CromatografíaCromatografía

CromatografíaCromatografía

CromatografíaCromatografía

CromatografíaCromatografía

CromatografíaCromatografía

Descubridor Descubridor

• El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919) Semenovich Tsvett, 1872-1919)

DefiniciónDefinición

• Cromatografía es un método de Cromatografía es un método de separación en el que se aprovechan las separación en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de diferencias en el comportamiento de partición entre una fase móvil y una fase partición entre una fase móvil y una fase estacionaria para separa los componentes estacionaria para separa los componentes de una mezcla.de una mezcla.

Cromatografía, definición (cont.)Cromatografía, definición (cont.)

• Una columna u otro soporte mantienen a Una columna u otro soporte mantienen a la fase estacionaria y la fase móvil acarrea la fase estacionaria y la fase móvil acarrea a la muestra.a la muestra.

• Los componentes de la muestra que Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase particionan fuertemente con la fase estacionaria estarán más tiempo dentro de estacionaria estarán más tiempo dentro de la columna.la columna.

Si es en columna :Si es en columna :

• Conforme los componentes son eluidos Conforme los componentes son eluidos de la columna, pueden ser cuantificados de la columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para análisis por un detector y colectados para análisis posteriorposterior

Métodos cromatográficosMétodos cromatográficos• De gasesDe gases• En capa finaEn capa fina• En líquidos inmovilizadosEn líquidos inmovilizados• De exclusión molecularDe exclusión molecular• Intercambio iónicoIntercambio iónico• HidroxiapatitaHidroxiapatita• HidrofóbicaHidrofóbica• AfinidadAfinidad• HPLCHPLC

Exclusión molecularExclusión molecular

• Fase estacionaria:Fase estacionaria:– Dextrán con enlaces cruzadosDextrán con enlaces cruzados– Agarosa con enlaces cruzadoAgarosa con enlaces cruzado– Poliacrilamida Poliacrilamida

• Las moléculas grandes fluyen más Las moléculas grandes fluyen más rápido que las pequeñas. rápido que las pequeñas.

Desarrollo de una cromatografía Desarrollo de una cromatografía de exclusión molecularde exclusión molecular

• Determinación del tamaño de la Determinación del tamaño de la columna columna

• Hidratación y lavado de la resinaHidratación y lavado de la resina

• Empaque de la columnaEmpaque de la columna

• Determinación del volumen vacíoDeterminación del volumen vacío

• Corrimiento de la muestraCorrimiento de la muestra

Cromatograma de exclusión Cromatograma de exclusión molecular (EM)molecular (EM)

Elusión de una columna de cromatografía de EM

Cromatografía de exclusiónCromatografía de exclusión

Características de las resinas Características de las resinas de EM clásicasde EM clásicas

BioGel

Sephadex

P-60P-100P-200P-300G-50G-100G-150G-200

3-605-100

30-20060-300

2-304-1505-3005-600

Nombre CódigoRango de

Fraccionamiento(kDa)

Flujo máximo(cm/hr)

55435532

Intercambio iónicoIntercambio iónico

Intercambio iónicoIntercambio iónico• Las proteínas difieren mucho en su afinidad Las proteínas difieren mucho en su afinidad

por materiales cargados positiva o por materiales cargados positiva o negativamente.negativamente.

• Los soportes pueden ser:Los soportes pueden ser:– Dextrán con enlaces cruzadosDextrán con enlaces cruzados– Agarosa con enlaces cruzadoAgarosa con enlaces cruzado– PoliacrilamidaPoliacrilamida– CelulosaCelulosa– PoliestirenoPoliestireno– SíliceSílice

Grupos intercambiadoresGrupos intercambiadores

• Carboximetilo (CM)Carboximetilo (CM)

CH2 —CH3

—(CH2) —NH

CH2 —CH3

+

—CH2 — N+— (CH3)3

—PO3-

—CH2 —COO-

• Fosfato (P)Fosfato (P)

• Dietilaminoetil (DEAE)Dietilaminoetil (DEAE)

• Mono QMono Q

2

Principios del intercambio Principios del intercambio iónicoiónico

• La afinidad de una proteína es proporcional La afinidad de una proteína es proporcional a la concentración de sal requerida para a la concentración de sal requerida para liberarla del material.liberarla del material.

• Una columna se carga (de proteínas) con Una columna se carga (de proteínas) con un amortiguador de baja fuerza iónica y la un amortiguador de baja fuerza iónica y la elusión se inicia por incremento de la elusión se inicia por incremento de la concentración del amortiguador de elusión.concentración del amortiguador de elusión.

Desarrollo de una cromatografía Desarrollo de una cromatografía de intercambio iónicode intercambio iónico

• Hidratación y Lavado de la resinaHidratación y Lavado de la resina

• Activación (lavado con ácido y base Activación (lavado con ácido y base fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usará 1M y finalmente con la sal que se usará ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal)

• Volumen de la columna y capacidad de Volumen de la columna y capacidad de retención de la resina.retención de la resina.

Diferentes sales tienen diferentes fuerzas Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de elución cuando se usan en de elución cuando se usan en

cromatografía de intercambio iónico.cromatografía de intercambio iónico.

• Intercambio del aniónIntercambio del anión– citrato>sulfato>oxalato>Icitrato>sulfato>oxalato>I-->NO>NO33

-2-2>CrO>CrO44-->Br- >Br-

> SCN> SCN-- > Cl > Cl-- > Formiato > Formiato

• Intercambio del catiónIntercambio del catión– BaBa2+2+ > Pb > Pb2+2+ > Sr > Sr2+2+ > Ca > Ca2+2+ > Ni > Ni2+2+ > Cd > Cu > > Cd > Cu >

Co > Zn>Mg>Ti+> Ag > Co > Zn>Mg>Ti+> Ag > RbRb++>Cs>Cs++>K>K++>NH>NH44

++>Na>Na++>H>H++>Li>Li++

Amortiguadores Amortiguadores

• Para intercambiadores aniónicos se Para intercambiadores aniónicos se deben usar amortiguadores catiónicos o deben usar amortiguadores catiónicos o zwitterionicoszwitterionicos

• No usar amortiguadores aniónicos pues No usar amortiguadores aniónicos pues se unen a la resina.se unen a la resina.

• Usar detergentes catiónicos o no Usar detergentes catiónicos o no iónicos.iónicos.

Cromatograma de intercambio Cromatograma de intercambio iónicoiónico

Tiempo de retención (min)

A 28

0 n

m

0 30 9060

b

0

500

NaC

l m

M

53

Hidroxiapatita (HA)Hidroxiapatita (HA)

• Introducida por Tiselius Introducida por Tiselius et alet al. en 1956. en 1956

• Bernardi realizó un estudio sistemático Bernardi realizó un estudio sistemático (Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)(Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography on calcium phosphate columns, Arch Biochem Biophys 65, 132–155

Fórmula Fórmula

• Forma cristalizada de fosfato de calcioForma cristalizada de fosfato de calcio

((Ca10(PO4)6(OH)2)

Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography: column performance for proteins, Eur J Biochem 152, 361–371

Unión selectiva de proteínas a Unión selectiva de proteínas a la hidroxiapatita la hidroxiapatita

• A, es una proteína A, es una proteína básica.básica.

• B, es una proteína B, es una proteína acídicaacídica

• El triángulo indica El triángulo indica enlaces de coordinación.enlaces de coordinación.

• Los dobles paréntesis Los dobles paréntesis indican repulsión.indican repulsión.

• Las líneas punteadas Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.indican enlaces iónicos.

Los grupos amino son atraídos por los sitios fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para los carboxilos.

Adsorción de grupos aminoAdsorción de grupos amino

• Se debe a interacción electrostática no Se debe a interacción electrostática no específica entre su cargas positivas y específica entre su cargas positivas y las cargas generales negativas de la las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de equilibrada con amortiguador de fosfato.fosfato.

Incremento de la unión de aminas Incremento de la unión de aminas por bloqueo de la repulsión.por bloqueo de la repulsión.

• A, es una proteína A, es una proteína básica.básica.

• B, es una proteína B, es una proteína acídicaacídica

• El triángulo indica El triángulo indica enlaces de coordinación.enlaces de coordinación.

• Los dobles paréntesis Los dobles paréntesis indican repulsión.indican repulsión.

• Las líneas punteadas Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.indican enlaces iónicos.

Los grupos fosfatos en solución pueden cubrir a calcios que repelerían a los grupos aminos.

Disociación selectiva de la Disociación selectiva de la hidroxiapatitahidroxiapatita

• A, es una proteína A, es una proteína básica.básica.

• B, es una proteína B, es una proteína acídicaacídica

• El triángulo indica El triángulo indica enlaces de enlaces de coordinación. Notar coordinación. Notar que estos no se que estos no se afectan.afectan.

Efecto de la concentración de Efecto de la concentración de fosfato en la unión de proteínasfosfato en la unión de proteínas

• El perfil superior fue El perfil superior fue cargado con fosfato 1 cargado con fosfato 1 mMmM

• El inferior, con fosfato El inferior, con fosfato 50 mM.50 mM.

• La capacidad de unión La capacidad de unión de las IgG se mejoró de las IgG se mejoró reduciendo la reduciendo la competencia de competencia de contaminantes.contaminantes.

Barrido con dos gradientesBarrido con dos gradientes

• El primer gradiente va El primer gradiente va de 0 a 500 mM de de 0 a 500 mM de cloruro de sodio.cloruro de sodio.

• El segundo, de 0 a 500 El segundo, de 0 a 500 mM de fosfato de mM de fosfato de potasio.potasio.

• El amortiguador base es El amortiguador base es 0.5 M MES, 1mM 0.5 M MES, 1mM fosfato, pH 6.fosfato, pH 6.

• La elusión de la IgG se La elusión de la IgG se observa en grisobserva en gris

UsosUsos

• Purificación de:Purificación de:– ProteínasProteínas– Ácidos nucléicosÁcidos nucléicos– Virus Virus

Bases de la TécnicaBases de la Técnica

• Su selectividad no depende de la masa Su selectividad no depende de la masa molecular, densidad de carga o punto molecular, densidad de carga o punto isoeléctrico.isoeléctrico.

Bases de la técnicaBases de la técnica

• La adsorción y la elución de las proteínas La adsorción y la elución de las proteínas no son procesos en reversa de un solo no son procesos en reversa de un solo efecto.efecto.

• Los grupos amino y carboxilo actúan de Los grupos amino y carboxilo actúan de manera diferente en la adsorción de las manera diferente en la adsorción de las proteínas a la HA.proteínas a la HA.

• La elución de proteínas ácidas y básicas La elución de proteínas ácidas y básicas por diferentes sales tiene deferentes por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.mecanismos.

Ventajas Ventajas

• HA tiene poco poder de adsorción de HA tiene poco poder de adsorción de moléculas de masa molecular baja moléculas de masa molecular baja como nucleótidos, sales y aminoácidos.como nucleótidos, sales y aminoácidos.

• Es relativamente incompresible.Es relativamente incompresible.

• Existen variantes cerámicas más fáciles Existen variantes cerámicas más fáciles de trabajar pues no se compactan.de trabajar pues no se compactan.

Cromatografía hidrofóbicaCromatografía hidrofóbica

Cromatografía HidrofóbicaCromatografía Hidrofóbica

• Los grupos adicionados al soporte son el Los grupos adicionados al soporte son el alcohol octílicoalcohol octílico, grupos , grupos bencénicosbencénicos u otros u otros grupos grupos hidrófobos como hidrocarburos hidrófobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18)(C4, C8 o C18)..

• Los centros hidrófobos de las proteínas son Los centros hidrófobos de las proteínas son expuestos por exceso de salinidad y son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.atrapados por la columna.

Cromatograma hidrofóbicoCromatograma hidrofóbico

Tiempo de retención (min)

A

28

0 n

m

0 30 9060

b

0

500

(NH

4) 2

SO

4 m

M

53

Series caotrópicasSeries caotrópicas

• AnionesAniones

POPO44––>SO>SO44

––>CH>CH33COOCOO––>CL>CL––>Br>Br––>NO>NO3–3–

>ClO>ClO44––>I>SCN>I>SCN––

• CationesCationes

NHNH44++>Rb>Rb++>K>Na>K>Na++>Cs>Cs++>Li>Li++>Mg>Ca>Mg>Ca2+2+>B>B

aa2+2+

Cromatografía de AfinidadCromatografía de Afinidad

• Sistema muy poderoso de purificaciónSistema muy poderoso de purificación• Sistema restringidoSistema restringido• Se basa en la interacciónSe basa en la interacción específicaespecífica de de

dos compuestosdos compuestos–Antígeno - AnticuerpoAntígeno - Anticuerpo–Enzima - sustratoEnzima - sustrato–Receptor - LigandoReceptor - Ligando

HPLCHPLC

Cromatografía líquida de alta Cromatografía líquida de alta resoluciónresolución

High-performance liquid High-performance liquid chromatography chromatography

Limitaciones de la cromatografía Limitaciones de la cromatografía a bajas presionesa bajas presiones

• Imposibilidad física de aumentar el flujoImposibilidad física de aumentar el flujo– Resinas compresiblesResinas compresibles

• Corridas de muchas horasCorridas de muchas horas

• Grandes volúmenesGrandes volúmenes

Descubrimientos que Descubrimientos que facilitaron la HPLCfacilitaron la HPLC

• Síntesis de resinas incompresiblesSíntesis de resinas incompresibles

• Nuevas técnicas en el empaque de Nuevas técnicas en el empaque de las columnaslas columnas

• Microparticulación de las resinasMicroparticulación de las resinas

• Adelantos en la tecnología Adelantos en la tecnología espectrofotometricaespectrofotometrica

Tipos de HPLCTipos de HPLC

• De exclusión molecularDe exclusión molecular

• Intercambio iónicoIntercambio iónico

• HidrofóbicaHidrofóbica

• AfinidadAfinidad

• De De fase reversafase reversa

InstrumentaciónInstrumentación

• Sistema de bombeoSistema de bombeo– Resistente a químicosResistente a químicos– Poca variabilidadPoca variabilidad– Presiones de 30 as 400 atmPresiones de 30 as 400 atm– Flujo constante (libre de pulsos)Flujo constante (libre de pulsos)– Buen mezclado de los solventesBuen mezclado de los solventes– Reproducibilidad en la formación de los Reproducibilidad en la formación de los

gradientesgradientes

Tipos de bombasTipos de bombas

• JeringaJeringa

• Pistón recíprocoPistón recíproco

• DiafragmaDiafragma

• Presión constantePresión constante

DetectoresDetectores

• Detectores de UV-Visible que pueda Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o más longitudes de onda al leer 2 o más longitudes de onda al mismo tiempomismo tiempo

• Detector de arreglo de diodos. Espectro Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.segundo.

Cromatografía de fase reversaCromatografía de fase reversa

• Se basa en las propiedades hidrofóbicas de las Se basa en las propiedades hidrofóbicas de las proteínas.proteínas.

• El proceso de elución es diferente que en la El proceso de elución es diferente que en la cromatografía hidrofóbicacromatografía hidrofóbica

• La fase móvil es un solvente orgánico (metanol, La fase móvil es un solvente orgánico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, ácido fosfórico, acético o hidroxibutírico).ácido fosfórico, acético o hidroxibutírico).

Fase estacionariaFase estacionaria• Sílica acoplada con un derivado alquilsilano.Sílica acoplada con un derivado alquilsilano.• La longitud de la cadena alquilo puede ser de La longitud de la cadena alquilo puede ser de

CC44, C, C88, C, C1818..

• La porosidad del soporte es variable y se La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 Arecomienda que sea entre 300 a 1000 A

• El tamaño de las partículas es de 5 a 20 El tamaño de las partículas es de 5 a 20 μμmmo

Fase móvilFase móvil• La acidez de la fase móvil:La acidez de la fase móvil:

– Influencia el estado iónico de la Influencia el estado iónico de la proteínaproteína

– Controla la ionización de la superficie Controla la ionización de la superficie silanolsilanol

– Forma pares iónicos con la zona Forma pares iónicos con la zona catiónica de la proteínacatiónica de la proteína

– Favorece la exposición de zonas Favorece la exposición de zonas hidrofóbicas de la proteínahidrofóbicas de la proteína

Cromatograma de fase reversaCromatograma de fase reversa

0 20 40

17

0

40

80

AcN

(%

)

A

215

Tiempo de Retención (min)

a

HPLC de Fase ReversaHPLC de Fase Reversa

• Separación eficiente aún con Separación eficiente aún con concentraciones altas de proteínasconcentraciones altas de proteínas

• Bajo ruido de fondoBajo ruido de fondo

• Solventes volátilesSolventes volátiles

• Fácil formulación de la fase móvil Fácil formulación de la fase móvil

• Reproducibilidad de gradientes.Reproducibilidad de gradientes.

Diagrama del sistema HPLCDiagrama del sistema HPLC

Manejador de muestrasManejador de muestras Manejador de solventeManejador de solvente

Celda MicroboreCelda Microbore

Celda AnalíticaCelda Analítica

Termostato de la columnaTermostato de la columna

ColumnaColumna

Celda PreparativaCelda Preparativa

HPLC WATERSHPLC WATERS modelo antiguo modelo antiguo

HPLC WATERSHPLC WATERS

Cromatógrafo de GasesCromatógrafo de Gases

Principales componentesPrincipales componentes

☯Gas de acarreoGas de acarreo

☯Controladores de flujoControladores de flujo

☯InyectoresInyectores

☯ColumnasColumnas

☯DetectoresDetectores

☯Sistema de datosSistema de datos

• Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (“make-el uso de un gas de complemento en el detector (“make-up”).up”).

• El “make-up”, es un gas de arrastre adicionado al El “make-up”, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector.efluente de la columna antes de que pase al detector.

• El sistema del gas portador, por lo general contiene uno El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxígeno.hidrocarburos y oxígeno.

• Los caudales utilizados en las columnas empacadas Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares. capilares.

Gas de acarreoGas de acarreo