FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN

Post on 12-Jan-2016

79 views 0 download

description

FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN. Carole Bernard Lorena Gómez Carolina Nuñez Lourdes Sanchez-Cid. INTRODUCCIÓN. Flavodoxin-like domain Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores. - PowerPoint PPT Presentation

Transcript of FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN

FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN

Carole Bernard

Lorena Gómez

Carolina Nuñez

Lourdes Sanchez-Cid

INTRODUCCIÓN

Flavodoxin-like domain

•Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores.

•Las proteínas flavodoxinas (compuesta únicamente por el dominio flavodoxina) solo se encuentran en organismos unicelulares (son proteínas altamente ácidas) sin embargo el dominio flavodoxina se encuentra en proteínas multidominio de eucariotas superiores.

•Ninguna flavodoxina ha sido encontrada en eucariotas superiores, pero la habilidad del producto del gen flavodoxina para unir FMN y participar en reacciones de transferencia de electrones parece que ha sido muy útil para organismos superiores que, a través de eventos de fusión génica, lo han incorporado en proteínas multidominio como la reductasa P450, y la sulfito reductasa, donde la secuencia original flavodoxina y el plegamiento pueden ser trazados claramente.

•Función : unión de flavinas (FMN, FAD) con actividad oxidorreductasa implicadas en el transporte de electrones. (ej: reacciones de fotosíntesis, detoxificación de xenobióticos...)

•Esenciales para la supervivencia de algunos patógenos humanos buenas dianas terapéuticas?

ROSSMAN-FOLD

• Motivo estructural de proteínas de unión a mono/dinucleótidos : NAD, FAD, FMN.

• Lámina compuesta de 5 cadenas paralelas (core central) envuelta por ambos lados por hélices alfa. Las hélices conservadas son 4 : 2 a cada lado y de larga longitud. Pueden haber otras hélices accesorias.

• Estructura en 3 capas / / .

“core” central lámina beta (cinco cadenas betas paralelas)

Hélices alfa (dos largas a cada cara de la lamina beta )

•El centro activo de las flavodoxinas se encuentra según el diagrama de la topología en el “topological switch point” que es donde se une al FMN de cara a su actividad redox

Punto topológico de cambio de orientación

FMN : Mononucleótido de Flavina

N3 N5

N1N10

02

04

CH3

CH3

P032-

Cadena

ribitil

Anillo isoaloxacina

FAD : Dinucleótido de Flavina Adenina

Adenina

Anillo de isoaloxacine

Cadena ribitil

Comparación de proteínas con plegamiento

“flavodoxin-like”de diferentes

SUPERFAMILIAS

Superfamilias / Familia / Proteína /Especie

1. Flavoproteins / Flavodoxin-related / Flavoprotein / Anabaena

2. SGNH hydrolase / Esterase / Esterase / Streptomyces scabies

3. Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase, alpha-chain, C-terminal domain / Escherichia coli

4. Che Y-like / Che Y-related / Che Y-protein / Thermotoga maritima

5. Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll-like receptor 1, TLR1 / Homo sapiens

CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES:

NO SE PARECEN EN SECUENCIA

LOW SCORE

RMS ALTO

NO SE PARECEN EN ESTRUCTURA (STAMP)

ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES COMPARTEN EL TIPO DE PLEGAMIENTO PERO NO SUELEN TENER SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ. ESTAS PROTEÍNAS TAMPOCO COMPARTEN FUNCIÓN Y ALGUNAS NO TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN.

Comparación de

proteínas con

dominio flavodoxina

de diferentes

FAMILIAS

Familia / Proteína /Especie

1. Flavodoxin-related / Flavodoxin / Escherichia coli

2. NADPH-cytochrome p450 reductase FAD-binding domain-like /NADPH-cytochrome p450 reductase / Rattus norvegicus

3. Quinone reductase / NAD(P)H:quinone reductase / Homo sapiens

4. Flavoprotein NrdI / Flavoprotein NrdI / Bacillus subtilis

CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES:

SE PARECEN POCO EN SECUENCIA (clustalw)

RMS MEDIO

RMS : +/- 3.14 A

DIFIEREN EN ESTRUCTURA PERO TIENEN UNA SUPERPOSICIÓN ACEPTABLE

ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES NO SUELEN TENER UNA GRAN SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ, PERO COMPARTEN MÁS SIMILARIDAD DE ESTRUCTURA.

FUNCIÓN DIFERENTE PERO TODAS TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN O EL FAD.

Familia “FLAVODOXINA – RELATED”

Toda la proteina está formada por un único dominio (dominio flavodoxina)

Proteinas de esta familia son perteneceintes a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas

Función: intervienen en procesos biológicos de transferencia de electrones

Cofactor (FMN) : unen FMN con actividad oxido reductasa, funciona como grupo redox

Actúan como mediadores redox en el metabolismo Intercambibles en su mayoría por ferrodoxinas

Especialmente importantes en la activación de sistemas enzimáticos donde se requieren donadores de electrones

(reacciones flavodoxinas dependientes)

Proteinas de transferencia de electrones

FMN coenzima del grupo prostético de varias flavoproteinas oxido-recutasas.

Familia de Cytochrome p450 reductase N-terminal domain-like

1)      NADPH-cytochrome p450 reductase, N-terminal domain-like (homo sapiens)

•Función: proteína donadora de electrones para varias enzimas oxigenasas como el citocromo P450, enzimas involucradas en el metabolismo de muchos fármacos y en la síntesis de hormonas esteroideas. 

2)     Nitric oxide (NO) synthase FMN domain (rattus norvegicus)

•Función: formación de NO por oxidación de la L-arginina para la señalización y defensa celular. (transfiere electrones)

Proteínas multidominio (unión a FAD,FMN,NADH)

Superposición del dominio flavodoxina

Ejemplo: NITRIC-OXIDE

SYNTHASE REDUCTASE

Glu816

Arg1229

Interacción entre dominio de unión a FMN y FAD por puente salino.

Connecting-domain

Flexible hinge (bisagra)

Residuos no cristalizados

Beta-finger

(Beta-Hairpin)

FAD

FMN3,38 A

En esta posición el FMN esta completamente “sepultado” en la interfase de los dominios impidiendo el flujo de electrones del FMN al aceptor de electrones.

El “flexible hinge” sirve de pivot y le confiere movilidad conformacional al dominio de unión de FMN.

Esta flexibilidad rotacional tiene importantes implicaciones funcionales ya que es la clave del mecanismo de transferencia de electrones

.

Familia: Quinone reductasa

Protein domains:

- NAD(P)H quinone reductase (QR1)

- Quinone reductase type 2 (menandione reductase) (QR2)

- Enzimas citosólicas

-Expresión en corazón, músculo esquelético, hígado y riñon

- Función: reducción de compuestos quinólicos para protección celular. Mediante una reducción de 2e-

- QR1 sobreexpresión en tumores nuevos quimioterápicos

- Donador e- en QR1: NADH o NADPH

Donador e- en QR2: derivdados nicotinamida no P

QR1 vs. QR2

QR2 QR1

Dominio flavodoxina

QR1 QR2

Alineamiento secuencias (48,18% identidad)

Sc: 7.66 RMS:0.76

Tyr126 y 128

Vs.

Phe126 y Ile128

INTERACCIONES CON FAD

Leu103

3A

172,8º

Tyr104

QR1 Gln

2.07A

160.2ºPhe106

2.705A

167.1º

Trp105

Gly1502.74A

150.9º

Gly1493.2A

138.3º

Tyr155

3A

160º

2.47AH?

2.7A

144.2º

Thr147

His112.64A

125.4º

Asn182.7A

112.2º

Phe17

3.5A

112.5º

Arg200

4.47A

135.7º

Glu147

3.9A

148.8º

SITIO ACTIVO

Cambios conformacionales durante la catálisis (QR1)

FAD

Mecanismo de reducción quinones (QR1)

NAD(P)H

NAD(P)+

His161

Tyr155

Quinona HH

FADH2

H

Histidina 161 muy importante

Sin embargo, no esta conservada en QR2:

His161(aromático) Asn161(no aromático)

Mecanismo de reduccion de quinonas (QR2)

Cys222

ZN

Tyr132

His173

Asn161

Tyr155

FAD

Clase Alfa y beta (a/b)Dominio Flavodoxina: existen 15 superfamiliasSuperfamilia Flavoproteínas

“Flavodoxin-related” Cytocromo P450 reductasa Quinona reductasa NADPH-reductasa FMN dep. Flavoproteina NrdI

Clasificación

Familias

ANÁLISIS DE:

- Las regiones, residuos y tipo de interacciones que intervienen en la estabilización del FMN en las proteinas de diferentes familias (del dominio flavodoxina)

- si existe o no conservación en estas interacciones en las proteinas de cada familia y entre familias

- Conservación de secuencia (dentro de cada familia)

- Conservación de estructura (dentro de cada familia)

-Encontrar diferiencias entre familias

Familia 1) “Flavodoxin – related”

Hemos cogido cuatro proteínas flavodoxinas de diferentes especies

-1ahn E. Coli -2fcr Chondrus crispus -1fx1 Desulfobrivio vulgaris -1czn Anacistys nidulans

Toda la proteina es el dominio flavodoxina; pertenecen a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas

E.ColiEJEMPLO: FLAVODOXINA E. Coli

Metilos en contacto con el solvente asomando

Interacciones que intervienen en la estabilización del FMN en la especie E. Coli

Asn14

Thr15

Ser10

Asp11

Thr12

Gly13

Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato

OH del r O 1,2,3 del grupo P

NH (esqueleto o del r) PH

FLAVODOXINA E.Coli

Thr56

Trp57Tyr58

Tyr59

Loop 2 - int. hidrofóbicas

- Thr puente de hidrógeno con la cadena ribitil FLAVODOXINA E.Coli

169º 3,71A

180º2,69 A

oLoop 3 - int. hidrofóbicas - tyr 94 y tyr 97

Tyr94

Tyr97

FLAVODOXINA E.Coli

Sandwich - 2 trp y tyr en situación paralela estabilizan el anillo isoaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas

Tyr94

Trp57

FLAVODOXINA E.Coli

¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?

β αLOOP 1 LOOP 2

LOOP 3

FAMILIA “FLAVODOXINA-RELATED”

1ahn S D T G N T

2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T

1czn T Q T G V T

LOOP 1

1ahn T W Y Y

2cfr T W N T

1fx1 T W G D

1czn T W N V

LOOP 2

1ahn Y A E Y F

2cfr Y P D N F

1fx1 _ Y E Y F

1czn Y S D N F

LOOP 3

SANDWICH dos aa hidrofóbicos paralelos estabilizan el anillo isaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas. (TIROSIONA Y TRIPTÓFANO)

1ahn Y W 1fx1 W Y

2cfr Y W 1czn W Y

ALTA CONSERVACIÓN EN LAS REGIONES DE UNIÓN A FMN EN LAS 4 PROTEINAS DE MI FAMILIA

CONSERVACIÓN DE LOS TRES LOOPS. - AMINOÁCIDOS SON IDENTICOS - OTROS VARIAN PERO SON DEL

MISMO TIPO Y INTERACCIÓN

LOOP 1 (REGIÓN DE UNIÓN A PO3) ES LA MÁS INVARIABLE Y CONSERVADA DE TODAS DENTRO DE LAS FLAVODOXINAS. LAS INTERACCIONES CON EL ANILLO TIENEN MÁS VARIABILIDAD.

¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?

Porcentaje de identidad de secuencia

-menor (29,27%) 2fcr y 1akw

-mayor (45,51%) 1ahn y 1czna Media 37,94%

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?

SUPERPOSICIÓN

RMS 1,30

SCORE 7,88

ESTRUCTURA SE CONSERVA MÁS QUE LA SECUENCIA

Hemos cogido dos proteinas

1b1c humano (solo cristalizado el dominio flavodoxina)

1tll rata (multidominios)

Familia 2) Citocromo 450 reductasa N-terminal domain like

Ejemplo:

FMN-BINDING DOMAIN OF HUMAN CYTOCHROME P450 REDUCTASE

Interacciones que intervienen en la estabilización del FMN

Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato

Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato

Ser 26

2,5 A

107º

Gln27

2,68 A

157º

2,8A 2,5A

Thr 28

123º

Asn 115

His 120

Gly 81

Asn 122

FMN

Loop 3 aa polares hacen puentes de hidrógeno con el grupo isoaloxacina

Gly81

FMN

3,04 A

3,80A

115º

150º

3,18 A

2,96A

Asn115

FMN

115º

130º

2,87AFMN

His120

129º

Asn122

FMN

2,9A

134º

Tyr80

Tyr118

Sandwich 2 aa hidrofóbicos estabilizan el anillo isoaloxacina (interacciones hidrofóbicas) paralelos al anillo

Asp148

Oxigeno 4Oxigeno 3

Oxigeno 3Oxigeno 4

Asp148

Asp 147 y 149

¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?

¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LA ANTERIOR?

LOOP 1

LOOP 2

LOOP 3

TRES LOOPS

Loop 1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con el grupo fosfato. Conservación entre proteinas de esta familia y con la familia 1) flavodoxina-related

1ahn S D T G N T

2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T

1czn T Q T G V T

1b1c S Q T G T A

1tll T E T G K S

Familia 1

Familia 2

Conservación dentro y entre las dos familias

PUENTES DE HIDRÓGENO CON EL GRUPO FOSFATO (PO3)

Loop 2) treonina que interacciona haciendo puente de hidrógeno con la cadena ribitil y aa hidrofóbico que forman parte del sandwich

1ahn T W Y Y

2cfr T W N T

1fx1 T W G D

1czn T W N V

1b1c T Y

1tll T F

Sandwich

Conservación dentro y entre las dos familias

T hace puente de hidrógeno con O de la cadena ribitil

Loop 3) aa hidrofóbico que forma el sandwich y aa polares que interaccionan con el anillo isoaloxacina mediante puente de hidrógeno

1ahn Y A E Y F

2cfr Y P D N F

1fx1 _ Y E Y F

1czn Y S D N F

1b1c N K T Y E H F N

1tll S R A Y P H F C

Aa hidrofóbico que forma parte del sandwichPH con el anillo

isoaloxacina

PH con el anillo isoaloxacina

DIFERENCIAS ENTRE FAMILIA 1 Y 2

AA ACIDOS (-) AA BASICOS (+)

BASICOS +

ACIDOS -

BASICOS +

>15 A

FUERTE MOMENTO DIPOLAR

Cluster 2

(Aspárticos) Cluster 1

(Glu + Asp)

Cluster3 (Glu+ Asp)

Distribución de cargas mixtas

¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?

Porcentaje de identidad de secuencia 35,71 %-

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?

SUPERPOSICIÓN

RMS 1,03

SCORE 7,02

Familia 3) Quinona reductasa

Hemos cogido dos proteinas

Un único dominio de unión a FAD

1QR2 humano

1D4A humano

EJEMPLO

EJEMPLO QUINONA REDUCTASA HUMANA TIPO 2

Interacciones que intervienen en la estabilización del FAD (solo FMN)

His112.64A

125.4º

Asn182.7A

112.2º

Loop 1 y cadena alfa aa polares hacen puente de hidrógeno con el grupo fosfato

Leu103

3A

172,8º

Tyr104

QR2 Gln

Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)

2.07A

160.2ºPhe106

2.705A

167.1º

Trp105

Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)

Gly1502.74A

150.9º

Gly1493.2A

138.3º

Loop 3) aa hacen puentes de hidrógeno con el anillo isoaloxacina

2.47AH?

2.7A

144.2º

Thr147

Loop 3) thr hace puente de hidrógeno con la cadena ribitil

Tyr155

3A

160º

Loop 4) tyr hace puente de hidrógeno con O del anillo isoaloxacina

¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?

¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LAS DOS ANTERIORES?

Loop 1 alfa

Loop 2 Loop 3

Loop 4

¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

Porcentaje de identidad de secuencia 48,18 %-

¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?

SUPERPOSICIÓN

RMS 0,76

SCORE 7,66

CONCLUSIONES

Conservación a nivel de secuencia en las tres familias (identidad 35,71 - 48,18 %)

Conservación a nivel de estructura en las tres familias

RMS ( 0,76 - 1,30)

“La estructura se conserva más que la secuencia” diferentes tipo de aa dan mismo plegamiento”

Interacciones de unión a FMN

-alta conseración dentro de cada familia

-alta conservación entre familias flavodoxina-related y familia citocromo p450 (las dos unen FMN)

- NO existe conservación en la familia quinona reductasa con las anteriores. Hipótesis unión a una flavina diferente FAD

- la familia citocromo p450 presenta una conservación de residuos cargados ausente en las demás familias. Hipótesis importancia de estos residuos en la interacción entre dominios, (proteinas multidominios)

FLAVOPROTEÍNAS CON FMN OXIDADO Y REDUCIDO

Gly 89

Trp 90

Gly 91

Met 56Gly 57

Asp 58

Glu 59

UPPER LOOP

LOWER LOOP

ANILLO ISOALOXAZINA

MET 56

TRP 90

ANILLO ISOALOXAZINA

Asn 11

O’4

O’2

Ala 55

CADENA RIBITIL

Asn 11O’2

Ala 55

O’4

Asn 11

O’4

CADENA RIBITIL

2,69 Å

135,7º

3,24Å

150,14º

Thr 9Gly 10

Asn 11

Thr 12

Gly 8

Ser 7

PO3-

GRUPO FOSFATO

PO32-

Ser 7

NO PUENTE H

O2

2,7 Å109,7 ºC

Gly 8

3,83 Å

135,5º

O2PUENTE H

O3

2,54Å

146,2º

Thr 9

PUENTE H

2,54 Å

146,2º

Gly 10

O3

PUENTE H

2,95 Å

123,5º

Asn 113,02Å

114,5º

O3

NO PUENTE H

2,93Å

137,3ºPUENTE H

Thr 12

O2

Asn 11

Trp 90

Asp 58

Gly 57Met 56

Met 56Gly 57

Asp 58

Asn 11

Trp 90

STAMP

  FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

MET 56    

C - C - C - N -72,4 -70,1

S - C - C - C -60,1 -67,8

C - S - C - C 114,7 -64,7

ÁNGULOS DIEDROS

ÁNGULOS DIEDROS

ASP 58 FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N -159,3 -176,7

O1 - C - C - C 63,5 23,2

O2 - C - C - C -94,2 -156,9

ÁNGULOS DIEDROS

TRP 90 FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N 55,3 51,2

C1 - C - C - C 83,1 79,7

N1 - C1 - C - C -178,9 179,5

ÁNGULOS DIEDROS

ASN 11 FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N -66,1 -63,6

O1 - C - C - C -21,4 158,4

N2 - C - C - C 156,2 -22,1

DIFERENCIAS EN LAS INTERACCIONES ENTRE FMN

OXIDADO Y REDUCIDO

Asp 58

Gly 57

CONFORMACIÓN TRANS-O-DOWN

FMN OXIDADO

Gly 57

Asp 58FMN REDUCIDO

CONFORMACIÓN TRANS-O-UP

Met 56

FMN OXIDADO

Met 56

FMN REDUCIDO

FMN OXIDADO

Trp 90 Trp 90

FMN REDUCIDO

125,5º 130,7º

FMN OXIDADO

O’4

Asn 11

2,69A

135,7º

NO PUENTE H

Asn 11 FMN REDUCIDO

NO PUENTE H

Asn 11 FMN REDUCIDO

FLAVOPROTEÍNA CON FMN VS SIN FMN

Thr 10 – Gly13

Gly 27 – Val 30

Pro 55 – Gln 63

Leu 133 – Phe 138

CON/SIN LIGANDO

Todos polares

Alternan polares e hidrofóbicos

2 HIDROFÓBICOS FLANQUEAN 2 BÁSICOS Y ÉSTOS A 2 POLARES CENTRALES

Relación estructura-función

El plegamiento del dominio permite la unión de cofactores que son donadores y aceptores de

electrones. El FMN además de poder unirse, es estabilizado por la gran cantidad de puentes de hidrógeno y de interacciones hidrofóbicas que

puede establecer gracias a la repetitiva presencia de anillos aromáticos. Éstos

proporcionan una deslocalización electrónica eficaz, sin la cual no podrían transferir electrones

y ejercer así su función de transportadores de éstos.

Bibliografía1) Ludwig, M L., (1996) Control of Oxidation-Reduction Potencials in Flavodoin from

Clostridium beijerinckii: The Role of Conformation Changes.

2) Frazao, C., Silva G. Structure of a dioxygen reduction enzyme from Desulfovibrio gigas

3) Faig, M., Bianchet. M.A (1999) Structures of recombinant human and mouse NAD(P)H: quinone oxidoreductases: Species comparison and structural changes with substrate and release (1999)

4) Sevrioukova, I.F., Li, H., (1998) Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex

5) Ludwig, M L, Andersen, R.D. (1969) The Structure of a Clostridial Flavodoxin

6) Sibille, N., Blackledge, M., (2005) Solution Structure of the Sulfite Reductase Flavodoxin-like Domain from Escherichia coli

7) Hubbard, P.A., Shen, A.L., (2001) NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase, structural basis for hybride nd electron transfer

8) Burnett, R.M., Darling, G.D., (1973) Structure of the Oxidized Form of Clostridial Flavodoxin at 1.9A Resolution

9) Foster, C.E., Bianchet, M.A., (1999) Crystal Structure of Human Quinone Reductase Type 2, a Metalloflavoprotein,

10) Grandori, R.,Khalifah, P. (1997) Biochemical Characterization of WrbA, Founding Member of a New Family of Multimeric Flavodoxin-like Proteins.

PEM1. Sobre les proteïnes flavodoxines, quines respostes son verdaderes?

a) Les proteïnes flavodoxines no es troben en eucariotes superiors.

b) El domini flavodoxina no es troba en organismes procariotes.

c) Les dos anteriors.

d) Uneixen mononucleòtids d’adenina.

e) Totes les anteriors.

2. Sobre el plegament de Rossman, quines respostes son certes?

a) És un plegament format per 5 làmines β paral·leles (core central) envoltada pels dos costats d’hèlix α.

b) És un motiu estructural de proteïnes d’unió a ATP, ADP i AMP.

c) Les dos anteriors.

d) Té una estructura de 3 capes α/ β /α.

e) Totes les anteriors.

3. Senyala la resposta verdadera sobre el FMN:

a) Té un dimetil benzè formant part del anell isoaloxacina.

b) La cadena ribitil és un sucre que uneix l’anell d’isoaloxacina i un grup fosfat.

c) Els N3 i N10 no poden participar en la formació de ponts d’hidrogen.

d) El grup fosfat es troba a uns 8.5 Amstrongs de l’anell d’isoaloxacina.

e) Totes les anteriors.

4. Senyala les verdaderes:

a) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like presenten sempre un domini d’unió a FMN.

b) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like no tenen per què tenir la mateixa funció.

c) Existeix una similaritat de seqüència acceptable entre les diferents superfamílies.

d) Les proteïnes de famílies diferents sempre tenen un domini d’unió a FMN o FAD i la mateixa funció.

e) Totes les anteriors.

5. En la proteïna Nitric-oxide synthase reductase de la superfamília de les flavoproteïnes,

a) Existeix un connecting domain amb regions específiques amb importants implicacions funcionals.

b) El “flexible hinge” confereix mobilitat al domini d’unió a FMN.

c) Les dos anteriors son certes.

d) Les regions específiques son el β finger (que és un β-propeller) i un “flexible hinge”.

e) Totes les anteriors son certes.

6. En relació amb les proteïnes QR1 i QR2 de la família Quinone reductase,

1) QR1 i QR2 s’uneixen tant a FAD com a FMN.

2) QR1 presenta un domini C-terminal, no present en QR2, important per la unió a NAD(P)H/NADH.

3) QR1 i QR2 son heterodímers.

4) L’alineament de les seves seqüències presenta un 48.18% d’identitat.

a) 1, 2, 3

b) 1 i 3

c) 2 i 4

d) 4

e) 1, 2, 3, 4

7. L’estabilització del FMN en el domini flavodoxina:

1) Depèn d’unes interaccions hidrofòbiques en sandwich entre dos arginines.

2) Dèpèn de múltiples interaccions amb molècules d’aigua del solvent, al que es troba exposat el FMN.

3) Depèn d’interaccions iòniques amb aminoàcids del loop 2.

4) Depèn d’interaccions de pont d’hidrogen entre aminoàcids polars i els oxígens del grup fosfat.

a) 1, 2, 3

b) 1 i 3

c) 2 i 4

d) 4

e) 1, 2, 3, 4

8. Sobre els canvis conformacionals que es produeixen quan el FMN està reduït i oxidat, assenyala la/les respostes

certes:

1) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N3 de l’anell d’isoaloxacina..

2) Quan el FMN està reduït el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N5 de l’anell d’isoaloxacina.

3) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N10 de l’anell d’isoaloxacina.

4) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down.

a) 1, 2, 3

b) 1 i 3

c) 2 i 4

d) 4

e) 1, 2, 3, 4

9. Quina de les regions que intervenen en l’estabilització del grup FMN de les proteïnes flavodoxines és el més

invariable i conservat? Assenyala la resposta correcta.

a) Regió d’unió al grup fosfat. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els tres oxígens del grup fosfat del FMN.

b) Regió d’unió al anell isoaloxacina. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els oxígens i nitrògens del anell.

c) Estructura en sandwich. Dos aminoàcids paral·lels al anell isoaloxacina l’estabilitzen a través d’interaccions hidrofòbiques.

d) Clusters d’aminoàcids carregats (bàsics i àcids) amb distribució asimètrica.

e) Regió de tres aspàrtics consecutius que interaccionen iònicament amb els oxígens del grup fosfat.

10. En quina família dins de la superfamília flavoproteïna, existeix una conservació de clusters d’aminoàcids

carregats amb distribució asimètrica que provoca que el domini sigui un fort dipol, i les interaccions

electrostàtiques del qual son essencials per la unió d’aquestes proteïnes amb el seu substrat?

1) Flavodoxin-related

2) Flavoprotein NrdI.

3) Quinona reductase

4) Cytocromo P450 reductase

a) 1, 2, 3

b) 1 i 3

c) 2 i 4

d) 4

e) 1, 2, 3, 4

ASSAIG1. ¿Com es produeix el mecanisme de transferència d’electrons en las proteïnes QR1 (NAD(P)Hquinone reductase) i QR2 (quinone reductase type2), i quin tipus de cinètica segueixen?Resposta: El mecanisme de transferència d’electrons en aquestes proteïnes es produeix a través d’una cinèticaping-pong. En QR1: arriba el NADH, cedeix un protó al FAD, quedant aquest semireduït, i després el NADH esdesprèn de l’enzim. Posteriorment, per estabilitzar-se, el FAD captura un protó de la tirosina 155, laqual compensa la seva càrrega negativa perquè la histidina 161 li cedeix un protó. En aquest moment elFAD es troba reduït per complet. Aleshores entra la quinona, i interacciona amb la histidina 161 através d’un pont d’hidrogen. El FADH2 li cedeix un protó a la quinona reduint-la, però necessita unsegon protó per reduïr-se completament, i aquest se li cedeix la histidina 161, amb la que estava fent unpont d’hidrogen. Finalment, la quinona ja reduïda surt del lloc catalític, permetent l’entrada demolècules d’aigua que reprotonan la histidina 161.En QR2: al no estar conservada la histidina 161 el mecanisme es diferent. No se sap molt bé, però s’hahipotetitzat una possible via de transferència d’electrons a través d’una sèrie d’aminoàcids específics(histidina173, tirosina132, asparagina161 i tirosina155), l’àtom de zinc endogen i el donadord’electrons, fins arribar al substrat.2. Perquè al realitzar un Stamp pot donar un Score i un RMS baixos? Com ho faries per obtenirun Score alt i un RMS baix?Al comparar proteïnes de longituds molt diferents, encara que stamp pugui superposarsatisfactòriament un número elevat de residus (RMS baix, bo), com queden molts residus que no podensuperposar-se degut a la diferència de longitud, apareix un Score baix (dolent). Per solucionar el fetd’obtenir un Score baix i un RMS bó, podem reduir el tamany d’una proteïna tallant el domini que ensinteressa.

3. Quin tipus de plegament presenten els dominis flavodoxina? Explica tot el que sàpigues sobre aquestplegament.

El domini flavodoxina presenta en tots els seus casos un plegament “Rossman-fold”.El plegament Rossman es un motiu estructural de proteïnes d’unió a mono/dinucleòtids (NAD, FAD, FMN).La seva estructura pertany a la classe alfa/beta (alternança).Té un plegament tridimensional organitzat en tres capes (alfa/beta/alfa). Les seves estructures secundariesson una làmina beta central formada per 5 cadenes beta paral·leles que formaria el “core central” envoltadaper els dos costats per hèlix alfa. Les hèlix més conservades son 4, dos hèlix alfa a cada costat, i poden haveraltres hèlix accessòries.

4. Per quin procés evolutiu el domini flavodoxina apareix en proteïnes multidomini en cèl·luleseucariotes quan en procariotes constitueix la proteïna sencera, i perquè?

Cap flavodoxina ha sigut trobada en eucariotes superiors, però l’habilitat del producte del gen flavodoxinaper unir FMN i participar en reaccions de transferència d’electrons sembla que ha sigut molt útil perorganismes superiors que, a través de processos de fusió gènica, l’han incorporat en proteïnes multidominicom la reductasa P450, i la sulfit reductasa, on la seqüència original flavodoxina i el plegament poden serreconeguts clarament.