified from
EPDs-Potenciados por Genómica
“Genomic-enhanced EPDs”
2012
• paneles con miles de marcadores para muchos rasgos
• Resultados reportados en unidades para el rasgo
• Inclusión de la información de DNA en las evaluaciones genéticas nacionales
Evolución del diagnóstico molecular aplicado a la industria pecuaria
Las pruebas de ADN son una herramienta invaluable
para la detección de alelos asociados a enfermedades
genéticas y a rasgos de calidad y productividad. En el
primer caso, esta herramienta es útil para disminuir o
eliminar la frecuencia del alelo mutante; mientras que
en el segundo permite incrementar o fijar la
frecuencia de los alelos favorables para rasgos
productivos específicos en los hatos ganaderos.
Se propone que cada Asociación ganadera en México,
considere el uso de las herramientas de diagnóstico
molecular como una estrategia de monitoreo continuo
de la salud, productividad y calidad genética de los
hatos.
Conclusión
Gracias.