Enzimas

Un poco de historia…

Se reconocen catalizadores biológicos al estudiar la degradación de carnes por secreciones estomacales

Se observa conversión de almidón a azúcar por saliva y extractos vegetales

La fermentación de azúcar a alcohol por levaduras es catalizada por fermentos que son inseparables de las células vivas de levadura

1700s

1800s

1850s

Un poco de historia…

Buchner: extractos de levaduras pueden fermentar azúcar a alcohol

Sumner: aísla y cristaliza ureasa todas las enzimas son proteínas

Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas se aíslan y cristalizan y son proteínas

1897

1926

1930s

ENZIMAS (Gk enzymos = levado)Kühne

1930s Haldane: interacciones débiles entre enzima y sustrato podrían usarse para catalizar reacción

Los Protagonistas…

¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?

Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas

Actividad catalítica requiere proteína nativa

Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106

Algunas requieren componente químico adicional para su actividad

COFACTOR

Algunos cofactores son iones metálicos…

…Otros son moléculas orgánicas complejas

Coenzimas que transfieren grupos de átomos

Coenzimas que transfieren electrones

COENZIMAS

Coenzimas que

transfieren electrones

Coenzimas que transfieren grupos de

átomos

Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas

¿ Qué son las vitaminas ?

Compuestos que son esenciales para la salud y que no pueden ser sintetizados por el

organismo

Deben ser incorporados en la dieta

Su deficiencia genera enfermedades por carencia

Se dividen en dos grupos de acuerdo con su solubilidad

Vitaminas Liposolubles

Vitaminas Hidrosolubles

Vitaminas Hidrosolubles

Volvamos a nuestras enzimas…

Clasificación de enzimas…

E.C.w.x.y.z.

Un ejemplo…la hexoquinasa

ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

E.C.2.7.1.1.transferasa

fosfotransferasa

P-transferasa con HO como aceptor

D-glucosa como aceptor del P

Las enzimas son catalizadores extraordinarios

Especificidad

Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción

Condiciones de funcionamiento

¿ Cómo funcionan las enzimas ?

S

P

ST

Dirección de Reacción

Energía Libre (G)

Energía requerida

T = Estado de transiciónAdapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

E S+ P+SE E

¿ Qué pasa en presencia de una enzima ?

La enzima estabiliza el Estado de Transición

S

PES

EST

EP

ST

Dirección de Reacción

Cambio en Energía

Energía requerida (no catálisis)

Energía disminuye (catálisis)

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

¿ Cómo lo logra ?

Sitio activo

El sitio activo…El sitio activo…

Proporciona una superficie catalíticaProporciona una superficie catalítica

EEstabiliza estado de transiciónstabiliza estado de transición

Transforma el estado de transición en productoTransforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A

Juang RH (2004) BCbasics

¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición ?

Evita influencia del agua

Posee grupos reactivos+

-

Juang RH (2004) BCbasics

Optimiza interacción con S

La enzima no es perfectamente complementaria al sustrato sino al estado de transición

(Linus Pauling, 1946)

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

X Ajuste inducido(Koshland, 1958)

Hexoquinasa

D-glucosa

El sitio activo…El sitio activo…

Proporciona una superficie catalítica

Estabiliza estado de transición

Transforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A

Juang RH (2004) BCbasics

Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de

distintos mecanismos

Catálisis covalente

Catálisis con ión metálico

Catálisis ácido-base

Catálisis ácido-base

Asp102

His57

Ser195

Tríada CatalíticaTríada Catalítica

HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1

NC

CN

[HOOC]H

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

Chequear especificidad de sustrato

Asp102

His57

Ser195HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A2

NC

CN

[HOOC]H

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

Primer Estado de Transición

HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A3

NC

CN

[HOOC]H O

CC

NC

C[NH

2]CC

O

Intermediario Acil-Enzima

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1

N-H

CC

N[HOOC]

H

O

CC

NC

C[NH

2]CC

O

H OH

Intermediario Acil-Enzima Agua

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2

O

O

CC

NC

C[NH

2]CC

H

Segundo Estado de Transición

OH

H

Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3

O

CC

NC

C[NH2]

CC

O

OH

Des-acilación

H

Ca

rga e

n e

l Sitio

Activo

Ser195

His 57

Asp 102

H–O–CH2

O

C–O -

=

Ser Activa

H–N N

C C

C

H

H

CH2

Ser195

His 57

Asp 102

- O–CH2

OC–O–H

=

N N–H

C C

C

H

H

CH2

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.15

8

HO

H

Catálisis Acido-Base

Ad

ap

ted

fro

m N

els

on

& C

ox

(20

00

) L

eh

nin

ger

Prin

cip

les

of

Bio

che

mis

try

(3e

) p

.25

2

Induce el estado de transición

CO=

NH

HCH

NH

+

C

- OOHO

H

-

+

HO

H

CO=

NH

HCH

CO=

NH

HCH

CO=

NH

HCH

Lenta Rápida Rápida Muy rápida

CatálisisAcido-base Catálisis

Acida

CatálisisBásica

Ambas

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.16

7

NH

+

C

- OO

HO

H

Especificidad

Mecanismo Concertado de Catálisis

1

2

3 4

5O

-H

+ H

COO -

(270)Glu

(248)Tyr

O -

H

His(196)

His (69)

Glu(72)

+Arg (145)

Carboxipeptidasa A

C-terminal

SITIOACTIVOSITIO

ACTIVO

Chequear porC-terminal

Sitio paraespecificidad

Bolsillodel SitioActivo

Cadenapeptidica del

Sustrato

RNCN C

COO -

O -

C

2+Zn

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

O ON–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C R H R’

Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad

O -

CSer

Sitio ActivoSitio Activo

Sitio deEspecificidad

Sitio deEspecificidad Sitio Catalítico

Juang RH (2004) BCbasics

Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas

COO-

CAsp

COO-

CAsp

Sitio Activo

Tripsina Quimotripsina Elastasacorta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly

Bolsillo No-polar

Bo

lsill

o P

rofu

ndo

y C

arga

doN

ega

tiva

men

te

Bolsillo Poco Profundoy

no-polar

O O–C–N–C–C–N– C C C C NH3

+

O O–C–N–C–C–N– C

O O–C–N–C–C–N–

CH3

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Especificidad Espacial

BC

DBC

DBC

D

Estos dos triángulos no son idénticos

A

La estructura tetrahédricade los orbitales del carbonotiene una tensión estéricaque conforma la unidadbase de la conformaciónproteica

Juang RH (2004) BCbasics

sp3

Superficie Enzima

Cinética Enzimática

[S]

Orden 0

Orden 1

VoV

ES

Otra vez un poco de historia…

Victor Henri: reacción E + S → ES etapa necesaria en catálisis enzimática

Michaelis y Menten: Teoría General de la Catálisis Enzimática

1903

1913

Las condiciones de M-M

rápida lenta*

ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo del complejo ES proceden a la misma

velocidad se mantiene constante la concentración de ES

E + S ESk1

k2

E + Pk3

k4

S P

EES

Tiempo de reacción

Concentr ación

Juang RH (2004) BCbasics

ET

EE

[S]

Vo

Vm

½ Vm

Km

Vo = Vm

Vo = Vm [S] Km

Vo = Vm [S] Km + [S]

Y siguiendo con la hexoquinasa…

Glucosa + ATP → Glc-6-P + ADPGlucosa Alosa Manosa

Km = 8 8.000 5 mM

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Juang RH (2004) BCbasics

Cinética Michaeliana

[S]

Vo

Vm

½ Vm

Km

Vo = Vm

Vo = Vm [S] Km

Vo = Vm [S] Km + [S]

¿ Qué pasa con MM cuando reacción catalizada tiene más de un sustrato ?

ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfato

Distintos mecanismos posibles…

¿Cómo hacemos en la práctica para obtener

Vm y Km?

Recopilando…

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Doble recíproca

Gráfico Directo

1)1) Usar una cantidad definida de Enzima → E 2)2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S

3)3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t)→ vo

4)4) Estimar Vmax y Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

¿Cómo medimos la cantidad de enzima?

UNIDAD ENZIMÁTICA

UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)

Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada cantidad de producto en la unidad de

tiempo, en condiciones de velocidad máxima

UE

Proteína (mg)ActividadEspecífica =

¿Cómo puedo comparar la eficiencia de distintas

enzimas?

E + S ES E + Pk2

k1 k3

En condiciones saturantes Vm = k3 ET

k catalíticaNúmero de recambio

Algunos ejemplos…

kcat / kmConstante de especificidad

Inhibición de la actividad enzimática

Algunos inhibidores son irreversibles…

Se unen covalentemente (o no) o destruyen grupo funcional clave para

catálisis

Inhibidores suicidas

Diseño racional de fármacos

Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño

Trypanosoma brucei

Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasaprimera enzima en biosíntesis poliaminas

Difluorometilornitina

Y otros inhibidores son evidentemente reversibles!!!!!

Existen distintos tipos de inhibición reversible…

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitiva No-competitiva Incompetitiva

EE

Sitio diferenteCompite por Sitio activoInhibidor

Sustrato

Dib

ujo

Guí

aEc

uació

n y

Desc

ripció

n

[II] se une a [E] libre solo,y compite con [S];aumento de [S] eliminala Inhibición por [II].

[II] se une a [E] libre o [ES] complejo; aumento de [S] noelimina [II] inhibición.

[II] se une al [ES] complejo Solo; aumento [S] favorecela inhibición por [II].

E + S → ES → E + P + II↓EII

←

↑

E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS

←

↑

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Km

Inhibición Reversible

I II Competitiva No-competitiva Incompetitiva

Grá

fico

Dire

cto

Dob

le R

ecí

proc

a

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

II II

Km [S], mM

Vmax

II

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax no cambiaKm aumenta

Vmax disminuyeKm no cambia

Vmax & Km disminuyen

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

IIII1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición competitiva…

¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !

metanol Formaldehído Alcohol

deshidrogenasa

etanol es inhibidor competitivo

Infusión lenta y continuada de etanol ☺

Otra aplicación clínica importante de la inhibición competitva: las sulfamidas

-COOHH2N-

-SONH2H2N-

Precursor Acidofólico

Sulfanilamida

Acido p-aminobenzoico (PABA)

Bacterias necesitan PABA para

biosíntesis de ácido fólico

Estructura similar al PABA, inhibe el crecimiento bacteriano.

Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Cinética Michaeliana: Resumen

vo=Vmax [S]Km + [S]

Km Vmax &

1er orden

Orden cero

Competitiva

No-competitiva

Incompetitiva

Directo

Doble recíprocaAfinidad consubstrato

VelocidadMáxima In

hibición

k3 [Et]

kcat

Número derecambio

kcat / Km

UE

1 molmin

Significa:

Juang RH (2004) BCbasics

Enzimas Regulatorias

Retroalimentación negativa

Enzimas Alostéricas

Gk: allos = otros steros = forma

Enzimas Alostéricas

Proteínas multiméricas y complejas

Modulador y S se unen a distintas subunidades

Modulador puede ser positivo o negativo

Un sitio específico para cada modulador

Unión modulador produce cambio conformacional que altera actividad enzimática

Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) o no (heterotrópico)

Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa

12 cadenas polipeptídicas2 clusters catalíticos con 3 cadenas

3 clusters regulatorios con 2 cadenas

Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa

+

Forma Activa relajada

Forma tensa Inactiva

ATCasa

COO-

CH2

HN-C-COO-

H H-

---

OH2N-C-O-PO3

2-

= OH2N-C-

=

COO-

CH2

N-C-COO-

H H

---

-

ATP

CTP

MetabolismoNcleicos

Feedback inhibición

AspartatoCarbamilfosfato

Carbamil aspartato

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

Juang RH (2004) BCbasics

Cinética alostérica

Cooperatividad

Dos modelos para explicar este comportamiento…

Concertado(Monod)

Ajuste inducido(Koshland)

2 formas R y T en equilibrio que se desplaza a un lado u otro según presencia modulador

1 forma única que va ajustando su actividad de acuerdo con entrada

modulador

S y modulador + sólo se unen a RModulador – sólo se une a T

El modulador puede afectar K0.5…

El modulador puede afectar Vm…

Volvamos a la ATC…

Efe

cto C

urva

Sig

mo

ide

a

Si exageramos la curva sigmoideaVemos el puntoOn/Off claramente

Efector positivo (ATP)lleva curva sigmoidea a hiperbólica

Efector Negativo (CTP) mantiene

Una enzima alostérica puede “detectar” la concentración en el ambiente y ajustar suactividad

CTPATP

vo

vo

[Sustrato]Off On

Juang RH (2004) BCbasics

Enzimas reguladas por clivaje proteolítico

Regulación irrversible

Proteólisis expone sitio activo

Se necesita otro mecanismo para inactivar

Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo

Enzimas reguladas por modificación covalente

Grupos de átomos unidos o removidos generalmente por otras enzimas

Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas específicas

Fosforilación tiene que ser reversible

Fosfo proteín fosfatasas

Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

A veces una misma enzima tiene varios sitios de fosforilación

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

GP

GS

Rápida Respuesta a Concentración Azúcar en Sangre

Glucógeno fosforilasa Glucógeno sintasaA

ctiv

idad

Enz

imát

ica

0 2 4 6 8Tiempo (min)

Glucosa

Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597