Detección de adulteración en leche bovina

Lic. Graciela Artavia González

Lizeth Rojas Bogantes

Eduardo Calderón Calvo

Octubre - 2019

Generalidades

• Problemática mundial (2008, China: contaminación con melamina en fórmulas infantiles)

• Inocuidad – Calidad

• Políticas de control y monitoreo

Tipos de adulteraciones

Inocuos No inocuos

Agua Urea, NaOH

Leche de otras especies Detergentes, formalina

Proteína vegetal (NH4)2SO4, peróxidos

Grasa vegetal Ácido bórico, benzoico o salicílico

Suero Azúcares y Almidones

Leche en polvo Melamina

Detección de presencia de grasa vegetal

• Composición de la grasa láctea:

• 98% triglicéridos, <2% diacilgliceroles, <0,5% colesterol, <1% fosfolípidos

• Origen producto del tipo de alimentación y rumen

• Perfil de ácidos grasos depende de varios factores • 68-70% saturados (C16:0, C18:0, C14:0)

• 25-27% monoinsaturados (C18:1)

• 3,5-4,0% poliinsaturados (C18:2 y C18:3)

Detección de presencia de grasa vegetal

• Fitoesteroles

• GC-FID (ISO 12078/IDF 159)

• Nivel de detección

28% a 32% grasa (origen vegetal)

Colesterol

Estigmasterol

Campesterol

-sitosterol

Detección de presencia de grasa vegetal

10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

uV

Data2:3039-3a.gcd SFID1Data1:Mix .gcd SFID1Data2:3039-3a.gcd SFID1Data1:Mix .gcd SFID1

8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 min

-5000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

uV

Data2:3059-16E.gcd SFID1Data1:mix 11-10-20.gcd SFID1Data2:3059-16E.gcd SFID1Data1:mix 11-10-20.gcd SFID1

Estigmasterol Campesterol

-sitosterol

Estigmasterol Campesterol

-sitosterol Colesterol

Colesterol

100% muestras analizadas (n=90) entre 2017-2019 no se detecta presencia de grasa vegetal

Detección de suero añadido

• Indicador? Glucomacropeptido (GMP): proteína que se encuentra únicamente en el suero obtenido de la producción de queso fresco, como resultado de la coagulación enzimática de la caseína

Detección de suero añadido

• HPLC-UV según Fukuda S., Roig S., Prata L. (2004). Correlation between acid ninhydrin and HPLC methods to evaluated fraudulent addition of whey in milk, Le Lait, 84, 501-512

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

-250000

0

250000

500000

750000

1000000

1250000

1500000

1750000

uV

GMP

Detección de suero añadido

• Limitante? Es posible que en leche almacenada algunos microorganismos psicotrópicos (especialmente Pseudomonas fluorescens) puedan producir vía enzimática un péptido similar a GMP, denominado pseudo-GMP

GMP y pseudo-GMP solo difieren en 1 aminoácido

Detección de suero añadido

Definición de umbral

Estudio de estabilidad en leche comercial (8 meses, 25 °C)

4 lotes de leche UHT (entera, semi y descremada)

Efecto de temperatura de almacenamiento en leche control

5 lotes leche entera control almacenada 5 °C, 20 °C y 30 °C (6 meses)

Estudio de estabilidad

• Leche descremada

GMP (2,86 a 31,87) mgL-1

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7 Mes 8G

MP

(m

g/L)

0% L1 (mar-16) 0% L2 (oct-16) 0% L3 (nov-16) 0% L4 (feb -17)

Estudio de estabilidad

• Leche semidescremada

GMP (2,33 a 31,56) mgL-1

0

5

10

15

20

25

30

35

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7 Mes 8

GM

P (

mg/

L)

2% L1 (mar-16) 2% L2 (oct-16) 2% L3 (nov-16) 2% L4 (feb-17)

Estudio de estabilidad

• Leche entera

GMP (2,09 a 30,95) mgL-1

0

5

10

15

20

25

30

35

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7 Mes 8

GM

P (

mg/

L)

3% L1 mar-16) 3% L2 (oct-16) 3% L3 (nov-16) 3% L4 (feb-17)

Estudio de estabilidad

• Factor: Contenido de grasa

• Contenido GMP • Inicial (2,10 – 7,59) mgL-1

• Final (12,58 – 31,87) mgL-1

GMP se incrementa 4 a 6 veces durante almacenamiento

Descremada Semidescremada ˃ Entera

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7 Mes 8

Pro

med

io G

MP

(m

g/L)

Entera Semidescremada Descremada

Efecto de temperatura de almacenamiento

• Se realizó 5 ensayos independientes en planta piloto (oct-16 a may-17)

• Tipo de leche: Leche entera UHT

• Contenido basal (ND a 1,87 mgL-1)

• 30 °C mayor variabilidad

• Recomendación: muestreos de calidad en un periodo máximo de 2 meses de producción

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5G

MP

(m

g/L)

5 °C 20 °C 30 °C

Estatus en Costa Rica

• Muestreo en leches comercializadas en C.R. • Periodo 2017 a 2019

• Más del 67% (no se cuantifica GMP) • Descremada > 48%

• Semidescremada > 69%

• Entera > 85%

86

110

127

61

93

113 104

115

128

183

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

200,00

GM

P (

mg/

L)

Detección de leche reconstituida

• Indicadores de daño térmico

4-O-β-D-galactopiranosil-D-fructosa

Detección de leche reconstituida

• Indicadores de daño térmico

Detección de leche reconstituida

• Indicadores de daño térmico

• Producto de reacción de Maillard: • Lactosa + Aminoácidos libre de proteína tipo e-amino (e.g. lisina)

Detección de leche reconstituida

• Indicadores de calidad según tratamiento térmico

Tipo de tratamiento térmico

Promedio mg furosina/100 g proteína

Pasteurización Trazas (<7)

UHT directo 67 (35 a 109)

UHT indirecto (tubular) 168 (118 a 193)

UHT indirecto (placas) 180 (108 a 240)

Esterilización (autoclave) 300 (220 a 372)

Detección de leche reconstituida

• Índice Lactulosa/Furosina • Formación de Lactulosa es

dependiente de pH • Temperatura de

almacenamiento tiene mayor impacto en contenido de furosina

Detección de leche reconstituida

• Índice Lactulosa/Furosina

• Formación de Lactulosa es dependiente de pH

• Temperatura de almacenamiento tiene mayor impacto en contenido de furosina

Detección de leche reconstituida

• Índice Lactulosa/Furosina

2,0 según Pellegrino, L., De Noni, I., Resmini, P., Int. Dairy Journal, 1995, 5, 647-659 y Cho, Y-H., Hong, S-M., Kim, C-H., Korean J. Food Sci. An., 2012, 32 (5), 540-54.

Método de análisis de lactulosa

• HPLC-RID según IDF 147B

Estándar de lactulosa

Lactulosa presente en muestra de leche almacenada a 30 °C

Señal de lactosa

Método de análisis de furosina

• Se desarrolló método analítico HPLC-UV según ISO 18329 / IDF 193 modificado

Método de análisis de furosina

Método de análisis de furosina

Estudio piloto: Adición leche reconstituida

1) Hidratación de leche en polvo: (10% de sólidos totales) 20-30 °C por 1 hora en tanque con agitación (40-80) rpm

2) Mezcla con leche fresca según % de combinación: agitación (40-80) rpm y calentamiento hasta alcanzar 37 °C

3) Homogeneización: Equipo ArmField FT90: 140/30 bar ± 10 a (25,5 ± 5) °C

4) Tratamiento térmico equivalente: (140 ± 3,5) °C en un periodo de (1-4) s Condiciones: ArmField FT44 UHT/HTST tubular : T1 input 33,2 °C; T2 preheat 58,2 °C; T3 Heat source (water) 138,7 °C;T4 Sample 130,9 °C (2 s), T5 output 28,6 °C

5) Llenado aséptico: Cabina estéril FT83: flujo 10 L/h; 5,3 bar; velocidad de la bomba 27,4; temperatura de llenado a 34 °C)

Estudio piloto: Adición leche reconstituida

Marzo, Abril, Mayo 2017

Polinomio grado 2

y =(2,7×10-4 ± 1,5×10-4 )x2 – (3,0×10-2 ± 1,9×10-2)x + (2,5±0,2)

Estudio piloto: Adición leche reconstituida

Marzo, Abril, Mayo 2018

Polinomio grado 3

y =(-6,4×10-4 ± 5,4×10-4 )x3 – (2,7×10-2 ± 2,1×10-2) x2 – (0,4 ± 0,3)x + (3,1±1,0)

Estudio piloto: Adición leche reconstituida

Correlación tiene dos tendencias según ámbito de reconstitución

Muestreo 2017 (L/F 1,85 A 3,62)

Muestreo 2018 (L/F 1,53 a 3,41)

Perspectivas

❶ Validación de modelos predictivos

❷ Separación y cuantificación analítica GMP vrs pseudo-GMP

❸ Indicadores de adición de leche reconstituida en leches deslactosadas

❹ Estudios en leche caprina