Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

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Pontificia Universidad Católica del Ecuadorn Elaborado por: Vanesa Vanesa Carrera Carrera

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Cinetica de las enzimas

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Pontificia

Universidad

Católica del

Ecuadorn

Elaborado por: Vanesa Vanesa CarreraCarrera

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IMPORTANCIA BIOMÉDICA

o La cinética enzimática es el área de la bioquímica relacionada con la determinación cuantitativa de las velocidades de las reacciones que catalizan las enzimas y el estudio sistemático de los factores que afectan dichas velocidades.

o Un conjunto complejo y equilibrado de actividades enzimáticas es fundamental para mantener la homeostasis.

o Es importante entender la cinética de las enzimas para saber cómo las condiciones fisiológicas adversas como anoxia, acidosis y alcalosis metabólicas, toxinas y agentes farmacológicos afectan la homeostasis.

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oEl análisis cinético permite conocer el número y orden de los pasos mediante los cuales las enzimas transforman a los sustratos en productos.

o La cinética de las enzimas juega un papel importante en el descubrimiento de los fármacos, la farmacodinámica comparativa y determina el modo de acción de los fármacos.

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LAS REACCIONES QUÍMICAS SE DESCRIBEN POR MEDIO

DE ECUACIONES BALANCEADAS

En una ecuación química balanceada se presentan las especies químicas iniciales (sustratos) presentes y las nuevas especies químicas (productos) formados por

una reacción química particular, todas en sus proporciones correctas o estequiométricas.

A y B : sustratos

P y Q : productos

reacción reversible

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- Para la reacción (1), si A y B forman P y Q, entonces P y Q también forman A y B. La designación de un reactivo particular como “sustrato” o “producto” es, por tanto, un tanto arbitraria ya que los productos para una reacción escritos en una dirección son los sustratos para la reacción inversa.

- El término “productos” suele utilizarse para designar los reactivos cuya formación se favorece desde el punto de vista termodinámico, entonces la flecha se representa a menudo con una sola flecha como si fueran “irreversibles”.

A + B → P + Q

Las flechas unidireccionales se utilizan para describir las

reacciones en las células vivas donde los productos de la reacción se consumen de inmediato en una reacción

posterior catalizada por enzimas y la reacción en condiciones

fisiológicas es funcionalmente irreversible

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LOS CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE DETERMINAN LA

DIRECCIÓN Y EL ESTADO DE EQUILIBRIO DE LAS

REACCIONES QUÍMICAS

El cambio de la energía libre de Gibbs ∆G describe tanto la dirección hacia la que procede una reacción química, como la

concentración de los reactivos y productos que se tienen en el equilibrio.

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El ∆G para una reacción química es igual a la suma de las energías libres de formación de los productos de la reacción ∆Gp menos la suma de las energías libres de formación de los sustratos ∆GS. Mediante ∆G0 se denota el cambio de energía libre que acompaña a la transición desde el estado estándar, concentraciones uno molar de sustratos y productos, hasta el equilibrio.

∆G0 = Estado estándar de protones 10-7 M, pH 7.0

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Si la energía libre de formación de los productos es menor que la de los sustratos, el signo ∆G0 y ∆G0 es negativo, lo que significa que la reacción como está escrita favorece en a dirección de izquierda a derecha. A estas reacciones se les denomina espontáneas. Con el signo y la magnitud del cambio de energía libre se determina hasta dónde procede la reacción.

Keq : constante de equilibrio

R : constante de los gases (1.98cal/mol/k, o bien, 8.31 J/mol/ºK)

T : temperatura absoluta en ºK

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La constante Keq es igual al producto de las concentraciones de los productos de la

reacción, cada una elevada a su coeficiente estequiométrico, dividido entre el producto de

los sustratos, cada uno elevado a su coeficiente estequiométrico.

• Para la reacción: A + B P + Q

• Para la reacción: A + A P

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∆G0 se podría calcular si se conocen las concentraciones de sustratos y productos presentes en

equilibrio.

* Si ∆G0 es un número negativo, Keq será mayor que la unidad y la concentración de los

productos en el equilibrio es mayor que la de los sustratos.

* Si ∆G0 es positivo, Keq es menor que la unidad y favorece la formación de sustratos.

∆G0 es una función exclusivamente de los sustratos inicial y final de las especies reactivas, por lo que sólo

proporciona información acerca de la dirección y estado de equilibrio de la reacción.

El ∆G0 es independiente del mecanismo de la reacción y, por

consiguiente, no da información respecto a la velocidad de la reacción.

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LA VELOCIDAD DE REACCIÓN SE DETERMINA

POR SU ENERGÍA DE ACTIVACIÓN

Las reacciones pasan por estados de transición

En esta ecuación se ilustra una reacción de desplazamiento en la que un grupo entrante E desplaza a un grupo saliente L, unido inicialmente a R.

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A la mitad del desplazamiento, el enlace entre R y L ya se debilitó pero aún no se corta por completo, y el nuevo enlace entre E y R todavía no se forma del todo. Este intermediario transitorio, en el que no existe sustrato libre ni producto, se denomina estado de transiciónestado de transición, E…R…L. Las líneas punteadas representan los enlaces “parciales” que están experimentando formación o rotura.

Se considera además, que la ecuación anterior consta de dos “reacciones parciales”, donde la

primera corresponde a la formación (F) y la segunda al decaimiento posterior (D) del

intermediario del estado de transición. Al igual que con todas las reacciones, los

cambios característicos de la energía libre,

∆Gf y ∆GD se relacionan con toda reacción parcial.

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Para la reacción global, ∆G es la suma de ∆Gf y ∆Gd.

En muchas reacciones hay varios estados de transición, cada uno con un cambio particular de energía libre.

Para estas reacciones, el ∆G global representa la suma de todos los cambios de energía libre relacionados con la formación y decaimiento de todos los estados de transición. Por consiguiente, no es posible inferir a partir del ∆G global el número o tipo de estados de transición por los que atraviesa la reacción.

La termodinámica global no especifica nada acerca de la cinética.

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∆Gf DEFINE LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN

Para la formación de los intermediarios del estado de transición es necesario superar las barreras de energía. Al ∆Gf se le conoce a menudo como la energía de activación, Eact, la energía requerida para superar una determinada barrera de energía.

La facilidad, y por consiguiente la frecuencia con la cual supera esta barrera tiene una relación inversa con Eact. Por ello, los parámetros termodinámicos que determinan qué tan rápido se efectúa una reacción son

los valores de ∆Gf para la formación de los

estados de transición por los que pasa la reacción.

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velocidad

∞ significa “proporcional a”

La energía de activación para la reacción que procede en dirección opuesta a la señalada es igual a -∆GD

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DIVERSOS FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE

REACCIÓN

La teoría cinética, también conocida como teoría de colisiones, establece que para que dos moléculas reaccionen deben:

1) aproximarse entre sí a la distancia de formación del enlace, o bien “chocar”.

2) deben poseer suficiente energía cinética para superar la barrera de energía y alcanzar el estado de transición.

Cualquier cosa que incremente la frecuencia o energía de colisión entre los sustratos aumentará la velocidad de la reacción en la que participan.

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TEMPERATURA

El aumento de la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas.

El número total de moléculas cuya energía cinética excede la barrera de energía Eact (barra vertical) para la formación de productos se incrementa desde la temperatura baja (A), pasando por la temperatura intermedia (B) hasta la alta (C).

Al incrementarse la energía cinética de las moléculas también se incrementa su movimiento y, por consiguiente, la frecuencia con la que chocan y la velocidad de la reacción.

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CONCENTRACIÓN DE REACTIVOS

La frecuencia de colisión de las moléculas es directamente proporcional a sus concentraciones. Para dos moléculas distintas A y , la frecuencia con la que se chocan se duplica si la concentración de A o de B aumenta al doble.

Si se duplican las concentraciones de A y B, se incrementa cuatro veces la probabilidad de colisión.

Para una reacción química que se efectúa a temperatura constante y en la que participan una molécula de A y una de B.

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A + B → P

El número de moléculas que posea energía cinética suficiente para vencer la energía de activación será una constante.

Velocidad ∞ [A][B]

La cantidad de colisiones con suficiente energía para producir el producto P es directamente proporcional a la cantidad de choques entre A y B y, por consiguiente a sus concentraciones molares.

De manera similar, para la reacción representada por: A + 2B → P

Que se escribe como:

A + B + B → P

La expresión que corresponde a la velocidad es:

Velocidad ∞ [A][B]2

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Para el caso general donde n moléculas de A reaccionan m moléculas B: nA + mB → P

La expresión para la velocidad es: Velocidad ∞ [A]n[B]m

Al sustituir la constante de proporcionalidad con un signo igual mediante la introducción de una constante de proporcionalidad a de velocidad k característica de la reacción en estudio se obtienen otras ecuaciones

que se presentan a continuación, en donde los subíndices 1 y -1 se refieren a las constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa,

respectivamente:

Velocidad1 = k1[A]n[B]m

Velocidad-1 = k-1[P]

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Keq ES UNA RELACIÓN DE CONSTANTES DE

VELOCIDAD

En el equilibrio, las concentraciones globales de reactivos y productos permanecen constantes.

La velocidad de conversión de sustratos en productos es igual a la velocidad a la que los productos se convierten en sustratos.

Velocidad1 = Velocidad-1

Por tanto...

Y...

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La relación de K1 / k -1 se denomina constante de equilibrio, Keq. Se debe tener en mente las siguientes propiedades importantes de un sistema en equilibrio:

1) La constante de equilibrio es una relación de las constantes de velocidad de la reacción (no de las velocidades de reacción).

2) En el equilibrio, son iguales las velocidades de reacción (no las constantes de velocidad) de las reacciones directa e inversa.

3) El equilibrio es una estado dinámico. Aunque no hay cambio neto en la concentración de los sustratos y los productos, las moléculas de sustrato y producto se interconvierten de manera continua.

4) El valor numérico de la constante de equilibrio Keq se calcula a partir de las concentraciones de sustratos y productos en el equilibrio o de la relación k1/k-1.

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CINÉTICA DE LA CATÁLISIS

Las enzimas disminuyen la Las enzimas disminuyen la barrera de la energía de barrera de la energía de

activación para una reacciónactivación para una reacción

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Todas las enzimas aceleran las velocidades de reacción porque proporcionan estados de transición

con menor ∆Gf.

Si el mecanismo o la secuencia de pasos químicos en el sitio activo es en esencia igual que para la misma

reacción que se efectúa en ausencia de catalizador, el ambiente del sitio activo disminuye ∆Gf al estabilizar

los intermediarios de los estados de transición.

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EN LA ESTABILIZACIÓN INTERVIENEN:

1.-1.- Grupos acidobásicos ubicados de manera Grupos acidobásicos ubicados de manera adecuada para transferir protones hacia el adecuada para transferir protones hacia el intermediario del estado de transición en intermediario del estado de transición en desarrollo o desde este intermediario. desarrollo o desde este intermediario.

2.-2.- Grupos cargados o iones metálicos Grupos cargados o iones metálicos ubicados en forma adecuada y que estabilizan ubicados en forma adecuada y que estabilizan las cargas en desarrollolas cargas en desarrollo

3.-3.- La imposición de impedimento estérico en La imposición de impedimento estérico en los sustratos de modo que su configuración los sustratos de modo que su configuración geométrica se aproxime al del estado de geométrica se aproxime al del estado de transición.transición.

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La proteasa de HIV ilustra

la catálisis mediante una enzima que disminuye la barrera de

activación al estabilizar un intermediario del estado de

transición.

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La catálisis mediante

enzimas que procede por

un mecanismo de acción único se

presenta, por lo comun, cuando el

intermediario del estado de

transición forma un

enlace covalente con

la enzima (catálisis

covalente)

En esta figura se ilustra

cómo una enzima por medio de la

catálisis covalente ofrece una

vía de reacción única.

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LAS ENZIMAS NO AFECTAN LA Keq

Las enzimas aceleran las velocidades de reacción porque disminuyen la barrera de activación ∆Gf. Aunque podrían experimentar modificaciones transitorias durante el proceso de catálisis, las enzimas siguen sin cambio al completarse la reacción. Por consiguiente, la presencia de una enzima no tiene efecto en el ∆G0 para la reacción global, la cual es función sólo de los estados inicial y final de los reactivos.

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En la siguiente ecuación se muestra la relación entre la constante de equilibrio para una reacción y el

cambio de energía libre estándar para esa reacción.

Si se incluye la presencia de la enzima E en el cálculo de la constante de equilibrio para una

reacción

La expresión para la constante de equilibrio,

Se reduce a otra que es idéntica a la de una reacción en ausencia de la enzima:

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VARIOS FACTORES INFLUYEN EN LA VELOCIDAD

DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

Al subir la temperatura se incrementa la velocidad tanto de las reacciones no catalizadas como la de las catalizadas por enzimas, ya que se incrementa la energía cinética y la frecuencia de choques de

las moléculas reactivas.

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La energía calorífica aumenta también la energía cinética de la enzima hasta un punto que excede

la barrera de energía para interrumpir las interacciones no covalentes que mantienen la

estructura tridimensional de la enzima. Entonces, la cadena polipeptídica comienza a

desdoblarse o desnaturalizarse, con una rápida pérdida de la actividad catalítica. El intervalo de temperatura en el que una enzima mantiene una

conformación estable, competente catalíticamente, depende de la temperatura

normal de las células en las que reside, y por lo regular dicha temperatura se excede de manera

moderada. Las enzimas del hombre son estables, por lo general, a temperaturas de hasta

45 a 55 ºC. En cambio, las enzimas de los microorganismos termofílicos que residen en

manantiales calientes de origen volcánico o en respiradores hidrotérmicos bajo el mar podrían ser estables hasta 100ºC o por arriba de este

valor.

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El Q10, o coeficiente de temperatura, es el factor mediante e que se incrementa la velocidad de un

proceso biológico para un aumento de temperatura de 10ºC.

En cuanto a las temperaturas en las cuales son estables las enzimas, las velocidades para la

mayor parte de los procesos biológicos se duplican, por lo general en un aumento de

temperatura de 10ºC (Q10=2). Los cambios en las velocidades de las reacciones catalizadas por

enzimas que acompañan a un aumento o disminución de temperatura corporal, constituye una característica de supervivencia importante para las formas de vida de “sangre fría”, cuyas temperaturas corporales las determina el medio

externo.

En cambio los organismos homeotérmicos, los cambios de velocidades de las reacciones

enzimáticas con la temperatura tienen importancia biológica sólo en circunstancias como

la fiebre o la hipotermia.

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CONCENTRACIÓN DEL ION HIDRÓGENO

La velocidad de casi todas las reacciones catalizadas por enzimas depende de la concentración del ión

hidrógeno. La mayor parte de las enzimas intracelulares muestra actividad óptima a valores de

pH entre 5 y 9.

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La relación entre la actividad y la concentración del ion hidrógeno refleja el equilibrio entre la desnaturalización de la enzima a pH alto o bajo y los efectos en el estado cargado de la enzima, de los sustratos, o de ambos. Para las enzimas cuyo mecanismo tiene que ver con la catálisis acidobásica, los residuos que intervienen deben estar en el estado apropiado de protonación para que proceda la reacción. El enlace y el reconocimiento de las moléculas del sustrato con grupos disociables, también se relacionan con la formación de puentes salinos con la enzima. Los grupos cargados más comunes son los carboxilato de carga negativa y los de aminas protonadas con carga positiva. La ganancia o pérdida de grupos importantes con carga afecta de manera adversa la unión del sustrato, y por consiguiente, retarda o anula la catálisis.

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POR LO COMÚN, LA VELOCIDAD INICAL SE DETERMINA EN LOS

ESTUDIOS DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

En la mayor parte de las determinaciones de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se utilizan tiempos relativamente cortos, condiciones que se aproximan a las de la velocidad inicial. En estas circunstancias, sólo se acumulan trazas de producto, de modo que es insignificante la velocidad de la reacción inversa. Por tanto, la velocidad inicial (V1) de la reacción es, en esencia, la misma que la de la reacción directa.

Page 36: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

En los estudios de la actividad enzimática casi siempre se utiliza un gran exceso molar (103 a 107) de sustrato respecto de la enzima. En estas condiciones V1 es proporcional a la concentración de la enzima. Por tanto, la medición de la velocidad inicial permite estimar la cantidad de enzima presente en una muestra biológica.

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LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO AFECTA LA

VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

Las reacciones enzimáticas se abordan como si tuvieran sólo un sustrato y un solo producto. Si

bien, la mayor parte de las enzimas tienen más de un sustrato, los principios que se analizan a

continuación tienen la misma validez en enzimas con varios sustratos.

Para una enzima representativa , cuando se

incrementa la concentración de sustrato, Vi aumenta hasta que alcanza un valor máximo Vmáx.

Page 38: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Cuando se llega al punto en que aumentar más la concentración de sustrato no incrementa la Vi, se dice que la enzima está “saturada” con el sustrato.

Obsérvese que la forma de la curva que relaciona la actividad con la concentración del sustrato es hiperbólica. En cualquier instante, sólo las moléculas de sustrato que están combinadas con la enzima como un complejo ES se transforma en producto. Segundo, la constante de equilibrio para la formación del complejo enzima-sustrato es finito. Por consiguiente, aun cuando el sustrato está presente en exceso, sólo una fracción de la enzima podría estar presente como un complejo ES.

Page 39: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Representación de una enzima a baja concentración (A), a alta Representación de una enzima a baja concentración (A), a alta concentración (C) y a una concentración de sustrato igual a Kconcentración (C) y a una concentración de sustrato igual a Kmm(B)(B)

Page 40: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

En los puntos A y B, al aumentar o En los puntos A y B, al aumentar o disminuir (S) se incrementa o disminuye la disminuir (S) se incrementa o disminuye la cantidad de complejos (ES) con un cambio cantidad de complejos (ES) con un cambio correspondiente en Vi. En el punto C, casi correspondiente en Vi. En el punto C, casi

toda la enzima está presente como toda la enzima está presente como complejo ES. Puesto que no queda complejo ES. Puesto que no queda enzima libre para formar (ES), otro enzima libre para formar (ES), otro

aumento de (S) no aumenta la velocidad aumento de (S) no aumenta la velocidad de reacción. En estas condiciones de de reacción. En estas condiciones de

saturación, Vi, depende sólo de la rapidez saturación, Vi, depende sólo de la rapidez con la que se libera la enzima libre para con la que se libera la enzima libre para

combinarse con más sustrato y, por combinarse con más sustrato y, por consiguiente, está limitada por dicha consiguiente, está limitada por dicha

rapidez. rapidez.

Page 41: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-MENTEN Y HILL MODELAN LOS

EFECTOS DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

Se ilustra la relación entre la velocidad inicial Vi y la concentración del sustrato (S).

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La constante de Michaelis Km es la concentración del sustrato a la cual Vi, es la mitad de la velocidad máxima (Vmáx/2) asequible a una concentración particular

de la enzima.. Por tanto, Km tiene las dimensiones de la concentración del

sustrato. Se podría ilustrar la dependencia de la velocidad de reacción inicial en (S) y Km mediante la evaluación

de la ecuación de Michaelis-Menten.

Page 43: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

3 condiciones de la ecuación de Michaelis-Menden

1.- Cuando (S) es mucho menos que Km, el término Km + (S) es esencialmente igual que Km. Si se sustituye Km + (S) por Km, la ecuación se reduce a:

Donde el signo = significa “aproximadamente igual a”. Puesto que tanto Vmáx como Km son constantes, cuando (S) es bastante menor que Km, Vi ∞ k(S). Por consiguiente, la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a (S).

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2.- Cuando (S) es mucho mayor que Km, el término Km + (S) es esencialmente igual a (S). Si se sustituye Km + (S) por (S), la ecuación se reduce a:

Así, cuando (S) excede por mucho a Km, la velocidad de la relación es máxima (Vmáx) y

es invariable con los incrementos adicionales de la concentración del sustrato.

Page 45: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

3.- Cuando (S) es = Km, la velocidad inicial es igual a la mitad de Vmáx.

Se observa también que Km es la concentración del sustrato a la que la

velocidad inicial es igual a la mitad de Vmáx, y se podría determinar de forma experimental a partir de dicha

concentración.

Page 46: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

PARA DETERMINAR Km Y Vmáx SE UTILIZA UNA FORMA LINEAL DE

LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

En la medición directa del valor numérico de Vmáx y, por tanto, en el cálculo de Km, a

menudo se requieren concentraciones de sustrato demasiado altas para lograr las

condiciones de saturación. Esta dificultad se supera mediante una forma lineal de la

ecuación de Michaelis que permite extrapolar Vmáx y Km, a partir de la velocidad inicial

obtenida a concentraciones menores del sustrato que las de saturación.

Page 47: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Y el inverso de la ecuación

Y al factorizar

Cuando se simplifica se obtiene

Page 48: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

La ecuación anterior, corresponde a una ecuación de una recta, Y = ax + b, donde Y = 1/Vi y x = 1/(S) como x se obtiene una recta cuya ordenada al origen y es Km/Vmáx. A esta gráfica se le denomina doble recíproca o gráfica de Lineweaver-Burk.

Si el término y de la ecuación:

Se iguala a cero y se despeja el valor de x se encuentra que la recta corta al eje de las X en -1/Km.

Por consiguiente, se calcula Km con mas facilidad a partir de la intersección con el eje de las x.

Page 49: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

ES POSIBLE QUE KM SE APROXIME A UNA CONSTANTE DE ENLACE

La afinidad de una enzima por su sustrato es el inverso de la constante de disociación Kd para la disociación

del complejo ES formado entre la enzima y el sustrato.

Expresado de otro modo, mientras menor sea la tendencia de la enzima y el sustrato a disociarse, mayor es la afinidad de la enzima con su sustrato.

Page 50: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Si bien la constante de Michaelis Km a menudo se aproxima a la constante de disociación Kd, esto no siempre es así.

Para la reacción característica catalizada por enzima:

El valor de (S) que da Vi = Vmáx/2 es

Page 51: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Cuando K-1 » K2, entonces

Y

Por consiguiente, 1/Km sólo se aproxima a 1/Kd en condiciones donde la asociación y disociación del complejo ES son rápidas respecto al paso limitante de la velocidad en la catálisis. Para muchas de las reacciones catalizadas por enzimas para las que K-1 + K2 no es aproximadamente igual a K-1, 1/Km será una mala estimación de 1/Kd.

Page 52: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

CON LA ECUACIÓN DE HILL SE DESCRIBE EL COMPORTAMIENTO DE

LAS ENZIMAS QUE MUESTRAN UNIÓN COOPERTATIVA DEL

SUSTRATO

En la mayor parte de las enzimas se observa la cinética de saturación simple mostrada

anteriormente, se describe muy bien mediante la expresión de Michaelis-Menten,

pero algunas enzimas se unen a sus sustratos de manera cooperativa análoga a la unión del oxígeno con la hemoglobina. El

comportamiento cooperativo es una propiedad exclusiva de las enzimas

multinuméricas que se unen al sustrato en varios sitios.

Page 53: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Para las enzimas en las que se observa cooperatividad positiva en la unión del

sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en Vi, con los cambios en (S) es

sigmoidal.

Page 54: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Ni la expresión de Michaelis-Menten ni sus gráficas recíprocas dobles derivadas se

utilizan para evaluar la cinética de saturación cooperativa.

Por ello, los enzimólogos utilizan una representación gráfica de la ecuación de

Hill que al principio se obtuvo para describir el enlace cooperativo de O2 con la

hemoglobina.

A continuación, la ecuación recta de Hill, donde K es una constante compleja.

Page 55: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

En la ecuación se expresa que cuando (S) es baja respecto de K, la velocidad inicial de la reacción se incrementa como la n-ésima potencia de (S).

Al graficar el logVi/Vmáx-Vi) en función de log (S) se obtiene una recta, donde la pendiente n de la

recta es el coeficiente de Hill, un parámetro empírico cuyo valor es una función del número,

clase y fuerza de las interacciones de los diversos sitios de unión de los sustratos en la enzima.

Page 56: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Cuando n = 1, los sitios de enlace se comportan en forma independiente y se observa un

comportamiento cinético simple de Michaelis-Menten. Si n es mayor que 1, se dice que la enzima muestra cooperatividad positiva. El enlace de la primera molécula de sustrato

incrementa entonces la afinidad de la enzima por la unión con el sustrato adicional. A medida que

aumenta el valor de n, mayor es el grado de cooperatividad y más sigmoideal es la gráfica de

Vi en función de (S).

Si se desciende de modo perpendicular desde el punto donde el término log Vi/(Vmáx-Vi) es cero, se

interseca al eje X en la concentración del sustrato que da como resultado la mitad de la Vmáx. Por tanto, S50 es análoga a P50 para

el enlace del oxígeno con la hemoglobina.

Page 57: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

EL ANÁLISIS CINÉTICO DISTINGUE LA INHIBICIÓN COMPETITIVA DE LA NO

COMPETITIVA

Los inhibidores de las actividades catalíticas de las enzimas proporcionan tanto agentes

farmacológicos como herramientas de investigación para el estudio del mecanismo de la acción enzimática. A los inhibidores

se les clasifica según su sitio de acción en la enzima o de acuerdo con los parámetros cinéticos sobre los que tienen efecto.

Desde el punto de vista cinético se distinguen dos clases de inhibidores

según si al elevar la concentración de sustrato se supera la inhibición o no.

Page 58: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

POR LO COMÚN, LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS SE ASEMEJAN A LOS SUSTRATOS

Para superar los efectos de los inhibidores competitivos se eleva la concentración del sustrato. En la inhibición competitiva, el inhibidor I, se une con

frecuencia a la parte del sitio activo que fija el sustrato e impide que ése interaccione con la enzima. Por

tanto, , las estructuras de la mayor parte de los inhibidores competitivos clásicos tienden a asemejarse

a las estructuras de un sustrato, por lo que se denominan análogos del sustrato. La inhibición

que experimenta la enzima deshidrogenasa de succinato con el malonato ilustra la inhibición competitiva mediante un análogo del sustrato.

Page 59: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

La succinato deshidrogenasa cataliza el retiro de un átomo de hidrógeno de cada uno de los

dos carbonos de metileno del succinato.

Tanto el succinato como su análogo estructural malonato

Se pueden enlazar con el sitio activo de la succinato deshidrogenasa para formar un complejo ES o EI, respectivamente.

Page 60: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Puesto que el malonato contiene sólo un carbono de metileno, no es deshidrogenado. La formación y disociación del complejo EI es un proceso dinámico descrito por:

Para la cual la constante de equilibrio Ki es:

En efecto, la acción de un inhibidor competitivo es disminuir el número de moléculas de enzima libre disponibles

para enlazarse con el sustrato, es decir, para formar ES y, por tanto, para formar

finalmente un producto.

Page 61: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Un inhibidor competitivo y el sustrato ejercen efectos recíprocos en la concentración de los

complejos EI y ES. Puesto que la unión (fijación) del sustrato elimina la enzima libre disponible para

combinarse con el inhibidor, al incrementar (S) se disminuye la concentración del complejo EI y

aumenta la velocidad de reacción. El grado al que debe incrementarse (S) para superar por completo

la inhibición depende de la concentración del inhibidor presente, su afinidad por la

enzima K1 y la Km de la enzima por su sustrato.

Page 62: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LAS GRÁFICAS DE LAS DOBLES RECÍPROCAS FACILITAN LA

EVALUACIÓN DE LOS INHIBIDORES

En las gráficas de los recíprocos se distingue entre inhibidores competitivos y no competitivos, y se simplifica

la evaluación de las constantes de inhibición. La V1 se determina mediante varias concentraciones de sustrato tanto en presencia como en ausencia del inhibidor. Para

los inhibidores competitivos , las rectas que unen los puntos de datos experimentales s e encuentran en el eje

y. Puesto que la ordenada al origen y es igual a 1/V max, este patrón indica que cuando 1/S tiende a 0, V1 es

independiente de la presencia del inhibidor. Sin embargo obsérvese que la intersección en el eje de las x varía con

la concentración del inhibidor y puesto que -1/K’m es menor que 1/Km. K’m (La Km “aparente”) se vuelve más grande en presencia de la concentración creciente de inhibidor.

Page 63: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Así, un inhibidor competitivo no tiene efecto en Vmax pero induce el aumento de K’m, la Km aparente para el sustrato. Para la inhibición competitiva simple, la intersección con el

eje de las x es:

Page 64: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Una vez determinada la Km en ausencia de inhibidor, K1 se calcula a partir de la ecuación. Los valores de K1 se utilizan

para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima. Mientras más pequeño sea el valor para Ki, más eficaz será el

inhibidor . por ejemplo, los fármacos de estatina que actúan como inhibidores

competitivos de la HMG-CoA reductasa muestran valores Ki varios órdenes de magnitud más bajos que la Km para el

sustrato HMG-CoA.

Page 65: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LOS INHIBIDORES NO COMPETITIVOS SIMPLES

DISMINUYEN LA VMAX PERO NO AFECTAN A LA KM

En la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor no afecta la fijación del sustrato. Por

tanto, es posible la formación de los complejos EI y EIS. No obstante, si bien el complejo enzima – inhibidor aun puede enlazarse con el sustrato, disminuye su efectividad para transformar al

sustrato en producto, reflejada por el valor de la Vmax. Los inhibidores no competitivos se unen con enzimas en sitios distintos del sitio de unión del sustrato y, por lo general,

tienen poca o ninguna semejanza estructural con el sustrato.

Page 66: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Para la inhibición no competitiva simple, E y EI poseen afinidad

idéntica con el sustrato, y el

complejo EIS genera producto a ritmo insignificante.

La inhibición no competitiva más compleja se observa cuando la fijación (unión) de

inhibidor afecta la afinidad evidente de la enzima con el sustrato, lo que causa que las rectas se crucen en los cuadrantes

tercero o cuarto de una gráfica recíproca doble (no mostrada).

Page 67: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LOS INHIBIDORES IRREVERSIBLES “envenenan” A LA ENZIMA

En los ejemplos anteriores, los inhibidores forman un complejo

dinámico y disociable con la enzima. Por ello la enzima totalmente activa

se recupera al eliminar el inhibidor del medio circundante. Sin embargo, hay otros inhibidores que actúan en forma

irreversible al modificar químicamente a la enzima.

Page 68: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Estas modificaciones, por lo general, implican formar o romper enlaces

covalentes con residuos de aminoacilo esenciales para la fijación del sustrato,

la catálisis o el mantenimiento de la conformación funcional de la enzima. Puesto que estos cambios covalentes

son relativamente estables, una enzima que fue envenenada por un inhibidor

irreversible permanece en su estado de inhibición incluso después de eliminar el inhibidor remanente del entorno.

Page 69: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

EN LA MAYOR PARTE DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS HAY DOS O MÁS

SUSTRATOS

Si bien muchas enzimas tienen un solo sustrato, otras más tienen dos sustratos y productos, y

algunas veces más de dos. Los principios fundamentales estudiados antes, aunque se ilustraron para enzimas con un solo sustrato,

también se aplican a enzimas que actúan en varios sustratos. Pero las expresiones matemáticas

utilizadas para evaluar las reacciones de varios sustratos son complejas. Aunque el análisis

cinético se consideran a continuación reacciones de dos sustratos o dos productos denominadas

reacciones “bi-bi”.

Page 70: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

REACCIONES DE DESPLAZAMIENTO SIMPLE O SECUENCIAL

En las reacciones secuenciales, es necesario que ambos sustratos se combinen con las enzimas para formar un complejo terciario antes de que proceda la catálisis

Page 71: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

A veces, a las reacciones secuenciales se les denomina reacciones de

desplazamiento simple porque el grupo que experimenta la transferencia pasa, por lo común, en forma directa y en un solo paso, de un sustrato a otro. Las

reacciones sucesivas bi-bi se distinguen también porque los dos sustratos se

agregan en orden aleatorio o forzoso. Para las reacciones de orden aleatorio, el

sustrato A o el sustrato B podría combinarse primero con la enzima para

formar un complejo EA o uno EB. Para las reacciones de orden forzoso, A debe

combinarse primero con E antes de que B se combine con el complejo EA. Una

explicación para un mecanismo forzoso es que la adición de A induce un cambio conformacional en la enzima, lo cual alinea

los residuos que reconoce y se une con B.

Page 72: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

REACCIONES DE ping-pong

El término “ping-pong” se aplica a mecanismos en los que la enzima libera uno o más productos antes de que todos

los sustratos sean agregados. En las reacciones ping-pong interviene la catálisis

covalente y una forma transitoria modificada de la enzima.

Page 73: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Las reacciones ping-pong bi-bi son reacciones de desplazamiento doble. La

enzima desplaza primero del sustrato A al grupo que experimenta la transferencia para formar un producto P y una forma

modificada de la enzima (F). La transferencia posterior del grupo desde F al segundo sustrato B, que da lugar a la

formación del producto Q y la regeneración de E, constituye el segundo

desplazamiento.

Page 74: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LA MAYOR PARTE DE LAS REACCIONES BI-BI CUMPLEN CON

LA CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTENMuchas de las reacciones bi-bi siguen una forma un

poco más compleja de la cinética de Michaelis-Menten en la que Vmáx se refiere a la velocidad de reacción obtenida cuando están presentes ambos sustratos a concentraciones de saturación. Cada sustrato tiene

su propio valor característico Km que corresponde a la concentración que produce la mitad de Vmáx cuando el segundo sustrato está presente en concentraciones de saturación. En cuanto a las reacciones de un solo

sustrato, las gráficas recíprocas dobles se puede utilizar para determinar Vmáx y Km, Vi se

cuantifica como una función de la concentración de un sustrato (el sustrato

variable) en tanto que la concentración del otro sustrato (el sustrato fijo) se mantiene constante.

Page 75: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Si se trazan las Si se trazan las rectas obtenidas rectas obtenidas para varias para varias concentraciones de concentraciones de sustrato fijo en la sustrato fijo en la misma gráfica, es misma gráfica, es posible distinguir posible distinguir entre una enzima entre una enzima ping-pong, que ping-pong, que generar rectas que generar rectas que se intersecan.se intersecan.

Page 76: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Los estudios de inhibición del producto Los estudios de inhibición del producto se utilizan para complementar análisis se utilizan para complementar análisis cinéticos y distinguir entre reacciones cinéticos y distinguir entre reacciones

bi-bi ordenadas y aleatorias. Por bi-bi ordenadas y aleatorias. Por ejemplo, en una reacción bi-bi de orden ejemplo, en una reacción bi-bi de orden aleatorio, cada producto es un inhibidor aleatorio, cada producto es un inhibidor competitivo sin importar cuál sustrato competitivo sin importar cuál sustrato se designe como sustrato variable. se designe como sustrato variable.

Pero en el caso de un mecanismo Pero en el caso de un mecanismo consecutivo, sólo con el producto Q se consecutivo, sólo con el producto Q se

obtiene el patrón indicativo de obtiene el patrón indicativo de inhibición competitiva cuando A es el inhibición competitiva cuando A es el sustrato variable, en tanto que sólo el sustrato variable, en tanto que sólo el producto P produce este patrón con B producto P produce este patrón con B

como sustrato variable. Las otras como sustrato variable. Las otras combinaciones de inhibidor de producto combinaciones de inhibidor de producto y sustrato variable y sustrato variable producen formas producen formas de inhibición no competitiva compleja.de inhibición no competitiva compleja.

Page 77: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

EL CONOCIMIENTO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA, SU MECANISMO DE

INHIBICIÓN AYUDA AL DESARROLLO DE LOS FÁRMACOS

Page 78: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

El objetivo de la farmacología es identificar a los agentes que pueden:

destruir o alterar el crecimiento, invasividad o desarrollo de patógenos invasivos.

estimular los mecanismos de defensa endógenos detener o impedir los procesos moleculares aberrantes precipitados por estímulos genéticos, ambientales o biológicos con afectación mínima de las funciones celulares normales del huésped.

Page 79: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

En virtud de sus funciones fisiológicas y alto grado de selectividad, las enzimas constituyen objetivos naturales para el

desarrollo de agentes farmacológicos que sean potentes y específicos. Los fármacos estatina, por ejemplo,

disminuyen la producción de colesterol inhibiendo la 3-hidroxi-metilglutaril

coenzima A reductasa, mientras que la emtricitabina y el fumarato de tenofovir

disoproxil bloquean la replicación del VHI por la inhibición de la transcriptasa

inversa viral.

El tratamiento farmacológico de la hipertensión incluye, a menudo, la

administración de enzimas convertidoras de angiotensina, bajando el nivel de angiotensina II, un vasoconstrictor.

Page 80: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

LA CINÉTICA DE LAS ENZIMAS DEFINE LO APROPIADO DE LAS CONDICIONES DE BÚSQUEDA

La cinética enzimática juega un papel muy importante en el descubrimiento de los fármacos. Es necesario conocer el comportamiento cinético de la enzima. Lo primero y de máxima importancia es seleccionar las condiciones apropiadas del ensayo que detectan con rapidez la presencia de un inhibidor.

La concentración del sustrato, por ejemplo, debe ajustarse a tal grado que se genere el producto

suficiente que permita facilitar la detección de la actividad

enzimática sin ser tan alta que enmascare la presencia de un inhibidor.

Page 81: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

MUCHOS FÁRMACOS SE METABOLIZAN IN VIVO

El desarrollo de fármacos involucra a menudo, más que la evolución cinética de la interacción de los inhibidores con la enzima problema. Los fármacos influyen sobre las enzimas presentes en el paciente o patógeno, proceso llamado metabolismo de los fármacos. Por ejemplo, la penicilina y otros antibióticos β lactámicos bloquean la síntesis de la pared celular en las bacterias envenenando la enzima alanil alanina carboxi peptidasa-transpeptidasa.

Muchas bacterias, sin embargo, producen β lactamasas que hidrolizan la función crítica de la β lactámica. Una estrategia para vencer la resultante resistencia antibiótica es la administración simultánea de un inhibidor de la β lactamasa y un antibiótico β lactámico.

Page 82: Capitulo 8 Cinetica Enzimatica

Se requiere también la transformación metabólica para convertir un precursor

inactivo del fármaco, o pro-fármaco, a su forma biológicamente activa.

El ácido 2’-desoxi-5-flourouridílico, inhibidor potente de la timidilato sintasa, un objetivo

común de la terapia antineoplásica, es producido a partir del 5-fluouracilo mediante una serie de transformaciones enzimáticas

catalizadas por una fosforobosil transferasa y las enzimas de la vía desoxirribonucleótido. El diseño efectivo y la administración de los profármacos requieren conocimiento de la

cinética y mecanismos de las enzimas responsables de la transformación en sus

formas biológicamente activas.

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