Aplicación de los Marcadores

moleculares en el área pecuaria:

avances, retos y perspectivas

Dra. Ana M. Sifuentes Rincón

Lab. de Biotecnología Animal

Centro de Biotecnología Genómica-IPN

¿Qué es la Biotecnología?

El desarrollo de bienestar y

servicios a partir del

conocimiento de los

genomas

Combinar los organismos vivos

o partes de éstos con tecnología

para producir o mejorar

productos.

Aplicaciones de la Biotecnología Animal

*Mejorar la productividad de los animales *Aplicaciones medicas para, producir proteinas valiosas en la leche, sangre u orina de los animales. *Desarrollar modelos animales de enfermedades del humano

- Desarrollo de Animales transgenicos para:

- Mejoramiento Genetico Asistido por marcadores

¿Porqué DNA?

Food Economics and Consumer Choice (Jeff Simmons, 2008)

• Prácticas: Hacerlas mejor

• Productos: Usar herramientas y tecnologías nuevas e innovadoras

• Genética: Incrementar los rasgos deseados en plantas y animales

La Genómica en los animales de importancia pecuaria

La industria pecuaria representa del 30–40% de las actividades agropecuarias

Los animales de granja representan una de las principales fuentes de proteina en

la dieta de los humanos

Desde el 2005 se iniciaron diferentes proyectos de secuenciación de los genomas de

los principales animales de granja que incluyen a los cerdos, bovinos, ovejas y pollos

Estrategias para el Mejoramiento

Genético

Registros

(Gen. y Prod).

Estimación

de Parám. Selección

EPD’s

Apareamientos

Técnicas

Reproductivas

Objetivos

de Selección

Kinghorn, B.P., Van der Werf, J. and Ryan, M. 2000

Mejoramiento

Animal

Tecnologías

moleculares

Bioinformática

Estructura

de

Población

¿Qué es un genoma? • El término “genoma” se usa para denotar la

totalidad de genes y cromosomas que se encuentran en el núcleo de una célula .

Análisis de genomas de especies

Uno de los principales objetivos del análisis de

los genomas de especies de interés pecuario es

encontrar aquellas variaciones en la secuencia

de ADN que explique los cambios fenotípicos.

El genoma del bovino

Tipos de variación en la secuencia de

DNA

- Diferencias en el número de copias de secuencias repetitivas

Secuencias de DNA repetido en tandem:

DNA minisatélite (VNTRs)

Microsatélites (repeticiónes cortas de di-,tri-, tetra-

nucleotidos)

- Inserciónes/Deleciones

- Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)

MARCADORES DE ADN

A G A A T C T G A A T.T G A A C A C T C

A G A A T G T G A A T.T G A A C A T T C

Variantes alélicas o

génicas

Es una región especifica del DNA donde se han

encontrado variaciones que se asocian con efectos

positivos o negativos en una característica de interés.

Dura suave dura suave

G

|

T

C

|

C

316

4751

G

|

T

C

|

C

316

4751

316 4751

Es un análisis en el que por medio

de marcadores de ADN se determina

en un animal , de cual o cuales

variantes génicas es portador

Pruebas de ADN

Las pruebas de ADN en animales, tienen una amplia gama de aplicaciones y específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para: Identificación de individuos Diagnóstico de enfermedades genéticas reconstrucción de linajes estimaciones de consanguinidad Casos forenses Estudios de trazabilidad

Diagnóstico molecular en ganado bovino

IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS

Las pruebas de paternidad es un análisis que han tenido

mucho impacto en la industria pecuaria.

Específicamente en bovinos se utilizan rutinariamente para:

Determinación de paternidad cuando un animal cambia o

intercambia su progenie con otra madre

En la determinación de paternidad cuando una hembra

se aparea por empadre múltiple

verificación de registros de hato

Pruebas de paternidad

Durante las últimas dos décadas los marcadores microsatélites han sido los

marcadores de elección para los análisis de paternidad/identidad y

trazabilidad en animales y humanos, sin embargo, los resultados obtenidos

con estos marcadores entre los diferentes laboratorios no son siempre

comparables debido a las dificultades técnicas para su análisis,

principalmente los errores en la determinación de los tamaños alélicos.

Pruebas de paternidad

Los SNPs son el tipo más común de variación genética y son los marcadores mas populares para los diferentes estudios de

genómica en bovinos

Los SNPs son mutaciones de un solo par de bases en un locus específico, por lo general constan de dos alelos donde la

frecuencia del alelo mas raro es ≥ 1% (MAF).

Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)

Aunque en términos de informatividad los SNPs podrían ser

considerados no tan óptimos (son bialélicos) comparados con los

microsatelites, presenta las siguientes características:

Amplia abundancia

Estabilidad en mamíferos, baja tasa de mutación (108) en

comparación con los microsatelites (103)

nomenclatura mas simple,

posibilidades de automatización del proceso de tipificación y de

interpretación de los datos.

Los SNPs son también ampliamente usados para el descubrimiento

de QTLs y en los estudios de asociación de genes con rasgos

productivos específicos

Ventajas de los SNPs como marcadores para pruebas de paternidad

Un paso esencial en las estrategias de

mejoramiento genético es la selección de los

animales con mayor mérito genético.

¿Porqué verificar el pedigrí de los

hatos?

Actualmente los valores genéticos son expresados en

forma de Diferencia Esperada en la Progenie y es la forma

más exacta de analizar la productividad de un animal

y/o un hato y por lo tanto es utilizada como una

herramienta muy útil en las desiciones de selección

Los productores consideran el pedigrí del animal como

un indicador muy importante de su valor genético,

tomando en cuenta a sus progenitores como ejemplo del

potencial racial que adquieren e invirtiendo grandes

sumas de dinero por aquellos que lo ameritan

Importancia de las Pruebas de paternidad Los errores de paternidad desvían los valores estimados de heredabilidad, valores genéticos, parámetros genéticos, predicciones de ganancia genética y por ende deprimen la tasa de progreso genético dada la selección errónea de los animales superiores. Ventajas:

* Certificación genética.

Evaluación de germoplasma y animales de

pie de cría, producto de inseminación artificial.

* Control genético.

Caracterización genética precisa del pedigrí de los animales

de registro en las Asociaciones Ganaderas

* Mejoramiento genético.

Determinación precisa del valor genético de los animales

dentro de un hato.

ASIGNACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PATERNIDAD

EN UN HATO DE GANADO CHAROLAIS

32 familias

3 Padres candidatos

Inseminación Artificial

Genotipificación con

10 microsatelites

27

38-H 3-02

233

285

129

210

301

231

145

80

140

148

132

149

291

42-02

66-02

39-02

27-02

17-02

210

32-02

36-02

37-02

29-02

74-01

45-02

16-01

75-01

24-02

294

43-9

72-02

207

231

253

18

17-02

141

73-02

94-02 60-01

21-02

250-I 209

60-02

154

22-02 23-02 65-02

Linajes encontrados en un hato de ganado Charolais

PATERNIDAD %

38-H 65%

43-99 22 %

250-I 13 %

I. A. 3 EXCLUSIONES X

38-H

OBSERVACIONES:

Dominancia del semental 38-H

Verificación de paternidad por inseminación

artificial

38-H

231

145

80

140

148

132

149

291

66-02

39-02

27-02

17-02

37-02

16-01

75-01

24-02

En un reciente análisis asignando paternidad con un panel de SNP’s, se encontró un 33% de error en la asignación de paternidad en toda la población estudiada. Para los hatos de Nuevo León los porcentajes de error en la verificación de paternidad fueron del 0 al 19%, en Sonora del 11% y en Tamaulipas del 37%. Para poner en contexto este resultado se ha reportado que en bovinos de leche (donde la inseminación artificial es el principal método reproductivo) los porcentajes de error en la asignación de la paternidad de los individuos pueden alcanzar el 11.7% siendo las principales causas, errores en la identificación de las pajillas de semen así como errores humanos en el registro del semen utilizado durante la inseminación.

Verificación de maternidad y paternidad

En México han existido diferentes iniciativas para la implementación de programas de verificación de paternidad, sin embargo es hasta este inicio del 2014 que se ha modificado el estatus de estas verificaciones y ahora son un requisito de registro de los animales. Esta nueva normativa es un gran paso para la ganadería en México, ya que el uso de las herramientas moleculares deberá ser de ahora en adelante no solo un requisito para la obtención de apoyos, sino también debería ser, si se dirige de manera ordenada y basada en los estándares internacionales (como por ejemplo iniciar con sistemas de identificación basados en SNPs mas que en microsatélites), una oportunidad para aterrizar y hacer uso de las ventajas de incluir estas tecnologías como apoyo de las estrategias de mejoramiento genético de los hatos de esta raza.

Perspectivas de la prueba en México

Diagnóstico Molecular de

enfermedades genéticas

En animales domésticos, actualmente, se conocen las

bases moleculares de un número creciente de

enfermedades hereditarias monogénicas, lo que hace

posible la detección molecular directa de los individuos

portadores.

Ibeagha-Awemu E et al.,2008

La detección de portadores hace posible su exclusión o

manejo adecuado dentro del hato y/o razas de ganado, de

tal manera que se logra mantener la salud y productividad

del mismo.

Artrogriposis Múltiple en el ganado Angus o síndrome de becerro contraído,

es una rara enfermedad congénita que causa múltiples contracturas y se

caracteriza por debilidad muscular y la fibrosis. En 2008, la asociación

Angus hizo un llamado de alerta ya que se detectó que sementales elite

eran portadores del gen asociado a este síndrome.

Diagnóstico molecular de portadores

El gen Miostatina como marcador de ADN

La “doble musculatura” o hipertrofia

muscular es una anomalía genética que ha

sido reconocida y seleccionada por los

criadores desde 1807.

DOBLE MÚSCULO

El fenotipo “doble-musculatura” se debe a un crecimiento

anormal del tejido muscular, que es causado enteramente por

un aumento del tamaño de las células existentes.

El crecimiento anormal en la hipertrofia muscular bovina

produce un aumento de la masa muscular en

aproximadamente un 20%.

Menor Fertilidad (dificultad

reproductiva)

Mayor Incidencia de distocia

(dificultades en parto)

Mayor Susceptibilidad a enf.

Respiratorias

Desventajas cardiovasculares

Fenotipo DM

selección positiva selección negativa Mayor masa muscular con menos

grasa

Reducción en el alimento ingerido

Aumento en conversión

alimenticia

Doble musculatura Normal

Arthur, 1995

Identificación del gen mh

McPherron et al., 1997, usando la técnica de "knock out" inactivaron el gen de la miostatina y en ratones de laboratorio (MSTN_GMO), obteniendo animales con un fenotipo similar a la doble musculatura bovina.

Esto permitió postular a la miostatina como el gen candidato para mh en bovinos

Conservación del gen MSTN en vertebrados

Raza de perros whippet

He mas rápidos que Ho

Oveja Texel

-Miostatina se ha analizado en más de 30 razas

bovinas.

Importancia de MSTN en la especie Bos

taurus

-Mutación o polimorfismo: hipertrofia, hiperplasia muscular, doble musculatura

- Productividad: Calidad y cantidad de musculatura

Diversidad alelica de MSTN Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura

Descripción Tipo de mutación Raza

inserción/deleción en la posición

418

Corrimiento en el marco

de lectura

Belgian blue,

Asturianas, Rubia

Gallega, Aubrac

transición C T en la posición

610

Sin sentido - terminación

prematura de la proteína Charoláis

transversión G T en la

posición 676

Sin sentido - terminación

prematura de la proteína

Maine-Anjou,

Parthenais

Deleción de 11 pb desde la

posición 821 hasta la 831

Corrimiento en el marco

de lectura - terminación

prematura de la proteína

Belgian blue,

Limousine, South

Devon, Asturiana de los

Valles

transición G A en la posición

938

Transversión consentido.

Cys Tyr en la proteina Piemontese, Gascon

Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales

transversión C A en la

posición 282

Mutación consentido. Phe

Leu en la proteina

Limousine, Aubrac,

Devon, Pirenaica

transición C T en la posición

414

Transición silente – sin

cambio en la proteína

Ampliamente

distribuida

Impacto de MSTN en el mercado de

carne

Gracias a un gen específico – una forma de

miostatina – natural en la raza Piedmontes, puedes

tener todos los beneficios nutricionales y el sabor

que es saludable, bajo en grasa, bajo en colesterol y

suave, siempre…

La Raza Charolais en México

Se rechaza la característica

de DM

Para manejar este problema,

se pueden utilizar estrategias

para identificar los portadores

del gen.

Detección de portadores de alelos asociados al

fenotipo mh

Homocigoto mh/mh Homocigoto +/+

Heterocigoto mh/+

Se ha realizado la prueba para detectar las variantes

del alelo Q204X en 44 muestras de semen

comercializado por la Asociación HerdBook de

México.

Se ha encontrado que la frecuencia del alelo Q204X

en 44 sementales que es del 17%.

Evaluación de la prevalencia del alelo

Q204X en ganado Charolais de México

Frecuencia del Alelo Q204X en hatos de registro

En un estudio realizado en dos hatos del estado de Jalisco, se ha encontrado

una frecuencia de 22.9% de portadores mh/+ (CT) y de homocigotos mh/mh

del 4.16% (TT).

El origen del material genético con el que se

mejoran los hatos se relaciona con su frecuencia.

*Crías probadas/hatos, Asociación Charolais HerdBook de México (2009)

IDENTIFICACIÓN DE LAS VIAS DE DISEMINACION

DEL ALELO Q204X

+/+

+/+

+/+

+/+

mh/+

+/+

+/+

+/+

+/+

NECESSAIRE mh/+

mh/+

+/+

+/+

MELLARD mh/+

+/+

+/+

+/+

mh/+

+/+

+/+

+/+

+/+

IMPERIAL +/+

mh/+

+/+

+/+

+/+ mh/+

+/+

ICARE mh/+

mh/+

+/+

IJOUFFLU

*221/12 *125/23

*496/65

*513/37

*58/4

mh/+

+/+

ICARE mh/+

+/+

+/+

mh/+

+/+

*496/65

Identificación de variantes génicas

asociadas a características

productivas

Es una herramienta que utiliza las pruebas de DNA para ajustar los valores genéticos (DEPs) de los animales medidos y genotipificados para un rasgo en particular para posteriormente usarlos en la selección

.

Selección asistida por marcadores (MAS)

(Van Eenennaam, 2007).

• Es aplicable para caracteres que:

• Tienen índice de herencia bajo (ej., resistencia a

enfermedades y reproducción)

• Son difíciles o costosos de medir

• El animal tiene que ser sacrificado para cuantificarlo

(canal, suavidad de la carne)

(Van Eenennaam, 2012).

Selección asistida por marcadores

(SAM)

Suavidad: SNPs del sistema proteolítico de la calpaína (CAPN1) y

calpastatina (CAST) sobre la suavidad de la carne de ganado Bos

taurus1 , ganado Bos indicus y sus cruzas.

(Page et al., 2002, 2004Casas et al., 2005; White et al., 2005).

Marcadores de ADN asociados a calidad de la carne

Marmoleo: SNP ubicado en la región 5’ no traducible del gen

tiroglobulina (a -521 pb) y se denomina marcador TG5.

Los rasgos de calidad como la suavidad, marmoleo, crecimiento, reproducción, etc. son muy complejos,

difícilmente son explicados por la variación en uno

o varios genes y por lo tanto el uso de pocos

marcadores no cubre el concepto de SAM.

Problemas en el uso de pocos marcadores Para SAM

Distribución de la varianza de los

factores que influyen en el FENOTIPO

Se han desarrollado “chips” de ADN que

permiten hacer pruebas de ADN no con uno

o varios marcadores sino con miles de ellos.

Con los “chips” se acelera el descubrimiento de

mutaciones causales que explican la variación genética entre razas

La selección Genómica Genomic selection (GS) es

un método para estimar los valores genéticos con

base a la tipificación del animal con un gran

número de marcadores moleculares.

Esto significa que a los métodos tradicionales que

incluyen la información del pedigrí y fenotipo de

un animal se le puede adicionar información que

permite estimar valores de cría basados y

ajustados con la información molecular.

Selección Genómica (SAM-

genómica)

3. Estimacion de EPDs para los rasgos nuevos (eficiencia, sanidad de del producto final, susceptibilidad a enfermedades)

¿Cuál es el valor de la integración de la información genómica en las Evaluaciones Genéticas?

La inclusión de información sobre los marcadores en los cálculos EPDs tiene los siguientes beneficios :

1. Una mayor precisión en la selección de los animales jóvenes

2. Acortamiento del Intervalo generacional

Van Eenennaam GeneSeek 9/12/2012

2003

• Un marcador/un rasgo

• Adopción limitada

2008 • Pruebas con diferentes

marcadores reportadas en diferentes formatos

• ningún vínculo entre los resultados de las pruebas de ADN y las asociaciones nacionales de evaluación genética o raza

2020

• presentación perfecta de los datos de genotipo a las asociaciones nacionales de evaluación genética / raza Información sobre el ADN utilizado para la trazabilidad, parentesco, defectos genéticos, selección, gestión asistida por marcadores, la diferenciación de productos

Modified from

EPDs-Potenciados por Genómica

“Genomic-enhanced EPDs”

2012

• paneles con miles de marcadores para muchos rasgos

• Resultados reportados en unidades para el rasgo

• Inclusión de la información de DNA en las evaluaciones genéticas nacionales

Evolución del diagnóstico molecular aplicado a la industria pecuaria

Las pruebas de ADN son una herramienta invaluable

para la detección de alelos asociados a enfermedades

genéticas y a rasgos de calidad y productividad. En el

primer caso, esta herramienta es útil para disminuir o

eliminar la frecuencia del alelo mutante; mientras que

en el segundo permite incrementar o fijar la

frecuencia de los alelos favorables para rasgos

productivos específicos en los hatos ganaderos.

Se propone que cada Asociación ganadera en México,

considere el uso de las herramientas de diagnóstico

molecular como una estrategia de monitoreo continuo

de la salud, productividad y calidad genética de los

hatos.

Conclusión

Gracias.